RU2234334C2 - Method for treatment diseases caused by colon intestine bacterial infection and method for suppression of microorganisms forming colonies in large intestine - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine, gastroenterology.

SUBSTANCE: invention can be used for treatment of diseases associated with infection of colon intestine with microorganism C. difficile and also with formation of enterococcus colonies exhibiting resistance to vancomycin. Method involves the effective amount of pharmaceutical composition containing cover retaining its integrity during passage through digestive tract and releasing an active component in colon intestine. The composition contains lantocin as an active component, from 2 to 20% of NaCl and from 20 to 80% of cover as measured for mass of crude active cover. Invention is designated for the development of agents directed for treatment of colon intestine diseases and for suppression of potentially danger microorganisms forming colonies in colon intestine and for the development of agents for delivery of taken lantocin to colon intestine in sufficient amount to provides the effective treatment of infection focus.

EFFECT: improved treatment method.

27 cl, 8 dwg, 11 tbl, 11 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к способам лечения заболеваний, связанных с инфекцией ободочной кишки микроорганизмом С.difficile, а также с образованием колоний, резистентных к ванкомицину энтерококков.The invention relates to methods for treating diseases associated with an infection of the colon with the microorganism C. difficile, as well as with the formation of colonies resistant to enterococcus vancomycin.

Уровень техникиState of the art

Низин является бактериоцином - противомикробным веществом, синтезируемым микроорганизмом, размножающимся на продуктах питания, и является членом группы близких в структурном отношении веществ, называемых лантиобиотиками (или в данном тексте описания - лантоцинами). К другим членам группы относятся субтилин, эпидермин, галлидермин и pep 5.Nisin is a bacteriocin, an antimicrobial substance synthesized by a microorganism that reproduces on food products, and is a member of a group of structurally similar substances called lantiobiotics (or lantocins in this description). Other members of the group include subtilin, epidermis, gallidermin and pep 5.

Низин синтезируется микроорганизмом Lactococcus lactis, подвид lactis, относящимся к серологической группе N по Ланцефилду (Mattick A.T.R. и А.Hirsch, 1947, Lancet. 2, 5). Низин представляет собой пептид, содержащий 34 аминокислотных остатка и 5 циклических структур, соединенных тиоэфирными мостиковыми связями, которые образуют лантионин или бетта-метиллантионин. Тиоэфирные связи образуются при конденсации сульфгидрильных групп остатков цистеина с дегидрофрагментами боковых цепей, образованными из остатков серина или треонина, и являются результатом пост-трансляционных модификаций пептида - предшественника низина.Nisin is synthesized by the microorganism Lactococcus lactis, a subspecies of lactis belonging to the Lancefield serological group N (Mattick A.T.R. and A. Hirsch, 1947, Lancet. 2, 5). Nisin is a peptide containing 34 amino acid residues and 5 cyclic structures connected by thioether bridging bonds that form lanthionine or betta-methylanthionine. Thioether bonds are formed upon the condensation of sulfhydryl groups of cysteine residues with dehydrofragments of side chains formed from serine or threonine residues, and are the result of post-translational modifications of the nisin precursor peptide.

Согласно опубликованным данным низин действует как катионный поверхностно-активный агент, и его активность может быть нейтрализована анионными поверхностно-активными веществами (Ramseier H.R., 1960, Arch. Microbiol., 37, 57), а на молекулярном уровне низин действует на цитоплазматическую мембрану и ингибирует биосинтез пептидогликанов (Reisinger с соавт., 1980, Arch. Microbiol., 127. 187). Наиболее вероятно, что действие низина на растительные бактерии является результатом деполяризации плазматической мембраны (зависимой от разности потенциалов), которая происходит после встраивания пептида в двойной слой липидов, по-видимому, путем взаимодействия соседних молекул низина с образованием временной поры или канала. Молекулярные свойства низина и механизм его биосинтеза описаны в опубликованном недавно обзоре [Jung G. и H.G.Sahl, 1991, Nisin and novel lantibiotics (Низин и новые лантибиотики) ESCOM Science Publishers, Leiden].According to published data, nisin acts as a cationic surfactant, and its activity can be neutralized by anionic surfactants (Ramseier HR, 1960, Arch. Microbiol., 37, 57), and at the molecular level, nisin acts on the cytoplasmic membrane and inhibits biosynthesis of peptidoglycans (Reisinger et al., 1980, Arch. Microbiol., 127. 187). It is most likely that the effect of nisin on plant bacteria is the result of the depolarization of the plasma membrane (depending on the potential difference), which occurs after the peptide is inserted into the double lipid layer, apparently by the interaction of neighboring nisin molecules with the formation of a temporary pore or channel. The molecular properties of nisin and the mechanism of its biosynthesis are described in a recent review [Jung G. and H. G. Sahl, 1991, Nisin and novel lantibiotics (Nisin and new lantibiotics) ESCOM Science Publishers, Leiden].

Считается, что низин характеризуется узким спектром активности и, в основном, проявляет активность только против некоторых грамположительных бактерий, за исключением действия в смеси схелатным агентом, когда низин проявляет неожиданную активность против грамотрицательных бактерий и характеризуется повышенной активностью против грамположительных бактерий (Патенты США No 5217950 и No 5260271, выданные Blackburn с соавт.). Низин применяют в качестве пищевого антимикробного консерванта, утвержденного как безопасный продукт организацией JEFCA и рядом других национальных государственных органов по контролю использования пищевых добавок, включая организации США, Великобритании и Европейского Экономического Сообщества.It is believed that nisin is characterized by a narrow spectrum of activity and mainly shows activity only against certain gram-positive bacteria, with the exception of the action of a chelate agent in the mixture, when nisin exhibits unexpected activity against gram-negative bacteria and is characterized by increased activity against gram-positive bacteria (U.S. Patent Nos. 5217950 and No. 5260271 issued by Blackburn et al.). Nisin is used as a food antimicrobial preservative, approved as a safe product by JEFCA and a number of other national government agencies for the control of the use of food additives, including organizations in the USA, Great Britain and the European Economic Community.

Несмотря на то, что предварительные исследования на моделях животных показали эффективность низина (Mattick A.T.R. и A.Hirsch, 1947, Lancet. 2:5; Bavin Е.М. с соавт., 1952, Lancet. 1:127; Gowans J.L, с соавт., 1952, Brit. J. Pharmacol. 7:438; Hirsch А. и A.T.R. Mattick, 1949, Lancet. ii:190), было установлено, что низин недостаточно эффективен для разработки терапевтических препаратов с целью их использования в медицине и ветеринарии.Despite the fact that preliminary studies on animal models have shown the effectiveness of nisin (Mattick ATR and A. Hirsch, 1947, Lancet. 2: 5; Bavin, E.M. et al., 1952, Lancet. 1: 127; Gowans JL, p. et al., 1952, Brit. J. Pharmacol. 7: 438; Hirsch A. and ATR Mattick, 1949, Lancet. ii: 190), it was found that nisin is not effective enough to develop therapeutic drugs for use in medicine and veterinary medicine .

Clostridium difficile является анаэробной грамположительной, споробразующей токсикогенной палочковидной бактерией, которую иногда обнаруживают в значительном количестве в ободочной кишке человека. Однако, в связи с резистентностью этой бактерии к ряду противомикробных препаратов и вызванной ею эндемией в больницах и частных лечебницах, бактерия может размножаться, если подавлена нормальная бактериальная флора ободочной кишки, в большинстве случаев после лечения противомикробными препаратами с широким спектром действия. В этом случае С.difficile может вызвать серьезные заболевания, известные как диарея и псевдомембранозный колит, связанные с применением антибиотиков. Лечение таких нарушений включает использование метронидазола и ванкомицина для орального введения. Однако в настоящее время применение ванкомицина, прежде всего оральным путем, вызывает серьезную озабоченность, так как этот антибиотик приводит к селекционному отбору нового класса высокорезистентных кишечных микроорганизмов, ванкомицин-резистентных энтерококков (ВРЭ), которые могут вызвать серьезные, не поддающиеся лечению инфекции в различных частях тела. Метронидазол не активен по отношению к энтерококкам, и таким образом, его использование также может вносить вклад в селекцию ВРЭ в ободочной кишке. Частота рецидивов заболеваний, вызванных С.difficile, чрезвычайно высока и составляет примерно 20%; предполагают, что это связано с образованием спор, которые трудно ликвидировать.Clostridium difficile is an anaerobic gram-positive, spore-forming toxicogenic rod-shaped bacterium, which is sometimes found in significant quantities in the human colon. However, due to the resistance of this bacterium to a number of antimicrobials and the endemic caused by it in hospitals and private hospitals, the bacterium can multiply if the normal bacterial flora of the colon is suppressed, in most cases after treatment with antimicrobial agents with a wide spectrum of action. In this case, C. difficile can cause serious diseases known as diarrhea and pseudomembranous colitis associated with the use of antibiotics. Treatment for such disorders includes the use of metronidazole and vancomycin for oral administration. However, at present, the use of vancomycin, primarily by the oral route, is of serious concern, since this antibiotic leads to the selection of a new class of highly resistant intestinal microorganisms, vancomycin-resistant enterococci (FEV), which can cause serious, untreatable infections in various parts body. Metronidazole is not active against enterococci, and thus, its use can also contribute to the selection of FEV in the colon. The relapse rate of diseases caused by C. difficile is extremely high and amounts to approximately 20%; suggest that this is due to the formation of spores that are difficult to eliminate.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Задачей изобретения является разработка средств для лечения вызванных бактериями заболеваний ободочной кишки и для подавления потенциально опасных бактерий, образующих колонии в ободочной кишке. Показано, что введение больших доз лантионинсодержащих антибиотиков (лантоцинов), таких как низин, в ободочную кишку характеризуется неожиданно высокой устойчивостью в ободочной кишке и отсутствием токсичности. Как следствие, другой задачей изобретения является разработка средств для доставки выбранного лантоцина в ободочную кишку в достаточном количестве для эффективного лечения очага инфекции в ободочной кишке.The objective of the invention is to develop tools for the treatment of bacterial diseases of the colon and for the suppression of potentially dangerous bacteria that form colonies in the colon. It has been shown that the introduction of large doses of lanthionine-containing antibiotics (lantocins), such as nisin, into the colon is characterized by unexpectedly high stability in the colon and the absence of toxicity. As a result, another object of the invention is to develop means for delivering the selected lantocin to the colon in sufficient quantities to effectively treat the focus of infection in the colon.

