RU2235778C2 - Isolated polynucleotide able to confer to plant resistance or tolerance to glyfosate herbicide, vector, method for preparing plants with tolerance or resistance to glyfosate herbicide, method for regeneration of transformed plant and method for selective control of weeds - Google Patents
Isolated polynucleotide able to confer to plant resistance or tolerance to glyfosate herbicide, vector, method for preparing plants with tolerance or resistance to glyfosate herbicide, method for regeneration of transformed plant and method for selective control of weeds Download PDFInfo
- Publication number
- RU2235778C2 RU2235778C2 RU2001132145/13A RU2001132145A RU2235778C2 RU 2235778 C2 RU2235778 C2 RU 2235778C2 RU 2001132145/13 A RU2001132145/13 A RU 2001132145/13A RU 2001132145 A RU2001132145 A RU 2001132145A RU 2235778 C2 RU2235778 C2 RU 2235778C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- epsps
- sequence
- enhancer
- rice
- plant
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение касается технологии рекомбинантных ДНК и, в частности, получения трансгенных растений, которые проявляют существенную резистентность (невосприимчивость) или существенную устойчивость к гербицидам по сравнению с подобными нетрансгенными растениями. Также изобретение, помимо прочего, касается нуклеотидных последовательностей (и продуктов их экспрессии), которые используются в получении указанных трансгенных растений или вырабатываются ими.The present invention relates to recombinant DNA technology and, in particular, to the production of transgenic plants that exhibit significant resistance (immunity) or substantial resistance to herbicides compared to similar non-transgenic plants. Also, the invention, inter alia, relates to nucleotide sequences (and their expression products), which are used in the production of these transgenic plants or produced by them.
Растения, которые по существу “устойчивы” к гербициду тогда, когда они подвергаются его воздействию, формируют кривую зависимости ответа от дозы, смещенную вправо в случае сравнения с той кривой, которую получают на подобных неустойчивых растениях, обработанных сходным образом. При построении таких кривых зависимости ответа от дозы на ось абсцисс наносят “дозу”, а на ось ординат наносят “долю уничтоженных растений”, “эффект действия гербицида” и т.д. Для устойчивых растений обычно должно требоваться вдвое больше гербицида по сравнению с подобными, не обладающими устойчивостью растениями с целью достижения данного эффекта действия гербицида. Растения, которые по существу “резистентны” к гербициду, проявляют незначительные некротические, литические, хлоротические или иные повреждения или не проявляют их вовсе, когда подвергаются действию гербицида при концентрации и интенсивности, которые обычно используют в сельскохозяйственной практике для уничтожения сорняков в полевых условиях, где культурные растения должны быть выращены в промышленных целях.Plants that are essentially “resistant” to the herbicide when they are exposed to it form a dose-response curve shifted to the right when compared with the curve obtained on similar unstable plants treated in a similar way. When constructing such dose-response curves, a “dose” is applied to the abscissa axis, and “the fraction of destroyed plants”, “effect of the action of the herbicide”, etc. are applied to the ordinate axis. For resistant plants, usually twice as much herbicide is required compared to similar non-resistant plants in order to achieve this effect of the herbicide. Plants that are essentially “resistant” to the herbicide show minor necrotic, lytic, chlorotic, or other injuries or do not show them at all when they are exposed to the herbicide at a concentration and intensity that are commonly used in agricultural practice to destroy weeds in the field, where cultivated plants must be grown for industrial purposes.
Особенно предпочтительным является то, что растения по существу резистентны или по существу устойчивы к гербицидам (здесь и далее “глифосат”), мишенью действия которых является 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтаза (здесь и далее “EPSPS”) и прекрасным примером которых является N-фосфонометилглицин (и различные его соли).Particularly preferred is that the plants are essentially resistant or substantially resistant to herbicides (hereinafter “glyphosate”), the target of which is 5-enolpyruvyl chicimate-3-phosphate synthase (hereinafter “EPSPS”) and an excellent example of which is N -phosphonomethylglycine (and its various salts).
Гербицид может быть нанесен как до, так и после появления всходов в соответствии с обычными методами применения гербицидов на полях, на которых выращивают культуры, которые резистентны к гербициду. Настоящее изобретение, помимо прочего, представляет нуклеотидные последовательности, применимые для получения указанных растений, устойчивых или резистентных к гербициду.The herbicide can be applied both before and after emergence in accordance with the usual methods of applying herbicides in fields where crops that are resistant to the herbicide are grown. The present invention, inter alia, provides nucleotide sequences useful for preparing said plants that are resistant or resistant to the herbicide.
В соответствии с настоящим изобретением представляется выделенный полинуклеотид, включающий последовательность, приведенную в SEQ ID No 43. Также изобретение представляет полинуклеотид, исключая кДНК, кодирующую EPSPS риса и кукурузы, который кодирует EPSPS и который комплементарен полинуклеотиду, который в случае инкубации при температуре 65-70°С в 0,1 конц. цитратном солевом буфере, содержащем 0,1% ДСН, с последующей промывкой при той же температуре в 0,1 конц. цитратном солевом буфере, содержащем 0,1% ДСН, гибридизирует с последовательностью, приведенной в SEQ ID No 43. Полинуклеотид по настоящему изобретению, кодирующий EPSPS, может, однако, быть получен путем скрининга библиотек геномной ДНК растений нуклеотидом, составляющим интрон в составе последовательности SEQ ID No 43, и изобретение также охватывает такую последовательность, полученную в указанном скрининге.In accordance with the present invention, an isolated polynucleotide is provided that includes the sequence shown in SEQ ID No 43. The invention also provides a polynucleotide excluding cDNA encoding EPSPS of rice and corn, which encodes EPSPS and which is complementary to polynucleotide, which when incubated at a temperature of 65-70 ° C at 0.1 conc. citrate saline buffer containing 0.1% SDS, followed by washing at the same temperature in 0.1 conc. citrate saline buffer containing 0.1% SDS hybridizes with the sequence shown in SEQ ID No 43. The polynucleotide of the present invention encoding EPSPS can, however, be obtained by screening plant genomic DNA libraries with a nucleotide constituting an intron in the SEQ sequence ID No. 43, and the invention also covers such a sequence obtained in the specified screening.
Также настоящее изобретение охватывает выделенный полинуклеотид, включающий сегмент, кодирующий хлоропластный сигнальный (транзитный) пептид и глифосат устойчивую 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), при этом последний расположен по ходу транскрипции за сегментом, кодирующим хлоропластный сигнальный пептид, причем экспрессия указанного сегмента находится под контролем функционального растительного промотора, при условии, что указанный промотор является негетерологичным по отношению к указанному сегменту и что хлоропластный сигнальный пептид является негетерологичным по отношению к указанной синтазе.The present invention also encompasses an isolated polynucleotide comprising a segment encoding a chloroplast signal (transit) peptide and glyphosate resistant 5-enolpyruvyl chicimate-3-phosphate synthase (EPSPS), the latter being located downstream of the segment encoding the chloroplast signal peptide, the expression of which is under the control of a functional plant promoter, provided that the specified promoter is non-heterologous with respect to the specified segment and that the chloroplast ignalny peptide is negeterologichnym respect to said synthase.
Термин “гетерологичный” подразумевает происхождение от отличающегося источника, и, соответственно, “негетерологичный” означает происхождение от одного и того же источника, но на генном уровне, а не на уровне организма или ткани. Например, промотор CaMV35S очевидно гетерологичен по отношению к кодирующей последовательности EPSPS петунии, поскольку промотор происходит от вируса, а последовательность, экспрессию которой он контролирует, от растения. Однако термин “гетерологичный” в соответствии с настоящим изобретением имеет еще более узкое значение. Например, “гетерологичный”, упоминаемый в связи с настоящим изобретением, означает, что кодирующая последовательность EPSPS петунии “гетерологична” по отношению, например, к промотору, также происходящему от петунии, но экспрессию гена EPSPS. В этом смысле промотор петунии, происходящий от гена EPSPS петунии и затем используемый для контроля экспрессии кодирующей последовательности EPSPS, также происходящей от петунии, является “негетерологичным” по отношению к указанной кодирующей последовательности. Однако термин “негетерологичный” не означает того, что промотор и кодирующая последовательность обязательно должны быть получены из состава одного и того же (исходного или предкового) полинуклеотида. То же самое касается сигнальных пептидов. Например, хлоропластный сигнальный пептид Rubisco, происходящий от подсолнечника, “гетерологичен” по отношению к кодирующей последовательности гена EPSPS, также происходящего от подсолнечника (того же растения, ткани или клетки). Последовательность, кодирующая сигнальный пептид Rubisco, происходящая от подсолнечника, “негетерологична” по отношению к последовательности, кодирующей фермент Rubisco, также происходящей от подсолнечника, даже если исходные для обеих последовательностей полинуклеотиды являются разными и могут присутствовать в разных клетках, тканях или растениях подсолнечника.The term “heterologous” means origin from a different source, and, accordingly, “non-heterologous” means origin from the same source, but at the gene level, and not at the level of the organism or tissue. For example, the CaMV35S promoter is obviously heterologous with respect to the coding sequence of the EPSPS petunia, since the promoter is derived from a virus and the sequence whose expression it controls is from a plant. However, the term “heterologous” in accordance with the present invention has an even narrower meaning. For example, “heterologous” referred to in connection with the present invention means that the coding sequence of an EPSPS petunia is “heterologous” with respect to, for example, a promoter also derived from petunia, but the expression of the EPSPS gene. In this sense, the petunia promoter derived from the EPSPS gene of the petunia and then used to control the expression of the EPSPS coding sequence also derived from petunia is “non-heterologous” with respect to said coding sequence. However, the term “non-heterologous” does not mean that the promoter and coding sequence must be obtained from the same (source or ancestral) polynucleotide. The same goes for signal peptides. For example, the Rubisco chloroplast signal peptide derived from sunflower is “heterologous” with respect to the coding sequence of the EPSPS gene, also originating from sunflower (the same plant, tissue, or cell). A sequence encoding a Rubisco signal peptide derived from sunflower is “non-heterologous” with respect to a sequence encoding a Rubisco enzyme also originating from sunflower, even if the polynucleotides for both sequences are different and may be present in different sunflower cells, tissues or plants.
Предпочтительная форма полинуклеотида включает следующие компоненты, перечисленные в направлении транскрипции 5’→ 3’:A preferred form of polynucleotide includes the following components listed in the transcription direction 5 ’→ 3’:
(i) по крайней мере один транскрипционный энхансер, являющийся энхансерным элементом, расположенным выше старт-сайта транскрипции в последовательности, от которой энхансер был получен, причем указанный энхансер сам по себе не функционирует в качестве промотора ни в последовательности, в которой он является эндогенным, ни в случае, когда он присутствует гетерологически как часть конструкции;(i) at least one transcriptional enhancer, which is an enhancer element located above the start site of transcription in the sequence from which the enhancer was obtained, and the specified enhancer by itself does not function as a promoter in the sequence in which it is endogenous, nor in the case when it is present heterologically as part of the construct;
(ii) промотор гена EPSPS риса;(ii) a promoter of the EPSPS gene of rice;
(iii) геномная последовательность риса, которая кодирует хлоропластный сигнальный пептид EPSPS риса;(iii) a rice genomic sequence that encodes a rice EPSPS chloroplast signal peptide;
(iv) геномная последовательность, которая кодирует EPSPS риса;(iv) a genomic sequence that encodes rice EPSPS;
(v) терминатор транскрипции;(v) a transcription terminator;
причем кодирующая последовательность EPSPS риса модифицирована таким образом, что первое положение мутировано так, что остатком в этом положении является Il вместо Thr, и второе положение мутировано так, что остатком в этом положении является Ser вместо Pro, причем мутации внесены в последовательности EPSPS, которые включают следующий консервативный сегмент GNAGTAMRPLTAAV в ферменте дикого типа, таким образом, что модифицированная последовательность читается как GNAGIAMRSLTAAV.moreover, the rice EPSPS coding sequence is modified so that the first position is mutated so that the residue in this position is Il instead of Thr, and the second position is mutated so that the residue in this position is Ser instead of Pro, and mutations are made in EPSPS sequences that include the next conserved segment of GNAGTAMRPLTAAV in the wild-type enzyme, such that the modified sequence reads as GNAGIAMRSLTAAV.
Энхансерный сегмент предпочтительно включает последовательность, 3’-конец которой находится по крайней мере на 40 нуклеотидов выше ближайшего старт-сайта транскрипции в последовательности, от которой энхансер получен. В следующем варианте полинуклеотида энхансерный сегмент включает сегмент, 3’-конец которого находится по крайней мере на 60 нуклеотидов выше указанного ближайшего старт-сайта, и еще в одном варианте полинуклеотида указанный энхансерный сегмент включает последовательность, 3’-конец которой находится по крайней мере на 10 нуклеотидов выше первого нуклеотида в консенсусном боксе ТАТА в последовательности, от которой энхансер получен.The enhancer segment preferably includes a sequence whose 3 ′ end is at least 40 nucleotides higher than the nearest transcription start site in the sequence from which the enhancer is derived. In a further embodiment of the polynucleotide, the enhancer segment comprises a segment whose 3 ′ end is at least 60 nucleotides higher than the nearest nearest start site, and in yet another embodiment of the polynucleotide, the enhancer segment comprises a sequence whose 3 ′ end is at least at 10 nucleotides above the first nucleotide in a TATA consensus box in the sequence from which the enhancer is derived.
Полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением может включать два или большее число транскрипционных энхансеров, которые в конкретном варианте полинуклеотида могут быть организованы тандемно (один за другим).A polynucleotide in accordance with the present invention may include two or more transcriptional enhancers, which in a particular embodiment of the polynucleotide can be arranged in tandem (one after another).
В заявляемом настоящим изобретением полинуклеотиде 3’-конец энхансера или первый энхансер, если их присутствует более одного, может находиться на расстоянии от примерно 100 до примерно 1000 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте в случае, когда указанный сегмент включает интрон. В более предпочтительном варианте полинуклеотида 3’-конец энхансера или первый энхансер находится на расстоянии от примерно 150 до примерно 1000 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте, и в еще более предпочтительном варианте 3’-конец энхансера или первый энхансер может находиться на расстоянии от примерно 300 до примерно 950 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте. В еще более предпочтительном варианте 3’-конец энхансера или первый энхансер может находиться на расстоянии от примерно 770 до примерно 790 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте.In the polynucleotide of the present invention, the 3 ′ end of the enhancer or the first enhancer, if more than one is present, can be located at a distance of from about 100 to about 1000 nucleotides upstream of the codon corresponding to the start codon of the translation of the EPSPS signal peptide, or the first nucleotide of the intron at 5 'non-broadcast segment in the case when the specified segment includes an intron. In a more preferred embodiment, the
В альтернативном заявляемом полинуклеотиде 3’-конец энхансера или первый энхансер может находиться на расстоянии от примерно 300 до примерно 380 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS, или от первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте, а в предпочтительном варианте указанного альтернативного полинуклеотида 3’-конец энхансера или первый энхансер расположен на расстоянии от примерно 320 до примерно 350 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS или первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте.In an alternative claimed polynucleotide, the 3 ′ end of the enhancer or the first enhancer may be located at a distance of about 300 to about 380 nucleotides up from the codon corresponding to the start codon of the translation of the EPSPS signal peptide, or from the first nucleotide of the intron in the 5 ′ untranslated segment, and in In a preferred embodiment of said alternative polynucleotide, the 3 ′ end of the enhancer or the first enhancer is located at a distance of from about 320 to about 350 nucleotides upstream of the codon corresponding to the translation start codon ignalnogo EPSPS peptide or the first nucleotide of an intron in the 5'-untranslated segment.
В полинуклеотиде по настоящему изобретению сегмент вверх от промотора гена EPSPS может включать по крайней мере один энхансер, происходящий из последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции в промоторах CaMV35S или FMV35S.In the polynucleotide of the present invention, the segment upstream of the EPSPS gene promoter may include at least one enhancer derived from a sequence that is above the transcription start site in CaMV35S or FMV35S promoters.
Следовательно, полинуклеотид может включать в направлении 5’→ 3’ первый энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции промотора GOS-2, и второй энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая расположена выше старт-сайта транскрипции промоторов CaMV35S или FMV35S.Therefore, the polynucleotide may include in the
Альтернативно, полинуклеотид может включать в направлении 5’→ 3’ первый энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции промотора гена актина риса, и второй энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая расположена выше старт-сайта транскрипции промоторов CaMV35S или FMV35S.Alternatively, the polynucleotide may include in the
Альтернативно, полинуклеотид может включать в направлении 5’→ 3’ первый энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции промотора гена пластоцианина ячменя, и второй энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая расположена выше старт-сайта транскрипции промоторов CaMV35S или FMV35S.Alternatively, the polynucleotide may include in the
Альтернативно, полинуклеотид может включать в направлении 5’→ 3’ первый энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции промотора гена полиубихитина кукурузы, и второй энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая расположена выше старт-сайта транскрипции промоторов CaMV35S или FMV35S.Alternatively, the polynucleotide may include in the
Альтернативно, полинуклеотид может включать в направлении 5’→ 3’ первый энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции промотора FMV35S, и второй энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая расположена выше старт-сайта транскрипции промотора CaMV35S.Alternatively, the polynucleotide may include in the
При любых идентичности и взаиморасположении различных энхансеров в составе полинуклеотида нуклеотиды с 5’-конца от кодона, который составляет старт-кодон трансляции хлоропластного сигнального пептида EPSPS риса, могут быть выбраны по Козаку. То, что это означает, хорошо известно специалистам в данной области техники и дополнительно станет понятным из приводимых далее примеров.For any identity and relative position of the various enhancers in the polynucleotide, nucleotides from the 5 ′ end of the codon, which is the start codon of the translation of the EPSPS rice chloroplast signal peptide, can be selected according to Kozak. What this means is well known to those skilled in the art and will further become apparent from the following examples.
В частности, в предпочтительных вариантах настоящего изобретения полинуклеотид включает нетранслируемый сегмент, который включает последовательность, которая выполняет функции интрона, расположенного с 5’-конца от геномной последовательности риса, которая кодирует хлоропластный сигнальный пептид EPSPS риса. Нетранслируемый сегмент может включать последовательность, приведенную в SEQ ID No 55. В частности, нетранслируемый сегмент может включать интрон гена ADHI кукурузы, характеризующийся последовательностью SEQ ID No 55.In particular, in preferred embodiments of the present invention, the polynucleotide comprises an untranslated segment that includes a sequence that functions as an intron located at the 5 ′ end of the rice genomic sequence that encodes the rice EPSPS chloroplast signal peptide. The untranslated segment may include the sequence shown in SEQ ID No. 55. In particular, the untranslated segment may include the intron of the maize ADHI gene, characterized by the sequence of SEQ ID No. 55.
Полинуклеотид по настоящему изобретению может включать происходящий от вируса трансляционный энхансер, находящийся в пределах нетранслируемого сегмента 5’-конца от геномной последовательности риса, которая кодирует хлоропластный сигнальный пептид EPSPS риса. Специалистам в данной области техники известны индивидуальные свойства таких подходящих трансляционных энхансеров - таких как последовательности Omega и Omega-prime, происходящие от TMV, и те, которые происходят от вируса гравировки табака, а также известно, как такие трансляционные энхансеры могут быть внесены в полинуклеотид так, чтобы обеспечить желательный результат.The polynucleotide of the present invention may include a virus-derived translational enhancer located within the untranslated 5 ′ end segment of the rice genomic sequence that encodes the rice EPSPS chloroplast signal peptide. Specialists in the art are aware of the individual properties of such suitable translational enhancers — such as the Omega and Omega-prime sequences derived from TMV and those derived from the tobacco engraving virus, and it is also known how such translational enhancers can be introduced into a polynucleotide as to provide the desired result.
Полинуклеотид по настоящему изобретению может дополнительно включать сегменты, кодирующие белки, способные обеспечивать содержащему их растительному материалу по крайней мере один из следующих агрономически-полезных признаков: резистентность к насекомым, грибкам, вирусам, бактериям, нематодам, стрессам, обезвоживанию и гербицидам. При том, что такой полинуклеотид предусматривает иной ген, обеспечивающий резистентность к гербицидам, нежели ген EPSPS, такой как, например, ген глифосатоксидоредуктазы (GOX), гербицид может и не являться глифосатом, причем в этом случае гены, обеспечивающие резистентность, могут быть выбраны из группы генов, кодирующих следующие белки: фосфинотрицин-ацетилтрансфераза (PAT), гидроксифенилпируватдиоксигеназа (HPPD), глутатион-S-трансфераза (GST), цитохром Р-450, ацетил-КоА-карбоксилаза (АККаза), ацетолактатсинтаза (ALS), протопорфириногеноксидаза (РРО), дигидроптероатсинтаза, белки-переносчики полиаминов, супероксиддисмутаза (SOD), бромоксинилнитрилаза, фитоендесатураза (PDS), продукт гена tfdA, выделенного из Alcaligenes eutrophus, и известные мутированные или по-иному модифицированные варианты указанных белков. В случае, когда полинуклеотид обеспечивает множественную гербицидную резистентность, такие гербициды могут быть выбраны из группы, которая включает динитроанилиновый гербицид, триазолопиримидины, урацил, фенилмочевину, трикетон, изоксазол, ацетанилид, оксадиазол, триазинон, сульфонанилид, амид, анилид, RP201772, фторхлоридон, норфлуразон и гербицид триазолинонового типа, а гербициды, применяемые после появления всходов, выбирают из группы, которая включает глифосат и его соли, глуфозинат, асулам, бентазон, биалафос, бромацил, сетоксидим или иной циклогександион, дикамба, фозамин, флупоксам, феноксипропионат, квизалофоп или иной арилоксифеноксипропаноат, пиклорам, флуорметрон, атразин или иной триазин, метрибуцин, хлоримурон, хлорсульфурон, флуметсулам, галосульфурон, сульфометрон, имазахин, имазетапир, изоксабен, имазамокс, метосулам, пиритробак, римсульфурон, бенсульфурон, никосульфурон, фомесафен, флурогликофен, KIH9201, ЕТ751, карфентразон, ZA1296, сулькотрион, паракват, дикват, бромоксинил и феноксапроп.The polynucleotide of the present invention may further include segments encoding proteins capable of providing at least one of the following agronomically useful traits to the plant material containing them: resistance to insects, fungi, viruses, bacteria, nematodes, stress, dehydration and herbicides. While such a polynucleotide provides a different gene that provides resistance to herbicides than the EPSPS gene, such as, for example, the glyphosate oxidoreductase (GOX) gene, the herbicide may not be glyphosate, and in this case, the genes that provide resistance can be selected from groups of genes encoding the following proteins: phosphinotricin-acetyltransferase (PAT), hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD), glutathione-S-transferase (GST), cytochrome P-450, acetyl-CoA-carboxylase (ACKase), acetolactate synthase (ALS), ), igidropteroatsintaza, polyamine transporter proteins, superoxide dismutase (SOD), bromoksinilnitrilaza, phytoene desaturase (PDS), tfdA gene product isolated from Alcaligenes eutrophus, and known mutated or otherwise modified variants of these proteins. In the case where the polynucleotide provides multiple herbicidal resistance, such herbicides may be selected from the group consisting of dinitroaniline herbicide, triazolopyrimidines, uracil, phenylurea, triketone, isoxazole, acetanilide, oxadiazole, triazinone, aminofluoronilide, sulfononidrylide, anidoronilidonilid2, iridononilidonilidonilidonilidonidli2011 and a triazolinone type herbicide, and the herbicides used after emergence are selected from the group consisting of glyphosate and its salts, glufosinate, asulam, bentazone, bialafos, bromacil, setoxydim or another cyclohexanedione, dicamba, fosamine, flupoxam, phenoxypropionate, quizalofop or other aryloxyphenoxypropanoate, picloram, fluormethron, atrazine or other triazine, metribucin, chlorimuron, chlorosulfuron, flumetsuramaz, imacronamoximetam, rimosulfonamide, rimosulfonamide, imosimetronimonazomethan, rimosulfonamide, imosulfonamide, rimosulfonamide, imosimetroimonazole, rimonoxamonase, imosulfonamide, imosimetronimonazole, rimosulfonamide, imosimetroimonazole, rimonoxamonazimes , bensulfuron, nicosulfuron, fomesafen, fluroglycofen, KIH9201, ET751, carfentrazone, ZA1296, sulcotrione, paraquat, diquat, bromoxynil and fenoxaprop.
В случае, когда полинуклеотид включает последовательности, кодирующие инсектицидные белки, такие белки могут быть выбраны из группы, которая включает кристаллические токсины, происходящие от Bacillus thuringiensis (Bt), включая секретируемые Bt-токсины; протеазные ингибиторы, лектины, токсины Xenorhabdus/Photorhabdus; гены, обеспечивающие резистентность к грибкам, могут быть выбраны из группы, которая включает гены, кодирующие известные AFP, дефензины, хитиназы, глюканазы, Avr-Cf9. В частности, предпочтительными инсектицидными белками являются cryIAc, cryIAb, сrу3А, Vip-1A, Vip-1B, ингибиторы цистеиновых протеаз и лектин подснежника. В случае, когда полинуклеотид включает гены, обеспечивающие резистентность к бактериям, такие гены могут быть выбраны из группы, которая включает гены, кодирующие цекропины и техиплезин и их аналоги. Гены, обеспечивающие резистентность к вирусам, могут быть выбраны из группы, которая включает гены, кодирующие вирусные капсидные белки, двигательные белки, вирусные репликазы и антисмысловые и рибозимные последовательности, для которых известно обеспечение резистентности к вирусам; кроме того, гены, обеспечивающие резистентность к стрессам, засолению и обезвоживанию, могут быть выбраны из генов, кодирующих глутатион-S-трансферазу и пероксидазу, последовательности которых включают известную регуляторную последовательность CBF1, и генов, для которых известно участие в накоплении трегалозы.In the case where the polynucleotide includes sequences encoding insecticidal proteins, such proteins may be selected from the group consisting of crystalline toxins derived from Bacillus thuringiensis (Bt), including secreted Bt toxins; protease inhibitors, lectins, toxins Xenorhabdus / Photorhabdus; genes that provide resistance to fungi can be selected from the group which includes genes encoding known AFP, defensins, chitinases, glucanases, Avr-Cf9. Particularly preferred insecticidal proteins are cryIAc, cryIAb, cr3A, Vip-1A, Vip-1B, cysteine protease inhibitors and snowdrop lectin. In the case where the polynucleotide includes genes that provide resistance to bacteria, such genes can be selected from the group that includes genes encoding cecropins and tehplezin and their analogues. Virus resistance genes can be selected from the group which includes genes encoding viral capsid proteins, motor proteins, viral replicases and antisense and ribozyme sequences for which virus resistance is known; in addition, genes that provide resistance to stress, salinity and dehydration can be selected from genes encoding glutathione S-transferase and peroxidase, sequences of which include the known regulatory sequence of CBF1, and genes for which participation in trehalose accumulation is known.
Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть модифицирован с целью усиления экспрессии кодирующих белок последовательностей таким образом, что мотивы, приводящие к нестабильности мРНК, и/или случайные сайты сплайсинга могут быть удалены, или же предпочитаемые библиотекой кодонов данного растения кодоны могут быть использованы таким образом, что экспрессия модифицированного таким путем полинуклеотида в растении даст по существу такой же белок, обладающий по существу такими же активностью и функциями по сравнению с тем белком, который получают в результате экспрессии немодицифированного полинуклеотида в организме, для которого кодирующие белок сегменты немодифицированного полинуклеотида являются эндогенными. Степень идентичности между модифицированным полинуклеотидом и полинуклеотидом, являющимся эндогенным для указанного растения и кодирующего по существу такой же белок, может быть такой, чтобы предотвращать эффект взаимного подавления модифицированной и эндогенной последовательностей. В этом случае степень идентичности между последовательностями предпочтительно должна быть меньше, чем примерно 70%.The polynucleotide of the present invention can be modified to enhance the expression of protein coding sequences so that motifs leading to mRNA instability and / or random splicing sites can be deleted, or codons preferred by the codon library of this plant can be used in such a way that the expression of a polynucleotide modified in this way in a plant will produce essentially the same protein, which has essentially the same activity and functions compared to that protein, tory prepared by expression nemoditsifirovannogo polynucleotide in the organism to which a protein encoding segments unmodified polynucleotide are endogenous. The degree of identity between the modified polynucleotide and the polynucleotide that is endogenous for the specified plant and encoding essentially the same protein may be such as to prevent the effect of mutual suppression of the modified and endogenous sequences. In this case, the degree of identity between the sequences should preferably be less than about 70%.
Далее настоящее изобретение охватывает биологический или трансформационный вектор, включающий заявляемый настоящим изобретением полинуклеотид. Следовательно, “вектор” означает, помимо прочего, одно из следующего: плазмиду, вирус, космиду или бактерию, трансформированную или трансфицированную таким образом, что она несет полинуклеотид.Further, the present invention encompasses a biological or transformation vector comprising the polynucleotide of the invention. Therefore, “vector” means, inter alia, one of the following: a plasmid, virus, cosmid or bacterium transformed or transfected in such a way that it carries a polynucleotide.
Далее настоящее изобретение охватывает растительный материал, который был трансформирован указанным полинуклеотидом или вектором, а также такой трансформированный растительный материал, который был дополнительно трансформирован полинуклеотидом, включающим сегменты, которые кодируют белки, способные обеспечивать несущему их растительному материалу по крайней мере один из следующих агрономически-полезных признаков: резистентность к насекомым, грибкам, вирусам, бактериям, нематодам, стрессу, обезвоживанию и гербицидам.Further, the present invention encompasses plant material that has been transformed with the indicated polynucleotide or vector, as well as such transformed plant material that has been further transformed with a polynucleotide, comprising segments that encode proteins capable of providing at least one of the following agronomically useful plant material that carries them signs: resistance to insects, fungi, viruses, bacteria, nematodes, stress, dehydration and herbicides.
Также настоящее изобретение охватывает морфологически нормальные фертильные цельные растения, которые были регенерированы из материала, представленного в предыдущем абзаце, образуемые на них семена и части потомства, которые несут полинуклеотид или вектор по настоящему изобретению, стабильно интегрированный в их геном и наследуемый по менделевскому типу.The present invention also encompasses morphologically normal fertile whole plants that were regenerated from the material presented in the previous paragraph, seeds formed on them and parts of the offspring that carry a polynucleotide or vector of the present invention, stably integrated into their genome and inherited according to the Mendelian type.
