RU2230785C2 - Strain of measles virus novo/96 for preparing antigen as component of test-system and immunoenzyme test-system for diagnosis of antibodies raised to measles virus - Google Patents

Abstract

FIELD: medicinal virology, microbiology.

SUBSTANCE: invention relates to detection of the new strain of measles virus NovO/96 for preparing antigen as a component of diagnostic test-system and to the test-system for diagnosis of antibodies raised to measles virus. The proposed invention provides the development of the strain-producer of measles virus NovO/96 eliciting with higher productivity and relates to immunoenzyme test-system based on thereof for diagnosis of antibodies raised to measles virus exhibiting higher sensitivity as compared with using the test-system based on cell cultured infected with measles virus. The strain is deposited in the collection of microorganism cultures of the State scientific center for virology and biotechnology "Vector" at the registration number № VB-04.

EFFECT: improved preparing antigen, valuable properties of strain.

2 cl, 1 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к выявлению нового штамма вируса кори NovO/96 для получения антигена - компонента диагностической тест-системы и тест-система для диагностики антител к вирусу кори.The invention relates to medical virology and microbiology, in particular to the identification of a new strain of measles virus NovO / 96 for the production of antigen, a component of the diagnostic test system and a test system for the diagnosis of antibodies to measles virus.

Известен штамм вируса кори Ленинград 16 (Л-16), используемый для приготовления вакцины и в качестве компонента диагностической тест-системы (Руководство по вакцинному и сывороточному делу под ред. Академика АМН П.Н.Бургасова. М.: Медицина, 1978, - с.220-223).A known strain of measles virus Leningrad 16 (L-16), used for the preparation of a vaccine and as a component of a diagnostic test system (Manual for vaccine and serum case under the editorship of the Academician of the Academy of Medical Sciences P.N. Burgasov. M .: Medicine, 1978, - p. 220-223).

Однако данный штамм вируса кори обеспечивает недостаточный урожай целевого продукта: на протяжении десяти пассажей концентрация вируса в культуральной жидкости не превышает (в среднем) 10^3,5 ТЦД₅₀/мл (Васильева Г.А., Бойчук Л.М. Отработка технологии получения вируса кори штамм Л-16 на тканевой культуре из эмбрионов японских перепелок. - Специфическая профилактика кори. - Материалы научно-практической конференции ЛНИИЭМ им. Пастера. - Л., 1970, - с.206-210).However, this measles virus strain provides an insufficient yield of the target product: for ten passages, the virus concentration in the culture fluid does not exceed (on average) 10 ^3.5 TCD ₅₀ / ml (Vasilyeva G.A., Boychuk L.M. Development of the technology for producing the virus measles strain L-16 on tissue culture from Japanese quail embryos - Specific measles prevention. - Materials of the scientific and practical conference of the Pasteur LNIIEM. - L., 1970, - p.206-210).

Наиболее близким штаммом (прототипом) является штамм вируса кори Эдмонстон (Патент США №4211843, МПК А 01 N 1/02; А 61 К 39/12, опубл. 08.07.1980 г.). Штамм Эдмонстон депонирован в Американской Коллекции Клеточных Культур (АТСС - VR-24, 4/92). В ГНЦ ВБ "Вектор" прошел четыре пассажа на культуре клеток Vero. Подлинность штамма установлена методом положительной цепной полимеразной реакции со специфическими праймерами. Штамм относится к генотипу А. Максимальные титры вируса достигают на 5-6 сутки после заражения монослоя клеток Vero и составляют 5×10⁶ ТЦПД₅₀/мл. [Агафонов А. и соавт.//Вопр. вирусол., 1997, N 1, с.102-205]. Антигенные свойства штамма: выявляет антитела к вирусу кори в сыворотках больных и вакцинированных людей (см. Табл. 1). Штамм патогенен для человека.The closest strain (prototype) is the measles virus strain Edmonston (US Patent No. 4211843, IPC A 01 N 1/02; A 61 K 39/12, publ. 08.07.1980). Strain Edmonston is deposited in the American Cell Culture Collection (ATCC - VR-24, 4/92). Four passages on the Vero cell culture took place at the SSC VB Vector. The authenticity of the strain was established by the method of positive polymerase chain reaction with specific primers. The strain belongs to genotype A. The maximum titers of the virus reach 5-6 days after infection of the monolayer of Vero cells and are 5 × 10 ⁶ TCPD ₅₀ / ml. [Agafonov A. et al. // Issues. virusol., 1997, N 1, pp. 102-205]. Antigenic properties of the strain: reveals antibodies to measles virus in the sera of patients and vaccinated people (see Table 1). The strain is pathogenic to humans.