Перечень фигур чертежей и иных материаловList of figures of drawings and other materials

На фиг.1 показана чувствительность низина к ферментам, присутствующим в желудочно-кишечном тракте.Figure 1 shows the sensitivity of nisin to enzymes present in the gastrointestinal tract.

На фиг.2 показано влияние толщины покрытия таблеток на время до начала разложения таблеток в фосфатном буферном растворе.Figure 2 shows the effect of the thickness of the coating of tablets on the time before the decomposition of tablets in phosphate buffer solution.

На фиг.3 показано влияние толщины покрытия таблеток на времена до начала и до завершения разложения таблеток в фосфатном буферном растворе.Figure 3 shows the effect of the coating thickness of the tablets on the times before and before the decomposition of the tablets in the phosphate buffer solution.

На фиг.4 показано влияние толщины покрытия таблеток на замедление высвобождения низина в фосфатном буферном растворе с рН 6,8.Figure 4 shows the effect of the coating thickness of the tablets on slowing down the release of nisin in a phosphate buffer solution with a pH of 6.8.

На фиг.5 показан профиль растворения 6-ти таблеток с 40%-ным покрытием из Eudragit™.Figure 5 shows the dissolution profile of 6 tablets with a 40% coating of Eudragit ™.

На фиг.6 показан процесс продвижения таблеток с 40%-ной толщиной покрытия через желудочно-кишечный тракт человека в процессе пищеварения в течение 7 ч.Figure 6 shows the process of promoting tablets with a 40% coating thickness through the human gastrointestinal tract during digestion for 7 hours.

На фиг.7 показан процесс продвижения таблеток с 120%-ной толщиной покрытия через желудочно-кишечный тракт человека в процессе пищеварения в течение 12 ч.Figure 7 shows the process of promoting tablets with a 120% coating thickness through the human gastrointestinal tract during digestion for 12 hours.

На фиг.8 показан процесс продвижения таблеток с 180%-ной толщиной покрытия через желудочно-кишечный тракт человека в процессе пищеварения в течение 16 ч.On Fig shows the process of promoting tablets with 180% coating thickness through the human gastrointestinal tract during digestion for 16 hours

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияInformation confirming the possibility of carrying out the invention

Предметом изобретения является разработка средств лечения заболеваний ободочной кишки, вызванных микроорганизмом С.difficile, и средства для подавления бактерий, образующих колонии в толстой кишке, таких как ВРЭ.The subject of the invention is the development of agents for the treatment of colon diseases caused by the microorganism C. difficile, and agents for the suppression of bacteria forming colonies in the colon, such as FEV.

В связи с этим авторами показано, что низин обладает высокой активностью против патогенных штаммов различных грамположительных бактерий, включая ВРЭ (заявка на выдачу патента США, регистрационный No 08/667650, включена в текст описания в виде ссылки). Известно, что низин обладает активностью против гнилостных микроорганизмов рода Clostridium, вызывающих порчу пищевых продуктов, и после открытой авторами активности низина против С.difficile такая активность была описана другими авторами (Kerr с соавт., 1997, Lancet. 349:1026).In this regard, the authors showed that nisin has high activity against pathogenic strains of various gram-positive bacteria, including FEV (application for the grant of a US patent, registration No. 08/667650, is incorporated into the description by reference). It is known that nisin has activity against putrefactive microorganisms of the genus Clostridium, causing food spoilage, and after the activity of nisin against C. difficile discovered by the authors, such activity was described by other authors (Kerr et al., 1997, Lancet. 349: 1026).

В данном описании показано, что низин обладает высокой активностью по отношению к большому числу клинических изолятов С.difficile, включая штаммы, резистентные к клиндамицину и метронидазолу. Показано также, что низин проявляет низкую активность по отношению к преобладающей нормальной кишечной флоре человека - Bacteroides fragilis. Действительно, наблюдается значительное различие между диапазоном концентраций низина, активных против 50% штаммов С.difficile, и диапазоном концентраций, активных против 50% штаммов В. fragilis. Это означает, что в отличие от рекомендаций Kerr с соавт., представляется маловероятным, что эффективные дозы низина будут оказывать отрицательное действие на защитную комменсальную микрофлору кишечного тракта. Несмотря на то, что, как уже было установлено, низин требует использования потенцирующего средства для проявления его активности против большинства грамотрицательных бактерий, существует несколько исключений. Например, трудно культивируемые грамотрицательные бактерии, такие как Neisseria gonorrhoeae чувствительны исключительно к низину. В. fragilis является трудно культивируемым анаэробом, чувствительность которого к низину до настоящего времени не известна.This description shows that nisin has high activity against a large number of clinical isolates of C. difficile, including strains resistant to clindamycin and metronidazole. It was also shown that nisin exhibits low activity with respect to the predominant normal intestinal flora of humans - Bacteroides fragilis. Indeed, there is a significant difference between the range of concentrations of nisin active against 50% of C. difficile strains and the range of concentrations active against 50% of strains of B. fragilis. This means that, unlike the recommendations of Kerr et al., It seems unlikely that effective doses of nisin will have a negative effect on the protective commensal microflora of the intestinal tract. Despite the fact that, as already been established, nisin requires the use of a potentiating agent for the manifestation of its activity against most gram-negative bacteria, there are several exceptions. For example, difficult-to-cultivate gram-negative bacteria such as Neisseria gonorrhoeae are sensitive exclusively to nisin. B. fragilis is a difficultly cultivated anaerobic whose sensitivity to nisin is not yet known.

Так как низин является пептидом и может быть расщеплен протеолитическими ферментами, присутствующими в больших количествах в тонкой кишке (сравни фиг.1), его применение оральным способом для доставки к локальным инфекционным очагам в нижней части желудочно-кишечного тракта ранее не обсуждалось. Кроме того, не известна толерантность интактного низина при его доставке в нижнюю часть желудочно-кишечного тракта, а также не известно, будет ли низин достаточно устойчив, чтобы ожидать проявления его противомикробной активности в этой части организма.Since nisin is a peptide and can be cleaved by proteolytic enzymes present in large quantities in the small intestine (cf. Fig. 1), its use by the oral method for delivery to local infectious foci in the lower gastrointestinal tract has not been previously discussed. In addition, the tolerance of intact nisin when delivered to the lower part of the gastrointestinal tract is not known, and it is not known whether nisin will be stable enough to anticipate manifestations of its antimicrobial activity in this part of the body.

При исследовании подострой внутрикишечной токсичности на моделях животных авторами показано, что низин не оказывает раздражающего действия на ободочную кишку при повторной доставке. Кроме того, показано, что интактный низин не может быть обнаружен в крови обработанных животных, что свидетельствует о том, что при таком пути прохождении низина системная абсорбция (и возможная системная токсичность) маловероятны. Кроме того, при исследовании животных, у которых на часть ободочной кишки наложена лигатура, показано, что значительная часть низина сохраняется в интактной форме in situ в течение нескольких часов после введения в ободочную кишку.In the study of subacute intestinal toxicity in animal models, the authors showed that nisin does not irritate the colon during repeated delivery. In addition, it was shown that intact nisin cannot be detected in the blood of treated animals, which indicates that with this path of passage of nisin, systemic absorption (and possible systemic toxicity) are unlikely. In addition, when examining animals in which a ligature was applied to a part of the colon, a significant part of the nisin was preserved in intact form in situ for several hours after introduction into the colon.