Далее настоящее изобретение дополнительно охватывает морфологически нормальные фертильные цельные растения, несущие данный заявляемый полинуклеотид и которые получены в результате скрещивания растений, которые были регенерированы из материала, трансформированного данным заявляемым полинуклеотидом или вектором, а также растения, которые были трансформированы полинуклеотидом, включающим участки, которые кодируют белки, способные обеспечивать несущему их растительному материалу по крайней мере один из следующих агрономически-полезных признаков; резистентность к насекомым, грибкам, вирусам, бактериям, нематодам, стрессу, обезвоживанию и гербицидам, а также потомство получаемых в результате растений, их семена и части.Further, the present invention further encompasses morphologically normal fertile whole plants bearing this inventive polynucleotide and which are obtained by crossing plants that have been regenerated from material transformed with this inventive polynucleotide or vector, as well as plants that have been transformed with a polynucleotide, including regions that encode proteins capable of providing at least one of the following agronomically field-bearing plant material GOVERNMENTAL signs; resistance to insects, fungi, viruses, bacteria, nematodes, stress, dehydration and herbicides, as well as the offspring of the resulting plants, their seeds and parts.
Растения по настоящему изобретению могут быть выбраны из группы, которая включает посевные культуры, фруктовые и овощные культуры, такие как брюква “canola”, подсолнечник, табак, сахарная свекла, хлопчатник, кукуруза, пшеница, ячмень, рис, сорго, помидор, манго, персик, яблоко, груша, земляника, банан, дыня, картофель, морковь, латук, капуста, лук, соя разных видов, сахарный тростник, горох, бобы, тополь, виноград, цитрусовые, люцерна, рожь, овес, дерновые и фуражные травы, лен и брюква, а также орехоносные растения, если только они уже не упоминались выше, а также их потомство, семена и части.The plants of the present invention can be selected from the group which includes crops, fruit and vegetable crops such as canola rutabaga, sunflower, tobacco, sugar beets, cotton, corn, wheat, barley, rice, sorghum, tomato, mango, peach, apple, pear, strawberries, banana, melon, potatoes, carrots, lettuce, cabbage, onions, soy of different types, sugarcane, peas, beans, poplar, grapes, citrus fruits, alfalfa, rye, oats, sod and fodder herbs, flax and rutabaga, as well as nut plants, unless they have already been mentioned yshe and their progeny, seeds and parts.
Особенно предпочтительными такими растениями являются кукуруза, соя, хлопчатник, сахарная свекла и брюква “canola”.Particularly preferred plants are corn, soybeans, cotton, sugar beets, and canola rutabaga.
Далее настоящее изобретение представляет способ избирательной борьбы с сорняками в полевых условиях, причем на поле находятся сорняки и растения по настоящему изобретению или резистентное к гербициду их потомство, включающий нанесение на поле гербицида глифосатного типа в количестве, достаточном для борьбы с сорняками без существенного негативного влияния на культурные растения. В соответствии с данным способом один или большее число гербицидов, инсектицидов, фунгицидов, нематоцидов, бактериоцидов и антивирусных средств можно наносить на поле (и, соответственно, на растения, растущие на нем) как до, так и после применения глифосатного гербицида.Further, the present invention provides a method for selectively controlling weeds in the field, with weeds and plants of the present invention or herbicide resistant progeny on the field comprising applying a glyphosate type herbicide to the field in an amount sufficient to control weeds without significantly adversely affecting cultivated plants. In accordance with this method, one or more herbicides, insecticides, fungicides, nematicides, bacteriocides and antiviral agents can be applied to the field (and, accordingly, to plants growing on it) both before and after application of the glyphosate herbicide.
Далее изобретение предусматривает способ получения растений, которые по существу устойчивы или по существу резистентны к глифосатному гербициду, включающий следующие стадии:The invention further provides a method for producing plants that are substantially resistant or substantially resistant to a glyphosate herbicide, comprising the steps of:
(i) трансформацию растительного материала полинуклеогидом или вектором по настоящему изобретению;(i) transforming the plant material with a polynucleogide or a vector of the present invention;
(ii) отбор трансформированного таким путем материала; и(ii) selection of material transformed in this way; and
(iii) регенерацию отобранного таким путем материала в морфологически нормальные фертильные цельные растения.(iii) regeneration of material selected in this way into morphologically normal fertile whole plants.
Трансформация может включать внесение полинуклеотида в материал с помощью любого известного метода, в частности, с помощью: (i) биолистической бомбардировки материала частицами, покрытыми полинуклеотидом; (ii) прокалывания материала волокнами из карбида кремния, покрытыми раствором, содержащим полинуклеотид; или (iii) внесения полинуклеотида или вектора в Agrobacterium и совместного культивирования трансформированной таким образом Agrobacterium с растительным материалом, который тем самым трансформируется, с последующим регенерированием. Методы трансформации, отбора и регенерации растений, которые могут потребовать рутинной модификации по отношению к конкретным видам растений, хорошо известны специалистам. Трансформированный таким образом растительный материал может быть отобран по его резистентности к глифосату.Transformation may include introducing a polynucleotide into the material using any known method, in particular using: (i) biolistic bombardment of the material with particles coated with a polynucleotide; (ii) piercing the material with silicon carbide fibers coated with a solution containing a polynucleotide; or (iii) introducing a polynucleotide or vector into Agrobacterium and co-culturing Agrobacterium thus transformed with plant material, which is thereby transformed, followed by regeneration. Methods of transformation, selection and regeneration of plants, which may require routine modification in relation to specific types of plants, are well known to specialists. Plant material thus transformed can be selected for its resistance to glyphosate.
Далее настоящее изобретение представляет использование заявляемого здесь полинуклеотида или вектора в получении растительных тканей и/или морфологически нормальных фертильных цельных растений, которые по существу устойчивы или по существу резистентны к глифосатному гербициду.Further, the present invention provides the use of a polynucleotide or vector as claimed herein in the production of plant tissues and / or morphologically normal fertile whole plants that are substantially resistant or substantially resistant to glyphosate herbicide.
Настоящее изобретение далее охватывает способ отбора биологического материала, трансформированного так, чтобы он экспрессировал интересующий ген, причем трансформированный материал несет полинуклеотид или вектор по настоящему изобретению и где данный отбор включает обработку трансформированного материала глифосатом или его солью с последующим отбором выживающего материала. Указанный материал может иметь растительное происхождение и может, в частности, происходить от однодольного растения, выбранного из группы, которая включает ячмень, пшеницу, кукурузу, рис, овес, рожь, сорго, ананас, сахарный тростник, банан, лук, спаржу и черемшу.The present invention further encompasses a method for selecting biological material transformed so that it expresses a gene of interest, the transformed material carrying a polynucleotide or vector of the present invention and wherein the selection includes processing the transformed material with glyphosate or its salt, followed by selection of the surviving material. The specified material may be of plant origin and may, in particular, come from a monocotyledonous plant selected from the group which includes barley, wheat, corn, rice, oats, rye, sorghum, pineapple, sugarcane, banana, onion, asparagus and wild garlic.
Кроме того, изобретение представляет способ регенерирования фертильного трансформированного растения, несущего чужеродную ДНК, включающий следующие стадии:In addition, the invention provides a method for regenerating a fertile transformed plant carrying foreign DNA, comprising the following steps:
(a) получение способной к регенерации ткани от указанного растения, которое предстоит трансформировать;(a) obtaining regenerative tissue from said plant to be transformed;
(b) трансформацию указанной регенерируемой ткани указанной чужеродной ДНК, где указанная чужеродная ДНК включает селективную последовательность ДНК, где указанная последовательность функционирует в регенерируемой ткани в качестве селективного агента;(b) transforming said regenerated tissue of said foreign DNA, wherein said foreign DNA comprises a selective DNA sequence, wherein said sequence functions in the regenerated tissue as a selective agent;
(c) по прошествии срока от одного дня до примерно 60 дней после стадии (b) помещение указанной регенерируемой ткани стадии (b) в среду, способную продуцировать побеги на указанной ткани, где указанная среда дополнительно содержит соединение, используемое для отбора регенерируемой ткани, несущей указанную селективную ДНК-последовательность, для обеспечения идентификации или отбора трансформированной регенерированной ткани;(c) after a period of one day to about 60 days after step (b) placing said regenerated tissue of step (b) in an environment capable of producing shoots on said tissue, wherein said medium further comprises a compound used to select regenerated tissue bearing the specified selective DNA sequence, to ensure the identification or selection of transformed regenerated tissue;
(d) после того, как на отобранной ткани (с) сформировался по крайней мере один побег, перенос указанного побега во вторую среду, способную образовывать корни на указанном побеге с получением проростка, где вторая среда необязательно содержит указанное соединение; и(d) after at least one shoot has formed on the selected tissue (c), transferring said shoot to a second medium capable of forming roots on said shoot to obtain a seedling, where the second medium optionally contains said compound; and
(e) выращивание указанного проростка в фертильное трансгенное растение, где чужеродная ДНК передается растениям-потомкам по менделевскому типу, характеризующееся тем, что чужеродная ДНК является или включающая селективную последовательность ДНК чужеродная ДНК включает полинуклеотид по настоящему изобретению, а указанное соединение является глифосатом или его солью. Растение может быть однодольным растением в соответствии с указанным выше: более предпочтительно выбранным из банана, пшеницы, риса, кукурузы и ячменя, а указанная регенерируемая ткань может включать эмбриогенные каллюсы, соматические зародыши, недоразвитые зародыши и т.п.(e) growing said seedling in a fertile transgenic plant, where the foreign DNA is transmitted to descendant plants of the Mendelian type, characterized in that the foreign DNA is or comprising a selective DNA sequence, the foreign DNA includes the polynucleotide of the present invention, and said compound is glyphosate or a salt thereof . The plant may be a monocotyledonous plant in accordance with the above: more preferably selected from banana, wheat, rice, corn and barley, and said regenerated tissue may include embryogenic calli, somatic embryos, underdeveloped embryos, and the like.
Далее настоящее изобретение дополнительно будет очевидно из нижеследующего описания, совместно с прилагающимися чертежами и списком последовательностей.Further, the present invention will be further apparent from the following description, in conjunction with the accompanying drawings and a list of sequences.
Список последовательностейSequence List
SEQ ID NO. 1-42 - праймеры для ПЦР.SEQ ID NO. 1-42 - primers for PCR.
SEQ ID NO. 43 - геномная последовательность EPSPS риса (от кодона ATG).SEQ ID NO. 43 - genomic sequence of EPSPS rice (from ATG codon).
SEQ ID NO. 44 - геномная последовательность EPSPS риса, содержащая двойную мутацию.SEQ ID NO. 44 is a genomic sequence of EPSPS rice containing a double mutation.
SEQ ID NO. 45 - энхансер FMV.SEQ ID NO. 45 - FMV enhancer.
SEQ ID NO. 46 - 1-й энхансер CaMV35S.SEQ ID NO. 46 - 1st enhancer CaMV35S.
SEQ ID NO. 47 - 2-й энхансер CaMV35S.SEQ ID NO. 47 - 2nd enhancer CaMV35S.
SEQ ID NO. 48 - энхансер полиубихитина кукурузы.SEQ ID NO. 48 - enhancer of corn polyubichitin.
SEQ ID NO. 49 - энхансер актина риса.SEQ ID NO. 49 - rice actin enhancer.
SEQ ID NO. 50 - энхансер GOS2 риса.SEQ ID NO. 50 - Rice GOS2 enhancer.
SEQ ID NO. 51 - энхансер пластоцианина ячменя.SEQ ID NO. 51 - enhancer of barley plastocyanin.
SEQ ID NO. 52 - промотор EPSPS риса G1 + 5’ “верхний” конец.SEQ ID NO. 52 - EPSPS promoter of rice G1 + 5 ’“ upper ”end.
SEQ ID NO. 53 - промотор EPSPS риса G3 + 5’ “верхний” конец.SEQ ID NO. 53 - EPS3 promoter of rice G3 + 5 ’“ upper ”end.
SEQ ID NO. 54 - промотор EPSPS риса G2 + интрон Adhl в составе 5’ “верхнего” конца.SEQ ID NO. 54 - EPSPS promoter of rice G2 + intron Adhl in the composition of the 5 ’“ upper ”end.
SEQ ID NO. 55 - интрон Adhl кукурузы.SEQ ID NO. 55 - Intron Adhl Corn.
Список чертежейDrawing list
Фиг.1 - схематическая геномная карта EPSPS риса.Figure 1 - schematic genomic map of EPSPS rice.
Фиг.2 - вектор pCR4-OSEPSPS (ген dmEPSPS риса в векторе pCR4-Blunt).Figure 2 - pCR4-OSEPSPS vector (rice dmEPSPS gene in pCR4-Blunt vector).
Фиг.3 - схематическое изображение стратегии, использованной для внесения двойной мутации.Figure 3 is a schematic representation of the strategy used to make a double mutation.
Фиг.4 - вектор pTCV1001.Figure 4 - vector pTCV1001.
Фиг.5 - вектор pTCV1001OSEPSPS (включает ген dmEPSPS риса в векторе pTCV1001).Figure 5 - vector pTCV1001OSEPSPS (includes the dmEPSPS gene of rice in the vector pTCV1001).
Фиг.6 - вектор pTCV1001EPSPSPAC (включает ген dmEPSPS риса в векторе pTCV1001).6 - vector pTCV1001EPSPSPAC (includes the dmEPSPS gene of rice in the vector pTCV1001).
Фиг.7 - вектор pBluSK + EPSPS (включает ген dmEPSPS риса в векторе pBluescript SK+).7 is the vector pBluSK + EPSPS (includes the dmEPSPS gene of rice in the pBluescript SK + vector).
Фиг.8 - вектор pPAC1.Fig - vector pPAC1.
Фиг.9 - вектор pTCVEPSPSPH.Figure 9 - vector pTCVEPSPSPH.
Фиг.10 - вектор pTCVEPSPSADH.Figure 10 - vector pTCVEPSPSADH.
Фиг.11 - вектор pBluSKEPSPSADH (включает ген dmEPSPS риса и интрон Adh1).11 - vector pBluSKEPSPSADH (includes dmEPSPS gene of rice and intron Adh1).
Фиг.12 - вектор pIGPD9.Fig - vector pIGPD9.
Фиг.13 - вектор Zen-9.13 is a Zen-9 vector.
Фиг.14 - вектор Zen-12.Fig - vector Zen-12.
Фиг.15 - вектор Zen-18.Fig - vector Zen-18.
Фиг.16 - внесение векторов Zen в супербифункциональные векторы.Fig - the introduction of vectors Zen in superfunctional vectors.
Получение растений, устойчивых к обработке глифосатом за счет сверхэкспрессии мутантного EPSPS под контролем негетерологичного промотораObtaining plants resistant to glyphosate processing due to overexpression of mutant EPSPS under the control of a non-heterologous promoter
Термин “энхансер” в соответствии с использованием его в данной заявке обозначает те последовательности, расположенные выше промотора, которые сами не включают промотор, но действие которых проявляется в усилении или регуляции инициации транскрипции с промотора. Термин “делеция промотора EPSPS” по использованию в данной заявке относится к промотору EPSPS наряду с нуклеотидами, отделяющими его от энхансера, являющегося нативным для гена EPSPS, - т.е. нуклеотидами, расположенными выше (т.е. с 5’-конца) данного промотора.The term “enhancer” in accordance with its use in this application refers to those sequences located above the promoter that themselves do not include the promoter, but whose effect is manifested in enhancing or regulating the initiation of transcription from the promoter. The term “deletion of the EPSPS promoter” as used in this application refers to the EPSPS promoter along with the nucleotides that separate it from the enhancer that is native to the EPSPS gene, i.e. nucleotides located upstream (i.e., from the 5’ end) of this promoter.
В отношении трансформации растительного материала для специалиста в данной области техники должно быть понятно, что, хотя конкретные типы материала-мишени (например, суспензионная культура зародышевых клеток или дедифференцированные недоразвитые зародыши) и конкретные способы трансформации (например, с использованием Agrobacterium или бомбардировки частицами) описаны далее в примерах, при этом настоящее изобретение не ограничено данными конкретными вариантами, и указанные материалы-мишени и способы можно использовать в разных сочетаниях. Более того, термин “растительные клетки” по использованию в данном описании может относиться к выделенным клеткам, включая суспензионные культуры, а также к клеткам в интактной или частично интактной ткани, такой как зародыш, щиток, микроспора, производный от микроспоры зародыш или соматические клетки растительных органов. Сходным образом, хотя конкретные примеры ограничиваются кукурузой, пшеницей и рисом, настоящее изобретение в равной степени применимо к любому из широкого круга сельскохозяйственных культур и домашних растений, которые могут быть трансформированы с помощью подходящих методов трансформации растительных клеток.With regard to the transformation of plant material, it will be understood by those skilled in the art that although specific types of target material (e.g., germ cell suspension culture or de-differentiated underdeveloped nuclei) and specific transformation methods (e.g., using Agrobacterium or particle bombardment) are described further in the examples, the present invention is not limited to these specific options, and these target materials and methods can be used in various combinations. Moreover, the term “plant cells” as used herein may refer to isolated cells, including suspension cultures, as well as cells in an intact or partially intact tissue, such as an embryo, scab, microspore, microspore-derived germ or somatic plant cells organs. Similarly, although specific examples are limited to corn, wheat and rice, the present invention is equally applicable to any of a wide variety of crops and domestic plants that can be transformed using suitable plant cell transformation methods.
Базовые молекулярно-биологические методы осуществляют, как описано Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Edn. Cold Spring Harbor Lab. Press.Basic molecular biological methods are carried out as described by Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Edn. Cold Spring Harbor Lab. Press
Пример 1Example 1
Формирование кДНК-зонда для EPSPS рисаThe formation of cDNA probe for EPSPS rice
Неполную кДНК, кодирующую EPSPS риса, получают с использованием ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Общую РНК выделяют из двухнедельных растений риса (Oryza sakiva L. indica, сорт Koshihikari) с использованием метода TRI-ZOL™ (Life Technologies). Синтез первой цепи кДНК осуществляют с использованием обратной транскриптазы Superscript II (Life Technologies) с 200 нг вырожденного обратного праймера 10 для EPSPS (SEQ ID NO. 1) и 2 мкг общей РНК в соответствии с прилагаемым протоколом. Синтез второй цепи и амплификацию кДНК с помощью ПЦР проводят с использованием вырожденных праймеров 10 и 4 для EPSPS (SEQ ID NO. 1 и SEQ ID NO. 2) и ПЦР-шариков (Pharmacia) в соответствии с инструкциями изготовителя. Все буквенные коды соответствуют стандартным аббревиатурам (Eur. J. Biochem. (1985) 150:15).Incomplete cDNA encoding rice EPSPS is obtained using reverse transcriptase PCR (RT-PCR). Total RNA was isolated from two-week-old rice plants (Oryza sakiva L. indica, cultivar Koshihikari) using the TRI-ZOL ™ method (Life Technologies). The first cDNA strand was synthesized using Superscript II reverse transcriptase (Life Technologies) with 200 ng of degenerate
SEQ ID NO. 1SEQ ID NO. 1
Вырожденный обратный праймер 10 для EPSPS10 degenerate reverse primer for EPSPS
Вырожденный прямой праймер 4 для EPSPS
SEQ ID NO. 2SEQ ID NO. 2
Полученные продукты клонируют в состав вектора pCR2.1 (Invitrogen) с использованием набора ТА Cloning kit™ в соответствии с рекомендациями поставщика. Плазмиду выделяют из отобранных колоний и последовательность анализируют с помощью способа, включающего компьютерный анализ гомологии (BLAST), для подтверждения того, что продукт ОТ-ПЦР проявляет высокий уровень гомологии с известными последовательностями EPSPS растений.The resulting products are cloned into the pCR2.1 vector (Invitrogen) using the TA Cloning kit ™ in accordance with the supplier's recommendations. The plasmid is isolated from the selected colonies and the sequence is analyzed using a method including computerized homology analysis (BLAST) to confirm that the RT-PCR product exhibits a high level of homology with known EPSPS plant sequences.
Пример 2Example 2
Выделение геномной последовательности EPSPS риса и клонирование гена EPSPS рисаIsolation of the genomic sequence of EPSPS rice and cloning of the EPSPS gene rice
Участок геномной ДНК, включающий полноразмерный ген EPSPS риса и 5’-верхний конец, выделяют из геномной библиотеки λ -EMBLSP6/T7, сконструированной на материале 5-дневных этиолированных побегов риса [Оrуzа sativa L. indica, сорт IR36) (Clontech). 1× 106 бляшкообразующих единиц (БОЕ) подвергают скринингу с использованием 32Р-меченого кДНК-зонда EPSPS риса (пример 1) с использованием протоколов, предоставляемых изготовителем. Позитивные бляшки подвергают последующим раундам гибридизационного скрининга до тех пор, как будет достигнута чистота на уровне перекрестно-гибридизующей бляшки. ДНК фага λ получают на материале маточного штамма фага в соответствии с методом, описанным у Sambrook et al., 1989. Полученную ДНК анализируют с помощью рестриктазного расщепления и Саузерн-блоттинга с использованием той же самой 32Р-меченой кДНК EPSPS риса в качестве зонда. У рестрикционных фрагментов, которые перекрестно гибридизуют, затупляют концы с использованием такого метода, как Perfectly Blunt™ (Novagen), и их клонируют в состав подходящего вектора, такого как pSTBlue (Novagen). Затем ДНК секвенируют с использованием автоматического ДНК-секвенатора ABI 377A PRISM. На фиг.1 схематически показан ген EPSPS риса с рядом отмеченных рестрикционных сайтов.A portion of genomic DNA, including the full-size rice EPSPS gene and the 5'-upper end, is isolated from the λ -EMBLSP6 / T7 genomic library constructed from 5-day-old etiolated rice shoots [Oruza sativa L. indica, grade IR36) (Clontech). 1 × 10 6 plaque-forming units (PFU) were screened using a 32 P-labeled rice EPSPS cDNA probe (Example 1) using protocols provided by the manufacturer. Positive plaques are subjected to subsequent rounds of hybridization screening until purity at the level of cross-hybridizing plaque is achieved. Phage λ DNA was obtained on the material of the mother phage strain in accordance with the method described by Sambrook et al., 1989. The obtained DNA was analyzed by restriction enzyme digestion and Southern blotting using the same 32 RPS-labeled EPSPS rice cDNA as a probe. The restriction fragments that cross hybridize are blunted using a method such as Perfectly Blunt ™ (Novagen), and they are cloned into a suitable vector such as pSTBlue (Novagen). DNA is then sequenced using an ABI 377A PRISM automated DNA sequencer. Figure 1 schematically shows the EPSPS gene of rice with a number of marked restriction sites.
Фрагмент гена EPSPS риса длиной 3,86 тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.), включающий кодирующий сегмент, промотор EPSPS, часть 5’-верхнего конца и терминатор, получают с помощью ПЦР. Олигонуклеотидный праймер OSGRA1 (SEQ ID NO. 3) используют в сочетании с праймером OSEPSPS3 (SEQ ID NO. 4) для амплификации желаемого сегмента. OSEPSPS3 включает дополнительные рестрикционные сайты рестриктаз SacI и SmaI, предназначенные для облегчения субклонирования гена в ходе последующих стадий конструирования вектора. Расположение указанных праймеров схематически показано на фиг.1.A fragment of the EPSPS gene of rice with a length of 3.86 thousand nucleotide pairs (kb), including a coding segment, an EPSPS promoter, a 5 ′ upper end portion and a terminator, is obtained by PCR. The oligonucleotide primer OSGRA1 (SEQ ID NO. 3) is used in combination with the primer OSEPSPS3 (SEQ ID NO. 4) to amplify the desired segment. OSEPSPS3 includes additional restriction restriction sites SacI and SmaI, designed to facilitate subcloning of the gene during the subsequent stages of vector construction. The location of these primers is shown schematically in figure 1.
Высокоточную полимеразу Pfu Turbo™ (Stratagene) используют для осуществления реакции ПЦР с ДНК, полученной из λ -препарата (описано выше), в качестве амплификационной матрицы. ПЦР-продукт ожидаемого размера клонируют в состав pCRBlunt 4-TOPO™ (Invitrogen) и секвенируют для проверки целостности.High-precision Pfu Turbo ™ polymerase (Stratagene) is used to carry out a PCR reaction with DNA obtained from a λ preparation (described above) as an amplification matrix. The expected size PCR product is cloned into pCRBlunt 4-TOPO ™ (Invitrogen) and sequenced to verify integrity.
Пример 3Example 3
Мутация Т→ 1 и Р→ S в EPSPS рисаMutation T → 1 and P → S in EPSPS Rice
Мутацию Т→ 1 и Р→ S получают путем внесения двух точковых мутаций. Указанные мутации вносят в геномный ген EPSPS риса с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, включающих желательную мутацию. Схематическая диаграмма, указывающая на сайты отжига использованных праймеров, показана на фиг.3. Осуществляют две раздельные реакции ПЦР (обе с использованием ДНК λ -фага в качестве матрицы).The mutation T → 1 and P → S are obtained by introducing two point mutations. These mutations are introduced into the rice EPSPS genomic gene by PCR using oligonucleotide primers including the desired mutation. A schematic diagram indicating the annealing sites of the used primers is shown in FIG. 3. Two separate PCR reactions are carried out (both using λ-phage DNA as a template).
Полученные в результате ПЦР-продукты объединяют с использованием эквимолярных концентраций каждого ПЦР-продукта, служащего матрицей, с двумя олигонуклеотидами SalIEnd и EcoRVEnd в новой реакции ПЦР. Аликвоту продукта реакции анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле и клонируют в состав pCR-Blunt II™ (Invitrogen). Плазмидную ДНК выделяют и секвенируют с целью выявления успешного внесения двойной мутации.The resulting PCR products are combined using equimolar concentrations of each matrix PCR product with two SalIEnd and EcoRVEnd oligonucleotides in a new PCR reaction. An aliquot of the reaction product was analyzed by agarose gel electrophoresis and cloned into pCR-Blunt II ™ (Invitrogen). Plasmid DNA is isolated and sequenced in order to detect the successful introduction of a double mutation.
ДНК-фрагмент, включающий двойную мутацию, вносят в геномный клон EPSPS риса (фиг.1) следующим образом. Клон, включающий двойную мутацию, расщепляют рестриктазами EcoRV и SalI. Плазмиду, включающую ДНК EPSPS риса, являющуюся ПЦР-продуктом, сходным образом расщепляют, и EсоRV/SаlI-фрагмент, включающий двойную мутацию, лигируют в ген EPSPS риса в составе pCR4Blunt-TOPO™ с использованием стандартных методов клонирования, описанных у Sarnbrook et al., 1989, и трансформируют в компетентные клетки Е.coli. Плазмиду выделяют из полученных в результате колоний и секвенируют с целью подтверждения присутствия двойной мутации при отсутствии других изменений. Данная плазмида, обозначенная pCR4-OSEPSPS, показана на фиг.2.The DNA fragment, including the double mutation, contribute to the genomic clone of EPSPS rice (figure 1) as follows. The double mutation clone was digested with restriction enzymes EcoRV and SalI. The plasmid comprising the EPSPS rice DNA, which is a PCR product, is similarly digested, and the EcoRV / SalI fragment comprising the double mutation is ligated into the rice EPSPS gene in pCR4Blunt-TOPO ™ using standard cloning methods described by Sarnbrook et al. , 1989, and transformed into competent E. coli cells. The plasmid is isolated from the resulting colonies and sequenced to confirm the presence of a double mutation in the absence of other changes. This plasmid, designated pCR4-OSEPSPS, is shown in FIG. 2.
Геномный ген EPSPS риса, включающий двойную мутацию (фиг.2), вырезают из плазмиды pCR4-Blunt-TOPO™ с использованием рестриктаз PstI и NotI и лигируют в состав pTCV1001 (фиг.4) с получением pTCV1001OSEPSPS (фиг.5), которую трансформируют в Е. coli с целью амплификации. Далее рестрикционный РасI/EсоRV-фрагмент вырезают из ДНК фага λ , (фиг.1) и встраивают в pTCV1001OSEPSPS (фиг.5) с получением pTCV1001EPSPSPAC (фиг.6). Ген EPSPS риса, теперь включающий последовательность от РасI до SacI (фиг.6), вырезают из pTCV1001EPSPSPAC (фиг.6) в виде ЕаgI/SacI-фрагмента и лигируют в сходным образом расщепленную плазмиду pBluescript SK+ с получением pBluSK + EPSPS (фиг.7). Далее расположенные выше сегменты EPSPS риса и желательные энхансеры собирают (в соответствии с описанным ниже) и лигируют в вектор pBluescript SK+ с использованием рестриктаз XbaI/PacI.The rice EPSPS genomic gene comprising a double mutation (FIG. 2) was excised from the pCR4-Blunt-TOPO ™ plasmid using PstI and NotI restriction enzymes and ligated into pTCV1001 (FIG. 4) to obtain pTCV1001OSEPSPS (FIG. 5), which was transformed in E. coli for the purpose of amplification. Next, the restriction RacI / EcoRV fragment is excised from the DNA of phage λ (Fig. 1) and inserted into pTCV1001OSEPSPS (Fig. 5) to obtain pTCV1001EPSPSPAC (Fig. 6). The EPSPS rice gene, now including the sequence from RacI to SacI (FIG. 6), was excised from pTCV1001EPSPSPAC (FIG. 6) as an EagI / SacI fragment and ligated into a similarly digested plasmid pBluescript SK + to obtain pBluSK + EPSPS (FIG. 7) ) Next, the above EPSPS rice segments and desired enhancers are harvested (as described below) and ligated into the pBluescript SK + vector using XbaI / PacI restriction enzymes.
Пример 4Example 4
Формирование химер отдельных энхансеров и промотора EPSPS рисаFormation of Chimeras of Individual Enhancers and EPSPS Rice Promoter
На фиг.1 показаны сайты связывания праймеров G1 и G2, использованных для получения серии делеций с 5’-конца гена EPSPS риса. Праймеры G1 и G2 используют в сочетании с праймером RQCR10, используя λ -ДНК-матрицу EPSPS риса и полимеразу Pfu Turbo™ (Stratagene) в соответствии с протоколами, предоставляемыми изготовителем.Figure 1 shows the binding sites of primers G1 and G2 used to obtain a series of deletions from the 5 ′ end of the rice EPSPS gene. Primers G1 and G2 are used in conjunction with primer RQCR10 using the λ-DNA EPSPS matrix of rice and Pfu Turbo ™ polymerase (Stratagene) according to the protocols provided by the manufacturer.
Полученные продукты анализируют методом электрофореза в агарозном геле и клонируют в состав вектора pCR-Blunt II-ТОРО™ (Invitrogen). Последовательность полученных в результате продуктов определяют для того, чтобы убедиться в отсутствии изменений последовательности геномного клона EPSPS риса. Клоны для дальнейшего анализа выбирают на основе их ориентации в составе вектора, определяемой по тому, удаляет или нет расщепление рестриктазой XhoI только полилинкерную последовательность, а не полную вставку из вектора.The resulting products were analyzed by agarose gel electrophoresis and cloned into the pCR-Blunt II-TOPO ™ vector (Invitrogen). The sequence of the resulting products is determined in order to ensure that there is no change in the sequence of the genomic clone of EPSPS rice. Clones for further analysis are selected based on their orientation in the vector, determined by whether or not cleavage with the restriction enzyme XhoI removes only the polylinker sequence, and not the complete insert from the vector.