Однако вышеприведенный штамм - прототип имеет недостаточную продуктивность: титр вируса не превышает 4-6×10⁶ ТЦПД₅₀/мл [Nobuyuki Ono, et al //J. of Virology, 2001, 75 (9): 4399-401].However, the above strain is a prototype has insufficient productivity: the titer of the virus does not exceed 4-6 × 10 ⁶ TTCP ₅₀ / ml [Nobuyuki Ono, et al // J. of Virology, 2001, 75 (9): 4399-401].

Известна отечественная иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу кори "Корь-скрин" (разработчик и производитель тест-системы "Корь-скрин" - ЗАО Биотехнологическая компания "БИОСЕРВИС" (Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу кори "Корь-скрин", Москва, 2001г.). Указанная тест-система содержит:Famous domestic enzyme immunoassay test system for detecting antibodies to measles virus "Meas-screen" (the developer and manufacturer of the test system "Meas-screen" - ZAO Biotechnological company "BIOSERVICE" (Instructions for use of the test system immuno-enzyme for detecting antibodies to measles virus "Measles-screen", Moscow, 2001.) The specified test system contains:

- иммуносорбент - полистироловые планшеты для иммунологических реакций, в лунках которых сорбирован антиген вируса кори (АгВК). АгВК - в рядах планшета А, С, Е, G и контрольный антиген (кАг) - в рядах В, D, F, Н. АгВК представляет собой инфицированные вирусом кори клетки Vero, содержащие не менее 80% вируссодержащих клеток; кАг представляет собой незараженные клетки Vero;- immunosorbent - polystyrene tablets for immunological reactions in the wells of which measles virus antigen (AgVK) is sorbed. AgVK - in the rows of tablet A, C, E, G and control antigen (kAg) - in rows B, D, F, N. AgVK is measles virus-infected Vero cells containing at least 80% virus-containing cells; kAG are uninfected Vero cells;

- положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови человека, содержащая антитела к вирусу кори;- positive control sample (K +) - human serum containing antibodies to measles virus;

- отрицательный контрольный образец (К-) - сыворотка крови человека или сывороточный альбумин человека, не содержащие антител к вирусу кори;- negative control sample (K-) - human serum or human serum albumin that does not contain antibodies to measles virus;

- конъюгат - антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена;- conjugate - diagnostic antibodies against human immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase;

- субстратная буферная смесь с гидроперитом (БСГ) - для приготовления раствора хромогена;- substrate buffer mixture with hydroperite (BSH) - for the preparation of a chromogen solution;

- хромоген - ортофенилендиамин (ОФД);- chromogen - orthophenylenediamine (OFD);

- стабилизатор - бычий сывороточный альбумин (БСА) или казеин;- stabilizer - bovine serum albumin (BSA) or casein;

- концентрат фосфатно-солевого буфера для отмывания планшетов и приготовления разведений сывороток и конъюгата.- a concentrate of phosphate-saline buffer for washing tablets and preparing dilutions of serum and conjugate.

Однако указанная тест-система (аналог) имеет низкую чувствительность вследствие того, что в ней используют АгВК, представляющий собой неочищенный антиген - инфицированные (не менее 80%) вирусом кори клетки Vero.However, this test system (analogue) has low sensitivity due to the fact that AgVK is used in it, which is a crude antigen - Vero cells infected (at least 80%) with measles virus.

Наиболее близкой тест-системой (прототипом) является иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу кори американской фирмы Wampole Laboratories (Wampole Laboratories measles IgG ELISA// P/N 6000-29W REV В. - №4, 1996; Helfand R.F. et al. Comparative detection of measles and rebella IgM and IgG derived from filter paper blood and serum samples.// J.Med. Virol. 2001, 65(4): 751-7). Указанная иммуноферментная тест-система содержит планшет с иммобилизованным инактивированным антигеном вируса кори, концентрат буфера, блокирующий раствор; цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР); ортофенилендиамин (ОФД), жидкая положительная контрольная сыворотка (К+), жидкая отрицательная контрольная сыворотка (К-), антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (конъюгат) в жидкой форме, жидкий стоп-реагент.The closest test system (prototype) is an enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibodies to measles virus of the American company Wampole Laboratories (Wampole Laboratories measles IgG ELISA // P / N 6000-29W REV B. - No. 4, 1996; Helfand RF et al Comparative detection of measles and rebella IgM and IgG derived from filter paper blood and serum samples.// J. Med. Virol. 2001, 65 (4): 751-7). The specified enzyme immunoassay system contains a tablet with immobilized inactivated antigen of measles virus, buffer concentrate, blocking solution; citrate-phosphate buffer solution for a substrate with hydrogen peroxide (CFR); orthophenylenediamine (CRF), liquid positive control serum (K +), liquid negative control serum (K-), antibodies against human immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase (conjugate) in liquid form, liquid stop reagent.