Таким образом, существует практическая необходимость в разработке систем для доставки низина или других противомикробных лантоцинов пептидной природы, включая структурные варианты этих молекул, синтезированных методом генной инженерии или полусинтетическим способом, для лечения инфекций ободочной кишки, вызванных микроорганизмами (включая, но не ограничиваясь С.difficile), чувствительными к этим пептидам, или для подавления чувствительных микроорганизмов, образующих колонии в толстой кишке (включая, но не ограничиваясь ВРЭ), которые представляют потенциальную опасность для здоровья индивидуума или других пациентов. В связи с этим, другим предметом изобретения является разработка составов композиций, которые позволяют осуществить доставку эффективных количеств низина оральным способом для лечения бактериальных инфекций в ободочной кишке.Thus, there is a practical need to develop systems for delivering nisin or other antimicrobial lantocins of a peptide nature, including structural variants of these molecules synthesized by genetic engineering or semi-synthetic method, for the treatment of colon infections caused by microorganisms (including, but not limited to C. difficile ), sensitive to these peptides, or to suppress sensitive microorganisms that form colonies in the colon (including, but not limited to FEV), which pre pose a potential hazard to the health of the individual or other patients. In this regard, another object of the invention is the development of compositions of compositions that allow the delivery of effective amounts of nisin by the oral method for the treatment of bacterial infections in the colon.

Фармацевтические композиции этих пептидов включают таблетки с соответствующим покрытием или гранулы, или капсулы для орального введения, которые позволяют сохранять целостность лекарственной формы в процессе прохождения через желудок и тонкую кишку, а затем обеспечивают высвобождение активного компонента в соответствующей части желудочно-кишечного тракта (от нижней тонкой кишки до верхней толстой кишки). Однако, очевидно, что в качестве эффективных лекарственных форм могут быть использованы, например, суппозитории и клизмы. Специфические лекарственные формы, описанные ниже, приведены просто для примера и ни коим образом не ограничивают объем изобретения.The pharmaceutical compositions of these peptides include tablets with an appropriate coating or granules or capsules for oral administration, which allow maintaining the integrity of the dosage form during passage through the stomach and small intestine, and then ensure the release of the active component in the corresponding part of the gastrointestinal tract (from the lower small intestines to the upper colon). However, it is obvious that, for example, suppositories and enemas can be used as effective dosage forms. The specific dosage forms described below are provided merely by way of example and in no way limit the scope of the invention.

ПримерыExamples

В примерах 1-5 описано изучение свойств низина в среде ободочной кишки и эффективности низина против бактерий нормальной микрофлоры кишечника.Examples 1-5 describe the study of the properties of nisin in the colon and the effectiveness of nisin against bacteria of normal intestinal microflora.

Пример 1аExample 1a

Активность низина против С.difficileNisin activity against C. difficile

20 Клиндамицин-резистентных клинических изолятов, полученных из больницы McGuire Veterans’ Administration Hospital, г.Ричмонд, штат Вирджиния, исследуют на бруцеллезном агаре с использованием крови овцы в анаэробных условиях. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяют как минимальную из исследованных концентраций, которая полностью ингибирует рост бактерии, наблюдаемый визуально.20 Clindamycin-resistant clinical isolates obtained from McGuire Veterans ’Administration Hospital, Richmond, Virginia, are examined on brucellosis agar using sheep’s blood under anaerobic conditions. The minimum inhibitory concentration (MIC) is defined as the minimum of the studied concentrations, which completely inhibits the growth of bacteria observed visually.

Как показано в табл.1, все штаммы ингибируются при концентрации низина 0,25 мкг/мл или менее.As shown in table 1, all strains are inhibited at a concentration of nisin of 0.25 μg / ml or less.

60 клинических изолятов, полученных из больницы университета г.Флоренции, Италия, исследуют на чувствительность к низину и к противомикробным средствам, используемым в настоящее время для лечения диареи и колитов, вызванных С.difficile, с использованием описанного выше метода. Как показано в табл.2, средние величины МИК или MИK₅₀ низина (концентрация, при которой наблюдается ингибирование роста 50% или более исследованных штаммов) для всех указанных штаммов составляют 0,05 мкг/мл, что значительно ниже по сравнению с количеством ванкомицина или метронидазола, необходимым для ингибирования тех же самых штаммов. Величины МИК₉₀ представляют собой концентрации противомикробного средства, при которых наблюдается ингибирование роста 90% исследованных штаммов или более.60 clinical isolates obtained from the University Hospital of Florence, Italy, are tested for sensitivity to nisin and to the antimicrobial agents currently used to treat diarrhea and colitis caused by C. difficile using the method described above. As shown in Table 2, the average MIC or MIC _{50 of} nisin (the concentration at which growth inhibition of 50% or more of the studied strains is observed) for all these strains is 0.05 μg / ml, which is significantly lower compared to the amount of vancomycin or metronidazole necessary to inhibit the same strains. MIC values of ₉₀ are antimicrobial concentrations at which growth inhibition of 90% of the studied strains or more is observed.

Данные этого примера свидетельствуют, что С.difficile является подходящим микроорганизмом-мишенью для лечения низином или родственными пептидами.The data from this example indicate that C. difficile is a suitable target microorganism for treatment with nisin or related peptides.

Пример 1бExample 1b

Отсутствие активности низина против Bacteroides fragilisLack of activity of nisin against Bacteroides fragilis

9 изолятов В.fragilis, полученных из больницы McGuire Veterans’ Administration Hospital, г.Ричмонд, штат Вирджиния, исследуют аналогичным способом, как описано выше. Ни один из штаммов не ингибируется низином даже при самой высокой из использованных концентраций низина (32 мкг/мл). Величина МИК низина по отношению к указанным штаммам составляет 64 мкг/мл или более. Аналогично, как показано в табл.3, 23 изолята из больницы университета г.Флоренции (Италия) также проявляют относительно низкую чувствительность к низину, средняя величина МИК составляет >128 мкг/мл.9 B.fragilis isolates obtained from McGuire Veterans ’Administration Hospital, Richmond, Virginia, are examined in a similar manner as described above. None of the strains is inhibited by nisin, even at the highest concentration of nisin used (32 μg / ml). The MIC value of nisin in relation to these strains is 64 μg / ml or more. Similarly, as shown in Table 3, 23 isolates from the University Hospital of Florence (Italy) also show relatively low sensitivity to nisin, the average MIC is> 128 μg / ml.

Пример 2Example 2

Толерантность к низину в лигированном кишечнике кроликовLowland tolerance in the ligated intestine of rabbits

Пять кроликов анестезируют и поддерживают их в состоянии нарколепсии в течение всего эксперимента. Вскрывают брюшную полость и накладывают лигатуру на сегмент кишечника, включая илеоцекальное соединение и проксимальную ободочную кишку. Двух кроликов используют в качестве контроля, а трем вводят по 20 мг неочищенного низина (т.е. полученного от фирмы-производителя) напрямую в лигированную область кишечника. Кроликов выдерживают в течение 6 ч, а затем забивают.Five rabbits are anesthetized and maintained in a state of narcolepsy throughout the experiment. The abdominal cavity is opened and a ligature is applied to a segment of the intestine, including the ileocecal junction and the proximal colon. Two rabbits are used as a control, and three are injected with 20 mg of crude nisin (i.e., obtained from the manufacturer) directly into the ligation region of the intestine. The rabbits are kept for 6 hours and then slaughtered.

При вскрытии трупов после гистопатологического исследования обработанного участка кишечника не наблюдается никаких признаков раздражения или токсичности, связанных с обработкой низином. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при прямом введении низина в ободочную кишку кроликов в дозе, равной дозам, которые могут быть введены человеку, не наблюдается никаких признаков местной токсичности, даже если дозу выдерживают в ободочной кишке искусственно в течение 6 ч с помощью наложения лигатуры на кишечник.At autopsy after histopathological examination of the treated intestinal tract, there are no signs of irritation or toxicity associated with the treatment of nisin. The results obtained indicate that with direct administration of nisin into the colon of rabbits at a dose equal to the doses that can be administered to humans, there are no signs of local toxicity, even if the dose is kept in the colon artificially for 6 hours by applying a ligature to the intestines.

Пример 3Example 3

Толерантность к низину при повторной доставке в ободочную кишку собакиTolerance to nisin when re-delivered to the dog’s colon

Собакам имплантируют хирургическим способом трубки в область проксимальной ободочной кишки. После выздоровления группам собак по 6 особей вводят неочищенный низин внутрь кишечника через трубку в количестве 0, 50, 125 или 300 мкг/кг вдень в течение 28 дней, причем данную дозу разделяют на две половины для введения ежедневно приблизительно в 10⁰⁰ и в 16⁰⁰ часов.Dogs are surgically implanted with tubes in the proximal colon. After recovery, groups of dogs of 6 animals each are injected with a crude nisin inside the intestine through a tube in an amount of 0, 50, 125 or 300 μg / kg per day for 28 days, and this dose is divided into two halves for administration daily at approximately 10 ⁰⁰ and at 16 ⁰⁰ hours.

После аутопсии, гистопатологического и клинического исследований не наблюдается никаких признаков местного раздражения или систематической токсичности, связанных с обработкой низином. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при повторном введении чрезвычайно высоких доз низина в ободочную кишку млекопитающих наблюдается толерантность к низину.After autopsy, histopathological and clinical studies, there are no signs of local irritation or systematic toxicity associated with the treatment of nisin. The results indicate that when reintroducing extremely high doses of nisin into the colon of mammals, nisin tolerance is observed.