Последовательности генов CaMV35S и FMV35S и связанных с ними 5’-верхних концов опубликованы в базе данных EMBL (например, депозитарные №№ v00141 и х06166). Праймеры конструируют таким образом, чтобы амплифицировать только расположенные выше энхансерные сегменты указанных генов. Энхансер-1 CaMV35S (SEQ ID NO. 36) получают таким образом с помощью ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO. 12 и SEQ ID NO. 13 в сочетании с полимеразой Pfu Turbo™ и ДНК pMJB1 (А59870) в качестве матрицы. Альтернативно, отличающийся участок энхансера CaMV35S получают с использованием сходных методов (SEQ ID NO. 37). Энхансер FMV35S синтезируют химическим путем (SEQ ID NO. 35).The sequences of the CaMV35S and FMV35S genes and their associated 5’s upper ends are published in the EMBL database (for example, depository nos. V00141 and x06166). The primers are designed to amplify only the upstream enhancer segments of these genes. Enhancer-1 CaMV35S (SEQ ID NO. 36) is thus obtained by PCR using primers SEQ ID NO. 12 and SEQ ID NO. 13 in combination with Pfu Turbo ™ polymerase and pMJB1 DNA (A59870) as a template. Alternatively, a different CaMV35S enhancer region is obtained using similar methods (SEQ ID NO. 37). The FMV35S enhancer is synthesized chemically (SEQ ID NO. 35).
Используют следующие олигонуклеотидные праймеры.The following oligonucleotide primers are used.
Последовательность амплифицированных и клонированных молекул подтверждают после клонирования в состав вектора pCR Blunt-II-TOPO (Invitrogen). Вектор pCR Blunt-II-TOPO, включающий делецию 5’UTR EPSPS, расщепляют рестриктазами XbaI /XhoI. Энхансер удаляют из соответствующего ему вектора pCR Blunt-II-TOPO также с использованием расщепления XbaI/XhoI и лигируют в первые векторы, включающие промоторные делеции EPSPS, сформированные с помощью ПЦР.The sequence of amplified and cloned molecules is confirmed after cloning into the pCR Blunt-II-TOPO vector (Invitrogen). The pCR Blunt-II-TOPO vector, including a 5’UTR EPSPS deletion, was digested with restriction enzymes XbaI / XhoI. The enhancer is removed from the corresponding pnt Blunt-II-TOPO vector also using XbaI / XhoI cleavage and are ligated into the first vectors including EPSPS promoter deletions generated by PCR.
Пример 5Example 5
Формирование химер двойных энхансеров с промотором EPSPS рисаThe formation of chimeras of double enhancers with the EPSPS promoter of rice
С целью дальнейшего усиления экспрессии с промотора EPSPS риса дополнительный энхансер может быть использован в сочетании с любым из энхансеров 35S или FMV. В одном примере стратегии клонирования с целью достижения указанного изначально формируют химеры энхансер/EPSPS (аналогично примеру 4), включающие единственный (первый) энхансер. Такие первые энхансеры выбирают из верхних 5’-концов от промоторов генов GOS2 риса, актина-1 риса, полиубихитина кукурузы, CaMV 35S, FMV 35S и пластоцианина ячменя. Нуклеотидные последовательности указанных сегментов опубликованы в базе данных EMBL (депозитарные №№ х51910, х15865, u29159, v00141, х06166 и z28347, соответственно). Праймеры конструируют таким образом, чтобы амплифицировать только желательные сегменты транскрипционных энхансеров из 5’-концов этих генов (SEQ ID NO. 15-22).In order to further enhance expression from the EPSPS promoter of rice, an additional enhancer can be used in combination with any of the 35S or FMV enhancers. In one example of a cloning strategy, in order to achieve this, an enhancer / EPSPS chimera is initially formed (as in Example 4), including a single (first) enhancer. These first enhancers are selected from the top 5’s from the promoters of the GOS2 genes of rice, actin-1 rice, maize polyubichitin, CaMV 35S, FMV 35S and barley plastocyanin. The nucleotide sequences of these segments are published in the EMBL database (depository Nos. X51910, x15865, u29159, v00141, x06166 and z28347, respectively). The primers are designed to amplify only the desired transcriptional enhancer segments from the 5 ′ ends of these genes (SEQ ID NO. 15-22).
ДНК выделяют из растений (кукуруза, ячмень или рис), выращенных в теплице, с использованием протокола DNAeasy (Qiagen), и используют ее в качестве исходной матрицы для ПЦР-амплификации. Продукты ПЦР клонируют в состав pCR-Blunt-II-ТОРО и секвенируют с целью подтверждения аутентичности. Химеру энхансер/EPSPS получают, как описано в примере 4 (используя обмен по XbaI/XhoI-сайтам), за исключением случая с геном актина-1 риса, когда энхансер встраивают в виде XbaI/PstI-фрагмента (XhoI-сайт заменен PsfI-сайтом из-за присутствия XhoI-сайта в энхансере актина риса), и с геном полиубихитина кукурузы, когда энхансер встраивают в виде SреI/ХhоI-фрагмента (XbaI-сайт заменен SpeI-сайтом из-за присутствия XbaI-сайта в энхансере полиубихитина кукурузы). Следует отметить, что в связи с энхансерным сегментом полиубихитина кукурузы используют внутренний XhoI-сайт. Второй энхансер, который может быть либо энхансером CaMV35S, либо энхансером FMV, амплифицируют с использованием праймеров 35SXho и 35S3 (SEQ ID NO. 23 и SEQ ID NO. 13) (35S) или праймеров FMVXho и FMV3 (SEQ ID NO. 25 и SEQ ID NO. 26), соответственно. Указанные праймеры облегчают внесение XhoI-сайта (или PstI-сайта) по 5’- и 3’-концам энхансера. Альтернативно, PacI-сайт вносят по 3’-концу вместо XhoI-сайта с использованием праймеров 35SPac (SEQ ID NO. 24) или FMVPAC3 (SEQ ID NО. 27).DNA is isolated from plants (corn, barley or rice) grown in a greenhouse using the DNAeasy protocol (Qiagen), and used as the starting template for PCR amplification. PCR products are cloned into pCR-Blunt-II-TOPO and sequenced to verify authenticity. The chimera enhancer / EPSPS is prepared as described in Example 4 (using exchange on XbaI / XhoI sites), except in the case of the rice actin-1 gene, when the enhancer is inserted as an XbaI / PstI fragment (the XhoI site is replaced by the PsfI site due to the presence of the XhoI site in the rice actin enhancer), and with the maize polyubichitin gene when the enhancer is inserted as a SpI / XhoI fragment (the XbaI site has been replaced by the SpeI site due to the presence of the XbaI site in the maize polyubichitin enhancer). It should be noted that in connection with the enhancer segment of maize polyubichitin, an internal XhoI site is used. The second enhancer, which can be either a CaMV35S enhancer or an FMV enhancer, is amplified using 35SXho and 35S3 primers (SEQ ID NO. 23 and SEQ ID NO. 13) (35S) or FMVXho and FMV3 primers (SEQ ID NO. 25 and SEQ ID NO. 25 and SEQ ID NO. 26), respectively. These primers facilitate the insertion of an XhoI site (or PstI site) at the 5 ′ and 3 ′ ends of the enhancer. Alternatively, the PacI site is inserted at the 3 ′ end instead of the XhoI site using 35SPac primers (SEQ ID NO. 24) or FMVPAC3 (SEQ ID NO. 27).
Будучи секвенированным, ПЦР-продукт в виде фрагмента XhoI:XhoI, PstI/PacI (когда первым энхансером является энхансер актина риса) или XhoI/PacI вносят в состав конструкции, которая включает химеру первого энхансера и гена EPSPS, либо по XhoI-сайту, либо между XhoI- и PacI-сайтами или между PstI- и PacI-сайтами, исходя из необходимости. Внесение по XhoI-сайту используют для конструирования химер с двумя энхансерами, включающими промоторные делеции EPSPS либо G1, либо G2. Как ХhоI/РасI-, так и PstI/PacI-фрагменты используют для конструирования химер с двумя энхансерами, включающими промоторную делецию EPSPS G3. Когда второй энхансер вносят в виде XhoI-фрагмента, ориентацию энхансера определяют с помощью ПЦР.When sequenced, a PCR product in the form of an XhoI fragment: XhoI, PstI / PacI (when the rice actin enhancer is the first enhancer) or XhoI / PacI is introduced into the construct, which includes the chimera of the first enhancer and EPSPS gene, either at the XhoI site, or between XhoI and PacI sites or between PstI and PacI sites, as necessary. XhoI site insertion is used to construct chimeras with two enhancers including EPSPS promoter deletions of either G1 or G2. Both the XhoI / PacI and PstI / PacI fragments are used to construct chimeras with two enhancers, including the EPSPS G3 promoter deletion. When the second enhancer is introduced as an XhoI fragment, the orientation of the enhancer is determined by PCR.
Пример 6Example 6
Внесение интрона Adhl в 5’-UTR гена EPSPS рисаAdhl Intron Insertion in Rice EPSPS Gene 5’-UTR
Внесение 1-го интрона из гена Adh1 кукурузы в состав желательного делеционного промотора EPSPS риса (например, сформированного в соответствии с описанным в примере 4) осуществляют перед формированием химерной конструкции с желательным(ми) энхансером(ами). В данном конкретном примере интрон Adh1 вносят в делеционный промотор EPSPS G2. Для специалиста будет очевидно, что аналогичная методология может быть приспособлена для внесения интрона Adh1 в другие промоторы EPSPS с делециями. Интрон Adh1 кукурузы встраивают в состав конструкций с помощью ПЦР. Интрон Adh1 амплифицируют из подходящего источника, такого как геномная ДНК кукурузы или вектор, такой как рРАС1 (фиг.8), с использованием праймеров Adh5 (SEQ ID NO. 28) и Adh3 (SEQ ID NO. 29):The introduction of the 1st intron from the Adh1 gene of maize into the composition of the desired rice EPSPS deletion promoter (for example, formed as described in Example 4) is carried out before the formation of the chimeric construct with the desired enhancer (s). In this specific example, the Adh1 intron is introduced into the EPSPS G2 deletion promoter. It will be apparent to one skilled in the art that a similar methodology can be adapted to introduce the Adh1 intron into other EPSPS promoters with deletions. Intron Adh1 maize embedded in the structure using PCR. The intron Adh1 is amplified from a suitable source, such as corn genomic DNA or a vector, such as pAC1 (Fig. 8), using primers Adh5 (SEQ ID NO. 28) and Adh3 (SEQ ID NO. 29):
Полученный в результате ПЦР-продукт денатурируют и используют в качестве праймера в сочетании с праймером Adh5Рас (SEQ ID NO. 30) для амплификации желательного продукта с использованием вектора pTCV1001EPSPSPAC (фиг.6) в качестве матрицы.The resulting PCR product is denatured and used as a primer in combination with an Adh5Pac primer (SEQ ID NO. 30) to amplify the desired product using the vector pTCV1001EPSPSPAC (FIG. 6) as a template.
Полученный ПЦР-продукт клонируют в состав pCR-Blunt-II (Invitrogen). PacI/HindIII-фрагмент вырезают из геномного клона риса (фиг.1) и встраивают в pTCV1001 с получением pTCVEPSPSPH (фиг.9). Далее PacI/NcoI-продукт, полученный выше с помощью ПЦР и включающий интрон Adh1, встраивают в состав pTCVEPSPS, как показано схематически (фиг.9). PacI/EcoRV-фрагмент, присутствующий в клонированном гене EPSPS, включающем двойную мутацию (фиг.10), вырезают и заменяют РасI/EсоRV-фрагментом из pTCVEPSPSPH, который включает последовательность интрона Adh1 (фиг.9). Наконец, полный ген EPSPS, который включает последовательность Adh1, вырезают из pTCVEPSPSADH (фиг.10) в виде EаgI/SасI-фрагмента и клонируют в вектор pBluescript SK+ с получением pBluSKEPSPSADH (фиг.11).The resulting PCR product is cloned into pCR-Blunt-II (Invitrogen). The PacI / HindIII fragment was excised from the genomic rice clone (FIG. 1) and inserted into pTCV1001 to obtain pTCVEPSPSPH (FIG. 9). Next, the PacI / NcoI product obtained above by PCR and incorporating the Adh1 intron is integrated into pTCVEPSPS, as shown schematically (Fig. 9). The PacI / EcoRV fragment present in the cloned EPSPS gene including the double mutation (FIG. 10) is excised and replaced with the PacI / EcoRV fragment from pTCVEPSPSPH, which includes the Adh1 intron sequence (FIG. 9). Finally, the complete EPSPS gene, which includes the Adh1 sequence, is excised from pTCVEPSPSADH (FIG. 10) as an EagI / CacI fragment and cloned into the pBluescript SK + vector to obtain pBluSKEPSPSADH (FIG. 11).
Пример 7Example 7
Внесение оптимизованной консенсусной последовательностью pre-ATG (по Козаку) с помощью направленного мутагенеза в конструкции, включающие интрон Adh1 кукурузыThe introduction of an optimized consensus sequence of pre-ATG (according to Kozak) using directed mutagenesis in constructs that include the maize Adh1 intron
Необязательно метод направленного (сайт-специфичного) мутагенеза осуществляют в отношении конструкций, включающих интрон Adh1, с использованием набора для мутагенеза QuickChange Site Directed Mutagenesis kit (Stratagene). Указанное проводят в отношении PacI/SacI-фрагмента EPSPS из pBluescript SK+ (фиг.11) перед лигированием на химеры энхансер/промотор EPSPS. Нижеследующие олигонуклеотиды используют в соответствии с протоколами изготовителя для оптимизации последовательности по Козаку.Optionally, a directed (site-specific) mutagenesis method is carried out for constructs including an Adh1 intron using the QuickChange Site Directed Mutagenesis kit (Stratagene) mutagenesis kit. The above is carried out in relation to the PacI / SacI fragment of EPSPS from pBluescript SK + (Fig. 11) before ligation onto the EPSPS enhancer / promoter. The following oligonucleotides are used in accordance with the manufacturer's protocols to optimize Kozak sequence.
Клоны изучали с помощью рестрикционного анализа с использованием рестриктазы KpnI на материале выделенной плазмиды. Точно измененная ДНК характеризуется дополнительным рестрикционным KpnI-сайтом по сравнению с неизмененной ДНК. Затем последовательность подтверждают с помощью автоматического секвенирования ДНК. Измененная последовательность ДНК может быть перенесена в исходные конструкции с использованием уникальных рестрикционных сайтов для рестриктаз SphI или РасI на 5’-конце и AvrII или EcoRV на 3’-конце в зависимости от того, что подходит для каждого вектора.Clones were studied using restriction analysis using the restriction enzyme KpnI on the material of the selected plasmid. Precisely altered DNA is characterized by an additional restriction KpnI site compared to unmodified DNA. The sequence is then confirmed by automatic DNA sequencing. The altered DNA sequence can be transferred to the original constructs using unique restriction sites for restriction enzymes SphI or PacI at the 5'-end and AvrII or EcoRV at the 3'-end, depending on which is suitable for each vector.
Пример 8Example 8
Завершение экспрессионных кассет EPSPS, которые включают в направлении 5’→ 3’: энхансерный(ые) сегмент(ы), верхний участок промотора EPSPS риса, промотор EPSPS, 5’-UTR EPSPS + (необязательно) 1-й интрон Adh1 кукурузы, кодирующий участок пластидного сигнального пептида EPSPS риса, кодирующий участок зрелой EPSPS риса и терминаторный сегмент гена EPSPS рисаCompletion of EPSPS expression cassettes that include in the 5 ′ → 3 ′ direction: enhancer segment (s), upper portion of the EPSPS rice promoter, EPSPS promoter, 5'-UTR EPSPS + (optional) 1st maize Adh1 intron encoding a plot of rice EPSPS plastid signal peptide encoding a plot of mature EPSPS rice and a terminator segment of rice EPSPS gene
Химеры промотора EPSPS риса с одним или двумя энхансерами (примеры 4 и 5), входящие в состав векторов pCR-Blunt-II-TOPO, вырезают с использованием рестриктаз XbaI и РасI и встраивают в аналогичным образом расщепленный клон pBluescript SK+, включающий остальную часть последовательности EPSPS риса (фиг.7-11). Однако, если должна быть использована химера EPSPS с энхансером полиубихитина кукурузы, то ее сначала клонируют в pBluescript с использованием SpeI/PacI. Затем остальную часть последовательности EPSPS риса встраивают в качестве PacI/SacI-фрагмента с завершением экспрессионной кассеты. Данный заключительный этап клонирования приводит к получению требуемых генных конструкций. Примеры конструкций, получаемых с использованием указанных выше стратегий, приведены в таблице 1. Их схематические карты показаны на фиг.13-15.The chimeras of the EPSPS promoter of rice with one or two enhancers (examples 4 and 5), which are part of the pCR-Blunt-II-TOPO vectors, are cut using restriction enzymes XbaI and PacI and built into a similarly split clone pBluescript SK +, including the rest of the EPSPS sequence rice (Figs. 7-11). However, if an EPSPS chimera with a maize polyubichitin enhancer is to be used, then it is first cloned into pBluescript using SpeI / PacI. The rest of the rice EPSPS sequence is then inserted as a PacI / SacI fragment to complete the expression cassette. This final cloning step results in the desired gene constructs. Examples of structures obtained using the above strategies are shown in table 1. Their schematic maps are shown in Fig.13-15.
Пример 9Example 9
Субклонирование экспрессионных кассет EPSPS из Bluescript в состав pIGPD9Subcloning Bluescript EPSPS Expression Cassettes into pIGPD9
Если желательно и особенно в случае трансформации растений с помощью методов прямого переноса ДНК (с вискерами, бомбардировка и протопласты), экспрессионные конструкции EPSPS вырезают из pBluescript с использованием рестриктазы XmaI и клонируют в pIGPD9 (фиг.12). Использование для трансформации данного вектора исключает перенос в растение генов резистентности к антибиотикам, потому что отбор осуществляется по комплементации ауксотрофного мутанта his-B E.coli геном, экспрессирующим IGPD (продукт his-B). Производные от pIGPD9 плазмиды, образованные в результате встраивания XmaI-фрагментов из pZEN9, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 23, 24 и 25, обозначают как pZEN9i, pZEN11i, pZEN12i... и т.п.If desired and especially in the case of plant transformation using direct DNA transfer methods (with whiskers, bombardment and protoplasts), EPSPS expression constructs are excised from pBluescript using XmaI restrictase and cloned into pIGPD9 (FIG. 12). The use of this vector for transformation excludes the transfer of antibiotic resistance genes to the plant, because the selection is carried out by complementing the auxotrophic mutant his-B E. coli with a gene expressing IGPD (his-B product). The plasmids derived from pIGPD9 formed by the insertion of XmaI fragments from pZEN9, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 23, 24 and 25 are designated as pZEN9i, pZEN11i, pZEN12i ... and the like.
Препараты ДНК большого объема для использования в трансформации растений получают с использованием процедуры Maxi-prep (Qiagen) с использованием прописей, представляемых производителем.Large-volume DNA preparations for use in plant transformation are obtained using the Maxi-prep procedure (Qiagen) using prescriptions provided by the manufacturer.
Пример 10Example 10
Получение ДНК для трансформации растенийObtaining DNA for plant transformation
Приведенная выше процедура описывает сборку “экспрессионных кассет EPSPS”, включающих в направлении 5’→ 3’: последовательность(ти) энхансера, промотор EPSPS риса, участок кодирования сигнального пептида EPSPS риса, участок, кодирующий зрелый фермент EPSPS риса, который резистентен к глифосату за счет наличия замен Т на I и Р на S по конкретным положениям, а также терминатор гена EPSPS риса.The above procedure describes the assembly of “EPSPS expression cassettes”, including in the 5 ′ → 3 ′ direction: enhancer sequence (s), rice EPSPS promoter, rice EPSPS signal peptide encoding region, region encoding a mature rice EPSPS enzyme that is glyphosate resistant due to the presence of substitutions of T by I and P by S for specific provisions, as well as the terminator of the EPSPS gene of rice.
Необязательно желательные кассеты также дополнительно включают маркерный ген селективной резистентности к лекарственным средствам (например, резистентность к ампициллину, резистентность к канамицину и т.п.), левый или правый граничные сайты Т-ДНК и (необязательно) участок прикрепления к ядерному матриксу, присоединенный к 5’- и/или 3’-концу описанной выше конструкции. Для специалиста будет очевидно, что методы, аналогичные тем, которые были описаны выше, могут быть использованы для получения данных дополнительных компонентов и клонирования их в желательных положениях.Optionally desirable cassettes also further include a marker gene for selective drug resistance (e.g., ampicillin resistance, kanamycin resistance, etc.), left or right T-DNA border sites and (optionally) a nuclear matrix attachment site attached to 5'- and / or 3'-end of the above construction. It will be apparent to one skilled in the art that methods similar to those described above can be used to obtain these additional components and clone them at desired positions.
Пример 11Example 11
Трансформация линий кукурузы с использованием штамма Agrobacterium, несущего супербифункциональный вектор, который включает экспрессионную кассету EPSPS между правым и левым граничными сайтами Т-ДНК; отбор и регенерация растительных клеток и растений, которые резистентны к глифосатуTransformation of maize lines using an Agrobacterium strain carrying a superbifunctional vector that includes an EPSPS expression cassette between the right and left T-DNA border sites; selection and regeneration of plant cells and plants that are resistant to glyphosate
Конструирование штамма AgrobacteriumConstruction of a strain of Agrobacterium
Плазмидную ДНК Bluescript (например, ZEN9, ZEN11, ZEN14, ZEN15, ZEN18, ZEN20, ZEN12, ZEN23, ZEN24 или ZEN25) расщепляют рестриктазами XmaI или XbaI/SacI и полученный таким путем EPSPS-кодирующий фрагмент (примерно 5-6,5 т.п.н.) лигируют в положение в пределах сайта клонирования между правым и левым граничными сайтами Т-ДНК в аналогично обработанной рестриктазами pSB1. В случае использования, например, XmaI-фрагмента из ZEN18 такое лигирование создает плазмиду pZEN18SB11 (фиг.16). Конструирование плазмиды pSB11 и конструирование исходной для нее плазмиды pSB21 описано у Komari et al. (1996, Plant J., 10: 165-174). Участок Т-ДНК в pZEN18 встраивают в супербифункциональный вектор pSB1 (Saito et al., ЕР 672752 A1) по механизму гомологичной рекомбинации (фиг.16) с образованием плазмиды pSB1ZEN18. Для достижения этого плазмиду pZEN18SB11 трансформируют в штамм НВ101 E.coli, который затем в соответствии с методом тройного скрещивания Ditta et al. (1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 7347-7351) скрещивают с Agrobacterium LBA4404, несущей pSB1, с образованием трансформированного штамма Agrobacterium, LBA4404 (pSB1ZEN18), в котором присутствие коинтегрированной плазмиды pSB1ZEN18 определяют на основе резистентности к спектиномицину. Также идентичность pSB1ZEN18 подтверждают на основе анализов рестрикции SalI (фиг.16). Штаммы LBA4404, несущие непосредственно аналогичные конструкции pSB1ZEN19, pSB1ZEN11, pSB1ZEN12, pSBZEN14 и т.д., аналогично конструируют, начиная с XmaI-фрагментов pZEN9, ZEN11, ZEN12, ZEN14 и т.д.Bluescript plasmid DNA (e.g., ZEN9, ZEN11, ZEN14, ZEN15, ZEN18, ZEN20, ZEN12, ZEN23, ZEN24 or ZEN25) was digested with restriction enzymes XmaI or XbaI / SacI and the EPSPS encoding fragment obtained in this way (approximately 5-6.5 t. bp) are ligated to a position within the cloning site between the right and left border sites of T-DNA in a similarly treated with restriction enzyme pSB1. In the case of using, for example, the XmaI fragment from ZEN18, such ligation creates the plasmid pZEN18SB11 (Fig. 16). The construction of plasmid pSB11 and the construction of its original plasmid pSB21 are described by Komari et al. (1996, Plant J., 10: 165-174). The T-DNA region in pZEN18 is inserted into the superbifunctional vector pSB1 (Saito et al., EP 672752 A1) by the homologous recombination mechanism (Fig. 16) to form plasmid pSB1ZEN18. To achieve this, the plasmid pZEN18SB11 is transformed into E. coli strain HB101, which is then, in accordance with the triple crossing method of Ditta et al. (1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 7347-7351) were crossed with Agrobacterium LBA4404 bearing pSB1 to form a transformed strain of Agrobacterium, LBA4404 (pSB1ZEN18), in which the presence of co-integrated plasmid pSB1ZEN18 was determined by resistance to . Also, the identity of pSB1ZEN18 was confirmed based on SalI restriction assays (FIG. 16). Strains LBA4404, bearing directly similar constructions pSB1ZEN19, pSB1ZEN11, pSB1ZEN12, pSBZEN14, etc., are similarly constructed starting from the XmaI fragments pZEN9, ZEN11, ZEN12, ZEN14, etc.
Альтернативно, используя методы, аналогично описанным выше, аналогичный фрагмент из pZEN9, ZEN11 и т.д. вносят по механизму гомологичной рекомбинации в положение между правым и левым граничными сайтами в супербифункциональном векторе рTOК162 (фиг.1 в US 5591616) с образованием аналогичного ряда коинтегрированных плазмид, отобранных в Agrobacterium по параметрам одновременной резистентности к канамицину и спектиномицину.Alternatively, using methods similar to those described above, a similar fragment from pZEN9, ZEN11, etc. introduced by the mechanism of homologous recombination to the position between the right and left boundary sites in the superbifunctional vector pTOK162 (Fig. 1 in US 5591616) with the formation of a similar series of co-integrated plasmids selected in Agrobacterium according to the parameters of simultaneous resistance to kanamycin and spectinomycin.
Штамм LBA4404 Agrobacterium, который несет хелперную плазмиду PAL4404 (включающую полный сегмент vir), доступен из Американской коллекции типовых культур (АТСС 37349). Альтернативным применимым штаммом Agrobacterium является штамм ЕНА101 (Hood et al., 1986, J. Bacteriol., 168(3), 1283-1290), который несет хелперную плазмиду, включающую сегмент vir от штамма Agrobacterium tumefaciens A281, характеризующегося высоким уровнем вирулентности.Agrobacterium strain LBA4404, which carries the PAL4404 helper plasmid (including the full vir segment), is available from the American Type Culture Collection (ATCC 37349). An alternative applicable Agrobacterium strain is EHA101 (Hood et al., 1986, J. Bacteriol., 168 (3), 1283-1290), which carries a helper plasmid comprising the vir segment from the Agrobacterium tumefaciens A281 strain, which is characterized by a high level of virulence.
Получение суспензий AgrobacteriumObtaining suspensions of Agrobacterium
Каждый из штаммов Agrobacterium LBA4404 (pSB1ZEN9), LBA4404 (pSB1ZEN11) и т.д. высевают полосами на чашки, содержащие плотную культуральную среду PHI-L, и культивируют при 28°С в темноте в течение 3-10 дней.Each of the Agrobacterium strains LBA4404 (pSB1ZEN9), LBA4404 (pSB1ZEN11), etc. seeded in strips on plates containing a dense culture medium PHI-L, and cultured at 28 ° C in the dark for 3-10 days.
Среда PHI-L соответствует описанному (пример 4) WO 98/32326. Среда PHI-L, приготовленная в дважды дистиллированной воде, содержит 25 мл/л маточного раствора А, 25 мл/л маточного раствора В, 450,9 мл/л маточного раствора С и 50 мг/л спектиномицина. Маточные растворы стерилизуют автоклавированием или фильтрованием. Маточный раствор А составлен 60 г/л К2НРO4 и 20 г/л NaH2PO4 с доведением до рН 7,0 с помощью КОН; маточный раствор В составлен 6 г/л MgSO4·7H2O, 3 г/л КСl, 20 г/л NH4Cl, 0,2 г/л CaCl2 и 50 мг/л FeSO4·7H2O; маточный раствор С составлен 5,56 г/л глюкозы и 16,67 г/л агара (А-7049: Sigma Chemicals, St.Louis, Mo, США).The PHI-L medium is as described (example 4) WO 98/32326. PHI-L medium prepared in doubly distilled water contains 25 ml / l of mother liquor A, 25 ml / l of mother liquor B, 450.9 ml / l of mother liquor C and 50 mg / l of spectinomycin. The mother liquors are sterilized by autoclaving or filtration. The mother liquor A was composed of 60 g / L K 2 HPO 4 and 20 g / L NaH 2 PO 4 adjusted to pH 7.0 with KOH; mother liquor B was composed of 6 g / l MgSO 4 · 7H 2 O, 3 g / l KCl, 20 g / l NH 4 Cl, 0.2 g / l CaCl 2 and 50 mg / l FeSO 4 · 7H 2 O; Stock solution C was made up of 5.56 g / L glucose and 16.67 g / L agar (A-7049: Sigma Chemicals, St. Louis, Mo, USA).
Альтернативно, Agrobacterium культивируют в течение 3-10 дней на чашке, содержащей культуральную среду YP (5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л пептона, 5 г/л NaCl, 15 г/л агара при рН 6,8), как описано Ishida et al. (1996, Nature Biotechnology, 14, 745-750) или, альтернативно, как описано Hei et al. в US 5591616 (культуральная среда АВ (Drlica & Kado, 1974; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 3677-3681)), однако в каждом случае включая модификации для обеспечения соответствующего отбора с антибиотиками (например, включением 50 мг/мл спектиномицина в случае штамма Agrobacterium LBA4404 (pSB1ZEN9) и т.д. или включением 50 мг/мл спектиномицина и 50 мг/мл канамицина в случае, когда используют Agrobacterium, несущую происходящий от рТОК162 супербифункциональный вектор).Alternatively, Agrobacterium is cultured for 3-10 days on a dish containing YP culture medium (5 g / l yeast extract, 10 g / l peptone, 5 g / l NaCl, 15 g / l agar at pH 6.8), as described by Ishida et al. (1996, Nature Biotechnology, 14, 745-750) or, alternatively, as described by Hei et al. US 5,591,616 (AB culture medium (Drlica & Kado, 1974; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 3677-3681)), however, in each case including modifications to ensure appropriate selection with antibiotics (e.g., 50 mg / ml of spectinomycin in the case of the Agrobacterium LBA4404 strain (pSB1ZEN9), etc., or by the inclusion of 50 mg / ml of spectinomycin and 50 mg / ml of kanamycin in the case when Agrobacterium is used, carrying a superfunctional vector derived from rTOC162).
Полученные, как описано выше, чашки с Agrobacterium хранят при 4°С и используют в течение месяца с момента получения. Для получения суспензий отдельную колонию с основной чашки пересевают полосами на чашку, содержащую при рН 6,8 5 г/л дрожжевого экстракта (Difco), 10 г/л пептона (Difco), 5 г/л NaCl, 15 г/л агара (Difco) и 50 мг/л спектиномицина (или то, что соответствует конкретному штамму Agrobacterium). Чашки инкубируют при 28°С в темноте в течение 2 дней.Obtained, as described above, plates with Agrobacterium are stored at 4 ° C and used within a month from the date of receipt. To obtain suspensions, a separate colony from the main plate is subcultured in stripes on a plate containing at pH 6.8 5 g / l of yeast extract (Difco), 10 g / l of peptone (Difco), 5 g / l of NaCl, 15 g / l of agar ( Difco) and 50 mg / L spectinomycin (or that which corresponds to a specific strain of Agrobacterium). Cups are incubated at 28 ° C in the dark for 2 days.