Однако в указанной тест-системе (прототип) в качестве антигена использован неочищенный NP-белок вируса кори, вследствие чего тест-система имеет недостаточную чувствительность (не выявляет антитела к другим белкам).However, in the indicated test system (prototype), the crude measles virus NP protein was used as antigen, as a result of which the test system has insufficient sensitivity (does not detect antibodies to other proteins).

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание штамма-продуцента вируса кори, обладающего более высокой продуктивностью и иммуноферментной тест-системы на его основе для диагностики антител к вирусу кори с более высокой чувствительностью.The technical result of the invention is the creation of a producer strain of measles virus with higher productivity and an enzyme-linked immunosorbent assay system for diagnosing antibodies to measles virus with higher sensitivity.

Указанный технический результат достигается созданием штамма вируса кори NovO/96 с более высокой продуктивностью и на его основе более чувствительной иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори, включающей планшет с иммобилизованным инактивированным антигеном вируса кори, концентрат фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБ-Т), блокирующий раствор; цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР); ортофенилендиамин (ОФД), жидкая положительная контрольная сыворотка (К+), жидкая отрицательная контрольная сыворотка (К-), антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (конъюгат) в жидкой форме, жидкий стоп-реагент, согласно изобретению в качестве иммобилизованного инактивированного антигена вируса кори тест-система содержит высокоочищенный антиген, приготовленный на основе штамма вируса кори NovO/96.The specified technical result is achieved by creating a measles virus strain NovO / 96 with higher productivity and based on it a more sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of measles virus antibodies, including a tablet with immobilized inactivated measles virus antigen, phosphate-buffered saline with tween (FSB -T) blocking solution; citrate-phosphate buffer solution for a substrate with hydrogen peroxide (CFR); orthophenylenediamine (CRF), liquid positive control serum (K +), liquid negative control serum (K-), antibodies against human immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase (conjugate) in liquid form, a liquid stop reagent according to the invention as an immobilized inactivated antigen measles virus test system contains a highly purified antigen prepared on the basis of the measles virus strain NovO / 96.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм NovO/96 относится к семейству вирусов Paramyxoviridae. Заявляемый штамм получен в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор”, Министерство здравоохранения Российской Федерации, Кольцове, Новосибирская обл.Characterization of the claimed strain. Strain NovO / 96 belongs to the Paramyxoviridae virus family. The inventive strain was obtained at the Research Institute of Molecular Biology of the State Scientific Center for Virology and Biotechnology "Vector", the Ministry of Health of the Russian Federation, Koltsovo, Novosibirsk region

Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под регистрационным номером №VB-04 (дата регистрации 24 апреля 2002 г., справка о депонировании штамма №0302 прилагается к заявке) и используется для производства антигена при выпуске тест-системы иммуноферментной для определения антител к вирусу кори “Анти-корь ИФА”.The strain is deposited in the culture collection of microorganisms of the State scientific center of virology and biotechnology "Vector" under registration number No. VB-04 (registration date April 24, 2002, certificate of deposit of strain No. 0302 attached to the application) and is used to produce antigen for the production of test enzyme immunoassay system for determining antibodies to measles virus “Anti-measles ELISA”.