Пример 4Example 4

Отсутствие систематической абсорбции низина из ободочной кишкиLack of systematic absorption of nisin from the colon

В течение токсикологических испытаний, описанных выше в примерах 2 и 3, у животных отбирают образцы крови для определения низина в сыворотке крови.During the toxicological tests described above in Examples 2 and 3, blood samples were taken from animals for determination of serum nisin.

У кроликов в модели с лигированным кишечником (пример 2) кровь отбирают через 0,5, 2 и 6 ч после введения низина. Уровень низина определяют специфическим методом иммуноферментного анализа (ИФА), предел определения которого составляет 1 мкг/мл сыворотки кролика.In rabbits in a model with a ligated intestine (Example 2), blood was taken 0.5, 2, and 6 hours after the administration of nisin. The level of nisin is determined by a specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), the limit of determination of which is 1 μg / ml rabbit serum.

Ни в одном из исследованных образцов не обнаружено присутствия низина, что свидетельствует об отсутствии абсорбции низина из ободочной кишки в данной модели животных.None of the investigated samples showed the presence of nisin, which indicates the absence of absorption of nisin from the colon in this animal model.

В эксперименте на собаках (пример 3) образцы крови отбирают на 28 день через 0, 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 ч после утреннего введения низина. В этом эксперименте сыворотку крови анализируют микробиологическим методом с использованием в качестве тестируемого микроорганизма Micrococcus luteus, предел определения этого метода составляет 0,5 мкг/мл сыворотки собаки. Из 18 собак, обработанных низином, 17 выдержали испытания и 16 имели правильное расположение катетера при аутопсии. (У двух собак наблюдалась утечка материала в брюшную полость, одну необходимо было забить в процессе обработки и одна выдержала испытания). В сыворотке крови, отобранной в любой период у собак с правильным (внутрикишечным) расположением катетера, низин не обнаружен.In a dog experiment (Example 3), blood samples were taken on day 28 at 0, 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 hours after the morning administration of nisin. In this experiment, blood serum is analyzed by the microbiological method using Micrococcus luteus as the test microorganism; the limit of determination of this method is 0.5 μg / ml of dog serum. Of the 18 dogs treated with nisin, 17 stood the test and 16 had the correct catheter placement during autopsy. (Two dogs showed leakage of material into the abdominal cavity, one had to be hammered during processing and one passed the test). In the blood serum taken at any time in dogs with the correct (intestinal) location of the catheter, nisin was not found.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при правильной доставке низина даже в чрезвычайно высоких дозах в ободочную кишку млекопитающих не наблюдается абсорбции низина в большой круг кровообращения и, следовательно, представляется маловероятным, что низин проявляет системную токсичность.The results obtained indicate that, with proper delivery of nisin, even at extremely high doses to the colon of mammals, no absorption of nisin in a large circle of blood circulation is observed and, therefore, it seems unlikely that nisin exhibits systemic toxicity.

Пример 5Example 5

Сохранение низина в ободочной кишке млекопитающих в концентрациях, достаточных для ингибирования бактерий-мишеней.Preservation of nisin in the colon of mammals in concentrations sufficient to inhibit target bacteria.

В эксперименте на кроликах, описанном выше в примере 2, при аутопсии содержимое кишечной петли собирают, экстрагируют и анализируют методом ВЭЖХ. Содержимое кишечника контрольных кроликов, необработанных низином, используют для оценки эффективности процедуры экстракции. С этой целью к указанным образцам добавляют известные количества низина, затем проводят гомогенизацию и экстракцию. Наиболее эффективный метод экстракции, который позволяет извлечь приблизительно 50% добавленного низина, используют для экстракции содержимого кишечника кроликов, обработанных низином. Из содержимого кишечника обработанных низином кроликов извлекают до 24% введенного низина, что с большой вероятностью свидетельствует об устойчивости, по крайней мере, половины введенного низина in situ в течение 6 ч.In the rabbit experiment described above in Example 2, during autopsy, the contents of the intestinal loop are collected, extracted and analyzed by HPLC. The intestinal contents of control rabbits untreated with nisin are used to evaluate the effectiveness of the extraction procedure. To this end, known amounts of nisin are added to these samples, then homogenization and extraction are carried out. The most effective extraction method, which allows you to extract approximately 50% of the added nisin, is used to extract the intestinal contents of rabbits treated with nisin. Up to 24% of the injected nisin is recovered from the intestines of the nisin-treated rabbits, which is likely to indicate the stability of at least half of the injected nisin in situ for 6 hours.

Принимая в расчет масштабирование дозы низина до 600 мг, необходимой для лечения взрослого человека, общий (полный) объем ободочной кишки, равный приблизительно 4 л, можно предположить, что местная концентрация низина в ободочной кишке в продолжительный период времени будет достигать выше 40-80 мкг/мл (или 40-80 мкг/г содержимого ободочной кишки). Эта величина во много раз превышает величину МИК для микроорганизмов-мишеней - С.difficile и Enterococcus spp., но равна или ниже предела чувствительности защитной грамположительной микрофлоры кишечника, такой как B.fragilis. Действительная доза может быть ниже или выше, что, конечно, будет зависеть от многих факторов, таких как эффективность вскрытия и растворения лекарственной формы в организме человека, местная биологическая доступность активного компонента (количество свободного активного компонента, способного взаимодействовать с бактериями по сравнению с количеством компонента, связанного с твердым материалом), степень тяжести заболевания, время прохождения продукта у больных диареей и т.д. Очевидно также, что низин можно вводить многократно (до 6 раз) в любой 24-часовой период. Соответственно, диапазон предполагаемой ежедневной дозы составляет от минимум приблизительно 100 мг и до максимум приблизительно 6 г, предпочтительно от приблизительно 300 мг до приблизительно 2 г.Taking into account the scaling of the dose of nisin to 600 mg necessary for the treatment of an adult, the total (full) volume of the colon equal to approximately 4 l, it can be assumed that the local concentration of nisin in the colon over a long period of time will reach above 40-80 mcg / ml (or 40-80 μg / g of the contents of the colon). This value is many times higher than the MIC value for target microorganisms - C. difficile and Enterococcus spp., But is equal to or lower than the sensitivity limit of protective gram-positive intestinal microflora, such as B.fragilis. The actual dose can be lower or higher, which, of course, will depend on many factors, such as the effectiveness of opening and dissolving the dosage form in the human body, the local bioavailability of the active component (the amount of free active component that can interact with bacteria compared to the amount of component associated with solid material), the severity of the disease, the transit time of the product in patients with diarrhea, etc. It is also obvious that nisin can be entered repeatedly (up to 6 times) in any 24-hour period. Accordingly, the estimated daily dose range is from a minimum of about 100 mg to a maximum of about 6 g, preferably from about 300 mg to about 2 g.

Так как известно, что противомикробное действие низина по отношению к чувствительным бактериям осуществляется очень быстро, то полученные в данном примере результаты свидетельствуют о том, что низин или родственные пептиды, доставляемые в ободочную кишку в эффективной дозе, могут быть использованы для лечения бактериальных заболеваний, вызванных чувствительными к низину бактериями, или для подавления потенциально опасных чувствительных бактерий, образующих колонии в кишечнике.Since it is known that the antimicrobial effect of nisin against sensitive bacteria is very fast, the results obtained in this example indicate that nisin or related peptides delivered to the colon in an effective dose can be used to treat bacterial diseases caused by bacteria that are sensitive to nisin, or to suppress potentially dangerous sensitive bacteria that form colonies in the intestines.

Примеры, приведенные выше, свидетельствуют о том, что низин и другие пептиды с аналогичной противомикробной активностью вопреки ожиданиям будут оказывать необходимое действие в среде ободочной кишки без рецидивов, без любых возможных нежелательных эффектов.The examples given above indicate that nisin and other peptides with similar antimicrobial activity, contrary to expectations, will have the necessary effect in the colon without relapses, without any possible undesirable effects.

Предварительно были разработаны композиции для осуществления доставки терапевтического количества низина в ободочную кишку путем орального введения. Эти композиции описаны в примерах 6-8. В экспериментах, представленных ниже, был проведен поиск лекарственных форм, которые сохраняют целостность в течение, по крайней мере, 4 ч при рН желудка и в течение 0,5-3 ч при рН 6,8 (рН среды нижней части тонкой кишки), а затем начинают расщепляться в ободочной кишке или в ближайшей к ней зоне.Preliminarily, compositions have been developed for delivering a therapeutic amount of nisin to the colon by oral administration. These compositions are described in examples 6-8. In the experiments presented below, a search was made for dosage forms that maintain integrity for at least 4 hours at pH of the stomach and for 0.5-3 hours at pH 6.8 (pH of the lower part of the small intestine), and then begin to split in the colon or in the zone closest to it.