Суспензии Agrobacterium для трансформации растительного материала получают по аналогичной методике, как описано в US 5591616. (Используя соответствующую микробиологическую практику, чтобы избежать загрязнения стерильных культур). По три 5-мм петли Agrobacterium снимают с чашек, переносят и суспендируют в 5 мл стерильной жидкой среды АА в 14-мл пробирке Фалькона. Как используется в данном исследовании, жидкая культуральная среда ДА при рН 5,2 содержит основные минеральные соли, аминокислоты и витамины, определенные у Toriyama & Hinata, 1985, Plant Science, 41, 179-183, минорные минеральные соли культуральной среды по Мурасиге-Скоогу (Murashige & Skoog, 1962, Physiol. Plant, 15, 473-497), 0,5 г/л казаминовой кислоты (гидролизат казеина), 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D), 0,2 мг/л кинетина, 0,1 мг/л гиббереллина, 0,2 М глюкозы, 0,2 М сахарозы и 0,1 мМ ацетосирингона.Agrobacterium suspensions for the transformation of plant material are obtained in a similar manner as described in US 5591616. (Using appropriate microbiological practice to avoid contamination of sterile cultures). Three 5-mm loops of Agrobacterium are removed from the dishes, transferred and suspended in 5 ml of sterile AA liquid in a 14-ml Falcon tube. As used in this study, the DA liquid culture medium at pH 5.2 contains the basic mineral salts, amino acids, and vitamins defined by Toriyama & Hinata, 1985, Plant Science, 41, 179-183, the minor mineral salts of the culture medium according to Murashige-Skog (Murashige & Skoog, 1962, Physiol. Plant, 15, 473-497), 0.5 g / l of casamic acid (casein hydrolyzate), 1 mg / l of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 0 , 2 mg / l kinetin, 0.1 mg / l gibberellin, 0.2 M glucose, 0.2 M sucrose and 0.1 mm acetosyringone.
Альтернативно, суспензии Agrobacterium для трансформации растительного материала получают по аналогичной методике, как описано в WO 98/32326. По три 5-мм петли Agrobacterium снимают с чашек, переносят и суспендируют в 5 мл стерильной основной среды PHI-A, описанной в примере 4 WO 98/32326/ или, альтернативно, суспендируют в 5 мл комбинированной среды PHI-I, также описанной в примере 4 WO 98/32326. В любом случае также добавляют 5 мл 100 мМ 3’-5’-диметокси-4’-гидроксиацетофенона. Основная среда PHI-A при рН 5,2 содержит 4 г/л основных солей CHU (N6) (Sigma C-1416), 1,0 мл/л витаминной смеси Эрикссона (1000Х, Sigma E-1511), 0,5 мг/л гидрохлорида тиамина, 1,5 мг/мл 2,4-D, 0,69 г/л L-пролина, 68,5 г/л сахарозы и 68,5 г/л глюкозы. Комбинированная среда PHI-I, также доведенная до рН 5,2 с помощью КОН и стерилизованная фильтрованием, содержит 4,3 г/л солей MS (Gibco BRL), 0,5 мг/мл никотиновой кислоты, 0,5 мг/мл гидрохлорида пиридоксина, 1,0 мг/мл гидрохлорида тиамина, 100 мг/л миоинозитола, 1 г/л витаминного гидролизата казеина (Difco), 1,5 мг/мл 2,4-D, 0,69 г/л L-пролина, 68,5 г/л сахарозы и 36 г/л глюкозы.Alternatively, Agrobacterium suspensions for transforming plant material are prepared in a similar manner as described in WO 98/32326. Three 5-mm loops of Agrobacterium are removed from the plates, transferred and suspended in 5 ml of sterile basic PHI-A medium described in Example 4 WO 98/32326 / or, alternatively, suspended in 5 ml of combined PHI-I medium also described in Example 4 WO 98/32326. In any case, 5 ml of 100 mM 3’-5’-dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone are also added. The basic PHI-A medium at pH 5.2 contains 4 g / l of basic salts of CHU (N6) (Sigma C-1416), 1.0 ml / l of Ericsson vitamin mixture (1000X, Sigma E-1511), 0.5 mg / l of thiamine hydrochloride, 1.5 mg /
Альтернативно, суспензии Agrobacterium для трансформации растительного материала получают по аналогичной методике, как описано Ishida et al (1996) Nature Biotechnology, 14, 745-750. По три 5-мм петли Agrobacterium снимают с чашек, переносят и суспендируют в 5 мл культуральной среды LS-inf. Среда LS-inf (Linsmaier & Skoog, 1965, Physiol. Plant, 18, 100-127), доведенная до рН 5,2 с помощью КОН, содержит основные и минорные минеральные соли LS, 0,5 мг/мл никотиновой кислоты, 0,5 мг/мл гидрохлорида пиридоксина, 1,0 мг/мл гидрохлорида тиамина, 100 мг/л миоинозитола, 1 г/л витаминного гидролизата казеина (Difco), 1,5 мг/мл 2,4-D, 68,5 г/л сахарозы и 36 г/л глюкозы.Alternatively, Agrobacterium suspensions for transforming plant material are prepared in a similar manner as described by Ishida et al (1996) Nature Biotechnology, 14, 745-750. Three 5 mm loops of Agrobacterium are removed from the dishes, transferred and suspended in 5 ml of LS-inf culture medium. LS-inf medium (Linsmaier & Skoog, 1965, Physiol. Plant, 18, 100-127), adjusted to pH 5.2 with KOH, contains LS basic and minor mineral salts, 0.5 mg / ml nicotinic acid, 0 5 mg / ml pyridoxine hydrochloride, 1.0 mg / ml thiamine hydrochloride, 100 mg / l myoinositol, 1 g / l casein vitamin hydrolyzate (Difco), 1.5 mg /
После получения суспензию Agrobacterium перемешивают на вортексе с получением однородной суспензии и клеточную популяцию корректируют в диапазоне от 0,5× 109 до 2× 109 БОЕ/мл (предпочтительно ближе к нижнему значению). 1× 109 БОЕ/мл соответствует OD (1 см) примерно 0,72 при 550 нм.After preparation, the Agrobacterium suspension is vortexed to obtain a uniform suspension and the cell population is adjusted in the range from 0.5 × 10 9 to 2 × 10 9 PFU / ml (preferably closer to the lower value). 1 × 10 9 PFU / ml corresponds to an OD (1 cm) of approximately 0.72 at 550 nm.
Суспензии Agrobacterium разделяют на аликвоты по 1 мл в стерильные 2-мл микроцентрифужные пробирки и используют максимально быстро.Agrobacterium suspensions are aliquoted in 1 ml in sterile 2 ml microcentrifuge tubes and used as quickly as possible.
Линии кукурузы для трансформацииCorn lines for transformation
Подходящими для трансформации линиями кукурузы являются, но не ограничиваются ими, А188, F1 Р3732, F1 (А188 × B73Ht), F1 (B73Ht × А 188), F1 (А188 × BMS). Сорта А188, BMS (черная мексиканская кукуруза) и B73Ht получают из министерства сельского, лесного и рыбного хозяйства, которое хорошо известно специалистам. Р3732 получают от IWATA RAKUNOU KYODOKUMIAI. Подходящие линии кукурузы также включают различные кроссы А188 с инбредными линиями (например, PHJ90 × А188, PHN46 × А188, РНРР8 × А188 в таблице 8 WO 98/32326), а также элитные инбредные линии из различных гетерозисных групп (например, PHN46, РНР28 и PHJ90 в таблице 9 WO 98/32326).Suitable maize lines for transformation include, but are not limited to, A188, F1 P3732, F1 (A188 × B73Ht), F1 (B73Ht × A 188), F1 (A188 × BMS). Varieties A188, BMS (Mexican black corn) and B73Ht are obtained from the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, which is well known to specialists. P3732 is obtained from IWATA RAKUNOU KYODOKUMIAI. Suitable maize lines also include various A188 crosses with inbred lines (e.g., PHJ90 × A188, PHN46 × A188, PHPP8 × A188 in table 8 of WO 98/32326), as well as elite inbred lines from various heterotic groups (e.g., PHN46, PHP28 and PHJ90 in table 9 of WO 98/32326).
Например, недоразвитые зародыши получают от кукурузы "HiII". "Hi-II" является гибридом между инбредными линиями (А188 × В73), образуемым путем реципрокных скрещиваний между родителем A Hi-II и родителем В Hi-II, доступными из Кооперативного центра по генетике кукурузы в университете Иллинойса в Шампейне (Urbana, IL). Семена, обозначенные как семена "Hi-II”, полученные в этих кроссах, высевают в теплице или в открытом грунте. Полученные в результате растения Hi-II воспроизводят с помощью самоопыления или перекрестного опыления с родственными растениями.For example, underdeveloped embryos are obtained from HiII maize. "Hi-II" is a hybrid between inbred lines (A188 × B73) formed by reciprocal crosses between parent A Hi-II and parent B Hi-II, available from the Cooperative Center for Corn Genetics at the University of Illinois in Champaign (Urbana, IL) . Seeds designated as “Hi-II” seeds obtained in these crosses are sown in a greenhouse or in open ground. The resulting Hi-II plants are reproduced by self-pollination or cross-pollination with related plants.
Получение недоразвитых зародышей, инфицирование и совместное культивированиеUnderdeveloped embryos, infection and co-cultivation
Трансформацию недоразвитых зародышей кукурузы осуществляют путем контактирования недоразвитых зародышей с подходящими рекомбинантными штаммами Agrobacterium, описанными выше. Недоразвитым зародышем является зародыш незрелого семени, которое находится на стадии созревания после опыления. Недоразвитые зародыши представляют собой интактную ткань, которая способна к клеточным делениям, приводящим к образованию каллюсных клеток, которые могут затем дифференцироваться с образованием тканей и органов цельного растения. Предпочтительным материалом для трансформации также является зародышевый щиток, который тоже способен индуцировать способные к дифференцировке каллюсы, обладающие способностью регенерировать нормальные фертильные растения, которые оказываются исходно трансформированными. Следовательно, предпочтительным материалом для трансформации также является каллюс, производный от такого дедифференцированного недоразвитого зиготического зародыша или щитка.The transformation of underdeveloped maize embryos is accomplished by contacting the underdeveloped embryo with suitable recombinant Agrobacterium strains described above. An underdeveloped embryo is the embryo of an immature seed, which is at the ripening stage after pollination. Underdeveloped embryos are intact tissue that is capable of cell division leading to the formation of callus cells, which can then differentiate with the formation of tissues and organs of the whole plant. A germinal shield is also a preferred material for transformation, which is also capable of inducing differentiating calluses with the ability to regenerate normal fertile plants, which turn out to be initially transformed. Consequently, callus derived from such a dedifferentiated, underdeveloped zygotic embryo or scab is also a preferred material for transformation.
Недоразвитые зародыши кукурузы выделяют в стерильных условиях из развивающихся початков, как описано Green and Phillips (1976, Crop Sci., 15: 417-421) или, альтернативно, с помощью методов Neuffer et al. (1982, "Growing Maize for genetic purposes", in Maize for biological research, W.F. Sheridan ed., University Press, University of North Dakota, Grand Forks, North Dakota, США). Например, недоразвитые зародыши кукурузы длиной 1-2 мм (предпочтительно 1-1,2 мм) в стерильных условиях выделяют из женских соцветий через 9-12 (предпочтительно 11) дней после опыления с использованием стерильной лопатки. Обычно колосья стерилизуют по поверхности 2,63%-ным гипохлоритом натрия в течение 20 мин с последующей промывкой стерильной деионизованной водой и асептическим выделением недоразвитых зародышей. Недоразвитые зародыши (предпочтительно примерно по 100 штук) вносят непосредственно в 2-мл микроцентрифужную пробирку, содержащую примерно 2 мл той же самой культуральной среды, которую использовали для получения суспензии Agrobacterium (альтернативы которой были описаны выше). Пробирку закрывают пробкой и содержимое перемешивают на вортексе в течение нескольких секунд. Культуральную среду декантируют, добавляют 2 мл свежей среды и перемешивание на вортексе повторяют. После этого всю среду выливают, оставляя недоразвитые зародыши на дне пробирки.Underdeveloped maize embryos are isolated under sterile conditions from developing ears, as described by Green and Phillips (1976, Crop Sci., 15: 417-421) or, alternatively, by the methods of Neuffer et al. (1982, "Growing Maize for genetic purposes", in Maize for biological research, W.F. Sheridan ed., University Press, University of North Dakota, Grand Forks, North Dakota, USA). For example, underdeveloped maize embryos 1-2 mm long (preferably 1-1.2 mm) under sterile conditions are isolated from female inflorescences 9-12 (preferably 11) days after pollination using a sterile scapula. Usually, ears are sterilized on the surface with 2.63% sodium hypochlorite for 20 minutes, followed by washing with sterile deionized water and aseptic isolation of underdeveloped embryos. Underdeveloped embryos (preferably about 100 each) are applied directly to a 2 ml microcentrifuge tube containing approximately 2 ml of the same culture medium that was used to prepare the Agrobacterium suspension (alternatives of which were described above). The tube is closed with a stopper and the contents are vortexed for several seconds. The culture medium is decanted, 2 ml of fresh medium is added and vortex mixing is repeated. After this, the whole medium is poured, leaving the underdeveloped embryos at the bottom of the tube.
После получения недоразвитых зародышей кукурузы следующей стадией процесса, стадией инфицирования, является контакт зародышей с трансформирующим штаммом Agrobacterium.After the immature maize embryos are obtained, the next stage of the process, the infection stage, is the contact of the embryos with the transforming strain of Agrobacterium.
В одном примере указанного процесса стадию инфицирования осуществляют в жидкой культуральной среде, которая содержит основные минеральные соли и витамины среды N6 (1987, Chu С.С.Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, pp.43-50), как описано в примере 4 WO 98/32326. 1,0 мл суспензии Agrobacterium, полученной как описано выше в среде PHI-A, добавляют к зародышам в микроцентрифужной пробирке и перемешивают на вортексе в течение 30 с. Альтернативно, 1,0 мл суспензии Agrobacterium, полученной как описано выше, добавляют либо в среду PHI-I, либо в среду LS-inf.In one example of this process, the infection step is carried out in a liquid culture medium that contains basic mineral salts and vitamins N6 (1987, Chu C. C. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, pp. 43-50), described in example 4 of WO 98/32326. 1.0 ml of a suspension of Agrobacterium, prepared as described above in PHI-A medium, is added to the embryos in a microcentrifuge tube and vortexed for 30 s. Alternatively, 1.0 ml of an Agrobacterium suspension prepared as described above is added either to PHI-I or LS-inf.
После отстаивания в течение 5 мин суспензию Agrobacterium и зародыши переливают в чашку Петри, содержащую либо (1) среду PHI-B, либо (2) среду PHI-J, либо (3) среду LS-AS: это зависит от того, в какой среде была изначально получена суспензия Agrobacterium: в среде PHI-A, в среде PHI-I или в среде LS-inf, соответственно. Суспензию Agrobacterium отсасывают пастеркой, зародышами манипулируют таким образом, чтобы их осевая сторона оказывалась обращенной вниз к культуральной среде, чашки закрывают парафильмом и инкубируют в темноте при 23-25°С в течение 3 дней совместного культивирования. Среда PHI-B при pH 5,8 содержит 4 г/л основных солей CHU (N6) (Sigma C-1416), 1,0 мл/л витаминной смеси Эрикссона (1000Х, Sigma E-1511), 0,5 мг/л гидрохлорида тиамина, 1,5 мг/мл 2,4-D, 0,69 г/л L-пролина, 0,85 мг/л нитрата серебра, 30 г/л сахарозы, 100 мкМ ацетосирингона и 3 г/л гельрита (Sigma). Среда PHI-J, также доведенная до рН 5,8, содержит 4,3 г/л солей MS (Gibco BRL), 0,5 мг/мл никотиновой кислоты, 0,5 мг/мл гидрохлорида пиридоксина, 1,0 мг/мл гидрохлорида тиамина, 100 мг/л миоинозитола, 1,5 мг/мл 2,4-D, 0,69 г/л L-пролина, 20 г/л сахарозы, 10 г/л глюкозы, 0,5 г/л MES (Sigma), 100 мM ацетосирингона и 8 г/л очищенного агара (Sigma А-7049). Среда LS-AS (Linsmaier & Skoog, 1965, Physiol. Plant, 18, 100-127), доведенная до рН 5,8 с помощью КОН, содержит основные и минорные минеральные соли LS, 0,5 мг/мл никотиновой кислоты, 0,5 мг/мл гидрохлорида пиридоксина, 1,0 мг/мл гидрохлорида тиамина, 700 мг/л L-пролина, 100 мг/л миоинозитола, 1,5 мг/мл 2,4-D, 20 г/л сахарозы, 10 г/л глюкозы, 0,5 г/л MES, 100 мМ ацетосирингона и 8 г/л очищенного агара (Sigma А-7049).After settling for 5 minutes, the Agrobacterium suspension and embryos are transferred to a Petri dish containing either (1) PHI-B medium, or (2) PHI-J medium, or (3) LS-AS medium: this depends on which Agrobacterium suspension was initially prepared in the medium: in PHI-A, in PHI-I or in LS-inf, respectively. The suspension of Agrobacterium is sucked off with a paste, the embryos are manipulated so that their axial side is facing down to the culture medium, the plates are closed with parafilm and incubated in the dark at 23-25 ° C for 3 days of co-culture. PHI-B medium at pH 5.8 contains 4 g / l of basic salts of CHU (N6) (Sigma C-1416), 1.0 ml / l of Ericsson vitamin mixture (1000X, Sigma E-1511), 0.5 mg / l of thiamine hydrochloride, 1.5 mg /
После получения недоразвитых зародышей, как описано выше, альтернативным методом трансформации является инфицирование их в процессе и после периода дедифференцировки, как описано в US 5591616. Недоразвитые зародыши помещают на плотную культуральную среду LSD-1.5, содержащую минеральные соли и витамины LS наряду с 100 мг/мл гидролизата казеина, 700 мг/л L-пролина, 100 мг/л миоинозитола, 1,5 мг/мл 2,4-D, 20 г/л сахарозы и 2,3 г/л гельрита. Через 3 недели при 25°С образовавшиеся от щитков каллюсы собирают в 2-мл микроцентрифужную пробирку и погружают в 1 мл суспензии Agrobacterium, полученной, как описано выше, в среде АА. После 5-минутного отстаивания полученные в результате каллюсы переносят на плотную среду 2N6, содержащую 100 мМ ацетосирингона, и инкубируют в темноте при 25°С в течение 3 дней периода совместного культивирования. Плотная культуральная среда 2N6 содержит минеральные соли и витамины среды N6 (Chu С.С., 1978; Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, pp.43-50), содержащей 1 г/л гидролизата казеина, 2 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы и 2 г/л гельрита.After receiving underdeveloped embryos, as described above, an alternative transformation method is to infect them during and after the period of dedifferentiation, as described in US 5591616. Underdeveloped embryos are placed on a dense culture medium LSD-1.5 containing mineral salts and vitamins LS along with 100 mg / ml casein hydrolyzate, 700 mg / l L-proline, 100 mg / l myoinositol, 1.5 mg /
Хранение и отбор трансформантовStorage and selection of transformants
После совместного культивирования зародыши, необязательно, переносят на чашку, содержащую среду PHI-C, закрывают сверху парафильмом и инкубируют в темноте в течение 3 дней в качестве “стадии хранения” перед проведением отбора. Среда PHI-C при рН 5,8 содержит 4 г/л основных солей CHU(N6) (Sigma C-1416), 1,0 мл/л витаминной смеси Эрикссона (1000Х, Sigma E-1511), 0,5 мг/л гидрохлорида тиамина, 1,5 мг/мл 2,4-D, 0,69 г/л L-пролина, 0,85 мг/л нитрата серебра, 30 г/л сахарозы, 0,5 г/л MES, 100 мг/л карбенициллина и 8 г/л очищенного агара (Sigma A-7049). Как описано в WO 98/32326, желательность включения указанной стадии хранения в общий процесс получения трансформантов зависит от линии кукурузы и является объектом экспериментальной оценки.After co-culturing, the embryos are optionally transferred to a dish containing PHI-C medium, covered with parafilm from above, and incubated in the dark for 3 days as a “storage step" before selection. PHI-C medium at pH 5.8 contains 4 g / l of basic salts of CHU (N6) (Sigma C-1416), 1.0 ml / l of Ericsson vitamin mixture (1000X, Sigma E-1511), 0.5 mg / l of thiamine hydrochloride, 1.5 mg /
Для стадии отбора примерно 20 зародышей переносят на каждую из ряда новых чашек, содержащих селективную среду PHI-D или селективную среду LSD-1,5, закрывают парафильмом и инкубируют в темноте при 28°С. Селективная среда PHI-D, доведенная до рН 5,8 с помощью КОН, содержит 4 г/л основных солей CHU(N6) (Sigma С-1416), 1,0 мл/л витаминной смеси Эрикссона (1000Х, Sigma Е-1511), 0,5 мг/л гидрохлорида тиамина, 1,5 мг/мл 2,4-D, 0,69 г/л L-пролина, 0,85 мг/л нитрата серебра, 30 г/л сахарозы, 0,5 г/л MES, 100 мг/л карбенициллина, 8 г/л очищенного агара (Sigma A-7049) и от 0,1 мМ до 20 мМ N-(фосфонометил) глицина чистоты для тканевых культур (Sigma Р-9556). Селективная среда LSD-1.5, доведенная до рН 5,8 с помощью КОН, содержит основные и минорные минеральные соли LS (Linsmaier & Skoog, 1965, Physiol. Plant, 18, 100-127), 0,5 мг/мл никотиновой кислоты, 0,5 мг/мл гидрохлорида пиридоксина, 1,0 мг/мл гидрохлорида тиамина, 700 мг/л L-пролина, 100 мг/л миоинозитола, 1,5 мг/мл 2,4-D, 20 г/л сахарозы, 0,5 г/л MES, 250 мг/л цефотаксима, 8 г/л очищенного агара (Sigma A-7049) и от 0,1 мМ до 20 мМ N-(фосфонометил)глицина чистоты для тканевых культур (Sigma Р-9556).For the selection step, approximately 20 embryos are transferred to each of a number of new plates containing selective PHI-D or selective LSD-1.5 medium, closed with parafilm and incubated in the dark at 28 ° C. Selective PHI-D medium adjusted to pH 5.8 with KOH contains 4 g / l of basic salts of CHU (N6) (Sigma С-1416), 1.0 ml / l of Ericsson vitamin mixture (1000X, Sigma Е-1511 ), 0.5 mg / l thiamine hydrochloride, 1.5 mg /
Альтернативно, в случае, когда исходным материалом для отбора являются каллюсы, происходящие от недоразвитых зародышей, как описано в US 5591616, такие каллюсы промывают стерилизованной водой, содержащей 250 мг/л цефотаксима, с последующим культивированием в селективной среде LSD-1,5.Alternatively, in the case where the starting material for selection is calluses originating from underdeveloped embryos, as described in US 5591616, such calluses are washed with sterilized water containing 250 mg / l cefotaxime, followed by cultivation in selective medium LSD-1,5.
Зародыши или клеточные кластеры, которые пролиферируют из недоразвитых зародышей, переносят (если необходимо, то с использованием стерильного скальпеля) на чашки, содержащие свежую селективную среду, с 2-недельными интервалами при общей продолжительности эксперимента примерно 2 месяца. Резистентные к гербициду каллюсы затем наращивают в объеме путем продолжающегося роста в той же культуральной среде до достижения диаметра отобранного каллюса свыше примерно 1,5 см.Embryos or cell clusters that proliferate from underdeveloped embryos are transferred (if necessary, using a sterile scalpel) to plates containing fresh selective medium at 2-week intervals with a total experiment duration of approximately 2 months. Herbicide-resistant calluses are then expanded in volume by continued growth in the same culture medium until the diameter of the selected callus is greater than about 1.5 cm.
Концентрацию N-(фосфонометил)глицина в селективной среде выбирают таким образом, чтобы отбирать желательное число истинных трансформантов, что предпочтительно составляет 0,3-5 мМ. Предпочтительно концентрация N-(фосфонометил)глицина, используемая в селективной среде, составляет примерно 1 мМ в первые две недели отбора и примерно 3 мМ после этого.The concentration of N- (phosphonomethyl) glycine in the selective medium is chosen so as to select the desired number of true transformants, which is preferably 0.3-5 mM. Preferably, the concentration of N- (phosphonomethyl) glycine used in the selective medium is about 1 mM in the first two weeks of selection and about 3 mM thereafter.
Регенерация трансформантов, размножение и анализ трансформированного растительного материалаTransformants regeneration, propagation and analysis of transformed plant material
Отобранные каллюсы регенерируют в нормальные фертильные растения в соответствии, например, с методами, описанными Duncan et al. (1985, Planta, 165, 322-332), Kamo et al. (1985, Bot. Gaz., 146(3), 327-334) и/или West et al. (1993, The Plant Cell, 5, 1361-1369), и/или Shillito et al. (1989, Bio/Technol, 7, 581-587).Selected calluses are regenerated in normal fertile plants according to, for example, the methods described by Duncan et al. (1985, Planta, 165, 322-332), Kamo et al. (1985, Bot. Gaz., 146 (3), 327-334) and / or West et al. (1993, The Plant Cell, 5, 1361-1369), and / or Shillito et al. (1989, Bio / Technol, 7, 581-587).
Например, отобранные каллюсы диаметром 1,5-2 см переносят в среду для регенерации/созревания и инкубируют в темноте в течение примерно 1-3 недель, давая возможность созреть соматическим зародышам. Подходящую регенерационную среду, PHI-Е (WO 98/32326) доводят до рН 5,6 с помощью КОН, и она содержит 4,3 г/л солей MS (Gibco BRL), 0,5 мг/мл никотиновой кислоты, 0,5 мг/мл гидрохлорида пиридоксина, 0,1 мг/мл гидрохлорида тиамина, 100 мг/л миоинозитола, 2 мг/л глицина, 0,5 мг/л зеатина, 1,0 мг/мл индолилуксусной кислоты, 0,1 мМ абсцизовой кислоты, 100 мг/л карбенициллина, 60 г/л сахарозы, 8 г/л очищенного агара (Sigma А-7049) и, необязательно, от 0,02 мМ до 1 мМ N-(фосфонометил) глицина чистоты для тканевых культур (Sigma Р-9556).For example, selected calluses with a diameter of 1.5-2 cm are transferred to a medium for regeneration / maturation and incubated in the dark for about 1-3 weeks, allowing somatic embryos to mature. A suitable regeneration medium, PHI-E (WO 98/32326) was adjusted to pH 5.6 with KOH and it contains 4.3 g / l MS salts (Gibco BRL), 0.5 mg / ml nicotinic acid, 0, 5 mg / ml pyridoxine hydrochloride, 0.1 mg / ml thiamine hydrochloride, 100 mg / l myoinositol, 2 mg / l glycine, 0.5 mg / l zeatin, 1.0 mg / ml indolylacetic acid, 0.1 mM abscis acids, 100 mg / l carbenicillin, 60 g / l sucrose, 8 g / l purified agar (Sigma A-7049) and, optionally, from 0.02 mm to 1 mm N- (phosphonomethyl) glycine of purity for tissue cultures (Sigma P-9556).
Затем каллюсы переносят в регенерационную среду для образования корешков и выращивают при 25°С либо в условиях смены освещения (16 ч, 270 мЕ/м2/с) и темноты (8 ч), либо при постоянном освещении (примерно 250 мЕ/м2/с) до того момента, как образуются побеги и корешки. Подходящей регенерационной средой для образования корешков является либо среда LSZ, описанная в следующем абзаце (необязательно лишенная фосфонометилглицина), либо среда PHI-F при рН 5,6, которая содержит 4,3 г/л солей MS (Gibco BRL), 0,5 мг/мл никотиновой кислоты, 0,5 мг/мл гидрохлорида пиридоксина, 0,1 мг/мл гидрохлорида тиамина, 100 мг/л миоинозитола, 2 мг/л глицина, 40 г/л сахарозы и 1,5 г/л гельрита.Then calluses are transferred to the regeneration medium for the formation of roots and grown at 25 ° C either under conditions of a change in lighting (16 h, 270 mU / m 2 / s) and darkness (8 h), or under constant illumination (approximately 250 mU / m 2 / s) until the shoots and roots are formed. A suitable regeneration medium for root formation is either LSZ medium described in the following paragraph (optionally devoid of phosphonomethylglycine) or PHI-F medium at pH 5.6, which contains 4.3 g / l MS salts (Gibco BRL), 0.5 mg / ml nicotinic acid, 0.5 mg / ml pyridoxine hydrochloride, 0.1 mg / ml thiamine hydrochloride, 100 mg / l myoinositol, 2 mg / l glycine, 40 g / l sucrose and 1.5 g / l gelrite.
Альтернативно, отобранные каллюсы переносят непосредственно в регенерационную среду LSZ, доведенную до рН 5,8 с помощью КОН и содержащую основные и минорные минеральные соли LS (Linsmaier & Skoog, 1965, Physiol. Plant, 18, 100-127), 0,5 мг/мл никотиновой кислоты, 0,5 мг/мл гидрохлорида пиридоксина, 1,0 мг/мл гидрохлорида тиамина, 700 мг/л L-пролина, 100 мг/л миоинозитола, 5 мг/мл зеатина, 20 г/л сахарозы, 0,5 г/л MES, 250 мг/л цефотаксима, 8 г/л очищенного агара (Sigma A-7049) и, необязательно, от 0,02 мМ до 1 мМ N-(фосфонометил)глицина чистоты для тканевых культур (Sigma Р-9556). По прошествии периода инкубации в темноте культуру освещают (непрерывно или по типу “светового дня” в соответствии с указанным выше), в результате чего регенерируются проростки.Alternatively, selected calluses are transferred directly to LSZ regeneration medium adjusted to pH 5.8 with KOH and containing LS basic and minor mineral salts (Linsmaier & Skoog, 1965, Physiol. Plant, 18, 100-127), 0.5 mg / ml nicotinic acid, 0.5 mg / ml pyridoxine hydrochloride, 1.0 mg / ml thiamine hydrochloride, 700 mg / l L-proline, 100 mg / l myoinositol, 5 mg / ml zeatin, 20 g / l sucrose, 0 5 g / l MES, 250 mg / l cefotaxime, 8 g / l purified agar (Sigma A-7049) and optionally 0.02 mM to 1 mM N- (phosphonomethyl) glycine of purity for tissue cultures (Sigma P -9556). After a period of incubation in the dark, the culture is illuminated (continuously or as a “daylight” in accordance with the above), as a result of which seedlings are regenerated.