Источник получения. Штамм выделен от больного К. во время вспышки 1996 в г. Новосибирске. Больной К. имел плотный контакт с инфекционным больным, у которого был серологически подтвержденный диагноз “корь”. Течение инфекции у больного К. было типичным: заболевание начиналось с повышения температуры до 37,8°С, появления сыпи на сгибах рук. Через 2 дня сыпь исчезла. На основании клинических проявлений и по нарастанию титров противокоревых антител в парных сыворотках, определенных с помощью РТГА и ИФА, больному К. был поставлен диагноз - корь. На 2-ой день после повышения температуры у больного К. были взяты образцы крови и соскоб со слизистой рта. Ватный тампон, которым делался соскоб со слизистой рта больного К., был помещен в 1 мл среды ДМЭМ, содержащей антибиотики и после стерилизации через фильтры 0,22 мкм помещали в пен/флакон с монослоем клеток Vero. После инкубирования при 37°С в течение 6 суток клетки снимали раствором трипсин-версена и помещали вместе с новой порцией свежих клеток Vero на культуральный сосуд объемом 75 мл. После инкубирования при 37°С в течение 6 суток (до появления на монослое симпластов) культуральный сосуд помещали на -20°С, затем производили оттаивание КВЖ (культуральной вируссодержащей жидкости). Полученную смесь КВЖ и лизата клеток Vero расфасовывали и одну часть стока лиофилизовали, а другую - хранили при минус 70°С.Source of receipt. The strain isolated from patient K. during an outbreak of 1996 in Novosibirsk. Patient K. had close contact with an infectious patient who had a serologically confirmed diagnosis of measles. The course of infection in patient K. was typical: the disease began with an increase in temperature to 37.8 ° C, the appearance of a rash on the bends of the hands. After 2 days, the rash disappeared. On the basis of clinical manifestations and an increase in titers of measles antibodies in paired sera determined using rtga and ELISA, patient K. was diagnosed with measles. On the 2nd day after an increase in temperature, patient K. was taken blood samples and scrapings from the oral mucosa. A cotton swab that made scraping from the mucous membrane of patient K. was placed in 1 ml of DMEM containing antibiotics and after sterilization through 0.22 μm filters was placed in a foam / vial with a monolayer of Vero cells. After incubation at 37 ° C for 6 days, the cells were removed with a trypsin-versene solution and placed with a new portion of fresh Vero cells on a 75 ml culture vessel. After incubation at 37 ° C for 6 days (before the appearance of symplasts on the monolayer), the culture vessel was placed at -20 ° C, followed by thawing of fluorescence fluids (culture virus-containing fluid). The resulting mixture of LEL and Vero cell lysate was packaged and one part of the drain was lyophilized, and the other was stored at minus 70 ° С.

Подлинность штамма. Проведена ПЦР-диагностика: положительная цепная полимеразная реакция со специфическими праймерами. Проведен сиквенс и изучен С-концевой участок генома вируса кори штамм NovO/96, отвечающий за кодирование NP белка. Проведено сравнение полученной последовательности аминокислот с последовательностью аминокислот штамма Эдмонстон. В позиции 1542 в штамме NovO/96 произошла замена нуклеиновой кислоты Т→А, приведшая к смене в позиции 478 аминокислоты Фенилаланин на Изолейцин.The authenticity of the strain. PCR diagnostics: positive polymerase chain reaction with specific primers. The sequence was studied and the C-terminal portion of the measles virus genome strain NovO / 96, which is responsible for the coding of the NP protein, was studied. The obtained amino acid sequence is compared with the amino acid sequence of the Edmonston strain. At position 1542 in strain NovO / 96, the T → A nucleic acid was replaced, leading to a change in position 478 of the amino acid Phenylalanine to Isoleucine.

На чертеже приведена карта сравнения аминокислотных последовательностей:The drawing shows a map of the comparison of amino acid sequences:

Из выше изложенного следует, что заявляемый штамм отличается генетически от известных штаммов вируса кори.From the above it follows that the claimed strain differs genetically from known strains of measles virus.

Генотип штамма. Генотип A [S.Santibanez,... A.Agafonov et al. // J. of Med. Virol. 1999, V.58, №3, P.313-320].The genotype of the strain. Genotype A [S. Santibanez, ... A. Agafonov et al. // J. of Med. Virol. 1999, V.58, No. 3, P.313-320].

Культуральные свойства. Штамм NovO/96 при культивировании на монослое клеток Vero вызывает образование симпластов на 4-6 сутки (темпер. культивирования 37°С). Максимальные титры вируса достигали на 5-6 сутки после заражения монослоя клеток Vero и составляли 4×10⁸ ТЦПД₅₀/мл. Продуктивность: Из 3 литров КВЖ получается 5 мг антигена для ИФА.Cultural properties. Strain NovO / 96 during cultivation on a monolayer of Vero cells causes the formation of symplasts at 4-6 days (temp. Cultivation 37 ° C). The maximum titers of the virus reached 5-6 days after infection with a monolayer of Vero cells and amounted to 4 × 10 ⁸ TCPD ₅₀ / ml. Productivity: 5 mg of antigen for ELISA is obtained from 3 liters of fluids.