Предварительные исследования были направлены на разработку состава ядра таблетки без покрытия, которое быстро распадается в фосфатном буферном растворе, рН 7,0. Разработка состава ядра таблетки является непростой задачей из-за особых физико-химических свойств низина и в связи с тем, что относительно большую часть ядра таблетки составляет активное лекарственное средство. В отличие от большинства лекарственных средств, включая пептиды медицинского назначения, низин является амфипатическим веществом (а также гидрофобным). Таким образом, несмотря на достаточно высокую растворимость в воде, даже при нейтральном рН, низин с трудом диффундирует из спрессованного ядра при погружении ядра в буферный раствор. Вместо растворения, вокруг таблетки образуется слой гелеобразного низина, который ограничивает доступ воды внутрь таблетки. В результате расширенной программы по разработке состава композиции и изучению различных наполнителей и дезинтеграторов эта уникальная проблема была решена простым добавлением в таблетку оптимального количества хлорида натрия. Эта добавка достаточно эффективно снижает гелеобразование и обеспечивает разложение таблетки.Preliminary studies were aimed at developing the composition of the core of the uncoated tablet, which rapidly decomposes in a phosphate buffer solution, pH 7.0. The development of the composition of the tablet core is not an easy task due to the special physicochemical properties of nisin and due to the fact that a relatively large part of the tablet core is the active drug. Unlike most drugs, including medical peptides, nisin is an amphipathic substance (as well as hydrophobic). Thus, despite the relatively high solubility in water, even at neutral pH, nisin hardly diffuses from the compressed core when the core is immersed in a buffer solution. Instead of dissolving, a gel-like nisin layer forms around the tablet, which restricts water from entering the tablet. As a result of an expanded program to develop the composition of the composition and study various excipients and disintegrants, this unique problem was solved by simply adding the optimal amount of sodium chloride to the tablet. This additive effectively reduces gelation and provides decomposition of the tablet.

Второй проблемой при разработке состава таблетки является прочность ядра таблетки, так как ядро должно выдерживать жесткие условия интенсивного перемешивания при формировании последовательных покрытий таблетки с использованием процесса в псевдоожиженном слое Wuster™ Fluidized. Таблетки, содержащие различные количества связующих веществ с высокой эффективностью (Providone, Methocel и Carbopol™), характеризуются недостаточной для указанного способа прочностью. Глубокий анализ проблемы позволяет сделать вывод о том, что благодаря природе и физико-химическим свойствам низина, связыванию компонентов препятствует захватываемый воздух, который, таким образом, приводит к снижению физической прочности таблеток. Эта проблема решается путем включения в процесс изготовления таблеток способа вальцового прессования.The second problem in developing the composition of the tablet is the strength of the tablet core, since the core must withstand the stringent conditions of vigorous stirring during the formation of successive tablet coatings using the Wuster ™ Fluidized process. Tablets containing various amounts of binders with high efficiency (Providone, Methocel and Carbopol ™) are characterized by insufficient strength for this method. A thorough analysis of the problem allows us to conclude that due to the nature and physicochemical properties of nisin, entrained air prevents the binding of the components, which, therefore, reduces the physical strength of the tablets. This problem is solved by including a roll pressing method in the tablet manufacturing process.

Характеристики высвобождения (лекарственного средства) из композиций изменяют путем формирования покрытия ядра таблеток с использованием сополимера метакриловой кислоты и метилметакрилата (Eudragit^тм). Время до начала разложения таблетки и время до завершения разложения изменяют воспроизводимым способом путем изменения соотношения массы покрытия и массы ядра таблетки.The release (drug) release characteristics of the compositions are changed by coating the core of the tablets using a copolymer of methacrylic acid and methyl methacrylate (Eudragit ^™ ). The time before the decomposition of the tablet and the time to complete the decomposition are changed in a reproducible way by changing the ratio of the mass of the coating and the mass of the core of the tablet.

В примерах 6-11 описаны различные составы композиций и результаты исследования их пригодности для доставки эффективных количеств лантоцидов согласно настоящему изобретению в ободочную кишку.Examples 6-11 describe the various compositions and the results of a study of their suitability for the delivery of effective amounts of lantocides according to the present invention into the colon.

Пример 6 аExample 6 a

Влияние дезинтегратора на разложение таблеткиThe effect of the disintegrator on the decomposition of tablets

Готовят ядра таблеток следующего состава.Prepare the core tablets of the following composition.

В качестве дезинтеграторов используют Ac-Di-Sol, Explotab и Polyplasdone XL. Времена разложения (измеренные в фосфатном буферном растворе, рН 7) таблеток, содержащих различные дезинтеграторы, приведены ниже.As disintegrants use Ac-Di-Sol, Explotab and Polyplasdone XL. The decomposition times (measured in phosphate buffered saline, pH 7) of tablets containing various disintegrants are given below.

Таблетки, содержащие в качестве дезинтегратора Ac-Di-Sol, разлагаются быстрее, чем таблетки, содержащие другие исследованные дезинтеграторы. Соответственно, следующие композиции получают с использованием Ac-Di-Sol.Tablets containing Ac-Di-Sol as a disintegrant decompose faster than tablets containing other disintegrants tested. Accordingly, the following compositions are prepared using Ac-Di-Sol.

Пример 6 бExample 6 b

Влияние NaCl на разложение таблетокThe effect of NaCl on tablet decomposition

Готовят ядра таблеток следующего состава.Prepare the core tablets of the following composition.

Представленные выше результаты свидетельствуют о том, что присутствие хлористого натрия в достаточной концентрации позволяет исключить гелеобразование и значительно увеличить скорость разложения таблеток низина при физиологических значениях рН. Исследованные ядра таблеток, содержащие более 1% хлористого натрия, распадаются в течение 4-6 мин, в то время как при концентрации NaCl 1% или менее разложения не происходит даже через 1,5 ч. Кроме того, не наблюдается значительных изменений времени разложения при концентрации NaCl до 15,3%. Таким образом, согласно настоящему изобретению следует ожидать, что композиции, содержащие NaCl в диапазоне концентрации от приблизительно 2% до приблизительно 20%, пригодны для доставки эффективного количества низина или других лантоцидов в ободочную кишку.The results presented above indicate that the presence of sodium chloride in sufficient concentration eliminates gelling and significantly increases the rate of decomposition of nisin tablets at physiological pH values. The studied tablet cores containing more than 1% sodium chloride disintegrate within 4-6 minutes, while at a NaCl concentration of 1% or less, decomposition does not occur even after 1.5 hours. In addition, no significant changes in the decomposition time are observed at NaCl concentrations up to 15.3%. Thus, according to the present invention, it is expected that compositions containing NaCl in a concentration range of from about 2% to about 20% are suitable for delivering an effective amount of nisin or other lantocides to the colon.

Пример 7Example 7

Ядра таблеток, содержащих низинThe core of tablets containing nisin

NIP (1)NIP (1)

Состав: (проценты относительно массы неочищенного низина)Composition: (percent relative to the mass of untreated nisin)

Внутригранулярные компоненты:Intragranular components:

Неочищенный низин 100Crude Lowland 100

Prosolv 90 12,5Prosolv 90 12.5

Ac-Di-Sol 5Ac-Di-Sol 5

Хлористый натрий 5Sodium Chloride 5

Тальк 5Talc 5

Внегранулярные компоненты:Extragranular components:

Prosolv 90 12,5Prosolv 90 12.5

Povidone 5Povidone 5

c-Di-Sol 5c-Di-Sol 5

Хлористый натрий 5Sodium Chloride 5

Стеарат магния 0,5Magnesium Stearate 0.5

Масса всей таблетки =152,5 мгThe weight of the whole tablet = 152.5 mg

Свойства таблетки:Tablet properties:

Прочность на раздавливание =2559,45±856,17 кг (5,65±1,8 килофунтов, (kp)) (n=10)Crushing strength = 2559.45 ± 856.17 kg (5.65 ± 1.8 kilo-pounds, (kp)) (n = 10)

Время разложения:Decomposition Time:

В R.O. воде (очищенной методом обратного осмоса)=24,4±2,5 мин (n=3)In R.O. water (purified by reverse osmosis) = 24.4 ± 2.5 min (n = 3)

В фосфатном буферном растворе рН 7,0=33,1±4,5 мин (n=3)In phosphate buffered saline, pH 7.0 = 33.1 ± 4.5 min (n = 3)

NIP (2)NIP (2)

Состав: (проценты относительно массы неочищенного низина)Composition: (percent relative to the mass of untreated nisin)

Внутригранулярные компоненты:Intragranular components:

Неочищенный низин 100Crude Lowland 100

Prosolv 90 12,5Prosolv 90 12.5

Ac-Di-Sol 7,5Ac-Di-Sol 7.5

Хлористый натрий 7,5Sodium Chloride 7.5

Тальк 2Talc 2

Внегранулярные компоненты:Extragranular components:

Prosolv 90 12,5Prosolv 90 12.5

Povidone 5Povidone 5

Ac-Di-Sol 7,5Ac-Di-Sol 7.5

Хлористый натрий 7,5Sodium Chloride 7.5

Стеарат магния 0,5Magnesium Stearate 0.5

Масса всей таблетки =162,5 мгThe weight of the whole tablet = 162.5 mg

Свойства таблетки:Tablet properties:

Прочность на раздавливание =2518,68±856,17 кг (5,56±1,89 килофунтов, (kp)) (n=10)Crushing strength = 2518.68 ± 856.17 kg (5.56 ± 1.89 kilo-pounds, (kp)) (n = 10)

Время разложения:Decomposition Time:

В R.O. воде =23,9±2,1 мин (n=3)In R.O. water = 23.9 ± 2.1 min (n = 3)

В фосфатном буферном растворе рН 7,0=29,9±2,7 мин (n=3)In phosphate buffered saline, pH 7.0 = 29.9 ± 2.7 min (n = 3)

Показано, что не только лекарственные формы обладают приемлемыми характеристиками при разложении и необходимой прочностью на раздавливание в условиях, аналогичных условиям прохождения таблетки через желудочно-кишечный тракт, но обнаружено, что при этом сохраняется целостность низина и равномерность состава композиции.It was shown that not only dosage forms have acceptable characteristics during decomposition and the necessary crushing strength under conditions similar to the conditions under which the tablet passes through the gastrointestinal tract, but it was found that the integrity of nisin and the uniform composition of the composition are preserved.