Небольшие проростки переносят в отдельные стеклянные пробирки, содержащие либо среду PHI-F, либо полуконцентрированную среду LSF при рН 5,8, содержащую основные соли LS (Linsmaier & Skoog, 1965, Physiol, Plant, 18, 100-127) в половинных концентрациях, минорные соли LS, 0,5 мг/мл никотиновой кислоты, 0,5 мг/мл гидрохлорида пиридоксина, 1,0 мг/мл гидрохлорида тиамина, 100 мг/л миоинозитола, 20 г/л сахарозы, 0,5 г/л MES, 8 г/л очищенного агара (Sigma A-7049), и выращивают в течение примерно еще недели. Затем проростки переносят в горшки с почвой, выставляют их в камеры для выращивания (относительная влажность 85%, 600 м.д. СО2 и освещение 250 мЕ/м2/с) и выращивают до созревания в почвенной смеси в условиях теплицы.Small seedlings are transferred to separate glass tubes containing either PHI-F medium or a semi-concentrated LSF medium at pH 5.8, containing LS basic salts (Linsmaier & Skoog, 1965, Physiol, Plant, 18, 100-127) in half concentrations, LS minor salts, 0.5 mg / ml nicotinic acid, 0.5 mg / ml pyridoxine hydrochloride, 1.0 mg / ml thiamine hydrochloride, 100 mg / l myoinositol, 20 g / l sucrose, 0.5 g / l MES , 8 g / l of purified agar (Sigma A-7049), and grown for about another week. Then the seedlings are transferred to pots with soil, put them in the growth chambers (relative humidity 85%, 600 ppm CO 2 and illumination 250 IU / m 2 / s) and grown to maturity in the soil mixture in a greenhouse.
Первое поколение растений (Т0), полученное, как описано выше, самоопыляют с целью получения семян второго поколения (T1). Альтернативно (причем предпочтительно), первое поколение растений подвергают реципрокным скрещиваниям с другой нетрансгенной инбредной линией кукурузы с целью получения семян второго поколения. Потомство таких кроссов (T1) затем, как ожидается, расщепляется в соотношении 1:1 по признаку резистентности к гербициду. Семена T1 замачивают, выращивают в теплице или в открытом грунте, и уровень резистентности, наследование признака резистентности и расщепление по признаку резистентности к глифосатному гербициду в текущем и последующих поколениях оценивают по наблюдениям за параметрами выживаемости, фертильности растений и симптомов некроза тканей после обработки глифосатом (приготовленным подходящим образом и необязательно в виде соли) в диапазоне уровней от 25 до 2000 г/га и в диапазоне стадий роста между V2 и V8 включительно (или, альтернативно, на 7-21-й дни после проращивания). Данные оценки соотносят с параметрами восприимчивых сегрегантов и со сходными не трансформированными линиями кукурузы, которые не несут генов по настоящему изобретению или последовательностей, способных обеспечивать резистентность к глифосату. Трансгенные линии, которые проявляют резистентность к глифосату, отбирают и снова самоопыляют или бэккроссируют на нетрансгенные инбредные растения.The first generation of plants (T 0 ), obtained as described above, is self-pollinated in order to obtain seeds of the second generation (T 1 ). Alternatively (and preferably), the first generation of plants is subjected to reciprocal crosses with another non-transgenic inbred line of corn in order to obtain seeds of the second generation. The offspring of such crosses (T 1 ) is then expected to split in a 1: 1 ratio based on herbicide resistance. T 1 seeds are soaked, grown in a greenhouse or in an open field, and the resistance level, inheritance of the resistance trait and cleavage according to the resistance to glyphosate herbicide in the current and subsequent generations are evaluated by observing survival parameters, plant fertility and tissue necrosis symptoms after treatment with glyphosate ( suitably prepared and optionally in salt form) in the range of levels from 25 to 2000 g / ha and in the range of growth stages between V2 and V8 inclusive (or, alternatively, on days 7-21 and after germination). These estimates correlate with the parameters of susceptible segregants and with similar non-transformed maize lines that do not carry the genes of the present invention or sequences capable of providing glyphosate resistance. Transgenic lines that exhibit glyphosate resistance are selected and self-pollinated again or backcrossed to non-transgenic inbred plants.
На всех стадиях описанных выше процессов образцы тканей трансформированных каллюсов, проростков, растительного материала Т0 и T1 необязательно берут и анализируют с помощью (1) Саузерн-блоттинга и ПЦР с целью определения присутствия, числа копий и целостности трансгенов, (2) Нозерн-блоттинга (или сходных методов) с целью измерения уровня экспрессии мРНК трансгенов, (3) количественного Вестерн-блоттинга ДСН-гелей с целью измерения уровней экспрессии EPSPS, и (4) измерения каталитической активности EPSPS в присутствии и в отсутствие глифосата с целью более точной оценки того, какая часть экспрессированной EPSPS происходит от трансгена.At all stages of the processes described above, tissue samples of transformed calluses, seedlings, plant material T 0 and T 1 are optionally taken and analyzed using (1) Southern blotting and PCR to determine the presence, number of copies and integrity of transgenes, (2) Northern blotting (or similar methods) to measure the level of transgene mRNA expression, (3) quantitative Western blotting of SDS gels to measure EPSPS expression levels, and (4) measuring the catalytic activity of EPSPS in the presence and absence of glyphosate with w more accurately assess what part of the EPSPS originates from the expressed transgene.
Такие методы анализа хорошо известны в данной области техники. Подходящие методы для анализа присутствия, целостности и экспрессии трансгена с помощью ПЦР, для осуществления Саузерн-блоттинга, для клонирования и экспрессии зрелой EPSPS риса в клетках Е. coli, для очистки EPSPS риса, для формирования поликлональных антител к очищенной EPSPS риса, для Вестерн-блоттинга уровней EPSPS в каллюсе и в тканях растения и для измерения уровней активности EPSPS в производных от растений экстрактах при той концентрации глифосата, которая разграничивает эндогенную глифосат-восприимчивую EPSPS и резистентный к глифосату продукт, кодируемый трансгеном EPSPS, описаны более подробно далее в примерах 17-20.Such analysis methods are well known in the art. Suitable methods for analyzing the presence, integrity and expression of a transgene by PCR, for southern blotting, for cloning and expression of mature EPSPS rice in E. coli cells, for purification of EPSPS rice, for the formation of polyclonal antibodies to purified EPSPS rice, for Western blotting EPSPS levels in callus and plant tissues and for measuring EPSPS activity levels in plant-derived extracts at a glyphosate concentration that differentiates between endogenous glyphosate-sensitive EPSPS and glyphosate-resistant product, encoded by the EPSPS transgene are described in more detail below in Examples 17-20.
Экспрессия трансгена в каллюсах, образованных в результате трансформации недоразвитых зародышей кукурузы А188 × В73 (Hi-II) штаммом LBA4404 Agrobacterium, несущим супербифункциональный вектор, включающий экспрессионные кассеты EPSPS векторов Bluescript (pZEN11, 12, 14 или 15) в пределах граничных сайтов Т-ДНК показано в табл.2.Expression of the transgene in calluses resulting from the transformation of underdeveloped maize embryos A188 × B73 (Hi-II) strain Agrobacterium LBA4404 carrying a superbifunctional vector including expression cassettes of EPSPS Bluescript vectors (pZEN11, 12, 14 or 15) within the T-DNA boundary sites shown in table 2.
Таблица 2 показывает результаты ферментного теста для EPSPS (присутствие/отсутствие 100 мкМ глифосата при 100 мкМ PEP), полученные при ферментном тестировании экстрактов стабильно трансформированного каллюса способного к регенерации гибрида кукурузы А188 × В73, трансформированного с использованием Agrobacterium, несущей супербифункциональный вектор, включающий экспрессионные кассеты EPSPS плазмид pZEN11, ZEN12, ZEN14 или ZEN15 Bluescript. Каждая каллюсная линия представляет собой единственное событие, которое анализируют в двух повторностях. Подсчитывают отношение истинно устойчивой активности фермента, экспрессируемого трансгеном (допускается примерно 8% ингибирования), к активности эндогенного восприимчивого фермента (более 98% подавления в присутствии глифосата). Мутантный EPSPS экспрессируется относительно сильно в ряде линий, а именно в линиях 5 и 12, в которых, допуская снижение Vmax устойчивого фермента по отношению к дикому типу (примерно на треть), можно оценить, что устойчивый фермент экспрессируется в 2-6 раз выше нормального уровня эндогенной EPSPS (такой подсчет осложняется тем фактом, что в некоторых отобранных каллюсах экспрессия трансгена имеет место наряду с примерно 2-2,5-кратным усилением фоновой экспрессии восприимчивого эндогенного фермента).Table 2 shows the results of the enzyme test for EPSPS (presence / absence of 100 μM glyphosate at 100 μM PEP) obtained by enzyme testing extracts of stably transformed callus capable of regenerating A188 × B73 maize hybrid transformed using Agrobacterium carrying a superbifunctional vector including expression cassettes EPSPS plasmids pZEN11, ZEN12, ZEN14 or ZEN15 Bluescript. Each callus line represents a single event that is analyzed in duplicate. The ratio of the truly stable activity of the enzyme expressed by the transgene (approximately 8% inhibition is allowed) to the activity of the endogenous susceptible enzyme (more than 98% inhibition in the presence of glyphosate) is calculated. Mutant EPSPS is expressed relatively strongly in a number of lines, namely,
Пример 12Example 12
Трансформация линий кукурузы с помощью бомбардировки частицами, покрытыми ДНК, которая включает экспрессионную кассету EPSPS; отбор и регенерация растительных клеток и растений, которые резистентны к глифосатуTransformation of maize lines by bombardment with DNA coated particles, which includes an EPSPS expression cassette; selection and regeneration of plant cells and plants that are resistant to glyphosate
В следующем примере рыхлый эмбриогенный каллюс, производный от недоразвитых зародышей кукурузы, инициируют на плотной культуральной среде и трансформируют биолистическим путем. Затем, по аналогичной методике, как описано в примере 11, трансформированный каллюс отбирают на основании дифференцированного роста в среде, содержащей разные концентрации глифосата. Резистентный каллюс отбирают и регенерируют с получением проростков То, которые высаживают в горшки, выращивают до зрелости и самоопыляют или перекрестно опыляют в теплице. Семена-потомки (T1) затем выращивают для получения последующих поколений растений, которые оценивают по резистентности к глифосату и анализируют на присутствие, целостность и экспрессию трансгена в соответствии с описанным в примере 11.In the following example, loose embryogenic callus, derived from underdeveloped maize embryos, is initiated on a dense culture medium and transformed biologically. Then, in a similar manner as described in Example 11, transformed callus was selected based on differentiated growth in a medium containing different concentrations of glyphosate. Resistant callus is selected and regenerated to produce T o seedlings that are planted in pots, grown to maturity, and self-pollinated or cross-pollinated in a greenhouse. The offspring seeds (T 1 ) are then grown to produce subsequent generations of plants that are evaluated for glyphosate resistance and analyzed for the presence, integrity and expression of the transgene as described in Example 11.
Инициация каллюса из недоразвитых зародышейInitiation of callus from underdeveloped embryos
Ломкий эмбриогенный каллюс II типа, пригодный для трансформации, извлекают из недоразвитых зародышей, например, кросса А188хВ73 кукурузы. Альтернативную инбредную линию, такую как производные от В73 и гибридные линии кукурузы, также можно использовать, включая, например, те, которые перечислены в примере 11. Недоразвитые зародыши кукурузы длиной 1-2 мм выделяют в стерильных условиях из женских соцветий обычно примерно на 11-й день после опыления с использованием методов, описанных в примере 11.Unbreakable embryogenic callus of type II, suitable for transformation, is extracted from underdeveloped embryos, for example, corn cross A188xB73. An alternative inbred line, such as B73 derivatives and hybrid maize lines, can also be used, including, for example, those listed in Example 11. Underdeveloped maize embryos 1-2 mm long are isolated under sterile conditions from female inflorescences, usually by about 11- day after pollination using the methods described in example 11.
Недоразвитые зародыши высевают, например, в среду на основе N6 (Chu et al., 1975, Scientia Sinica, 18, 659-668), доведенную до рН 5,8 с помощью КОН и содержащую 1 мг/л 2,4-D, 2,9 г/л L-пролина, 2 мг/л L-глицина, 100 мг/л гидролизата казеина, основные соли N6, минорные соли N6, витамины N6, 2,5 г/л гельрита (или 2 г/л препарата Gelgro) и 20 г/л сахарозы. Альтернативно, культуральная среда включает, например, аналогичную среду, но содержащую соли MS (Murashige & Skoog, 1962, Physiol. Plant, 15, 473-497) вместо солей N6. Альтернативно, культуральная среда может содержать примерно 10 мг/л дикамбы вместо 2,4-D.Underdeveloped embryos are seeded, for example, on a N6-based medium (Chu et al., 1975, Scientia Sinica, 18, 659-668) adjusted to pH 5.8 with KOH and containing 1 mg /
Недоразвитые зародыши инкубируют в темноте в указанной выше среде при примерно 25°С с целью инициации каллюса. Материал каллюса II типа отбирают путем визуального отбора быстрорастущих рыхлых эмбриогенных клеток с помощью методов, известных в данной области техники и описанных в WO 98/44140. Например, подходящие реципиентные клетки отбирают “вручную” путем выбора предпочтительных клеток, которые могут находиться на поверхности клеточного кластера, и далее идентифицируются по отсутствию у них дифференцировки, небольшому размеру и высокому соотношению объемов ядра и цитоплазмы. Суспензионную культуру инициируют из ткани в пределах каллюса, которая выглядит наименее дифференцированной, наиболее мягкой и наиболее рыхлой. Ткань, характеризующуюся такой морфологией, переносят на новые чашки со средой примерно через 8-16 дней после исходного высева недоразвитых зародышей. Затем ткань стандартным образом субкультивируют каждые 14-21 дней путем изъятия примерно 10% кусочков, которые достигают примерно грамма. На каждом этапе в субкультуру включают только тот материал, который удовлетворяет морфологии желательного типа II или типа III.Underdeveloped embryos are incubated in the dark in the above medium at about 25 ° C in order to initiate callus. Callus material of type II is selected by visual selection of fast-growing loose embryogenic cells using methods known in the art and described in WO 98/44140. For example, suitable recipient cells are selected “manually” by selecting the preferred cells that can be on the surface of the cell cluster, and then identified by their lack of differentiation, small size and high ratio of nucleus to cytoplasm volumes. Suspension culture is initiated from tissue within the callus, which looks the least differentiated, the softest and the most friable. Tissue characterized by such morphology is transferred to new plates with medium approximately 8-16 days after the initial sowing of underdeveloped embryos. The tissue is then subcultured in a standard manner every 14-21 days by removing about 10% of the pieces, which reach about a gram. At each stage, only material that satisfies the morphology of the desired type II or type III is included in the subculture.
Получение суспензионных клеточных культурObtaining suspension cell cultures
Предпочтительно в течение 6 месяцев после описанной выше инициации каллюсов диспергированные суспензионные культуры инициируют в жидких культуральных средах, содержащих подходящие гормоны, такие как 2,4-D и NAA, необязательно представленные в форме капсулы с замедленным высвобождением гормона в соответствии с описанным в примерах 1 и 2 US 5550318. Необязательно, уровни гормонов в культурах поддерживают путем внесения свежих гормональных добавок по необходимости. Суспензионные культуры инициируют, например, добавлением приблизительно 0,5 г каллюсной ткани в 100-мл колбу, содержащую 10 мл среды для суспензионной культуры. Каждые 7 дней культуру дополнительно субкультивируют путем переноса с использованием стерильной пипетки с широким концом, 1 мл осевших клеток и 4 мл кондиционной среды в новую колбу, содержащую свежую среду. Крупные клеточные агрегации, которые не могут пройти через кончик пипетки, отбрасывают на каждом этапе субкультивирования. Необязательно, суспензионные культуры пропускают через подходящее сито (например, с ячейкой примерно 0,5-1,0 мм) на каждом этапе субкультивирования. Через 6-12 недель культура становится диспергированной. Подходящие культуральные среды для клеточных суспензий включают, например, среду, доведенную до рН 6,0 и содержащую основные и минорные соли Мурасиге-Скоога (Murashige & Skoog, 1962) (необязательно модифицированные так, чтобы содержать сниженный уровень нитрата аммония, 1,55 г/л), 30 г/л сахарозы, 0,25 мг/л тиамина, 10 мг/л дикамбы, 25 мМ L-пролина, 200 мг/л гидролизата казеина, 100 мг/л миоинозитола, 500 мг/л сульфата калия и 400 мг/л однозамещенного фосфата калия. Альтернативно, вместо дикамбы среда для клеточной суспензии содержит 2,4-D и/или NAA.Preferably, within 6 months after the callus initiation described above, dispersed suspension cultures are initiated in liquid culture media containing suitable hormones, such as 2,4-D and NAA, optionally in the form of a sustained release hormone capsule as described in Examples 1 and 2 US 5550318. Optionally, hormone levels in cultures are maintained by adding fresh hormone supplements as needed. Suspension cultures are initiated, for example, by adding approximately 0.5 g of callus tissue to a 100 ml flask containing 10 ml of suspension culture medium. Every 7 days, the culture is further subcultured by transferring using a sterile wide-end pipette, 1 ml of settled cells and 4 ml of conditioned medium to a new flask containing fresh medium. Large cell aggregations that cannot pass through the tip of the pipette are discarded at each stage of subculture. Optionally, suspension cultures are passed through a suitable sieve (e.g., with a mesh of about 0.5-1.0 mm) at each subculture step. After 6-12 weeks, the culture becomes dispersed. Suitable culture media for cell suspensions include, for example, a medium adjusted to pH 6.0 and containing Murashige & Skoog basic and minor salts (Murashige & Skoog, 1962) (optionally modified to contain reduced levels of ammonium nitrate, 1.55 g / l), 30 g / l sucrose, 0.25 mg / l thiamine, 10 mg / l dicamba, 25 mM L-proline, 200 mg / l casein hydrolyzate, 100 mg / l myoinositol, 500 mg / l potassium sulfate and 400 mg / L monosubstituted potassium phosphate. Alternatively, instead of dicamba, the cell suspension medium contains 2,4-D and / or NAA.
Криоконсервация суспензионных клеточных культурCryopreservation of suspension cell cultures
Необязательно, суспензионные культуры, полученные в соответствии с описанным выше, криоконсервируют с использованием криоконсервантов и способов, описанных, например, в примере 2 US 5550318. Криоконсервация заключается в добавлении криоконсерванта при температуре льда к заранее охлажденным также до температуры льда клеткам постепенно в течение одного-двух часов. Полученную смесь выдерживают при температуре льда, в которой конечный объем криоконсерванта равен объему клеточной суспензии. Конечные концентрации криоконсервантов, например, составляют 10% диметилсульфоксида, 10% полиэтиленгликоля (молекулярная масса 6000), 0,23 М L-пролина и 0,23 М глюкозы. По прошествии 30-минутного периода уравновешивания при температуре льда смесь разделяют на аликвоты примерно по 0,5 мл, переносят в 2-мл микроцентрифужные пробирки и медленно охлаждают до температуры -8°С со скоростью 0,5°С/мин. После периода ледяной нуклеации образец далее медленно охлаждают до -35°С и затем погружают в жидкий азот. При необходимости использования замороженные образцы оттаивают сначала путем погружения их в своих контейнерах в воду при примерно 40°С на 2 мин и затем оставляют их медленно размораживаться полностью. Смесь клеток и криоконсервантов затем пипеткой наносят на фильтр, положенный сверху слоя фидер-клеток BMS при 25°С. После того, как размороженная ткань начинает расти, ее переносят обратно на свежую плотную культуральную среду, и после адаптации (в течение 1-2 недель) далее переносят в среду для суспензионной клеточной культуры. После повторного установления роста жидкой суспензионной культуры клетки используют для трансформации.Optionally, suspension cultures prepared as described above are cryopreserved using cryopreservatives and methods described for example in US Pat. two hours. The resulting mixture was kept at ice temperature, in which the final volume of the cryopreservative is equal to the volume of the cell suspension. Final concentrations of cryopreservatives, for example, are 10% dimethyl sulfoxide, 10% polyethylene glycol (molecular weight 6000), 0.23 M L-proline and 0.23 M glucose. After a 30-minute equilibration period, the mixture is aliquoted in approximately 0.5 ml aliquots, transferred to 2-ml microcentrifuge tubes and slowly cooled to -8 ° C at a rate of 0.5 ° C / min. After a period of ice nucleation, the sample is then slowly cooled to -35 ° C and then immersed in liquid nitrogen. If necessary, the frozen samples are thawed first by immersing them in their containers in water at about 40 ° C for 2 minutes and then leave them slowly thawing completely. The mixture of cells and cryopreservatives is then pipetted onto a filter placed on top of the BMS feeder cell layer at 25 ° C. After thawed tissue begins to grow, it is transferred back to a fresh, dense culture medium, and after adaptation (within 1-2 weeks) it is then transferred to a suspension cell culture medium. After re-establishing the growth of the liquid suspension culture, the cells are used for transformation.
Трансформация с помощью частицParticle Transformation
ДНК, производную от плазмиды pIGPD9 (фиг.12), включающую XmaI-экспрессионные кассеты EPSPS (а именно pZEN9i, ZEN11i, ZEN12i, ZEN14i и т.д.), очищают, концентрируют (например, с помощью анионообменной хроматографии или денситометрического выделения плазмидной ДНК в градиенте хлорида цезия из клеток подходящего штамма-хозяина HisB-, RecA- E.coli (например, DH5α : hisB-) после роста до стационарной фазы культуры в минимальной среде 5хА (К2НРО4 52,5 г, KH2PO4 22,5 г, (NH4)2SO4 5 г и цитрат натрия· 2Н2O 2,5 г на литр) и представляют в виде концентрированного раствора (предпочтительно примерно 1 мг/мл) в стерильной воде. ДНК получают в виде кольцевой плазмидной ДНК или, альтернативно, в виде ДНК, расщепленной рестриктазой ХmаI с получением линейной экспрессионной кассеты, включающей EPSPS-фрагмент, и используют ее после очистки методом электрофореза в агарозном геле и электроэлюции.DNA derived from the plasmid pIGPD9 (Fig. 12), including EPSMA Xma-expression cassettes (namely pZEN9i, ZEN11i, ZEN12i, ZEN14i, etc.), is purified, concentrated (for example, using anion exchange chromatography or densitometric isolation of plasmid DNA in a gradient of cesium chloride from cells of a suitable host strain HisB-, RecA- E.coli (e.g. DH5α: hisB-) after growth to the stationary phase of the culture in minimal medium 5xA (K 2 NRA 4 52.5 g, KH 2 PO 4 22.5 g, (NH 4) 2 SO 4 5 g and sodium citrate · 2H 2 O 2,5 g per liter) and are in the form of a concentrated solution (preferably 1 g / ml) in sterile water. DNA is prepared in the form of circular plasmid DNA or, alternatively, as DNA, digested with HmaI to obtain a linear expression cassette comprising EPSPS-fragment and use it after purification by agarose gel electrophoresis and electroelution.
Подходящим устройством для бомбардировки является, например, гелиевое ружье Biorad PDS1000. Чашку помещают на 5-6 см ниже блокирующего экрана, используемого для остановки каптонных макрочастиц. ДНК-конструкцию осаждают на частицы из вольфрама или золота, имеющие диаметр примерно 1,0 мкм, по аналогичной методике, как описано Klein et al., 1987, Nature, 327, 70-73. Например, 1,25-мг вольфрамовых или золотых частиц (предварительно промытых этанолом при 65°С в течение 12 ч) смешивают последовательно в следующем порядке: с примерно 20-30 мг ДНК, 1,1 М CaCl2 и 8,7 мМ спермидина до конечного объема примерно 0,6 мл. Смесь перемешивают в течение 10 мин при 0-4°С, подвергают низкоскоростному центрифугированию (примерно 500g) в течение 5 мин и концентрат супернатанта декантируют таким образом, чтобы оставить вольфрамовые частицы, суспендированные в конечном объеме примерно 30 мл. Аликвоты по 1-10 мкл пипеткой наносят на макрочастицы ружья.A suitable bombardment device is, for example, the Biorad PDS1000 helium gun. The cup is placed 5-6 cm below the blocking screen used to stop kapton particulates. The DNA construct is deposited on particles of tungsten or gold having a diameter of about 1.0 μm, in a similar manner as described by Klein et al., 1987, Nature, 327, 70-73. For example, 1.25 mg of tungsten or gold particles (pre-washed with ethanol at 65 ° C for 12 hours) are mixed sequentially in the following order: with about 20-30 mg of DNA, 1.1 M CaCl 2 and 8.7 mm spermidine to a final volume of about 0.6 ml. The mixture is stirred for 10 minutes at 0-4 ° C., subjected to low speed centrifugation (about 500 g) for 5 minutes, and the supernatant concentrate is decanted so as to leave tungsten particles suspended in a final volume of about 30 ml. Aliquots of 1-10 μl are pipetted onto the gun particles.
Суспензионные культуры, производные от каллюса II-го типа и/или III-го типа, поддерживают в культуре в течение 3-5 месяцев (или, альтернативно, выделяют после криоконсервации), заново субкультивируют и затем просеивают через сито из нержавеющей стали с ячейкой примерно 0,5-1,0 мм. Затем приблизительно 0,5 мл объема собранных клеток, выделенных из фильтрата, пипеткой наносят на бумажные фильтры размером 5 см и высушивают в вакууме с последующим переносом в чашку Петри, содержащую “сэндвич” из трех 7-см бумажных фильтров, смоченных средой для суспензионной культуры. Каждую чашку с клеточной суспензией центруют на лотке для чашек с образцами, убирают крышку чашки Петри и подвергают двукратной бомбардировке в вакууме 28 дюймов рт.ст. Экраны 0,1 или 1,0 мм помещают примерно на 2,5 см ниже стоп-пластины для ослабления повреждаемости бомбардируемой ткани. После бомбардировки растительные клетки удаляют с фильтра, снова ресуспендируют в среде для клеточной суспензионной культуры и культивируют в течение 2-21 дней. Альтернативно, подвергнутый бомбардировке каллюс переносят с чашки на чашку в конечном счете на чашку, содержащую аналогичную плотную среду (например, содержащую 8 г/л очищенного агара) и аналогично культивируют при примерно 25°С в темноте.Suspension cultures derived from type II and / or type III callus are maintained in the culture for 3-5 months (or alternatively isolated after cryopreservation), subcultured again and then sieved through a stainless steel sieve with a mesh of 0.5-1.0 mm. Then, approximately 0.5 ml of the volume of the collected cells isolated from the filtrate was pipetted onto 5 cm paper filters and dried in vacuum, followed by transfer to a Petri dish containing a “sandwich” of three 7 cm paper filters moistened with suspension culture medium . Each cell suspension plate was centered on the sample dish tray, the lid of the Petri dish was removed and subjected to double bombardment in a vacuum of 28 inches Hg. Screens of 0.1 or 1.0 mm are placed approximately 2.5 cm below the stop plate to reduce the damage to the bombarded tissue. After the bombardment, the plant cells are removed from the filter, resuspended in cell suspension culture medium and cultured for 2-21 days. Alternatively, the bombarded callus is transferred from dish to dish ultimately to a dish containing a similar solid medium (for example, containing 8 g / l of purified agar) and likewise cultured at about 25 ° C. in the dark.
Отбор трансформантовSelection of transformants
После трансформации клетки, растущие без отбора в жидкой или плотной культуре, переносят на фильтры и переслаивают на плотную среду, содержащую диапазон (0,1-20 мМ) селективных концентраций N-(фосфонометил)глицина чистоты для тканевых культур (Sigma). Подходящими плотными селективными средами являются среды, доведенные до рН 5,8 или 6,0 с помощью КОН, содержащие соли либо MS, либо N6 (такие как те, которые описаны выше для инициации каллюсов, или, с соответствующим добавлением агара, те, которые описаны выше для роста клеток в жидкой суспензии) и N-(фосфонометил)глицин. Также подходящими селективными средами являются, например, селективные среды, описанные в примере 11, но в данном случае модифицированные так, чтобы не содержать антибиотики. Трансформированные каллюсы, экспрессирующие резистентный фермент ЕРSР-синтазу, отбирают на основе их роста при концентрациях, являющихся ингибиторными для аналогичных препаратов нетрансформированных клеток. Растущие скопления пересевают на свежую селективную среду. Предпочтительно концентрация N-(фосфонометил)глицина, используемого в селективной среде, составляет примерно 1 мМ в первые две недели отбора и примерно 3 мМ после этого. Через 6-18 недель предполагаемые резистентные каллюсы идентифицируют и отбирают.After transformation, cells growing without selection in a liquid or dense culture are transferred to filters and layered on a solid medium containing a range (0.1-20 mm) of selective concentrations of N- (phosphonomethyl) glycine purity for tissue cultures (Sigma). Suitable dense selective media are those adjusted to a pH of 5.8 or 6.0 with KOH, containing either MS or N6 salts (such as those described above for initiating calluses or, with appropriate addition of agar, those that described above for cell growth in liquid suspension) and N- (phosphonomethyl) glycine. Also suitable selective media are, for example, the selective media described in Example 11, but in this case modified so as not to contain antibiotics. Transformed calluses expressing the resistant enzyme EPP synthase are selected based on their growth at concentrations that are inhibitory for similar preparations of untransformed cells. Growing clusters are subcultured on fresh selective medium. Preferably, the concentration of N- (phosphonomethyl) glycine used in the selective medium is about 1 mM in the first two weeks of selection and about 3 mM thereafter. After 6-18 weeks, putative resistant calluses are identified and selected.
Регенерация трансформантов, размножение и анализ трансформированного растительного материалаTransformants regeneration, propagation and analysis of transformed plant material
Отобранные каллюсы регенерируют в нормальные фертильные растения в соответствии, например, с методами, описанными Duncan et al. (1985, Planta, 165, 322-332), Kamo et al (1985, Bot. Gaz. 146(3), 327-334) и/или West et al. (1993, The Plant Cell, 5, 1361-1369), и/или Shillito et al. (1989) Bio/Technol. 7, 581-587).Selected calluses are regenerated in normal fertile plants according to, for example, the methods described by Duncan et al. (1985, Planta, 165, 322-332), Kamo et al (1985, Bot. Gaz. 146 (3), 327-334) and / or West et al. (1993, The Plant Cell, 5, 1361-1369), and / or Shillito et al. (1989) Bio / Technol. 7, 581-587).