Использование полученного из штамма NovO/96 антигена - 0,2-0,4 мкг/лунку позволяет выявлять противокоревые антитела в сыворотках вакцинированных и больных корью людей методом ИФА.The use of the antigen obtained from NovO / 96 strain - 0.2-0.4 μg / well allows detecting measles antibodies in the sera of vaccinated and measles patients by ELISA.

Антигенные свойства. Выявляет антитела к вирусу кори в сыворотках больных и вакцинированных людей (см. табл. 1). Выделенный штамм по серологическим свойствам близок к референс-штамму Эдмонстон и к вакцинному штамму Л-16.Antigenic properties. Detects antibodies to measles virus in the sera of patients and vaccinated people (see table. 1). The isolated strain is close in serological properties to the Edmondston reference strain and the L-16 vaccine strain.

Патогенность для человека. По клиническим признакам заболевания у больного, от которого был выделен штамм NovO/96 (температура - 37,8°С, сыпь не обильная, исчезновение сыпи через 2 дня), можно считать, что штамм NovO/96 не является высокопатогенным. Штамм NovO/96 не является фито- и зоопатогенным.Pathogenicity for humans. According to the clinical signs of the disease in the patient from whom the NovO / 96 strain was isolated (temperature - 37.8 ° C, the rash is not plentiful, the rash disappears after 2 days), it can be considered that the NovO / 96 strain is not highly pathogenic. Strain NovO / 96 is not phyto- and zoopathogenic.

Для длительного хранения штамм лиофилизируют с использованием в качестве защитной среды раствор желатина и сахарозы.For long-term storage, the strain is lyophilized using a gelatin and sucrose solution as a protective medium.

Для размножения штамма используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ x 2АВК, ДМЭМ, содержащие 2-5% фетальной сыворотки КРС.The following nutrient media are used to propagate the strain: MEM needle, MEM x 2ABK needle, DMEM containing 2-5% fetal bovine serum.

Изучение серологических свойств полученного штамма (NovO/96) выявило существенное сходство с референс-штаммом (прототип) вируса кори и со штаммом Л-16. Полученные от иммунизированных мышей линии BALB/c антисыворотки к штамму Эдмонстон и к заявляемому штамму, выделенному от больного, были исследованы в реакции иммуноферментного анализа. Результаты изучения перекреста между полученными сыворотками показаны в табл. 1. Как видно из результатов табл. 1, сыворотка от всех мышей, иммунизированных вирусом кори штамм Эдмонстон, реагировала как с вирусами кори штамм Эдмонстон и Л-16, так и со штаммом NovO/96, выделенным при вспышке. С другой стороны, сыворотки от всех мышей, иммунизированных заявляемым штаммом, выделенном при вспышке кори 1996 года, реагировали как с самим вирусом, так и с вирусами кори штамм Эдмонстон и Л-16. Исходя из полученных результатов можно заключить, что заявляемый штамм по серологическим свойствам близок к референс-штамму Эдмонстон и к вакцинному штамму Л-16.The study of the serological properties of the obtained strain (NovO / 96) revealed significant similarities with the reference strain (prototype) of measles virus and with strain L-16. The antisera obtained from immunized BALB / c mice to the Edmonston strain and to the inventive strain isolated from the patient were tested in an enzyme-linked immunosorbent assay. The results of the study of the cross between the obtained sera are shown in table. 1. As can be seen from the results of table. 1, the serum from all mice immunized with measles virus strain Edmonston reacted with both measles viruses strain Edmonston and L-16, and with strain NovO / 96, isolated during the outbreak. On the other hand, the sera from all mice immunized with the claimed strain isolated from the measles outbreak of 1996 reacted both with the virus itself and with the measles viruses strain Edmonston and L-16. Based on the results obtained, it can be concluded that the claimed strain by serological properties is close to the reference strain of Edmonston and the vaccine strain L-16.

Пример 1. Способ получения антигена вируса кори.Example 1. A method of obtaining an antigen of measles virus.

Очищенный и инактивированный антиген вируса кори используют для постановки реакции иммуноферментного анализа.The purified and inactivated measles virus antigen is used to set up an enzyme immunoassay.