Пример 8Example 8

(А) Получение ядер таблеток(A) Obtaining tablet cores

 ¹ - Ac-Di-Sol = поперечно сшитая натрий карбоксиметилцеллюлоза ¹ - Ac-Di-Sol = cross-linked sodium carboxymethyl cellulose

 ² - ProSolv = силикатированная микрокристаллическая целлюлоза ² - ProSolv = silicate microcrystalline cellulose

 ³ - Povidone = поливинилпирролидон ³ - Povidone = polyvinylpyrrolidone

Ядра таблеток получают с использованием следующих стадий:Tablet cores are prepared using the following steps:

1. Все компоненты просеивают каждый отдельно через сито № 20 (0.0331’’).1. All components are sieved each separately through a No. 20 sieve (0.0331 ’’).

2. Взвешивают указанные количества внутригранулярных компонентов: низин, NaCl, Ac-Di-Sol и ProSolv (компоненты № 1-4). Смешивают их в подходящем стеклянном сосуде.2. Weigh the indicated amounts of intragranular components: nisin, NaCl, Ac-Di-Sol and ProSolv (components No. 1-4). Mix them in a suitable glass jar.

3. Перемешивают на турбулентной мешалке Turbula при 50 об/мин в течение 15 мин.3. Stirred on a Turbula turbulent mixer at 50 rpm for 15 minutes.

4. Взвешивают тальк (компонент № 5), добавляют к перемешанному продукту, полученному на стадии 3.4. Weigh the talcum powder (component No. 5), add it to the mixed product obtained in stage 3.

5. Перемешивают на турбулентной мешалке Turbula при 50 об/мин в течение 3 мин.5. Stirred on a Turbula turbulent mixer at 50 rpm for 3 minutes.

6. Смесь, полученную на стадии 5, уплотняют на валиковом уплотнителе (модель TF-mini), давление валков =9806,6 кН/м² (100 кг/см²), скорость вращения валков =6 об/мин, скорость винтовой прокатки =11 об/мин.6. The mixture obtained in stage 5 is sealed on a roller seal (TF-mini model), roll pressure = 9806.6 kN / m ² (100 kg / cm ² ), roll rotation speed = 6 rpm, screw rolling speed = 11 rpm

7. Уплотненный материал, полученный на стадии 6, отсеивают на сите с размером ячеек 1,0 мм с использованием качающегося гранулятора (Erweka AR400 Wet-Dry Granulator).7. The densified material obtained in step 6 is screened on a sieve with a mesh size of 1.0 mm using a swinging granulator (Erweka AR400 Wet-Dry Granulator).

8. Полученные на стадии 7 гранулы уплотняют на валиковом уплотнителе (модель TF-mini), давление валков =2941,9 кН/м² (30 кг/см²), скорость вращения валков =8 об/мин, скорость винтовой прокатки =11 об/мин.8. The granules obtained in stage 7 are compacted on a roller compactor (TF-mini model), roll pressure = 2941.9 kN / m ² (30 kg / cm ² ), roll rotation speed = 8 rpm, screw rolling speed = 11 rpm

9. Уплотненный материал, полученный на стадии 8, отсеивают на сите с размером ячеек 1,0 мм с использованием качающегося гранулятора.9. The densified material obtained in stage 8 is screened on a sieve with a mesh size of 1.0 mm using a swinging granulator.

10. Полученные на стадии 9 гранулы уплотняют на валиковом уплотнителе, давление валков =2941,9 кН/м² (30 кг/см²), скорость вращения валков =8 об/мин, скорость шнека =11 об/мин.10. The granules obtained in stage 9 are compacted on a roller compactor, roll pressure = 2941.9 kN / m ² (30 kg / cm ² ), roll rotation speed = 8 rpm, screw speed = 11 rpm.

11. Уплотненный материал, полученный на стадии 10, отсеивают на сите с размером ячеек 1,0 мм с использованием качающегося гранулятора.11. The densified material obtained in step 10 is screened on a sieve with a mesh size of 1.0 mm using a swinging granulator.

12. Взвешивают указанные количества дополнительно гранулированных порций NaCl, Ac-Di-Sol, Prosolv и Povidone (компоненты № 6-9). Добавляют к гранулам, полученным на стадии 11.12. Weigh the indicated amounts of additional granular portions of NaCl, Ac-Di-Sol, Prosolv, and Povidone (components No. 6-9). Add to the granules obtained in stage 11.

13. Перемешивают на турбулентной мешалке Turbula при 50 об/мин в течение 10 мин.13. Stirred on a Turbula turbulent mixer at 50 rpm for 10 minutes.

14. Взвешивают стеарат магния (компонент No 10). Добавляют к смеси, полученной на стадии 13.14. Weigh magnesium stearate (component No. 10). Add to the mixture obtained in stage 13.

15. Перемешивают на турбулентной мешалке Turbula при 50 об/мин в течение 2 мин.15. Stirred on a Turbula turbulent mixer at 50 rpm for 2 minutes.

16. Смесь, полученную на стадии 15, уплотняют на ротационном прессе для таблетирования Manesty D3B (давление уплотнения =679,5 кг (1500 фунтов), скорость =16 об/мин) с использованием двояковогнутых блоков размером 7,0 мм.16. The mixture obtained in step 15 is compacted on a Manesty D3B rotary tableting press (compaction pressure = 679.5 kg (1500 pounds), speed = 16 rpm) using 7.0 mm biconcave blocks.

Показано, что полученные указанным способом ядра таблеток обладают необходимой прочностью и сохраняют целостность в процессе последующего формирования покрытия.It was shown that the tablet cores obtained in this way have the necessary strength and maintain integrity in the process of subsequent coating formation.

(Б) Получение таблеток с покрытием(B) Obtaining coated tablets

Дисперсию для формирования покрытия ядер таблеток, полученных, как указано выше на стадии (А), готовят следующим образом.The dispersion for coating the nuclei of the tablets obtained as described above in step (A) is prepared as follows.

1. Фильтруют Eudragit L30D-55 через чистое сито.1. Filter Eudragit L30D-55 through a clean sieve.

2. Взвешивают дисперсию Eudragit L30D-55.2. Weigh the dispersion of Eudragit L30D-55.

3. Взвешивают воду. В процессе перемешивания к суспензии Eudragit добавляют приблизительно 2/3 воды.3. Weigh the water. During mixing, approximately 2/3 of the water is added to the Eudragit suspension.

4. Взвешивают триэтилцитрат (ТЭЦ), в процессе перемешивания кдисперсии Eudragit добавляют по каплям ТЭЦ. Промывают сосуд, из которого добавляли ТЭЦ, двумя порциями оставшегося количества воды и промывные воды добавляют к смеси.4. Triethyl citrate (CHP) is weighed, while mixing the dispersion of Eudragit, a CHP is added dropwise. The vessel from which the CHP was added is washed, with two portions of the remaining amount of water, and the washings are added to the mixture.

5. Перемешивают в течение 1 ч.5. Stirred for 1 h.

6. Взвешивают тальк, добавляют к смеси при перемешивании.6. Weigh the talcum powder, add to the mixture with stirring.

7. Перемешивают в течение 1,5 ч.7. Stirred for 1.5 hours

Покрытие ядер таблеток формируют с использованием дисперсии дляThe coating of tablet cores is formed using a dispersion for

покрытия следующим образом.coverings as follows.

1. Ядра таблеток помещают в устройство аппарата Вурстера с псевдоожиженным слоем.1. The tablet cores are placed in a Wurster fluidized bed apparatus.

2. Дисперсию для покрытия помещают на балансир, обеспечивающий непрерывное перемешивание с помощью магнитной мешалки.2. The dispersion for coating is placed on the balancer, providing continuous mixing using a magnetic stirrer.

3. Покрытие таблеток формируют в следующих условиях:3. The tablet coating is formed under the following conditions:

Скорость распыления:7,0 г/минAtomization rate: 7.0 g / min

Давление распыления: 150 кН/м² (1,5 бар)Atomization pressure: 150 kN / m ² (1.5 bar)

Температура ввода:50°С.Input temperature: 50 ° C.

Пример 9Example 9

Влияние толщины покрытия на разложение таблетки.The effect of coating thickness on tablet degradation.