Например, растения эффективно регенерируются путем переноса эмбриогенного каллюса в среду Мурасиге-Скоога, доведенную до рН 6,0, содержащую 0,25 мг/л 2,4-D, 10 мг/л 6-бензиламинопурина и, необязательно, от 0,02 до 1 мМ N-(фосфонометил)глицина. Спустя примерно 2 недели ткань переносят в аналогичную среду, но лишенную гормонов. Необязательно, содержание гормонов снижают постепенно с помощью большего числа переносов и за более длительный период времени вплоть до 6-8 недель. Побеги, которые развиваются через 2-4 недели, переносят в среду MS, содержащую 1% сахарозы, и уплотняют ее 2 г/л Gelgro, в которую затем прорастают корешки.For example, plants are efficiently regenerated by transferring embryogenic callus to Murashige-Skoga medium, adjusted to pH 6.0, containing 0.25 mg /
Альтернативные способы и среды, применяемые для регенерации, соответствуют описанным в примере 1, за исключением того, что используемые среды не содержат антибиотиков.Alternative methods and media used for regeneration are as described in Example 1, except that the media used do not contain antibiotics.
Способы выращивания растений до созревания, дальнейшего размножения растений в ряду поколений, анализа наследования резистентности к глифосату и анализа присутствия, целостности и экспрессии трансгена EPSPS соответствуют описанным в примере 11.Methods of growing plants to maturity, further propagation of plants in a series of generations, analysis of inheritance of glyphosate resistance and analysis of the presence, integrity and expression of the EPSPS transgene correspond to those described in example 11.
Пример 13Example 13
Трансформация линий кукурузы ДНК, включающей экспрессионную кассету EPSPS, нанесенной на вискеры из карбида кремния: отбор и регенерация растительных клеток и растений, которые резистентны к глифосатуTransformation of maize DNA lines including an EPSPS expression cassette applied to silicon carbide whiskers: selection and regeneration of plant cells and plants that are resistant to glyphosate
В следующем примере линии кукурузы, включая, например, гибридные линии с генотипом А188× В73, получают в виде клеточных суспензий и трансформируют путем контактирования клеток с вискерами из карбида кремния, покрытыми ДНК, с использованием методов, сущность которых описана Frame et al. (1994, Plant J. 6, 941-948). Как было описано в предыдущих примерах, трансформированный каллюс, полученный таким путем, отбирают исходя из различного роста в среде, содержащей ряд концентраций глифосата, регенерируют в проростки (Т0), которые выращивают до созревания, и либо самоопыляют, либо перекрестно опыляют с получением семян потомства (T1) для дальнейшего воспроизведения. Растения и растительный материал оценивают на резистентность к глифосату и анализируют на присутствие, целостность и экспрессию трансгена в соответствии с описанным в предыдущих примерах.In the following example, maize lines, including, for example, hybrid lines with the A188 × B73 genotype, are obtained as cell suspensions and transformed by contacting cells with DNA coated silicon carbide whiskers using methods described in Frame et al. (1994, Plant J. 6, 941-948). As described in the previous examples, the transformed callus obtained in this way is selected on the basis of different growth in a medium containing a number of glyphosate concentrations, regenerated in seedlings (T 0 ), which are grown before maturation, and either self-pollinated or cross-pollinated to obtain seeds offspring (T 1 ) for further reproduction. Plants and plant material are evaluated for glyphosate resistance and analyzed for the presence, integrity and expression of the transgene as described in the previous examples.
Инициация каллюса из недоразвитых зародышей, получение суспензионных клеточных культурInitiation of callus from underdeveloped embryos, obtaining suspension cell cultures
Суспензии клеток кукурузы, пригодные для трансформации, необязательно подвергают криоконсервации и представляют таким же образом, как это описано в примере 12.Corn cell suspensions suitable for transformation are optionally cryopreserved and presented in the same manner as described in Example 12.
ТрансформацияTransformation
ДНК, производную от плазмиды pIGPD9 (фиг.12), включающую XmaI-экспрессионные кассеты EPSPS (а именно pZEN9i, ZEN11i, ZEN12i, ZEN14i и т.д.), очищают, концентрируют (например, с помощью анионообменной хроматографии или денситометрического выделения плазмидной ДНК в градиенте хлорида цезия из клеток подходящего штамма-хозяина HisB-, RecA- E.coli (например, DH5α : hisB-) после роста до стационарной фазы культуры в минимальной среде 5× А (К2НРO4 52,5 г, КН2РO4 22,5 г, (NH4)2SO4 5 г и цитрат натрия· 2Н2O 2,5 г на литр) и представляют в виде концентрированного раствора (предпочтительно примерно 1 мг/мл) в стерильной воде. ДНК получают в виде кольцевой плазмидной ДНК или, альтернативно, в виде ДНК, расщепленной рестриктазой XmaI с получением линейной экспрессионной кассеты, включающей EPSPS-фрагмент, и используют ее после очистки методом электрофореза в агарозном геле и электроэлюции.DNA derived from the plasmid pIGPD9 (Fig. 12), including EPSMA Xma-expression cassettes (namely pZEN9i, ZEN11i, ZEN12i, ZEN14i, etc.), is purified, concentrated (for example, using anion exchange chromatography or densitometric isolation of plasmid DNA in a gradient of cesium chloride from cells of a suitable host strain HisB-, RecA- E.coli (e.g. DH5α: hisB-) after growth to the stationary phase of the culture in a minimal medium of 5 × A (K 2 HPO 4 52.5 g, KH 2 PO 4 22.5 g, (NH 4 ) 2 SO 4 5 g and sodium citrate · 2H 2 O 2.5 g per liter) and are presented as a concentrated solution (preferably approximately 1 mg / ml) in sterile water.The DNA is obtained as circular plasmid DNA or, alternatively, as DNA digested with restriction enzyme XmaI to give a linear expression cassette comprising an EPSPS fragment and is used after purification by agarose gel electrophoresis and electroelution .
Трансформацию проводят в точном соответствии с описанным у Frame et al. Альтернативно, процедуру в некоторой степени модифицируют, как описано ниже.The transformation is carried out exactly as described by Frame et al. Alternatively, the procedure is modified to some extent, as described below.
Клетки, выращенные в жидкой среде для клеточных суспензий, через день после субкультивирования оставляют отстаиваться в шейкерной колбе. Истощенную среду декантируют и отбрасывают, после чего 12 мл среды N6 (Сhu et al., 1975) при рН 6,0, модифицированной так, чтобы содержать 6 мМ L-пролина, 20 г/л сахарозы, 2 мг/л 2,4-D, 0,25 М сорбита и 0,25 М маннита, добавляют в расчете на объем 4 мл клеточного сгустка. Колбу возвращают в шейкер (роторное перемешивание при 125 об/мин, инкубация при 26-28°С) на 45 мин. По прошествии этого времени аликвоты по 1 мл клеточной суспензии переносят с использованием пипетки с широким отверстием в серию стерильных микроцентрифужных пробирок. После отстаивания клеток в каждой пробирке удаляют по 0,6 мл супернатанта истощенной среды так, чтобы остаток в основном состоял от отстоянных клеток. 50 мг вискеров из карбида кремния (вискеры Silar SC-9: Advanced Composite Materials Corp., Greer, SC, США) суспендируют на вортексе в 1 мл модифицированной среды N6, описанной выше. Затем 40 мл таких суспендированных вискеров и 25 мг плазмидной или линейной ДНК, включающей экспрессионную кассету EPSPS, добавляют в каждую пробирку с отстоявшимися клетками. Пробирки взбалтывают вручную 2-3 раза, взвихривают 1 с (с помощью стоматологического миксера Mixomat, (Degussa, Ontario, Канада)) и затем по 0,3 мл среды N6 (модифицированной в соответствии с описанным выше) добавляют в каждую микроцентрифужную пробирку. После этого суспендированные клетки высевают (200 мкл на чашку) на дисковый фильтр, наслоенный поверх среды N6 (та же модификация среды N6, которая описана выше, но при отсутствии сорбита и маннита и содержании 30 г/л сахарозы и 3 г/л гельрита). Затем каждую чашку оборачивают лентой Urgopore (Stelrico, Brussels) и оставляют инкубироваться в темноте в течение 1 недели при 26-28°С.Cells grown in cell suspension liquid are allowed to settle in a shaker flask one day after subculture. The depleted medium is decanted and discarded, after which 12 ml of N6 medium (Chu et al., 1975) at pH 6.0, modified to contain 6 mM L-proline, 20 g / l sucrose, 2 mg / l 2.4 -D, 0.25 M sorbitol and 0.25 M mannitol are added based on a volume of 4 ml of cell clot. The flask is returned to the shaker (rotary stirring at 125 rpm, incubation at 26-28 ° C) for 45 minutes. After this time, 1 ml aliquots of the cell suspension are transferred using a wide-opening pipette into a series of sterile microcentrifuge tubes. After settling of the cells in each tube, 0.6 ml of the supernatant of the depleted medium is removed so that the remainder mainly consists of the defended cells. 50 mg of silicon carbide whiskers (Silar SC-9 whiskers: Advanced Composite Materials Corp., Greer, SC, USA) are suspended on a vortex in 1 ml of the modified N6 medium described above. Then, 40 ml of such suspended whiskers and 25 mg of plasmid or linear DNA, including the EPSPS expression cassette, are added to each settling tube. The tubes are shaken manually 2-3 times, vortexed for 1 s (using a Mixomat dental mixer, (Degussa, Ontario, Canada)) and then 0.3 ml of N6 medium (modified as described above) is added to each microcentrifuge tube. After this, suspended cells are seeded (200 μl per dish) onto a disk filter layered on top of N6 medium (the same modification of N6 medium as described above, but in the absence of sorbitol and mannitol and containing 30 g / l sucrose and 3 g / l gelrite) . Then each cup is wrapped with Urgopore tape (Stelrico, Brussels) and left to incubate in the dark for 1 week at 26-28 ° C.
Отбор трансформантовSelection of transformants
Трансформированный каллюс отбирают, как описано в примере 12 или, альтернативно, как описано Frame et al., 1994, за исключением того, что используют N-(фосфонометил)глицин в диапазоне концентраций от 1 до 5 мМ вместо биалафоса, указанного в публикации Frame et al.Transformed callus was selected as described in example 12 or, alternatively, as described by Frame et al., 1994, except that N- (phosphonomethyl) glycine was used in a concentration range of 1 to 5 mM instead of the bialaphos indicated in Frame et al.
Регенерация трансформантов, размножение и анализ трансформированного растительного материалаTransformants regeneration, propagation and analysis of transformed plant material
Растения регенерируют, воспроизводят и скрещивают, как описано в примере 12. Растения анализируют на резистентность к глифосату, а растительный материал тестируют на присутствие, целостность и экспрессию трансгена, как описано в примере 12.Plants regenerate, reproduce and cross, as described in example 12. Plants are analyzed for glyphosate resistance, and plant material is tested for the presence, integrity and expression of the transgene, as described in example 12.
Пример 14Example 14
Трансформация линий риса с использованием штамма Agrobacterium, несущего супербифункциональный вектор, который включает экспрессионную кассету EPSPS между правым и левым граничными сайтами Т-ДНК: отбор и регенерация растительных клеток и растений, которые резистентны к глифосатуTransformation of rice lines using an Agrobacterium strain carrying a superbifunctional vector that includes an EPSPS expression cassette between the right and left T-DNA border sites: selection and regeneration of plant cells and plants that are glyphosate resistant
В следующем примере зародышевые щитки выделяют из зрелых семян подходящих линий риса (например, включая сорта Koshihikari, Tsukinohikari и Asanohikari) и дедифференцируют, а полученные в результате каллюсы трансформируют инфицированием Agrobacterium. После отбора и регенерации получают трансгенные проростки (Т0), которые выращивают до созревания и либо самоопыляют, либо перекрестно опыляют с получением семян потомства (T1) для дальнейшего размножения. Растения и растительный материал оценивают по резистентности к глифосату и анализируют на присутствие, целостность и экспрессию трансгена, как описано в предыдущих примерах. В качестве альтернативы способам, описанным ниже, способы, описанные в примере 1 US 5591616, подходящим образом приспособленные для использования глифосата вместо гигромицина, используют для отбора.In the following example, germinal shields are isolated from mature seeds of suitable rice lines (for example, including the varieties Koshihikari, Tsukinohikari and Asanohikari) and dedifferentiate, and the resulting calluses are transformed with Agrobacterium infection. After selection and regeneration, transgenic seedlings (T 0 ) are obtained, which are grown before maturation and either self-pollinated or cross-pollinated to produce offspring seeds (T 1 ) for further propagation. Plants and plant material are evaluated for glyphosate resistance and analyzed for the presence, integrity and expression of the transgene, as described in the previous examples. As an alternative to the methods described below, the methods described in Example 1 of US 5591616, suitably adapted to use glyphosate instead of hygromycin, are used for selection.
Конструирование штамма Agrobacterium: получение суспензии AgrobaсteriumConstruction of a strain of Agrobacterium: obtaining a suspension of Agrobaсterium
Штамм Agrobacterium, несущий супербифункциональный вектор, включающий желательную экспрессионную кассету EPSPS между первым и левым граничными сайтами, конструируют (трансформируя Agrobacterium с применением электропорации плазмидной ДНК), как описано в примере 1. Суспензии получают способами, описанными в примере 1. Альтернативно, трансформированный штамм Agrobacterium выращивают в течение 3 дней в среде АВ (Chilton et al., 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3672-3676), содержащей подходящий селективный антибиотик (например, 50 мг/л спектиномицина в случае LBA4404 (pSB1ZEN18 и т.д.)), и снимают петлей с чашки для формирования суспензии в среде ААМ (Hiei et al., 1994, The Plant Journal, 6(2), 271-282) при плотности 1-5× 109 клеток/мл.An Agrobacterium strain carrying a superbifunctional vector including the desired EPSPS expression cassette between the first and left boundary sites is constructed (transforming Agrobacterium using plasmid DNA electroporation) as described in Example 1. Suspensions are prepared by the methods described in Example 1. Alternatively, the transformed Agrobacterium strain grown for 3 days in AB medium (Chilton et al., 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3672-3676) containing a suitable selective antibiotic (e.g., 50 mg / L spectinomycin in the case of LBA4404 (pSB1ZEN18 etc.)), and remove n aphids from the cup to form a suspension in AAM medium (Hiei et al., 1994, The Plant Journal, 6 (2), 271-282) at a density of 1-5 × 10 9 cells / ml.
Сорта риса, получение каллюса из щиткаVarieties of rice, receiving callus from the flap
Сортами риса являются, например, сорта Tsukinohikari, Asanohikari и Koshihikari Oryza sativa L.Rice varieties are, for example, Tsukinohikari, Asanohikari and Koshihikari Oryza sativa L.
Зрелые семена отшелушивают, поверхность стерилизуют промывкой 70%-ным этанолом и затем замачивают в течение 30 мин в 1,5% NaOCl. После промывки в стерильной воде семена культивируют при 30°С в темноте в течение 3 недель при рН 5,8 в среде 2N6, содержащей основные соли, минорные соли и витамины среды N6 (Сhu, 1978, in Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking: Science Press, pp. 43-50), 30 г/л сахарозы, 1 г/л гидролизата казеина, 2 мг/л 2,4-D и 2 г/л гельрита. Производные от семенного щитка пролиферированные клетки каллюса пересевают в течение 3-7 дней в свежую среду 2N6. Растущий каллюс (диаметром 1-2 мм) отбирают, суспендируют в жидкой среде 2N6 (без гельрита) и культивируют в колбах в темноте на роторном шейкере при 125 об/мин при 25°С. Среду заменяют каждые 7 дней. Для трансформации используют клетки, растущие в логарифмической фазе после 3-4 субкультивирования.Mature seeds are exfoliated, the surface is sterilized by washing with 70% ethanol and then soaked for 30 minutes in 1.5% NaOCl. After washing in sterile water, the seeds were cultured at 30 ° C in the dark for 3 weeks at pH 5.8 in 2N6 medium containing basic salts, minor salts and vitamins N6 (Schu, 1978, in Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking: Science Press, pp. 43-50), 30 g / l sucrose, 1 g / l casein hydrolyzate, 2 mg /
Инфицирование, трансформация и отборInfection, transformation and selection
Суспендированные каллюсные клетки риса оставляют отстаиваться из суспензии, и затем их ресуспендируют в суспензии Agrobacterium, оставляя в контакте в течение нескольких минут, и после этого опять оставляют отстаиваться, без промывки высевают на среду 2N6-AS (среда 2N6, доведенная до рН 5,2 и содержащая 10 г/л D-глюкозы и 100 мМ ацетосирингона) и инкубируют в темноте при 25°С в течение 3-5 дней. Растущий материал тщательно промывают 250 мг/л цефотаксима в стерильной воде и затем переносят на среду 2N6-CH (среда 2N6, доведенная до рН 5,8 с помощью КОН, содержащая 250 мг/л цефотаксима и 0,5-5 мМ N-(фосфонометил)глицина чистоты для тканевых культур) или, альтернативно, среду 2N6K-CH (среда 2N6, модифицированная, как описано Hiei et al., 1994, но вместо гигромицина содержащая 0,5-5 мМ N-(фосфонометил)глицина чистоты для тканевых культур) и культивируют в течение 3 недель в темноте при 25°С. Пролиферировавшие колонии субкультивируют на вторую чашку с селективной средой на дополнительный срок 7-14 дней.Suspended rice callus cells are allowed to settle from the suspension, and then they are resuspended in an Agrobacterium suspension, leaving in contact for several minutes, and then again left to settle, without washing, plated on 2N6-AS medium (2N6 medium adjusted to pH 5.2 and containing 10 g / l D-glucose and 100 mm acetosyringone) and incubated in the dark at 25 ° C for 3-5 days. The growing material is thoroughly washed with 250 mg / l cefotaxime in sterile water and then transferred to 2N6-CH medium (2N6 medium adjusted to pH 5.8 with KOH containing 250 mg / l cefotaxime and 0.5-5 mM N- ( phosphonomethyl) glycine of purity for tissue cultures) or, alternatively, 2N6K-CH medium (2N6 medium modified as described by Hiei et al., 1994, but instead of hygromycin containing 0.5-5 mM N- (phosphonomethyl) glycine of purity for tissue cultures) and cultured for 3 weeks in the dark at 25 ° C. The proliferating colonies are subcultured onto a second plate with selective medium for an additional period of 7-14 days.
Регенерация и анализ растенийPlant regeneration and analysis
Растущие колонии высевают на регенерационную среду при рН 5,8, содержащую половину концентрации основных солей N6, минорные соли N6, аминокислоты N6, витамины среды АА (Chilton et al, 1974), 1 г/л гидролизата казеина, 20 г/л сахарозы, 0,2 мг/л нафталинуксусной кислоты, 1 мг/л кинетина, 3 г/л гельрита и, необязательно, 0,04-0,1 мМ N-(фосфонометил)глицина. Такие чашки инкубируют при 25°С и выдерживают в условиях постоянного освещения (примерно 2000 люкс). Как описано в примере 11, регенерированные растения в конечном счете переносят в горшки с почвой и выращивают до созревания в теплице.Growing colonies are seeded on a regeneration medium at pH 5.8, containing half the concentration of basic salts N6, minor salts N6, amino acids N6, vitamins AA (Chilton et al, 1974), 1 g / l casein hydrolyzate, 20 g / l sucrose, 0.2 mg / l naphthalene acetic acid, 1 mg / l kinetin, 3 g / l gelrite and, optionally, 0.04-0.1 mM N- (phosphonomethyl) glycine. Such plates are incubated at 25 ° C and incubated in constant light (approximately 2000 lux). As described in Example 11, the regenerated plants are eventually transferred to pots with soil and grown to maturity in a greenhouse.
Растения размножают и скрещивают (например, самоопыляют трансгенные растения), по существу как описано в примере 11. Растения анализируют на резистентность к глифосату и растительный материал тестируют на присутствие, целостность и экспрессию трансгена, по существу как описано в примере 11.Plants propagate and cross (for example, self-pollinate transgenic plants), essentially as described in Example 11. Plants are tested for glyphosate resistance and plant material is tested for the presence, integrity and expression of the transgene, essentially as described in Example 11.
Пример 15Example 15
Трансформация линий пшеницы с использованием ДНК, которая включает экспрессионную кассету EPSPS, с помощью бомбардировки микрочастицами; отбор и регенерация растительных клеток и растений, которые резистентны к глифосатуTransformation of wheat lines using DNA, which includes an EPSPS expression cassette, using microparticle bombardment; selection and regeneration of plant cells and plants that are resistant to glyphosate
В следующем примере недоразвитые зародыши выделяют на материале подходящих линий пшеницы (включая, например, яровую пшеницу сортов BobWhite или Jaggar), инкубируют в среде, содержащей гормон (2,4-D), в течение 2 дней и трансформируют путем бомбардировки частицами, покрытыми ДНК. После периода выделения и последующего роста каллюса каллюсные зародыши субкультивируют через серию сред, содержащих фиксированный уровень глифосата и (в серийном разведении) снижающиеся уровни 2,4-D таким образом, что индуцируется соматический эмбриогенез. Отобранный материал регенерируют с образованием побегов в среде, также содержащей глифосат, переносят в среду для развития корешков и, как и в предыдущих примерах с кукурузой, регенерируют в проростки (То), которые выращивают до созревания и либо самоопыляют, либо перекрестно опыляют с получением семян потомства (T1) для дальнейшего размножения. Растения и растительный материал оценивают по резистентности к глифосату и анализируют на присутствие, целостность и экспрессию трансгена, как описано в предыдущих примерах. В качестве альтернативы способам, описанным далее, используют способы, описанные в примере 1 US 5631152.In the following example, underdeveloped embryos are isolated on the material of suitable wheat lines (including, for example, spring wheat of varieties BobWhite or Jaggar), incubated in a medium containing hormone (2,4-D) for 2 days and transformed by bombardment with particles coated with DNA . After a period of isolation and subsequent growth of callus, callus embryos are subcultured through a series of media containing a fixed level of glyphosate and (serial dilution) lowering levels of 2,4-D in such a way that somatic embryogenesis is induced. The selected material is regenerated to shoots in a medium also containing glyphosate, transferred to the root development medium, and, as in the previous examples with corn, regenerated in seedlings (T o ), which are grown before maturation and either self-pollinated or cross-pollinated to obtain seed offspring (T 1 ) for further reproduction. Plants and plant material are evaluated for glyphosate resistance and analyzed for the presence, integrity and expression of the transgene, as described in the previous examples. As an alternative to the methods described below, use the methods described in example 1 of US 5631152.
Получение недоразвитых зародышейObtaining Underdeveloped Embryos
Линии пшеницы (например, обыкновенная пшеница Triticum aestivum ярового сорта BobWhite) выращивают до созревания в теплице, и зерновки выделяют на 11-15-й день после опыления. Зерновки стерилизуют по поверхности обработкой в течение 15 мин 5%-ным NaOCl и затем промывают несколько раз стерильной водой. Недоразвитые зародыши в стерильных условиях помещают на 3 см2 нейлоновой сети (размер ячейки 1,5 мм), расположенной поверх среды А2. Среда А2, доведенная до рН 5,8, содержит 4,32 г/л солей Мурасиге-Скоога, 20 г/л сахарозы, 0,5 г/л L-глутамина, 2 мг/л 2,4-D, 100 мг/л гидролизата казеина, 2 мг/л глицина, 100 мг/л миоинозитола, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,1 мг/л гидрохлорида тиамина и 2,5 г/л гельрита. Зародыши размещают на плотном диске 2,5 см в числе приблизительно 50. Чашки закрывают лейкопоровой лентой и инкубируют при 25°С в темноте в течение 2 дней. За 4 ч до проведения бомбардировки зародыши переносят на чашки, содержащие свежую среду А2, дополненную 36,44 г/л D-сорбита и 36,44 г/л D-маннита. Зародыши переносят с чашки на чашку с помощью нейлоновой сетки, на которой они размещены. Зародыши находятся на указанной среде с повышающейся осмотической силой в течение 4 ч при 25°С в темноте перед последующей бомбардировкой.Wheat lines (for example, ordinary wheat Triticum aestivum spring varieties BobWhite) are grown to maturity in the greenhouse, and grains are isolated on the 11-15th day after pollination. Cereals are surface sterilized by treatment with 15% NaOCl for 15 minutes and then washed several times with sterile water. Under sterile embryos are placed under sterile conditions on 3 cm 2 of a nylon network (cell size 1.5 mm) located on top of A2 medium. Medium A2, adjusted to pH 5.8, contains 4.32 g / l of Murashige-Scoog salts, 20 g / l of sucrose, 0.5 g / l of L-glutamine, 2 mg /
Трансформация с помощью частицParticle Transformation
ДНК, производную от плазмиды pIGPD9 (фиг.12), включающую XmaI-экспрессионные кассеты EPSPS (а именно pZEN9i, ZEN11i, ZEN12i, ZEN14i и т.д.), очищают, концентрируют (например, с помощью анионообменной хроматографии или денситометрического выделения плазмидной ДНК в градиенте хлорида цезия из клеток подходящего штамма-хозяина HisB-, RecA- E. coli (например, DH5α : hisB-) после роста до стационарной фазы культуры в минимальной среде 5хА (К2НРO4 52,5 г, КН2РО4 22,5 г, (NH4)2SO4 5 г и цитрат натрия· 2Н2O 2,5 г на литр) и представляют в виде концентрированного раствора (предпочтительно примерно 1 мг/мл) в стерильной воде. ДНК получают в виде кольцевой плазмидной ДНК или, альтернативно, в виде ДНК, расщепленной рестриктазой XmaI с получением линейной экспрессионной кассеты, включающей EPSPS-фрагмент, и используют ее после очистки методом электрофореза в агарозном геле и электроэлюции.DNA derived from the plasmid pIGPD9 (FIG. 12), including EPSMA XmaI expression cassettes (namely pZEN9i, ZEN11i, ZEN12i, ZEN14i, etc.), is purified, concentrated (for example, by anion exchange chromatography or densitometric isolation of plasmid DNA in a gradient of cesium chloride from cells of a suitable host strain HisB-, RecA- E. coli (e.g., DH5α: hisB-) after growth to a stationary phase of the culture in minimal medium 5xA (K 2 HPO 4 52.5 g, KH 2 PO 4 22.5 g, (NH 4 ) 2 SO 4 5 g and sodium citrate · 2H 2 O 2.5 g per liter) and are presented as a concentrated solution (preferably approximately 1 mg / ml) in sterile water. DNA is obtained as circular plasmid DNA or, alternatively, as DNA digested with restriction enzyme XmaI to give a linear expression cassette comprising an EPSPS fragment and is used after purification by agarose gel electrophoresis and electroelution .
Частицы получают и покрывают ДНК по аналогичной методике, как описано Klein et al, 1987, Nature, 327, 70-73. Получение покрытых ДНК частиц и работа с “генным ружьем” соответствует описанному в примере 2. Альтернативно, некоторые подробности таковы. Например, 60 мг золотых или вольфрамовых частиц (примерно 1,0 мкм) в микроцентрифужной пробирке промывают несколько раз этанолом ВЭЖХ-чистоты и затем несколько раз в стерильной воде. Частицы ресуспендируют в 1 мл стерильной воды и аликвотами по 50 мкл распределяют по микроцентрифужным пробиркам. Золотые частицы хранят при 4°С, вольфрамовые частицы при -20°С. По 3 мг ДНК добавляют к каждой аликвоте (размороженных) частиц и содержимое пробирок перемешивают на вортексе с максимальной скоростью. Поддерживая практически непрерывное интенсивное перемешивание, добавляют 50 мкл 2,5 М CaCl2 и 20 мкл 0,1 М спермидина. Через 10 мин последующего встряхивания образцы центрифугируют в течение 5 с на эппендорфовской микроцентрифуге, супернатант удаляют и частицы промывают последовательно добавляемым этанолом ВЭЖХ-чистоты. Частицы тщательно ресуспендируют в 60 мкл этанола и затем распределяют аликвотами по 10 мкл на поверхности каждого макроносителя, которые должны быть использованы в генном ружье PDS1000.Particles are prepared and coated with DNA in a similar manner as described by Klein et al, 1987, Nature, 327, 70-73. Obtaining DNA-coated particles and working with a “gene gun” is as described in Example 2. Alternatively, some of the details are as follows. For example, 60 mg of gold or tungsten particles (approximately 1.0 μm) in a microcentrifuge tube is washed several times with ethanol HPLC-purity and then several times in sterile water. Particles are resuspended in 1 ml of sterile water and 50 μl aliquots are dispensed into microcentrifuge tubes. Gold particles are stored at 4 ° C, tungsten particles at -20 ° C. 3 mg of DNA is added to each aliquot of (thawed) particles and the contents of the tubes are vortexed at maximum speed. While maintaining practically continuous vigorous stirring, 50 μl of 2.5 M CaCl 2 and 20 μl of 0.1 M spermidine are added. After 10 minutes of subsequent shaking, the samples were centrifuged for 5 s on an Eppendorf microcentrifuge, the supernatant was removed, and the particles were washed with sequentially added ethanol HPLC-purity. Particles are carefully resuspended in 60 μl of ethanol and then distributed in 10 μl aliquots on the surface of each macrocarrier to be used in the PDS1000 gene gun.
Детали генного ружья PDS1000 стерилизуют по поверхностям погружением в 70%-ный этанол и высушивают на воздухе. Чашки-мишени, полученные как описано выше, несущие примерно по 50 зародышей, размещенных на диске ≈ 2,5 см, размещают в 6 см от стоп-экрана. Для бомбардировки затем используют пробойные диски при 1100 psi. Каждую чашку бомбардируют 1 или 2 раза.PDS1000 gene gun parts are surface sterilized by immersion in 70% ethanol and air dried. The target cups obtained as described above, carrying approximately 50 nuclei located on a ≈ 2.5 cm disk, are placed 6 cm from the stop screen. Breakdown discs are then used for the bombing at 1100 psi. Each cup is bombarded 1 or 2 times.
Подвергнутые бомбардировке чашки закрывают пористой лентой и выдерживают при 25°С в темноте примерно в течение 16 ч. Зародыши, отделенные от поверхности среды ударной гелиевой волной, выделяют и также инкубируют в течение ночи на новых чашках в среде А2, таким же образом дополненной маннитом и сорбитом. Затем подвергнутые бомбардировке зародыши переносят на новые чашки со средой А2 и инкубируют в течение 1 недели при 25°С в темноте для последующего отбора.The bombarded cups are covered with a porous tape and kept at 25 ° C in the dark for about 16 hours. Germs separated from the surface of the medium by a helium shock wave are isolated and also incubated overnight on new plates in A2 medium, in the same way supplemented with mannitol and sorbitol. The bombarded embryos are then transferred to new plates with A2 medium and incubated for 1 week at 25 ° C in the dark for subsequent selection.