Получение вируссодержащей жидкости. Исходные клетки Vero хранят в жидком азоте и выращивают путем серийных пересевов. В качестве ростовой среды используют раствор Игла MEM с 8-10% эмбриональной сыворотки КРС. Культуру клеток выращивают в течение 3-4 суток при посевной концентрации клеток 5-10×10⁵ кл/мл среды и пересевают общепринятым способом.Obtaining a virus-containing fluid. The original Vero cells are stored in liquid nitrogen and grown by serial passages. As a growth medium using a solution of MEM Needle with 8-10% fetal bovine serum. The cell culture is grown for 3-4 days at an inoculum cell concentration of 5-10 × 10 ⁵ cells / ml of medium and subcultured in a conventional manner.

Вирусом кори (штамм NovO/96) заражают 1-литровые матрасы с монослоем культуры клеток Vero или Л-68 (множественность заражения 1:10). После инкубации при 20-25°С в течение 40 мин приливают 200 мл питательной среды Игла МЭМ с добавлением (3,0±0,1) мл сыворотки крупного рогатого скота, 0,001% - трипсина, 200 ед/мл бензилпеницилина и 200 нг/мл стрептомицина, и после инкубации в течение 5-7 суток при (36±1)°С сливают питательную среду. Титр вируса в КВЖ - не менее 10⁸ ТЦПД₅₀/мл.Measles virus (strain NovO / 96) infects 1-liter mattresses with a monolayer of Vero or L-68 cell culture (multiplicity of infection 1:10). After incubation at 20-25 ° C for 40 min, 200 ml of nutrient medium are poured with a MEM needle with the addition of (3.0 ± 0.1) ml of cattle serum, 0.001% trypsin, 200 units / ml of benzylpenicillin and 200 ng / ml of streptomycin, and after incubation for 5-7 days at (36 ± 1) ° C, the nutrient medium is drained. The titer of the virus in the LEL is at least 10 ⁸ TTCP ₅₀ / ml.

Получение лизата клеток Vero. При культивировании переход вируса из клетки в клетку осуществляется за счет образования симпластов без выхода основного количества последнего в КВЖ, поэтому накопления вируса происходит как в КВЖ, так и внутри клеток. В культуральный сосуд добавляют 5-7 мл 0,01 М Трис НСl, рН=9,0. Клетки разрушают трехкратным замораживанием-оттаиванием для выхода вируса из клеток. Клеточный лизат освобождают от клеточного детрита низкоскоростным центрифугированием в роторе JA-10 центрифуги J2-21 (ф. “Beckman”, США) при 1500 об/мин в течение 10 мин при температуре +4°С. Титр вируса в лизате клеток - 2-4×10⁶ ТЦПД₅₀/мл.Obtaining a lysate of Vero cells. During cultivation, the transition of the virus from cell to cell is carried out due to the formation of symplasts without the release of the main amount of the latter in the SCL, therefore, the accumulation of the virus occurs both in the SCL and inside the cells. 5-7 ml of 0.01 M Tris Hcl, pH = 9.0, are added to the culture vessel. Cells are destroyed by triple freezing-thawing to exit the virus from the cells. The cell lysate is freed from cell detritus by low-speed centrifugation in a JA-10 rotor of a J2-21 centrifuge (F. Beckman, USA) at 1500 rpm for 10 min at a temperature of + 4 ° С. The virus titer in the cell lysate is 2-4 × 10 ⁶ TTCP ₅₀ / ml.

Проведение ультрафильтрации. Концентрирование и очистку вируса кори из КВЖ проводят на мембранах "Владипор" типа УАМ-100 (Россия) или РТНК 0005 (ф. “Millipore”, США). Линейная скорость подачи КВЖ на ячейку должна быть равна 0,6 л/мин. Давление на выходе должно быть не более 2,5 кг/см², давление на входе не должно превышать давление на выходе более, чем на 0,4 кг/см². Конечный продукт представляет собой КВЖ, сконцентрированную в 20 раз, освобожденную от низкомолекулярных соединений и клеточного детрита. Титр вируса кори в концентрате не менее 10⁹ ТЦПД₅₀/мл.Conducting ultrafiltration. Concentration and purification of measles virus from COL is carried out on Vladipor membranes of the UAM-100 type (Russia) or RTNK 0005 (F. Millipore, USA). The linear flow rate of the QOL to the cell should be equal to 0.6 l / min. The outlet pressure should be no more than 2.5 kg / cm ² , the inlet pressure should not exceed the outlet pressure by more than 0.4 kg / cm ² . The final product is an up to 20-fold concentrated fluids, free from low molecular weight compounds and cellular detritus. The measles virus titer in a concentrate of at least 10 ⁹ TCPD ₅₀ / ml.