Исследуют влияние толщины покрытия из Eudragit L30D на разложение и растворение таблеток при рН 6,8. Толщину покрытия выражают в процентах, т.е. в соотношении массы покрытия и массы ядра таблетки. Полученные результаты, представленные на фиг.2 и 3, свидетельствуют о строгой пропорциональной зависимости времени до начала разложения и времени до завершения разложения от толщины покрытия из Eudragit L30D. На фиг.4 показано, что время запаздывания между первоначальным контактом таблетки с буфером и первоначальным высвобождением низина напрямую зависит от толщины покрытия. Таким образом, с помощью формирования покрытия из Eudragit L30D достаточной толщины, можно придавать необходимые характеристики пролонгированного действия, достаточные для доставки лекарственного средства в ободочную кишку посредством орального введения. Более того, характеристики пролонгированного действия можно варьировать путем изменения толщины покрытия.The effect of coating thickness from Eudragit L30D on the decomposition and dissolution of tablets at pH 6.8 is investigated. The coating thickness is expressed as a percentage, i.e. in the ratio of coating weight to tablet core mass. The results obtained, presented in figure 2 and 3, indicate a strict proportional dependence of the time before decomposition and time to complete decomposition on the thickness of the coating of Eudragit L30D. Figure 4 shows that the delay time between the initial contact of the tablet with the buffer and the initial release of nisin directly depends on the thickness of the coating. Thus, by forming a coating of Eudragit L30D of sufficient thickness, it is possible to impart the necessary characteristics of a sustained action sufficient to deliver the drug to the colon through oral administration. Moreover, the characteristics of prolonged action can be varied by changing the thickness of the coating.

Согласно настоящему изобретению следует ожидать, что толщина покрытия в диапазоне от приблизительно 20% до приблизительно 180% (от 0,15 мм до 1,316 мм, измерено по центру) будет обеспечивать необходимые характеристики пролонгированного действия композиций. Согласно наилучшему варианту воплощения настоящего изобретения толщина покрытия составляет приблизительно 40% (0,371±0,07 мм, измерено по центру).According to the present invention, it should be expected that a coating thickness in the range of from about 20% to about 180% (from 0.15 mm to 1.316 mm, measured in the center) will provide the necessary characteristics of the prolonged action of the compositions. According to a best embodiment of the present invention, the coating thickness is approximately 40% (0.371 ± 0.07 mm, measured in the center).

Пример 10Example 10

Высвобождение лекарственного средства в имитированных условиях прохождения через желудочно-кишечный тракт.Drug release under simulated conditions of passage through the gastrointestinal tract.

Таблетки (6) с 40%-ным покрытием из Eudragit L30D (толщина покрытия 0,371 мм, измерено по центру) получают с использованием аппарата для таблетирования USP тип II в буферном растворе рН 6,8 при 37°С и при перемешивании со скоростью 100 об/мин. Зависимость растворения таблеток от времени определяют сначала при выдерживании их в 0,1 н. HCl (среда желудка), а затем в 50 мМ фосфатном буфере рН 6,8 (среда толстой кишки). Результаты, представленные на фиг.5, свидетельствуют о том, что можно приготовить содержащие низин таблетки с воспроизводимыми характеристиками пролонгированного действия низина (т.е. временем задержки растворения), необходимыми для доставки низина в ободочную кишку.Tablets (6) with a 40% coating of Eudragit L30D (coating thickness 0.371 mm, measured in the center) are prepared using a USP type II tabletting apparatus in a pH 6.8 buffer solution at 37 ° C and with stirring at a speed of 100 rpm / min The dependence of the dissolution of tablets on time is determined first by keeping them in 0.1 N. HCl (stomach medium), and then in 50 mM phosphate buffer pH 6.8 (colon medium). The results presented in FIG. 5 indicate that nisin-containing tablets with reproducible sustained-release characteristics of nisin (i.e., dissolution delay time) needed to deliver nisin to the colon can be prepared.

Пример 11Example 11

Иллюстрация доставки низина в ободочную кишку человека с использованием таблеток пролонгированного действияAn illustration of the delivery of nisin to the human colon using sustained release tablets

Ядра таблеток, содержащие 100 мг неочищенного низина, формируют при соотношении активного компонента и наполнителей, как указано выше в примере 8, но кроме того, добавляют оксид самария в количестве 10 мг на таблетку. Таблетки покрывают слоем из Eudragit L30D-55, как указано в примере 8, и формируют 40%-ный слой покрытия (толщина покрытия 0,371 мм, измерено по центру). Кроме того, формируют таблетки с 120%-ным покрытием (толщина покрытия 0,896 мм, измерено по центру) и с 180%-ным покрытием (толщина покрытия 1,316 мм, измерено по центру). Затем таблетки бомбардируют нейтронами, при этом часть нерадиоактивного самария (¹⁵²Sm) превращается в радиоактивный самарий (¹⁵³Sm), что позволяет осуществлять наблюдение за прохождением таблетки через желудочно-кишечный тракт с использованием сцинтиграфии [Digenis G.A. and Sandefer E. Gamma scintigraphy and neutron activation techniques in the in vivo assessment of orally administered dosage forms (Методы гамма-сцинти-графии и активации нейтронов для наблюдения за продвижением введенных орально лекарственных форм in vivo), Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Systems 7, 309-345 (1991)].Tablet cores containing 100 mg of crude nisin are formed at a ratio of active component to excipients as described in Example 8 above, but in addition 10 mg per tablet of samarium is added. The tablets are coated with a layer of Eudragit L30D-55, as described in example 8, and form a 40% coating layer (coating thickness 0.371 mm, measured in the center). In addition, tablets with a 120% coating (coating thickness 0.896 mm, measured in the center) and 180% coating (coating thickness 1.316 mm, measured in the center) are formed. Then the tablets are bombarded with neutrons, while part of non-radioactive samarium ( ¹⁵² Sm) is converted into radioactive samarium ( ¹⁵³ Sm), which allows monitoring the passage of the tablet through the gastrointestinal tract using scintigraphy [Digenis GA and Sandefer E. Gamma scintigraphy and neutron activation techniques in the in vivo assessment of orally administered dosage forms (Crit.Rev. Theher.Drug Carrier Systems 7, 309-345 (1991) ].

Сцинтиографические исследования проводят на 12 здоровых мужчинах. В первой группе шесть испытуемых получают по одной таблетке либо с 40%, 120%, либо 180%-покрытием из Eudragit (по два испытуемых на каждый тип композиции). Во второй группе четыре испытуемых получают по одной таблетке с 40%-ным покрытием, а два испытуемых получают по одной таблетке с 120%-ным покрытием. Таблетки запивают 250 мл ледяной воды. Наблюдение проводят через каждые 30 мин.Scintiographic studies are performed on 12 healthy men. In the first group, six subjects receive one tablet, either with 40%, 120%, or 180% coverage from Eudragit (two subjects for each type of composition). In the second group, four subjects receive one tablet with a 40% coating, and two subjects receive one tablet with a 120% coating. Tablets are washed down with 250 ml of ice water. Observation is carried out every 30 minutes.

На фиг.6, 7 и 8 представлены сцинтиграммы процесса прохождения таблеток с различной композицией через желудочно-кишечный тракт. На фиг.6 показан путь прохождения таблетки с 40-%-ным покрытием у одного испытуемого, на фиг.7 - таблетки со 120%-ным покрытием, на фиг.8 - таблетки с 180%-ным покрытием. Как видно на фиг.6-1 - 6-6, таблетка с 40%-ным покрытием сохраняет свою целостность при прохождении через желудок и тощую кишку. Таблетка полностью расщепляется в проксимальной ободочной кишке через 5,5 ч (фиг.6-7 - 6-9). Таблетка с 120%-ным покрытием начинает разлагаться через 12 ч, причем в этот момент она находится в поперечной ободочной кишке (Фиг.7-7, 7-8). Таблетка с 180%-ным покрытием достигает прямой кишки, сохраняя целостность (фиг.8-1 - 8-9). Полученные результаты свидетельствуют о том, что время разложения таблетки как in vivo, так и in vitro зависит от толщины покрытия.6, 7 and 8 are scintigrams of the process of passing tablets with a different composition through the gastrointestinal tract. In Fig.6 shows the path of the tablets with 40% coverage in one subject, Fig.7 - tablets with 120% coating, Fig.8 - tablets with 180% coating. As can be seen in Fig.6-1 - 6-6, a tablet with a 40% coating retains its integrity when passing through the stomach and jejunum. The tablet is completely cleaved in the proximal colon after 5.5 hours (Figs. 6-7 - 6-9). A tablet with a 120% coating begins to decompose after 12 hours, at which point it is in the transverse colon (Figs. 7-7, 7-8). A tablet with a 180% coating reaches the rectum, maintaining integrity (Figs. 8-1-8-9). The results obtained indicate that the decomposition time of the tablet both in vivo and in vitro depends on the thickness of the coating.

Данные, полученные при исследовании 6 испытуемых, получивших таблетку с 40%-ным покрытием, представлены в табл.11. У пяти из шести испытуемых таблетка начинает распадаться между периферической подвздошной кишкой и поперечной ободочной кишкой, а прогрессирующее расщепление таблетки происходит в процессе прохождения через ободочную кишку.The data obtained in the study of 6 subjects who received a tablet with a 40% coating are presented in table 11. In five of the six subjects, the tablet begins to disintegrate between the peripheral ileum and the transverse colon, and the progressive cleavage of the tablet occurs during passage through the colon.

У всех шести испытуемых, получивших указанные композиции, отрицательного действия таблеток не наблюдается.All six subjects who received these compositions, the negative effects of tablets are not observed.