Отбор и регенерация трансформантовThe selection and regeneration of transformants
После указанного периода выделения каллюсные зародыши снимают с сеток и переносят в среду А2-2Р (среда А2, доведенная до рН 5,8, содержащая 2 мМ N-(фосфонометил)глицина) при плотности 20 эксплантатов на чашку. Через неделю культивирования в среде А2-2Р каллюсы переносят в среду А1-2Р (среда А2, содержащая только 1,0 мг/л 2,4-D и 2 мМ N-(фосфонометил)глицина) в течение 2 недель и затем в среду А0,5-2Р (среда А2, содержащая только 0,5 мг/л 2,4-D и 2 мМ N-(фосфонометил)глицина) в течение еще двух недель. Необязательно, 2-недельные периоды инкубации сокращают до 1 недели и/или средний этап инкубации в среде А1-2Р отменяют. Необязательно, селективная концентрация N-(фосфонометил) глицина составляет от 0,5 до 10 мМ, хотя предпочтительна концентрация 2 мМ. Общая продолжительность периода индукции каллюса при снижающейся концентрации 2,4-D в среде составляет 2-10 недель, предпочтительно 3-6 недель, а наиболее предпочтительно, примерно 4 недели.After the indicated period of isolation, callus embryos are removed from the grids and transferred to A2-2P medium (A2 medium adjusted to pH 5.8 containing 2 mM N- (phosphonomethyl) glycine) at a density of 20 explants per dish. After a week of cultivation in A2-2P medium, calluses are transferred to A1-2P medium (A2 medium containing only 1.0 mg /
После этого, для обеспечения максимального роста побегов и недопущения развития корешков, каллюсы переносят в среду Z. Среда Z является средой А2, содержащей 10 мг/л зеатина вместо 2,4-D и также содержащей 0,1 мМ N-(фосфонометил)глицина. Необязательно концентрация N-(фосфонометил)глицина находится в диапазоне 0,04-0,25 мМ. Регенерирующие каллюсы выдерживают в указанной среде в течение 3 недель перед субкультивированием, когда хорошо развитые побеги отрезают. Чтобы только одно событие приводило к образованию отдельного каллюса (что соответствует отдельному зародышу), весь каллюс переносят на новую чашку и выдерживают вместе с отрезанными побегами так, чтобы множественные клоны, возникающие на том же самом каллюсе, не воспринимались как отдельные события. Каллюсы, несущие лишь частично развитые побеги или не имеющие регенерирующих секторов, возвращают в среду Z еще на 3 недели. По окончании этого времени нерегенерированные каллюсы отбрасывают.After that, to maximize shoot growth and prevent root development, calluses are transferred to medium Z. Medium Z is medium A2 containing 10 mg / l zeatin instead of 2,4-D and also containing 0.1 mM N- (phosphonomethyl) glycine . Optionally, the concentration of N- (phosphonomethyl) glycine is in the range of 0.04-0.25 mm. Regenerating calli are incubated in this medium for 3 weeks before subculturing, when well-developed shoots are cut off. So that only one event leads to the formation of a separate callus (which corresponds to a separate embryo), the whole callus is transferred to a new cup and kept together with cut shoots so that multiple clones that arise on the same callus are not perceived as separate events. Calluses, bearing only partially developed shoots or lacking regenerating sectors, are returned on Wednesday for another 3 weeks. At the end of this time, non-regenerated calluses are discarded.
Побеги выдерживают в среде Z до тех пор, пока не образуются 4 или большее число хорошо развитых листьев (достигающих в длину примерно 2 см). Регенерированный растительный материал затем аккуратно переносят в пластиковые пробирки, содержащие среду 0,5MS. Среда 0,5MS при рН 5,8 содержит 2,16 г/л солей Мурасиге-Скоога, 15 г/л сахарозы, 2,5 г активированного угля, 2,5 г/л гельрита, 1 мг/л глицина, 50 мг/л миоинозитола, 0,25 мг/л никотиновой кислоты, 0,25 мг/л гидрохлорида пиридоксина, 0,05 мг/л гидрохлорида тиамина и 0,1 мМ N-(фосфонометил)глицина (необязательно 0,0-0,25 мМ).The shoots are kept in Z medium until 4 or more well-developed leaves are formed (reaching a length of about 2 cm). The regenerated plant material is then carefully transferred to plastic tubes containing 0.5MS medium. 0.5MS medium at pH 5.8 contains 2.16 g / l of Murashige-Skoga salts, 15 g / l of sucrose, 2.5 g of activated carbon, 2.5 g / l of gelrite, 1 mg / l of glycine, 50 mg / l myoinositol, 0.25 mg / l nicotinic acid, 0.25 mg / l pyridoxine hydrochloride, 0.05 mg / l thiamine hydrochloride and 0.1 mM N- (phosphonomethyl) glycine (optionally 0.0-0.25 mm).
После того, как у растений образуются корешки, их высаживают в почву и выращивают или переносят в отдельные стеклянные пробирки для кипячения, содержащие 0,5MS (без N-(фосфонометил)глицина) и 2,5 г/л угля. Предпочтительно включать уголь в среду для образования корешков с целью адсорбции любых оставшихся PGR или отбора химикатов, привнесенных с проростком, и с целью создания темной корневой среды, что тем самым исключает образование физиологически аномальных зеленых корней.After the roots form in the plants, they are planted in the soil and grown or transferred to separate glass boiling tubes containing 0.5MS (without N- (phosphonomethyl) glycine) and 2.5 g / l of coal. It is preferable to include coal in the root formation medium in order to adsorb any remaining PGR or select chemicals introduced with the seedling and to create a dark root environment, thereby eliminating the formation of physiologically abnormal green roots.
Индукция каллюсов и первая неделя регенерации проходят при 25°С в темноте. Вторая неделя регенерации проходит при слабом освещении при 25°С, а затем последующие недели проходят при приблизительно 2500 люкс при 16-часовом периоде освещенности.Callus induction and the first week of regeneration take place at 25 ° C in the dark. The second week of regeneration takes place in low light at 25 ° C, and then the following weeks pass at approximately 2500 lux with a 16-hour period of illumination.
Размножение, скрещивание и анализ трансформированного растительного материала.Reproduction, crossbreeding and analysis of transformed plant material.
Способы получения T1 и последующих потомств хорошо известны в данной области техники и по существу описаны в предыдущих примерах. Способы анализа наследования резистентности к глифосату и присутствия, целостности и экспрессии трансгенов соответствуют тому, что описано в предыдущих примерах.Methods of obtaining T 1 and subsequent offspring are well known in the art and are essentially described in the previous examples. Methods for analyzing the inheritance of glyphosate resistance and the presence, integrity and expression of transgenes are consistent with those described in the previous examples.
Пример 16Example 16
Трансформация линий пшеницы ДНК, включающей экспрессионную кассету EPSPS, с помощью электропорации протопластов; отбор и регенерация растительных клеток и растений, которые резистентны к глифосатуTransformation of wheat DNA lines, including the EPSPS expression cassette, by electroporation of protoplasts; selection and regeneration of plant cells and plants that are resistant to glyphosate
В следующем примере плазмидную или линейную ДНК, включающую экспрессионную кассету EPSPS и идентичную той, которую использовали в примерах 12, 13 и 15, используют для прямой трансформации протопластов линии пшеницы, способной регенерировать в фертильные растения (см. US 5231019). Выделенные протопласты пшеницы, предпочтительно на материале ткани листьев или культивируемых клеток (см. Gamborg, O.L., and Wetter, L.R., Plant Tissue Culture Methods, 1975, 11-21), получают в концентрации примерно 2х106 протопластов на 1 мл в 0,4 М маннита при рН 5,8. К указанной суспензии добавляют сначала 0,5 мл 40%-ного (мас/об) полиэтиленгликоля (ПЭГ) молекулярной массы 6000 в модифицированной среде F (Nature (1982), 296, 72-74) при рН 5,8, и затем 65 мл воды, содержащей 15 мг желательной плазмидной или линейной ДНК и 50 мг ДНК вилочковой железы теленка. Смесь инкубируют вместе в течение 30 мин при 26°С, изредка помешивая, с последующим разведением средой F (Nature (1982), 296, 72-74). Протопласты выделяют с помощью низкоскоростного центрифугирования, отбирая их в 4 мл культуральной среды СС (Potrykus, Harms, Lorz, (1979) Theor. Appi. Genet., 54, 209-214), и инкубируют в темноте при 24°С.In the following example, plasmid or linear DNA, including an EPSPS expression cassette and identical to that used in examples 12, 13 and 15, is used to directly transform protoplasts of a wheat line that can regenerate into fertile plants (see US 5231019). Isolated wheat protoplasts, preferably on leaf or cultured tissue material (see Gamborg, OL, and Wetter, LR, Plant Tissue Culture Methods, 1975, 11-21), are obtained at a concentration of about 2x10 6 protoplasts per ml in 0.4 M mannitol at pH 5.8. To this suspension, first add 0.5 ml of 40% (w / v) polyethylene glycol (PEG) of molecular weight 6000 in a modified medium F (Nature (1982), 296, 72-74) at a pH of 5.8, and then 65 ml of water containing 15 mg of the desired plasmid or linear DNA and 50 mg of calf thymus DNA. The mixture was incubated together for 30 min at 26 ° C, stirring occasionally, followed by dilution with medium F (Nature (1982), 296, 72-74). Protoplasts are isolated by low-speed centrifugation, collecting them in 4 ml of CC culture medium (Potrykus, Harms, Lorz, (1979) Theor. Appi. Genet., 54, 209-214), and incubated in the dark at 24 ° C.
Альтернативно, и в дополнение к обработке ПЭГ, трансформацию протопластов зерновых проводят с использованием дополнительных стадий теплового шока и/или электропорации (Neumann, E.et al. (1982), the EMBO J., 1, 841-845). Так, например, протопласты пшеницы инкубируют в водном растворе ДНК и маннита, нагревают до 45°С в течение 5 мин и затем охлаждают до 0°С в течение 10 с. Затем добавляют полиэтиленгликоль (молекулярная масса 3-8 кД) до конечной концентрации примерно 8% мас/об. После аккуратного, но тщательного перемешивания проводят обработку на электропораторе. Камеры поратора Dialog (Dialog, Dusseldorf, Германия) стерилизуют промывкой 70%-ным этанолом и затем высушивают в стерильном воздухе. Суспензии протопластов (примерно 2× 106 протопластов на 1 мл в 0,4 М маннита + ДНК) корректируют с помощью хлорида магния до измеренного электрического сопротивления примерно 1,4 кОм. Образцы объемом примерно 0,4 мл подвергают трем пульсам с 10-секундными интервалами при приложенном напряжении 1000-2000 В. Затем трансформированные таким путем протопласты собирают и вновь растворяют в культуральной среде СС.Alternatively, and in addition to PEG processing, the transformation of cereal protoplasts is carried out using additional stages of heat shock and / or electroporation (Neumann, E. et al. (1982), the EMBO J., 1, 841-845). For example, wheat protoplasts are incubated in an aqueous solution of DNA and mannitol, heated to 45 ° C for 5 min, and then cooled to 0 ° C for 10 s. Then polyethylene glycol (molecular weight 3-8 kD) is added to a final concentration of about 8% w / v. After careful but thorough mixing, the treatment is carried out on an electroporator. Dialog chambers (Dialog, Dusseldorf, Germany) are sterilized by washing with 70% ethanol and then dried in sterile air. Suspensions of protoplasts (approximately 2 × 10 6 protoplasts per ml in 0.4 M mannitol + DNA) are corrected with magnesium chloride to a measured electrical resistance of about 1.4 kΩ. Samples with a volume of approximately 0.4 ml are subjected to three pulses at 10-second intervals at an applied voltage of 1000-2000 V. Then protoplasts transformed in this way are collected and re-dissolved in the SS culture medium.
Для специалистов в данной области техники будет понятно, что возможны разнообразные допущения и вариации указанных процедур трансформации, и что, например, трансформацию также можно оптимизировать увеличением рН до 9,5 и/или повышением концентрации ионов кальция в растворе, в котором осуществляют трансформацию.It will be understood by those skilled in the art that various assumptions and variations of these transformation procedures are possible, and that, for example, transformation can also be optimized by increasing the pH to 9.5 and / or increasing the concentration of calcium ions in the solution in which the transformation is carried out.
Через 3-14 дней аликвоты культур развивающихся клеток переносят в среду, содержащую разные селективные концентрации N-(фосфонометил)глицина чистоты для тканевых культур (Sigma) от 1 до 5 мМ (предпочтительно 2 мМ). Колонии резистентных клеток, идентифицированных таким образом (проявляющие рост при концентрациях глифосата, которые по крайней мере вдвое выше, чем могут переносить нетрансформированные контроли), переносят в свежую агаровую среду, также содержащую диапазон селективных концентраций глифосата, и, как это было описано в примере 15, пересевают с чашки на чашку при постепенно снижающейся концентрации 2,4-D. Растущие резистентные колонии могут быть проанализированы (с помощью ПЦР и т.п.) на присутствие рекомбинантной ДНК. Проведение дополнительного отбора возможно или невозможно на стадии каллюса. В любом случае все растущие каллюсы должны быть отобраны в первую очередь.After 3-14 days, aliquots of cultures of developing cells are transferred to a medium containing different selective concentrations of N- (phosphonomethyl) glycine purity for tissue cultures (Sigma) from 1 to 5 mM (preferably 2 mM). Colonies of resistant cells identified in this way (showing growth at glyphosate concentrations that are at least twice as high as non-transformed controls can tolerate) are transferred to fresh agar medium, also containing a range of selective glyphosate concentrations, and as described in Example 15 , subcultured from cup to cup with a gradually decreasing concentration of 2,4-D. Growing resistant colonies can be analyzed (by PCR, etc.) for the presence of recombinant DNA. An additional selection is possible or impossible at the callus stage. In any case, all growing calluses should be selected first.
Затем растущие каллюсы переносят в среду для регенерации побегов, содержащую зеатин и N-(фосфонометил)глицин, и из нее переносят в среду для образования корешков точно так же, как в примере 15. Фертильные трансгенные растения, экспрессирующие резистентную к глифосату ЕРSР-синтазу, затем регенерируют, отбирают и тестируют, как известно в данной области техники и как описано в примере 15, а также с использованием аналитических методов, описанных в примере 11.Then, the growing calluses are transferred to shoot regeneration medium containing zeatin and N- (phosphonomethyl) glycine, and from it are transferred to the root formation medium in the same manner as in Example 15. Fertile transgenic plants expressing glyphosate-resistant EPP synthase, then regenerate, select and test, as is known in the art and as described in example 15, as well as using analytical methods described in example 11.
Пример 17Example 17
Способ оценки активности EPSPS и определения кинетических констант. Способ оценки активностей EPSPS в неочищенных растительных материалах и определения доли, которая резистентна к глифосатуA method for assessing EPSPS activity and determining kinetic constants. Method for evaluating EPSPS activities in raw plant materials and determining the fraction that is resistant to glyphosate
Ферментный анализ EPSPSEPSPS enzyme analysis
Анализ проводят по существу в соответствии с радиохимическим методом Padgette et al., 1987 (Archives of Biochemistry and Biophysics, 258 (2), 564-573) с ионами К+ как основным видом катионного контриона. Пробы общим объемом 50 мкл в 50 мМ HEPES (КОН) при рН 7,0 при 25°С содержат очищенный фермент или растительный экстракт (см. ниже), разведенный подходящим образом буфером HEPES при рН 7,0, содержащим 10% глицерина и 5 мМ ДТТ, 14С-РЕР либо в качестве варьирующегося субстрата (для кинетических определений), либо в фиксированной концентрации 100 или 250 мкМ, и шикимат-3-фосфат (калиевая соль) при 2 или 0,75 мМ, как указано. Необязательно, при анализе неочищенных растительных экстрактов пробы также содержат 5 мМ КF и/или 0,1 мМ молибдата аммония. Анализ начинают с добавления 14С-фосфоенолпирувата (циклогексиламмоний + соль) и останавливают через 2-10 мин (предпочтительно 2 мин) добавлением 50 мкл раствора 1 М уксусной кислоты и этанола (1:9). После остановки 20 мкл загружают на колонку Synchropak AX100 (25 см × 4,6 мм) и хроматографируют с использованием изократического элюирования 0,28 М фосфата калия при рН 6,5 при скорости протока подвижной фазы 0,5 мл/мин в течение 35 мин. При этих условиях время удерживания для PEP и EPSP составляет примерно 19 и 25 мин, соответственно. Сцинтилляционный счетчик СР 525TR подсоединяют к концу колонки AX100. Он заполняется 0,5 мл проточных клеток, и скорость протока сцинтиллянта (Ultima Flo АР) устанавливают на уровне 1 мл/мин. Относительные пиковые области PEP и EPSP интегрируют с целью определения процента превращения меченого PEP в EPSP. Значения Кm и Vmах определяют методом подбора с помощью наименьших квадратов к гиперболе при простом взвешивании с использованием программы Grafit 3.09b от Erithacus Software Ltd. Величины Кm обычно устанавливают с использованием 8-9 концентраций разного субстрата в диапазоне от Кm/2 до 10Km и тройных точек. За исключением специально оговариваемых случаев, данные включают в анализ только тогда, когда имеется менее чем 30%-ное превращение субстрата в EPSP.The analysis is carried out essentially in accordance with the radiochemical method of Padgette et al., 1987 (Archives of Biochemistry and Biophysics, 258 (2), 564-573) with K + ions as the main type of cationic counterion. Samples with a total volume of 50 μl in 50 mM HEPES (KOH) at pH 7.0 at 25 ° C contain a purified enzyme or plant extract (see below), diluted appropriately with HEPES buffer at pH 7.0 containing 10% glycerol and 5 mM DTT, 14 C-PEP, either as a variable substrate (for kinetic determinations), or at a fixed concentration of 100 or 250 μM, and shikimat-3-phosphate (potassium salt) at 2 or 0.75 mM, as indicated. Optionally, when analyzing crude plant extracts, the samples also contain 5 mM KF and / or 0.1 mM ammonium molybdate. Analysis begins with the addition of 14 C-phosphoenolpyruvate (cyclohexylammonium + salt) and is stopped after 2-10 minutes (preferably 2 minutes) by adding 50 μl of a solution of 1 M acetic acid and ethanol (1: 9). After stopping, 20 μl was loaded onto a Synchropak AX100 column (25 cm × 4.6 mm) and chromatographed using isocratic elution of 0.28 M potassium phosphate at pH 6.5 at a flow rate of the mobile phase of 0.5 ml / min for 35 minutes . Under these conditions, the retention times for PEP and EPSP are approximately 19 and 25 minutes, respectively. A CP 525TR scintillation counter is connected to the end of the AX100 column. It is filled with 0.5 ml of flow cells, and the scintillant duct speed (Ultima Flo AR) is set at 1 ml / min. The relative peak areas of PEP and EPSP are integrated to determine the percent conversion of labeled PEP to EPSP. The values of K m and V max are determined by the least squares fit to the hyperbole with simple weighing using the Grafit 3.09b program from Erithacus Software Ltd. Values of K m are usually set using 8-9 concentrations of different substrates in the range from K m / 2 to 10K m and triple points. Unless otherwise specified, data are included in the analysis only when there is less than 30% conversion of the substrate to EPSP.
Шикимат-3-Pi (S3P) получают следующим образом, К 7 мл 0,3 М TAPS при рН 8,5, содержащего 0,05 М шикимата, 0,0665 М АТФ (соль Na), 10 мМ KF, 5 мМ ДТТ и 0,05 М МgСl2·2Н2O, добавляют 75 мкл раствора 77 единиц (мкмоль/мин)/мл раствора шикиматкиназы. Через 24 ч при комнатной температуре реакцию останавливают кратковременным нагреванием до 95°С. Реакционный раствор разбавляют в 50 раз в 0,01 М Трис-НСl при рН 9 и хроматографируют на анионообменнике Dowex 1х8-400 с использованием градиента 0-0,34 М LiCl2. Фракции S3P объединяют, лиофилизуют и затем снова растворяют в 7 мл дистиллированной воды. Затем добавляют 28 мл 0,1 М Ва(СН3СООН)2 и 189 мл абсолютного этанола. Этот раствор оставляют перемешиваться в течение ночи при 4°С. Полученный преципитат трехбариевого S3P собирают и промывают 30 мл 67%-ного этанола. Затем промытый преципитат растворяют примерно в 30 мл дистиллированной воды. При необходимости добавлением K2SO4 получают либо К+, либо ТМА+ соль S3P. Необходима особая аккуратность при добавлении минимального избытка сульфата. Преципитат ВаSO4 удаляют и надосадочную фракцию, содержащую требуемую соль S3P, лиофилизуют. Каждую соль взвешивают и анализируют с помощью протонного ЯМР. Полученные таким путем препараты S3P характеризуются чистотой >90% по данным протонного ЯМР и (в соответствии с их массами и включением 31Р-ЯМР) содержат только следовые остатки сульфата калия.Shikimat-3-Pi (S3P) is prepared as follows:
Получение экстрактов растительного материала, пригодных для тестирования EPSPSPreparation of Plant Material Extracts Suitable for EPSPS Testing
Материал каллюсов или проростков (0,5-1,0 г) измельчают в мелкий замороженный порошок с помощью охлаждаемых жидким азотом ступки и пестика. Указанный порошок отбирают в равный объем охлажденного экстракционного буфера (например, 50 мМ буфера HEPES/KOH при рН 7,5, содержащего 1 мМ ЭДТА, 3 мМ ДТТ, 1,7 мМ “pefabloc” (ингибитор сериновых протеаз), 1,5 мМ лейпептина, 1,5 мМ пепстатина-А, 10% глицерина (об/об) и 1% поливинилпирролидона), ресуспендируют, смешивают и центрифугируют в охлажденной центрифуге для осаждения клеточного дебриса. Супернатант обменивают в охлажденную колонку PD10 сефадекса G25 в 25 мМ буфера HEPES/KOH при рН 7,5, содержащего 1 мМ ЭДТА, 3 мМ ДТТ и 10% глицерина (об/об). Белок оценивают по Брэдфорду с нормализацией к бычьему сывороточному альбумину. Часть экстракта замораживают на жидком азоте, а часть анализируют сразу.The material of calluses or seedlings (0.5-1.0 g) is ground into a fine frozen powder using mortars and a pestle cooled with liquid nitrogen. The specified powder is taken into an equal volume of chilled extraction buffer (for example, 50 mm HEPES / KOH buffer at pH 7.5, containing 1 mm EDTA, 3 mm DTT, 1.7 mm pefabloc (serine protease inhibitor), 1.5 mm leipeptin, 1.5 mM pepstatin-A, 10% glycerol (v / v) and 1% polyvinylpyrrolidone) are resuspended, mixed and centrifuged in a cooled centrifuge to precipitate cell debris. The supernatant is exchanged on a chilled PD10 column of Sephadex G25 in 25 mM HEPES / KOH buffer at pH 7.5 containing 1 mM EDTA, 3 mM DTT and 10% glycerol (v / v). Protein is evaluated according to Bradford with normalization to bovine serum albumin. Part of the extract is frozen in liquid nitrogen, and part is analyzed immediately.
Тесты на EPSPS на материале растительных экстрактов проводят стандартным образом, как описано выше, с 0,1 мМ 14С-РЕР и 0,75 мМ шикимат-3-Pi либо в отсутствие, либо в присутствии 0,1 мМ N-(фосфонометил)глицина. При таких условиях тестирования резистентную форму EPSPS (см. далее) определяют, как ту, которая должна подавляться менее чем на 8,5%, в то время как восприимчивая форма дикого типа по существу подавляется полностью (>98%). Таким образом, уровень активности, выявленный в присутствии глифосата (А), принят примерно за 92% уровня резистентного фермента, образующегося в результате экспрессии трансгена, в то время как уровень восприимчивого EPSPS дикого типа принимается за общий уровень активности EPSPS, наблюдаемой в отсутствие глифосата за вычетом А: х≈ 1,08. Поскольку Vmах мутантного фермента оценивается на уровне всего одной трети от Vmах фермента дикого типа (и поскольку величины Кm для PEP и у мутантной формы, и у формы дикого типа были оценены на уровне примерно 20 мкМ или меньше), то уровень экспрессии полипептида мутантного фермента по отношению к уровню экспрессии эндогенного EPSPS дикого типа принимается как примерно в три раза более высокий по сравнению с отношением, подсчитанным на основе отношения их выявленных относительных активностей. Общий уровень экспрессии полипептида EPSPS (мутант + дикий тип) также оценивают с помощью Вестерн-блоттинга (см. далее).The EPSPS tests on the material of plant extracts are carried out in the standard manner as described above with 0.1 mM 14 C-PEP and 0.75 mM shikimat-3-Pi, either in the absence or in the presence of 0.1 mM N- (phosphonomethyl) glycine. Under such test conditions, the resistant form of EPSPS (see below) is defined as that which should be suppressed by less than 8.5%, while the susceptible wild-type form is substantially completely suppressed (> 98%). Thus, the level of activity detected in the presence of glyphosate (A) is taken as approximately 92% of the level of the resistant enzyme resulting from transgene expression, while the level of susceptible wild-type EPSPS is taken as the total level of EPSPS activity observed in the absence of glyphosate minus A: x ≈ 1.08. Since the V max of the mutant enzyme is estimated to be only one third of the V max of the wild-type enzyme (and since the K m values for both the mutant and wild-type PEP were estimated at about 20 μM or less), the expression level of the polypeptide the mutant enzyme with respect to the expression level of wild-type endogenous EPSPS is taken as about three times higher than the ratio calculated on the basis of the ratio of their detected relative activities. The overall expression level of the EPSPS polypeptide (mutant + wild type) is also evaluated by Western blotting (see below).
Пример 18Example 18
Клонирование и экспрессия кДНК дикого типа и мутантной кДНК, кодирующих зрелый EPSPS риса, в Е.coli. Очистка и характеристика EPSPS дикого типа и мутантного EPSPS рисаCloning and expression of wild-type cDNA and mutant cDNA encoding mature rice EPSPS in E. coli. Purification and characterization of EPSPS wild-type and mutant EPSPS rice
Экспрессия, очистка и характеристика зрелого EPSPS риса дикого типаExpression, purification and characterization of mature wild-type EPSPS rice
кДНК EPSPS риса амплифицируют с применением ОТ-ПЦР на материале РНК, выделенной из клеток риса сорта Koshigari, с использованием обратной транскриптазы Superscript от BRL в соответствии с рекомендациями, предлагаемыми производителем. ПЦР проводят с использованием полимеразы Pfu turbo от Stratagene в соответствии с методами, предлагаемыми изготовителем. Приведенные далее олигонуклеотиды используют на этапах реакций амплификации и обратной транскрипции.Rice EPSPS EPSD cDNA was amplified using RT-PCR on RNA material isolated from Koshigari rice cells using Superscript reverse transcriptase from BRL in accordance with the recommendations of the manufacturer. PCR is performed using Pfu turbo polymerase from Stratagene in accordance with the methods proposed by the manufacturer. The following oligonucleotides are used in the steps of amplification and reverse transcription reactions.
ПЦР-продукт клонируют в состав pCRBlunt II с использованием набора Zero Blunt TOPO kit от Invitrogen. Последовательность вставки подтверждают путем прямого секвенирования с подтверждением того, что предсказанная открытая рамка считывания соответствует той, которая предсказана для зрелого хлоропластного белка EPSPS риса, за исключением присутствия старт-кодона Met. Клонированную и подтвержденную последовательность EPSPS риса вырезают с использованием рестриктаз NdeI и XhoI, и очищенный фрагмент клонируют в плазмиду рЕТ24а (Novagen), расщепленную аналогичным образом. Рекомбинантные клоны вносят в BL21 (DE3), оптимизованный по библиотеке кодонов штамм RP Е.coli, предоставляемый Stratagene. Белок EPSPS экспрессируется указанным штаммом после добавления 1 мМ IPTG к питательной среде (среда LB, дополненная 100 мкг/мл канамицина). Рекомбинантный белок с точной предсказанной молекулярной массой идентифицируют: (i) на основе окрашивания по Кумасси ДСН-гелей клеточных экстрактов и параллельного сравнения с окрашенными по Кумасси гелями экстрактов аналогичных клеток Е. coli, трансформированных пустым вектором рЕТ24а, и (ii) с помощью Вестерн-блоттинга с использованием поликлонального антитела, сформированного к ранее очищенному растительному белку EPSPS. Зрелый белок EPSPS риса очищают при примерно 4°С следующим образом. Клетки (25 г сырого веса) промывают в 50 мл 0,1 М буфера HEPES/KOH при рН 7,5, содержащего 5 мМ ДТТ, 2 мМ ЭДТА и 20% глицерина (об/об). После низкоскоростного центрифугирования клеточный сгусток ресуспендируют в 50 мл того же буфера, но также содержащего 2 мМ “Pefabloc”, ингибитора сериновых протеаз. Клетки равномерно суспендируют с помощью стеклянного гомогенизатора и затем разрушают с помощью клеточного дезинтегратора Basic Z от Constant Systems (Budbrooke Road, Warwick, Великобритания) под давлением 10000 psi. Неочищенный экстракт центрифугируют при примерно 30000g в течение 1 ч и сгусток отбрасывают. Протаминсульфат (сальмин) добавляют в конечной концентрации 0,2%, смешивают и раствор оставляют отстаиваться в течение 30 мин. Осажденный материал удаляют центрифугированием в течение 30 мин при ≈ 30000g. Сульфат аммония от Aristar добавляют до конечной концентрации 40% насыщения, перемешивают в течение 30 мин и затем центрифугируют при ≈ 27000g в течение 30 мин. Сгусток ресуспендируют примерно в 10 мл тоже буфера, который использовался для разрушения клеток, после чего сульфат аммония добавляют с доведением раствора до примерно 70%-ного насыщения, раствор перемешивают в течение 30 мин и вновь центрифугируют с получением сгустка, который ресуспендируют примерно в 15 мл буфера S200 (10 мМ HEPES/KOH (рН 7,8), содержащего 1 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА и 20% глицерина (об/об)). Полученный фильтрат (0,45 мкм) загружают и хроматографируют после загрузки на колонку К26/60, содержащую Superdex 200, уравновешенную буфером S200. Фракции, содержащие EPSPS, выявленные исходя из параметров ферментной активности EPSPS, объединяют и загружают на колонку xk16, содержащую 20 мл высокочистой Q-сефарозы, уравновешенную буфером S200. Колонку промывают буфером S200 и затем EPSPS элюируют линейным градиентом от 0,0 до 0,2 М КСl в том же буфере. EPSPS элюируется в пределах единственного пика, соответствующего концентрации соли 0,1 М или меньше. Фракции, содержащие EPSPS, выявленные исходя из параметров ферментной активности EPSPS, объединяют и загружают на колонку HiLoad xk26/60 супердекса-75, уравновешенную буфером Superdex 75 (25 мМ HEPES/KOH (рН 7,5), содержащим 2 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА и 10% глицерина (об/об)). EPSPS элюируется с колонки позже, чем этого можно было ожидать исходя из молекулярной массы предполагаемого димера. Это может объясняться взаимодействием белка с гелем матрикса при низкой ионной силе раствора. Фракции, содержащие EPSPS, выявленные исходя из параметров ферментной активности EPSPS, объединяют и загружают на 1-мл колонку MonoQ, уравновешенную тем же буфером Superdex 75. Колонку промывают начальным буфером и EPSPS элюируется в виде единственного пика по ходу 15 мл линейного градиента, сформированного от 0,0 до 0,2 М КСl. На данной стадии очистки EPSPS получают с чистотой >90%. Необязательно, EPSPS дополнительно очищают путем обмена в буфер Superdex 75, содержащий 1,0 М сульфата аммония (Aristar) и загруженный в 10-мл фенилсефарозную колонку, уравновешенную тем же самым буфером. EPSPS элюируется в виде единственного пика в начале снижающегося линейного градиента сульфата аммония, сформированного от 1,0 до 0,0 М сульфата аммония.The PCR product is cloned into pCRBlunt II using the Invitrogen Zero Blunt TOPO kit. The insert sequence was confirmed by direct sequencing to confirm that the predicted open reading frame was the same as that predicted for mature rice EPSPS chloroplast protein, except for the presence of the Met start codon. The cloned and confirmed EPSPS sequence of rice was excised using restriction enzymes NdeI and XhoI, and the purified fragment was cloned into plasmid pET24a (Novagen), similarly digested. Recombinant clones are introduced into BL21 (DE3), a codon library-optimized E. coli strain RP provided by Stratagene. EPSPS protein is expressed by the indicated strain after adding 1 mM IPTG to the growth medium (LB medium supplemented with 100 μg / ml kanamycin). A recombinant protein with an exact predicted molecular weight is identified: (i) based on Coomassie staining of SDS gels of cell extracts and parallel comparison with Coomassie stained gels of extracts of similar E. coli cells transformed with empty pET24a vector, and (ii) using Western blotting using a polyclonal antibody formed against previously purified plant protein EPSPS. Mature rice EPSPS protein is purified at about 4 ° C as follows. Cells (25 g wet weight) are washed in 50 ml of 0.1 M HEPES / KOH buffer at pH 7.5, containing 5 mM DTT, 2 mM EDTA and 20% glycerol (v / v). After low speed centrifugation, the cell clot is resuspended in 50 ml of the same buffer, but also containing 2 mM Pefabloc, a serine protease inhibitor. Cells are uniformly suspended using a glass homogenizer and then destroyed using a Basic Z cell disintegrator from Constant Systems (Budbrooke Road, Warwick, UK) at a pressure of 10,000 psi. The crude extract is centrifuged at about 30,000 g for 1 hour and the clot discarded. Protamine sulfate (salmin) is added in a final concentration of 0.2%, mixed and the solution is left to stand for 30 minutes. The precipitated material is removed by centrifugation for 30 min at ≈ 30000g. Aristar ammonium sulfate is added to a final concentration of 40% saturation, stirred for 30 minutes and then centrifuged at ≈ 27000g for 30 minutes. The clot is resuspended in about 10 ml of the same buffer used to destroy the cells, after which ammonium sulfate is added to bring the solution to about 70% saturation, the solution is stirred for 30 minutes and centrifuged again to obtain a clot, which is resuspended in about 15 ml S200 buffer (10 mM HEPES / KOH (pH 7.8) containing 1 mM DTT, 1 mM EDTA and 20% glycerol (v / v)). The obtained filtrate (0.45 μm) was loaded and chromatographed after loading onto a K26 / 60 column containing Superdex 200 equilibrated with S200 buffer. Fractions containing EPSPS, determined from the EPSPS enzyme activity parameters, were pooled and loaded onto an xk16 column containing 20 ml of high-purity Q-Sepharose, equilibrated with S200 buffer. The column was washed with S200 buffer and then EPSPS was eluted with a linear gradient of 0.0 to 0.2 M KCl in the same buffer. EPSPS elutes within a single peak corresponding to a salt concentration of 0.1 M or less. Fractions containing EPSPS, determined from the EPSPS enzyme activity parameters, are pooled and loaded onto a HiLoad xk26 / 60 column of Superdex-75 balanced with Superdex 75 buffer (25 mM HEPES / KOH (pH 7.5) containing 2 mM DTT, 1 mM EDTA and 10% glycerol (v / v)). EPSPS elutes from the column later than would be expected based on the molecular weight of the proposed dimer. This can be explained by the interaction of the protein with the matrix gel at a low ionic strength of the solution. Fractions containing EPSPS, determined from the EPSPS enzyme activity parameters, were pooled and loaded onto a 1 ml MonoQ column equilibrated with the same Superdex 75 buffer. The column was washed with initial buffer and EPSPS was eluted as a single peak along a 15 ml linear gradient formed from 0.0 to 0.2 M KCl. At this stage of purification, EPSPS is obtained with a purity> 90%. Optionally, EPSPS is further purified by exchange into a Superdex 75 buffer containing 1.0 M ammonium sulfate (Aristar) and loaded onto a 10 ml phenylsepharose column equilibrated with the same buffer. EPSPS elutes as a single peak at the beginning of a decreasing linear gradient of ammonium sulfate formed from 1.0 to 0.0 M ammonium sulfate.