Ультрацентрифугирование вируссодержащего материала. Осаждение вируса. Антиген для ИФА получают из двух источников:Ultracentrifugation of virus-containing material. The deposition of the virus. Antigen for ELISA is obtained from two sources:

1 - из концентрата КВЖ;1 - from KVZh concentrate;

2 - из лизата клеток после размораживания.2 - from a cell lysate after thawing.

На первом этапе вирус осаждают через “подушку” 10%-ной сахарозы в роторе SW 28. Для этого в пробирки ротора осторожно наливают 5 мл 10%-ной сахарозы и сверху наслаивают 30 мл концентрата КВЖ или лизата клеток. Осаждение вируса проводят при 26000 об/мин, 4°С, 10 часов. Надосадочную жидкость осторожно отбирают пипеткой, а осадок растворяют в 0,5-1,0 мл NTE-буфера (0,1 М NaCl, 0,01 М Трис НС1, 0,001 М ЭДТА, рН=7,6).At the first stage, the virus is precipitated through a “cushion” of 10% sucrose in the SW 28 rotor. For this, 5 ml of 10% sucrose are carefully poured into the test tubes of the rotor and 30 ml of UHF concentrate or cell lysate are layered on top. Virus precipitation is carried out at 26,000 rpm, 4 ° C, 10 hours. The supernatant was carefully taken with a pipette, and the precipitate was dissolved in 0.5-1.0 ml of NTE buffer (0.1 M NaCl, 0.01 M Tris HC1, 0.001 M EDTA, pH = 7.6).

Очистка антигена вируса кори. Антиген для ИФА очищают от чужеродных белков ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Осадки из всех пробирок (осадки из концентрата КВЖ и лизата клеток) объединяют, проводят обработку на ультразвуковом дезинтеграторе при 6000 Гц 3 раза по 10 с и наслаивают на раствор 20-60%-ной сахарозы. Для приготовления линейного градиента раствора сахарозы используют смеситель, состоящий из двух камер, которые можно изолировать перекрыванием крана между ними. Одну из камер (первую) соединяют гибким шлангом с перистальтическим насосом. Шланг, выходящий из насоса, опускают в пробирку вместимостью 12 мл таким образом, чтобы он касался стенки пробирки в верхней ее части. Смеситель устанавливают на магнитную мешалку. В первую камеру помещают якорек. Смеситель заполняют при закрытом кране следующим образом. В первую камеру наливают 4,5 мл 60%-ного раствора сахарозы, во вторую 4,5 мл 20%-ного раствора сахарозы. Затем включают магнитную мешалку, перистальтический насос и осторожно открывают кран между камерами. Раствор из второй камеры поступает в первую, перемешивается и через насос поступает в пробирку. Общий объем приготовленного линейного градиента составляет 9 мл в каждой пробирке. Осажденный антиген вируса кори осторожно наслаивают с помощью шприца с толстой иглой на линейный градиент сахарозы 20-60% в стаканы ротора SW-41 центрифуги Beckman L-8-70. Режим ценрифугирования-37000 об/мин при 4-6°С в течение 12 ч. Полосу на уровне 42-45%-ной сахарозы осторожно отбирают шприцом с толстой иглой и после определения чистоты антигена методом электрофореза и определения концентрации антигена по белку используют для проведения ИФА.Purification of measles virus antigen. The antigen for ELISA is purified from foreign proteins by ultracentrifugation in a sucrose density gradient. Precipitation from all test tubes (precipitations from LWC concentrate and cell lysate) are combined, they are processed on an ultrasonic disintegrator at 6000 Hz 3 times for 10 s and layered on a solution of 20-60% sucrose. To prepare a linear gradient of a sucrose solution, a mixer is used, consisting of two chambers that can be isolated by shutting off a tap between them. One of the chambers (first) is connected with a flexible hose to a peristaltic pump. The hose leaving the pump is lowered into a 12 ml tube so that it touches the tube wall in its upper part. The mixer is mounted on a magnetic stirrer. An anchor is placed in the first chamber. The mixer is filled with the tap closed as follows. 4.5 ml of a 60% sucrose solution are poured into the first chamber, 4.5 ml of a 20% sucrose solution into the second chamber. Then turn on the magnetic stirrer, peristaltic pump and carefully open the crane between the chambers. The solution from the second chamber enters the first, mixes and enters the tube through the pump. The total volume of the prepared linear gradient is 9 ml in each tube. The precipitated measles virus antigen is carefully layered using a syringe with a thick needle onto a linear sucrose gradient of 20-60% in Beckman L-8-70 centrifuge rotor glasses. The centrifugation mode is 37,000 rpm at 4-6 ° C for 12 hours. The band at the level of 42-45% sucrose is carefully selected with a syringe with a thick needle and, after determining the antigen purity by electrophoresis and determining the concentration of antigen by protein, is used to IFA.