Данные, полученные в этом примере, свидетельствуют о том, что можно сформировать содержащую низин таблетку с подходящими характеристиками пролонгированного действия для местного лечения заболевания ободочной кишки человека, что можно обеспечить расщепление содержимого таблетки в ободочной кишке человека, а также, что доза, содержащая 100 мг неочищенного низина, характеризуется хорошей толерантностью при введении композиций пролонгированного действия в ободочную кишку человека. Согласно изобретению можно использовать таблетки, содержащие от приблизительно 50 мг до приблизительно 600 мг низина. Можно принимать несколько таблеток (до 4) при любом данном курсе лечения и применять несколько курсов лечения (до 6) в любой данный 24-часовой промежуток времени. Диапазон ежедневной дозы низина может составлять от минимум приблизительно 100 мг до максимум приблизительно 6 г, предпочтительно от приблизительно 300 мг до приблизительно 2 г. Аналогичные дозы таблеток и ежедневные дозы применимы по отношению к другим лантоцинам.The data obtained in this example indicate that it is possible to form a nisin-containing tablet with suitable sustained-release characteristics for topical treatment of a human colon disease, which can ensure that the contents of the tablet are cleaved in the human colon, and that a dose containing 100 mg untreated nisin, characterized by good tolerance with the introduction of compositions of prolonged action in the colon of a person. Tablets containing from about 50 mg to about 600 mg of nisin can be used according to the invention. You can take several tablets (up to 4) for any given course of treatment and apply several courses of treatment (up to 6) at any given 24-hour period. The daily dose range of nisin may be from a minimum of about 100 mg to a maximum of about 6 g, preferably from about 300 mg to about 2 g. Similar tablet doses and daily doses are applicable to other lantocins.

Claims (29)

1. Способ лечения заболеваний, вызванных бактериальной инфекцией ободочной кишки, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей покрытие, сохраняющей свою целостность в процессе прохождения через желудочно-кишечный тракт и высвобождающей активный компонент в ободочной кишке, отличающийся тем, что используют фармацевтическую композицию, содержащую лантоцин в качестве активного компонента, 2 - 20% NaCl и 20 - 180% покрытия в расчете на массу неочищенного активного компонента.1. A method of treating diseases caused by a bacterial infection of the colon, comprising administering an effective amount of a pharmaceutical composition containing a coating that retains its integrity during passage through the gastrointestinal tract and releases the active component in the colon, characterized in that a pharmaceutical composition containing lantocin as an active component, 2 - 20% NaCl and 20 - 180% coverage based on the weight of the crude active component. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве лантоцина выбирают низин.2. The method according to claim 1, characterized in that as lantocin choose nisin. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что бактериальной инфекцией является С.difficile.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the bacterial infection is C. difficile. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что заболеванием является ассоциированная с приемом антибиотика диарея или псевдомембранозный колит.4. The method according to claim 3, characterized in that the disease is diarrhea associated with taking an antibiotic or pseudomembranous colitis. 5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что лантоцин вводят в ежедневной дозе в диапазоне от минимум приблизительно 100 мг до максимум приблизительно 6 г.5. The method according to claim 1 or 2, characterized in that lantocin is administered in a daily dose in the range from a minimum of approximately 100 mg to a maximum of approximately 6 g. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что лантоцин вводят в ежедневной дозе в диапазоне от приблизительно 300 мг до приблизительно 2 г.6. The method according to claim 5, characterized in that lantocin is administered in a daily dose in the range from about 300 mg to about 2 g. 7. Способ по п.3, отличающийся тем, что лантоцин вводят в ежедневной дозе в диапазоне от минимум приблизительно 100 мг до максимум приблизительно 6 г.7. The method according to claim 3, characterized in that lantocin is administered in a daily dose in the range from a minimum of about 100 mg to a maximum of about 6 g. 8. Способ по п.4, отличающийся тем, что лантоцин вводят в ежедневной дозе в диапазоне от минимум приблизительно 100 мг до максимум приблизительно 6 г.8. The method according to claim 4, characterized in that lantocin is administered in a daily dose in the range from a minimum of about 100 mg to a maximum of about 6 g. 9. Способ по п.7, отличающийся тем, что лантоцин вводят в ежедневной дозе в диапазоне от приблизительно 300 мг до приблизительно 2 г.9. The method according to claim 7, characterized in that lantocin is administered in a daily dose in the range from about 300 mg to about 2 g. 10. Способ по п.8, отличающийся тем, что лантоцин вводят в ежедневной дозе в диапазоне от приблизительно 300 мг до приблизительно 2 г.10. The method according to claim 8, characterized in that lantocin is administered in a daily dose in the range from about 300 mg to about 2 g. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что лантоцин вводят оральным способом.11. The method according to claim 1, characterized in that lantocin is administered orally. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что лантоцин вводят в форме таблеток или капсул.12. The method according to claim 11, characterized in that the lantocin is administered in the form of tablets or capsules. 13. Способ по п.1, отличающийся тем, что лантоцин вводят ректально.13. The method according to claim 1, characterized in that the lantocin is administered rectally. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что лантоцин вводят в форме суппозитория или с помощью клизмы.14. The method according to item 13, wherein the lantocin is administered in the form of a suppository or using an enema. 15. Способ подавления бактерий, образующих колонии в толстой кишке, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей покрытие, сохраняющей свою целостность в процессе прохождения через желудочно-кишечный тракт и высвобождающей активный компонент в ободочной кишке, отличающийся тем, что используют фармацевтическую композицию, содержащую лантоцин в качестве активного компонента, 2 - 20% NaCl и 20 - 180% покрытия в расчете на массу неочищенного активного компонента.15. A method of suppressing colonizing bacteria in the colon, comprising administering an effective amount of a pharmaceutical composition containing a coating that retains its integrity during passage through the gastrointestinal tract and releases the active component in the colon, characterized in that a pharmaceutical composition containing lantocin as an active component, 2 - 20% NaCl and 20 - 180% coverage based on the weight of the crude active component. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что в качестве лантоцина выбирают низин.16. The method according to p. 15, characterized in that the lowland is selected as lantocin. 17. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что бактериями являются резистентные к ванкомицину энтерококки.17. The method according to p. 15 or 16, characterized in that the bacteria are enterococci resistant to vancomycin. 18. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что лантоцин вводят в ежедневной дозе, находящейся в диапазоне от минимум приблизительно 100 мг до максимум приблизительно 6 г.18. The method according to p. 15 or 16, characterized in that lantocin is administered in a daily dose in the range from a minimum of about 100 mg to a maximum of about 6 g. 19. Способ по п.17, отличающийся тем, что лантоцин вводят в ежедневной дозе, находящейся в диапазоне от минимум приблизительно 100 мг до максимум приблизительно 6 г.19. The method according to 17, characterized in that lantocin is administered in a daily dose in the range from a minimum of approximately 100 mg to a maximum of approximately 6 g. 20. Способ по п.18, отличающийся тем, что лантоцин вводят в ежедневной дозе от приблизительно 300 мг до приблизительно 2 г.20. The method according to p. 18, characterized in that the lantocin is administered in a daily dose of from about 300 mg to about 2 g. 21. Способ по п.19, отличающийся тем, что лантоцин вводят в ежедневной дозе от приблизительно 300 мг до приблизительно 2 г.21. The method according to claim 19, characterized in that the lantocin is administered in a daily dose of from about 300 mg to about 2 g. 22. Способ по п.15, отличающийся тем, что лантоцин вводят оральным способом.22. The method according to p. 15, characterized in that the lantocin is administered orally. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что лантоцин вводят в форме таблеток или капсул.23. The method according to item 22, wherein the lantocin is administered in the form of tablets or capsules. 24. Способ по п.15, отличающийся тем, что лантоцин вводят ректально.24. The method according to clause 15, wherein the lantocin is administered rectally. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что лантоцин вводят в форме суппозитория или с помощью клизмы.25. The method according to paragraph 24, wherein the lantocin is administered in the form of a suppository or using an enema. 26. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, вызванных бактериальной инфекцией ободочной кишки, сохраняющая свою целостность в процессе прохождения через желудочно-кишечный тракт и высвобождающая активный компонент в ободочной кишке, отличающаяся тем, что она содержит лантоцин в качестве активного компонента, 2 - 20% NaCl и 20 - 180% покрытия в расчете на массу неочищенного активного компонента.26. A pharmaceutical composition for the treatment of diseases caused by a bacterial infection of the colon, maintaining its integrity during passage through the gastrointestinal tract and releasing the active component in the colon, characterized in that it contains lantocin as an active component, 2 to 20% NaCl and 20 to 180% coverage based on the weight of the crude active component. 27. Фармацевтическая композиция по п.26, отличающаяся тем, что в качестве лантоцина она содержит низин.27. The pharmaceutical composition according to p. 26, characterized in that as lantocin it contains nisin. Приоритет по пунктам:Priority on points: 09.06.1997 - по пп.1-14, 16-25, 27;06/09/1997 - according to claims 1-14, 16-25, 27; 10.01.2000 - по пп.1,15, 26.10.01.2000 - according to paragraphs 1,15, 26.

Images