Клонирование, экспрессия, очистка и характеристика резистентной к глифосату мутантной EPSPS рисаCloning, expression, purification and characterization of glyphosate-resistant mutant EPSPS rice
кДНК EPSPS риса в составе pCRBlunt используют в качестве матрицы в двух дополнительных ПЦР с использованием следующих пар праймеров, сконструированных так, чтобы внести конкретные изменения:The rice EPSPS cDNA in pCRBlunt is used as template in two additional PCRs using the following primer pairs designed to make specific changes:
Полученные продукты очищают в геле и помещают в пробирку в эквимолярных концентрациях, чтобы они выполняли роль матрицы в следующем раунде ПЦР с олигомерами рисовый-5’ и рисовый-3’. Полученные продукты клонируют в pCRBlunt II с использованием набора Zero Blunt TOPO kit от Invitrogen. Подтверждено, что последовательность ДНК у вставки и ее предсказанная открытая кодирующая рамка соответствуют предсказанному для зрелого хлоропластного белка EPSPS риса (за исключением присутствия старт-кодона Met) и также тому, что кодируются желательные замены (конкретные мутации Т→ I и P→ S по конкретным положениям последовательности EPSPS). Клонированную таким путем и подтвержденную последовательность EPSPS риса вырезают с использованием рестриктаз NdeI и XhoI, и очищенный фрагмент клонируют в рЕТ24а (Novagen), расщепленную аналогичным образом. Рекомбинантные клоны вносят в BL21 (DЕ3), оптимизованный по библиотеке кодонов штамм RP Е.coli, предоставляемый Stratagene. Белок EPSPS экспрессируется указанным штаммом после добавления 1 мМ IPTG к питательной среде (среда LB, дополненная 100 мкг/мл канамицина). Рекомбинантный белок с точной предсказанной молекулярной массой идентифицируют: (i) на основе окрашивания по Кумасси ДСН-гелей клеточных экстрактов и параллельного сравнения с окрашенными по Кумасси гелями экстрактов аналогичных клеток Е.coli, трансформированных пустым вектором рЕТ24а, и (ii) с помощью Вестерн-блоттинга с использованием поликлонального антитела, сформированного к ранее очищенному растительному белку EPSPS. Данную мутантную форму EPSPS риса очищают и охарактеризовывают сходным образом со способом, описанным выше для EPSPS риса дикого типа.The resulting products were gel purified and placed in an equimolar concentration tube in order to perform the role of a matrix in the next round of PCR with rice-5 ’and rice-3’ oligomers. The resulting products are cloned into pCRBlunt II using the Invitrogen Zero Blunt TOPO kit. It was confirmed that the DNA sequence at the insert and its predicted open coding frame correspond to that predicted for mature rice EPSPS chloroplast protein (except for the presence of the Met start codon) and also that desired substitutions are encoded (specific T → I and P → S mutations for specific EPSPS sequence statements). Rice cloned in this way and confirmed EPSPS sequence was cut using NdeI and XhoI restriction enzymes, and the purified fragment was cloned into pET24a (Novagen), similarly digested. Recombinant clones are introduced into BL21 (DE3), an E. coli strain RP provided by Stratagene, optimized for the codon library. EPSPS protein is expressed by the indicated strain after adding 1 mM IPTG to the growth medium (LB medium supplemented with 100 μg / ml kanamycin). A recombinant protein with an exact predicted molecular weight is identified: (i) based on Coomassie staining of SDS gels of cell extracts and parallel comparison with Coomassie stained gels of extracts of similar E. coli cells transformed with empty pET24a vector, and (ii) using Western blotting using a polyclonal antibody formed against previously purified plant protein EPSPS. This mutant form of EPSPS rice is purified and characterized similarly to the method described above for wild-type EPSPS rice.
Полученная таким образом мутантная форма EPSPS риса, протестированная, как описано выше, в присутствии 2 мМ шикимат-3-Pi, характеризуется Vmax примерно 10 мкмоль/мин/мг, а Кm для PEP 22 мкМ. При 40 мкМ PEP величина IC50 для калиевой соли глифосата составляет примерно 0,6 мМ. Оцененная величина Ki для глифосата калия составила у мутантной EPSPS примерно 0,2 мМ.The mutant form of EPSPS rice thus obtained, tested as described above in the presence of 2 mM shikimat-3-Pi, has a V max of about 10 μmol / min / mg and K m for PEP of 22 μM. At 40 μM PEP, the IC 50 value for glyphosate potassium salt is about 0.6 mM. The estimated K i value for potassium glyphosate in mutant EPSPS was approximately 0.2 mM.
Пример 19Example 19
Получение антител к очищенной EPSPS риса и методы Вестерн-блоттингаObtaining antibodies to purified EPSPS rice and Western blotting methods
Используют стандартные методы получения поликлональных антисывороток у кроликов. Используют молодых крольчих новозеландской белой породы. Курс иммунизации составляет 4 дозы, каждая примерно по 100 мг, вводимые с месячным интервалом. Каждую дозу в фосфатно-солевом буфере вводят в виде эмульсии с полным адъювантом Фройнда (1-я доза) или неполным адъювантом Фройнда (2-4-я дозы), которые инъецируют в четыре разных подкожных сайта. Предварительную пробу крови берут до введения 1-й дозы. Тест-пробы крови берут через 14 дней после второй дозы для подтверждения иммунного ответа. Окончательное взятие крови проводят через 14 дней после 4-й дозы, которую используют в эксперименте. Пятую и последнюю дозы вводят по прошествии по крайней мере 6 недель после 4-й дозы, а заключительное взятие крови (также используемое в эксперименте) проводят через 14 дней после указанного. Антитела инициируют и к (i) очищенной нативной зрелой EPSPS риса дикого типа (пример 8), и также к (ii) ДСН-денатурированному полипептиду EPSPS риса, который элюирован из полосы, вырезанной из 12%-ного ДСН-геля (точное положение белка маркируется путем параллельного сопоставления бэндов, окрашенных по Кумасси).Using standard methods for producing polyclonal antisera in rabbits. Young rabbits of the New Zealand white breed are used. The course of immunization is 4 doses, each approximately 100 mg, administered at a monthly interval. Each dose in phosphate-buffered saline is administered as an emulsion with complete Freund's adjuvant (1st dose) or incomplete Freund's adjuvant (2-4th dose), which are injected into four different subcutaneous sites. A preliminary blood sample is taken before the introduction of the 1st dose. Blood samples are taken 14 days after the second dose to confirm the immune response. The final blood sampling is carried out 14 days after the 4th dose, which is used in the experiment. The fifth and last dose is administered after at least 6 weeks after the 4th dose, and the final blood sampling (also used in the experiment) is carried out 14 days after the indicated one. Antibodies initiate both (i) purified native mature wild type EPSPS rice (Example 8) and also (ii) SDS-denatured EPSPS polypeptide of rice, which is eluted from a strip excised from 12% SDS gel (exact position of the protein it is marked by parallel matching of bands painted according to Coomassie).
Для электрофореза в ДСН-геле и Вестерн-блоттинга используют 12%-ный полиакриламидный гель. Электрофорез проводят с постоянным током при 100 В в течение 90 мин. Гели блотируют на нитроцеллюлозные пластины в течение ночи при 4°С при напряжении постоянного тока 30 В. Пластины блокируют 5% фосфатно-солевым буфером Marvel, содержащим 0,1% Твин (ФСБ-Твин) в течение 1-2 ч, трижды промывают ФСБ-Твином и инкубируют с первичным антителом к EPSPS-Rb1 риса из расчета примерно 1,3 мг IgG/мл (что в норме эквивалентно разведению окончательной пробы крови 1:4000-1:20000). Такие разведения антител проводят в ФСБ (фосфатно-солевой буфер), содержащем 1% Marvel и 0,05% Твин-20, в течение 2 ч. Вторичное антитело, козье антикроличье с пероксидазой хрена (Sigma А-6154), применяют в разведении 1:10000 или 1:20000 в ФСБ, содержащем 0,05% Твин и 1% Marvel. Инкубацию с вторичным антителом продолжают 1 ч, блот промывают 3 раза в ФСБ (0,05% Твин), субстрат для ECL вносят обычно в течение 1 мин и пленку экспонируют в течение 30-60 с. Негативными контрольными блотами являются блоты с (1) преиммунной сывороткой в таких разведениях, чтобы дать тот же выход IgG, что и в иммунных сыворотках (IgG стандартным образом очищают из аликвоты каждой сыворотки и количественно оценивают так, чтобы указанные разведения можно было подсчитывать напрямую), а также с (2) иммунной сывороткой только к адъюванту Фройнда. Концентрацию IgG в контрольных иммунных сыворотках корректируют таким образом, чтобы контроли имели соответствующую концентрацию IgG. С целью такого подсчета IgG очищают из неочищенной антисыворотки с помощью фильтрации через шприцевой фильтр 0,45 мкм и пропускают через 1-мл колонку Hi Trap с белком-G (Pharmacia: каталожный №17-0404-01). Связанный IgG элюируют из колонки 0,1 М глицин-HCl, рН 2,9 и диализуют против ФСБ в течение ночи. Концентрацию IgG определяют с помощью УФ-детектора (1-см пробег раствора 1 мг/мл чистого IgG характеризуется поглощением 1,35 при длине волны 280 нм). На основе выхода IgG может быть выполнен подсчет концентрации IgG в неочищенной антисыворотке с соответствующим точным подсчетом разведении для Вестерн-блоттинга.For SDS gel electrophoresis and Western blotting, a 12% polyacrylamide gel is used. Electrophoresis is carried out with direct current at 100 V for 90 minutes. The gels are blotted onto nitrocellulose plates overnight at 4 ° C at a DC voltage of 30 V. The plates are blocked with 5% Marvel phosphate-buffered saline containing 0.1% Tween (FSB-Tween) for 1-2 hours, washed with FSB three times Tween and incubate with primary antibody against rice EPSPS-Rb1 at a rate of approximately 1.3 mg IgG / ml (which is normally equivalent to diluting a final blood sample of 1: 4000-1: 20,000). Such dilutions of antibodies are carried out in PBS (phosphate-buffered saline) containing 1% Marvel and 0.05% Tween-20 for 2 hours. Secondary antibody, goat anti-rabbit with horseradish peroxidase (Sigma A-6154), is used in dilution 1 : 10,000 or 1: 20,000 in the FSB containing 0.05% tween and 1% Marvel. Incubation with the secondary antibody is continued for 1 hour, the blot is washed 3 times in PBS (0.05% Tween), the substrate for ECL is usually added for 1 minute, and the film is exposed for 30-60 seconds. Negative control blots are blots with (1) preimmune serum in such dilutions as to give the same IgG yield as in immune sera (IgG is routinely purified from aliquots of each serum and quantified so that these dilutions can be directly calculated), and also with (2) immune serum only to Freund's adjuvant. The concentration of IgG in the control immune sera is adjusted so that the controls have an appropriate concentration of IgG. For this count, IgG is purified from crude antiserum by filtration through a 0.45 μm syringe filter and passed through a 1 ml Hi Trap protein-G column (Pharmacia: Catalog No. 17-0404-01). Bound IgG was eluted from a 0.1 M glycine-HCl column, pH 2.9, and dialyzed against PBS overnight. The concentration of IgG is determined using a UV detector (1 cm run of a solution of 1 mg / ml pure IgG is characterized by an absorption of 1.35 at a wavelength of 280 nm). Based on the IgG yield, an IgG concentration in the crude antiserum can be calculated with an appropriate accurate dilution count for Western blotting.
Образцы растительных тканей получают, например, как описано в примере 17. Альтернативно, для Вестерн-блоттинга используют более простую процедуру. 100-200 мг растительной ткани, предназначенной для анализа, быстро гомогенизируют (например, с помощью диспергатора Ultra Turrax, шарикового измельчителя или стеклянного гомогенизатора) в равном объеме буфера (сходного с буфером примера 7), центрифугируют в течение 5 мин в охлажденной эппендорфовской центрифуге и (а) небольшую аликвоту надосадочной фракции анализируют на белок по Брэдфорду, или (b) большую часть надосадочной фракции смешивают 1:1 с “буфером для образца” Laemli-ДСН, нагревают и затем хранят готовым для загрузки в гель. Обычно ДСН-гели загружают десятью образцами белка в 10 лунках. Обычно используют 1-10 мкг неочищенных экстрактов растительного материала для анализа параллельно калибровочной кривой от 0 до 20 нг чистой EPSPS риса. В некоторых случаях Вестерн-блоты разгоняют с использованием антител, сформированных к очищенной EPSPS дикого типа от брюквы Brassica napus (экспрессированной и очищенной с использованием методов, сходных с описанными выше). В этом случае сила перекрестной реакции антител оказывается меньше по отношению к EPSPS риса (или с EPSPS, эндогенной для растений пшеницы или кукурузы) по сравнению с антителами, сформированными к EPSPS риса, но, несмотря на это, проявляет уровень реакции, достаточный для получения эффективной количественной информации по отношению к калибровочной кривой.Plant tissue samples are obtained, for example, as described in Example 17. Alternatively, a simpler procedure is used for Western blotting. 100-200 mg of the plant tissue to be analyzed is quickly homogenized (for example, using an Ultra Turrax dispersant, a ball mill or a glass homogenizer) in an equal volume of buffer (similar to the buffer of Example 7), centrifuged for 5 min in a chilled Eppendorf centrifuge, and (a) a small aliquot of the supernatant fraction is analyzed for Bradford protein, or (b) most of the supernatant fraction is mixed 1: 1 with Laemli-SDS “sample buffer”, heated and then stored ready for loading into the gel. Typically, SDS gels are loaded with ten protein samples in 10 wells. Typically, 1-10 μg of crude plant material extracts are used to analyze a parallel calibration curve from 0 to 20 ng of pure EPSPS rice. In some cases, Western blots are dispersed using antibodies generated to purified wild-type EPSPS from Brassica napus rutabaga (expressed and purified using methods similar to those described above). In this case, the cross-reaction force of antibodies is less with respect to rice EPSPS (or with EPSPS endogenous for wheat or corn plants) compared to antibodies formed to rice EPSPS, but despite this, it shows a reaction level sufficient to obtain an effective quantitative information in relation to the calibration curve.
Пример 20Example 20
Выделение геномной ДНК из трансгенного растительного материала. ПЦР-анализ. Получение и гибридизация ДНК-зондов. Число копий и целостность трансгенаIsolation of genomic DNA from transgenic plant material. PCR analysis. Obtaining and hybridization of DNA probes. Copy Number and Transgene Integrity
Геномную ДНК выделяют из материала растений, проростков и каллюсов с помощью, например, метода Dellporta et al. (1983) in Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18’th Stadler Genetics Symposium. J.P.Gustafson and R.Appels, eds). New York: Plenum Press) pp. 263-283, или, альтернативно, с использованием набора DNAeasy kit (Qiagen). Трансгенные каллюсы и растения-сегреганты, которые несут мутантный трансген EPSPS риса, идентифицируют с использованием флуоресцентной ПЦР с олигонуклеотидными праймерами SEQ ID NO. 39 и 40, которые специфичны в отношении мутаций в пределах геномной последовательности EPSPS риса. Флуоресцентный краситель SYBR зеленки, который интеркалирует двухцепочечную ДНК, включают в ПЦР таким образом, что образцы, включающие мутантный ген EPSPS риса, идентифицируются по повышению флуоресценции образца, что выявляется на устройстве ABI 3377. Альтернативно, специалистам в данной области техники известно, что праймеры могут быть помечены флуоресцентным образом, причем доступны такие методы, как “молекулярный маяк” и “Scorpions”.Genomic DNA is isolated from plant material, seedlings and calluses using, for example, the method of Dellporta et al. (1983) in Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18’th Stadler Genetics Symposium. J.P. Gustafson and R. Appels, eds). New York: Plenum Press) pp. 263-283, or alternatively using the DNAeasy kit (Qiagen). Transgenic calli and segregant plants that carry the mutant rice EPSPS transgene are identified using fluorescence PCR with oligonucleotide primers SEQ ID NO. 39 and 40, which are specific for mutations within the genomic sequence of EPSPS rice. The fluorescent dye of SYBR brilliant green, which intercalates double-stranded DNA, is included in PCR so that samples containing the mutant EPSPS gene of rice are identified by increasing the fluorescence of the sample, which is detected on an ABI 3377 device. Alternatively, it is known to those skilled in the art that primers can be labeled in a fluorescent manner, and methods such as the molecular beacon and scorpions are available.
Обычная реакция ПЦР, приготовленная на 96-луночных планшетах Optical, закрытых лентой Optical (РЕ Biosystems), соответствует следующему:A typical PCR reaction prepared on Optical 96-well plates covered with Optical tape (PE Biosystems) corresponds to the following:
5,0 мкл геномной ДНК-матрицы (препарат DNAeasy, Qiagen),5.0 μl of the genomic DNA template (DNAeasy, Qiagen),
12,5 мкл 2х премикса SYBR зеленого;12.5 μl of 2x SYBR green premix;
2,5 мкл 5 пкмоль/мкл маточного прямого праймера;2.5
2,5 мкл 5 пкмоль/мкл маточного обратного праймера;2.5
2,5 мкл дважды дистиллированной воды;2.5 μl of twice distilled water;
общий объем - 25,0 мкл.total volume - 25.0 μl.
Параметры циклов следующие:The parameters of the cycles are as follows:
стадия 1:2 мин при 50°С,stage 1: 2 min at 50 ° C,
стадия 2:10 мин при 95°С;stage 2:10 min at 95 ° C;
стадия 3: 50 циклов по 15 с при 95°С и по 45 с при 60°С.stage 3: 50 cycles of 15 s at 95 ° C and 45 s at 60 ° C.
Изменения флуоресценции в образцах регистрируют каждые 7 с со стадии 3 реакции.Fluorescence changes in the samples are recorded every 7 s from
Для Саузерн-блоттинга приблизительно 10 мкг ДНК используют для каждого расщепления рестриктазами. Геномную ДНК расщепляют подходящими рестриктазами (например, HindIII) в соответствии с инструкциями изготовителя (например, Promega). Выбирают рестрикционные ферменты, которые расщепляют ДНК и в пределах, и за пределами мутантной последовательности EPSPS. ДНК разделяют с использованием 0,8%-ных агарозных гелей с ТАЕ (0,04 М Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА). Саузерн-блоттинг осуществляют в соответствии с методами, предлагаемыми Sambrook et al., 1989, с использованием нитроцеллюлозной мембраны HyBond N+ для блоттинга (Amersham Pharmacia). ДНК перекрестно сшивают с указанной мембраной действием ультрафиолетового облучения.For Southern blotting, approximately 10 μg of DNA is used for each restriction enzyme digestion. Genomic DNA is digested with suitable restriction enzymes (e.g., HindIII) according to the manufacturer's instructions (e.g., Promega). Restriction enzymes that cleave DNA both within and outside the mutant EPSPS sequence are selected. DNA was separated using 0.8% agarose gels with TAE (0.04 M Tris-acetate, 1 mM EDTA). Southern blotting is carried out in accordance with methods proposed by Sambrook et al., 1989, using a HyBond N + nitrocellulose membrane for blotting (Amersham Pharmacia). DNA is cross-linked with the specified membrane by ultraviolet radiation.
Фрагменты ДНК, используемые для получения специфичных зондов, выделяют с помощью очистки в гелях рестрикционных фрагментов плазмидной ДНК или получают с помощью ПЦР. Например, фрагмент длиной 700 п.н., включающий 1-й интрон гена EPSPS риса, получают с помощью ПЦР с использованием показанных далее праймеров:The DNA fragments used to produce specific probes are isolated by purification of restriction fragments of plasmid DNA in gels or obtained by PCR. For example, a 700 bp fragment including the 1st intron of the EPSPS gene of rice is obtained by PCR using the primers shown below:
Такие зонды помечают 32P с использованием метода случайного мечения, например, с помеченными шариками Ready-To-Go NA labelling beads (Amersham Pharmacia), и очищают, например, на колонках MicroSpin G-25 (Amersham Pharmacia).Such probes are labeled with 32 P using a random labeling method, for example with labeled Ready-To-Go NA labelling beads (Amersham Pharmacia), and purified, for example, on MicroSpin G-25 columns (Amersham Pharmacia).
Блоты гелей с ДНК прегибридизуют при 65°С в 5× SSC, 0,5% ДСН, 2× раствор Денхардта, 0,15 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося по крайней мере в течение 1 ч. Затем блот гибридизуют с денатурированным зондом в течение 16-24 ч при 65°С в свежем прегибридизационном растворе. Мембраны блотируют досуха и проявляют с помощью авторадиографии.DNA gel blots are hybridized at 65 ° C in 5 × SSC, 0.5% SDS, 2 × Denhardt's solution, 0.15 mg / ml denatured salmon sperm DNA for at least 1 hour. The blot is then hybridized with a denatured probe in for 16-24 hours at 65 ° C in fresh prehybridization solution. Membranes are blotted to dryness and developed by autoradiography.
Если Саузерн-блоттинг указывает на единственное событие встраивания трансгена по единственному локусу, о чем говорит гибридизация зонда с единственным рестрикционным фрагментом конкретного размера, то такой результат подтверждают путем повторной гибридизации блота с использованием альтернативного зонда. Для контроля используют нетрансформированный материал. Дополнительно блот может быть прозондирован еще с гибридизационными зондами, специфичными в отношении иных участков трансгенной конструкции (например, промотора, сегмента 5’UTR в интроне или расположенной выше энхансерной последовательности) с целью подтверждения целостности конструкции. Кроме того, в случае, когда применяют трансформацию бактерией Agrobacterium, конкретные зонды используют для указания на присутствие или отсутствие любой ДНК, расположенной вне пределов, ограниченных граничными сайтами RB и LB супербифункционального вектора.If Southern blotting indicates a single event of transgene insertion at a single locus, as indicated by hybridization of the probe with a single restriction fragment of a specific size, then this result is confirmed by repeated hybridization of the blot using an alternative probe. For control using non-transformed material. Additionally, the blot can also be probed with hybridization probes specific for other regions of the transgenic construct (for example, a promoter, a 5’UTR segment in an intron or an upstream enhancer sequence) in order to confirm the integrity of the construct. In addition, when a transformation using the Agrobacterium bacterium is used, specific probes are used to indicate the presence or absence of any DNA located outside the bounds of the boundary sites RB and LB of the superfunctional vector.
SEQ ID NO. 43. Геномная последовательность EPSPS риса (от ATG - последовательность дикого типа)SEQ ID NO. 43. The genomic sequence of EPSPS rice (from ATG - wild-type sequence)
SEQ ID NO. 44. Геномная последовательность EPSPS риса (от ATG - включая двойную мутацию: отмечены)SEQ ID NO. 44. The genomic sequence of EPSPS rice (from ATG - including double mutation: marked)
Claims (14)
Applications Claiming Priority (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9909968.1 | 1999-04-29 | ||
| GBGB9930213.5A GB9930213D0 (en) | 1999-04-29 | 1999-04-29 | Improvements in or relating to organic compounds |
| GB9930213.5 | 1999-04-29 | ||
| GBGB9917834.5A GB9917834D0 (en) | 1999-04-29 | 1999-04-29 | Improvements in or relating to organic compounds |
| GB9917834.5 | 1999-04-29 | ||
| GB9917840.2 | 1999-07-29 | ||
| GB9917847.7 | 1999-07-29 | ||
| GB9917846.9 | 1999-07-29 | ||
| GB9917839.4 | 1999-07-29 | ||
| GB9930200.2 | 1999-12-21 | ||
| GB9930209.3 | 1999-12-21 | ||
| GB9930204.4 | 1999-12-21 | ||
| GB9930207.7 | 1999-12-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001132145A RU2001132145A (en) | 2003-08-20 |
| RU2235778C2 true RU2235778C2 (en) | 2004-09-10 |
Family
ID=33436329
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001132145/13A RU2235778C2 (en) | 1999-04-29 | 2000-04-20 | Isolated polynucleotide able to confer to plant resistance or tolerance to glyfosate herbicide, vector, method for preparing plants with tolerance or resistance to glyfosate herbicide, method for regeneration of transformed plant and method for selective control of weeds |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2235778C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7803992B2 (en) | 2005-08-24 | 2010-09-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for expressing an herbicide-tolerant polynucleotide |
| RU2707527C2 (en) * | 2015-04-30 | 2019-11-27 | Бэйджинг Дабейнонг Текнолоджи Груп Ко., Лтд. | Maize plant dbn9936 and method of using in detection nucleic acid sequence thereof |
-
2000
- 2000-04-20 RU RU2001132145/13A patent/RU2235778C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GASSER С.S. ет al. Journal of biological chemistry. - 1988, vol.263, no. 9, p.4280-4287. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7803992B2 (en) | 2005-08-24 | 2010-09-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for expressing an herbicide-tolerant polynucleotide |
| US7973218B2 (en) | 2005-08-24 | 2011-07-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for controlling weeds |
| US8203033B2 (en) | 2005-08-24 | 2012-06-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for providing tolerance to multiple herbicides |
| RU2707527C2 (en) * | 2015-04-30 | 2019-11-27 | Бэйджинг Дабейнонг Текнолоджи Груп Ко., Лтд. | Maize plant dbn9936 and method of using in detection nucleic acid sequence thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1173582B1 (en) | Herbicide resistant plants | |
| JP2003527080A (en) | Herbicide-tolerant plants | |
| JP2003528571A6 (en) | Herbicide resistant plants | |
| US20030079246A1 (en) | Herbicide resistant plants | |
| US7169970B2 (en) | Herbicide resistant plants | |
| EP2287292B1 (en) | Plant derived hydroxy phenyl pyruvate dioxygneases (hppd) resistant against triketone herbicides and transgenic plants containing these dioxygenases | |
| US6143562A (en) | Carbon-based process for selection of transgenic plant cells | |
| EP0820513A2 (en) | TRANSGENIC PLANTS EXPRESSING ACETYL CoA CARBOXYLASE GENE | |
| US6222099B1 (en) | Transgenic plants expressing maize acetyl COA carboxylase gene and method of altering oil content | |
| RU2235778C2 (en) | Isolated polynucleotide able to confer to plant resistance or tolerance to glyfosate herbicide, vector, method for preparing plants with tolerance or resistance to glyfosate herbicide, method for regeneration of transformed plant and method for selective control of weeds | |
| DE60028751T2 (en) | HERBICIDRESISTENT PLANTS | |
| ZA200108766B (en) | Herbicide resistant plants. | |
| ZA200108769B (en) | Herbicide resistant plants. | |
| ZA200108768B (en) | Herbicide resistant plants. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140421 |