Выход пригодного для ИФА антигена с 3 л КВЖ и лизата клеток составляет 4-6 мг по белку.The yield of ELISA-suitable antigen with 3 L of fluids and cell lysate is 4-6 mg per protein.

Стадия инактивации вируса: очищенный в градиенте плотности сахарозы антиген вируса кори инактивируют прогреванием при 56°С в течение 30 мин [Жданов В.М., Гайдамович С.Я. Вирусология. М.: Медицина, 1966 г., с. 382].Virus inactivation stage: the measles virus antigen purified in a sucrose density gradient is inactivated by heating at 56 ° C for 30 min [Zhdanov V.M., Gaidamovich S.Ya. Virology. M .: Medicine, 1966, p. 382].

Пример 2. Состав тест-системы.Example 2. The composition of the test system.

Состав компонентов тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу кори (Анти-корь ИФА), которая представляет собой набор реагентов:The composition of the components of the enzyme immunoassay system for detecting antibodies to measles virus (Anti-measles ELISA), which is a set of reagents:

- контрольная положительная сыворотка (К+) - сыворотка крови человека, содержащая антитела к вирусу кори, инактивированная прогреванием, и краситель феноловый красный по ТУ 6-09-3070-84;- control positive serum (K +) - human blood serum containing antibodies to measles virus, inactivated by heating, and phenol red dye according to TU 6-09-3070-84;

- контрольная отрицательная сыворотка (К-) - сыворотка крови здоровых доноров, не содержащая антител к вирусу кори;- control negative serum (K-) - healthy donor blood serum that does not contain antibodies to measles virus;

- антитела против иммуноглобулинов класса G человека, меченые пероксидазой хрена по ТУ 6-09-10-1408-79 (конъюгат);- antibodies against human class G immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase according to TU 6-09-10-1408-79 (conjugate);

- субстрат пероксидазы ортофенилендиамин (ОФД) по ТУ 6-09-08-1127-76 или ВФС 42-76ВС-88;- substrate of peroxidase orthophenylenediamine (OFD) according to TU 6-09-08-1127-76 or VFS 42-76BC-88;

- цитратно-фосфатный буферный раствор (ЦФР) (состав ЦФР: натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172-76 39,59 г; лимонная кислота моногидрат по ГОСТ 908-79Е или ТУ 6-09-584-75 5,21 г; вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72 до 1 л; водорода перекиси до массовой доли 0,02 ГОСТ 177-88 рН 5,3±0,3. Коррекцию рН проводят гидроокисью натрия по ГОСТ 4328-77 в концентрации 1 моль/л);- citrate-phosphate buffer solution (CFR) (composition of CFR: sodium phosphoric disubstituted 12-water in accordance with GOST 4172-76 39.59 g; citric acid monohydrate in accordance with GOST 908-79E or TU 6-09-584-75 5, 21 g; distilled water in accordance with GOST 6709-72 to 1 l; hydrogen peroxide to a mass fraction of 0.02 GOST 177-88 pH 5.3 ± 0.3. Correction of pH is carried out with sodium hydroxide according to GOST 4328-77 at a concentration of 1 mol / l);

- концентрат фосфатно-солевого буферного раствора двадцатипятикратный (ФСБТ-25Х) (состав ФСБ-Т (25Х) - натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный ГОСТ 4172-76 90,0 г; натрий фосфорно-кислый однозамещенный 2-водный по ГОСТ 245-76 4,75 г; натрий хлористый ГОСТ 245-76 22,0 г; твин-20 "Сигма", США 12,5 мл);- twenty-five-fold phosphate-saline buffer concentrate (FSBT-25X) (composition FSB-T (25X) - sodium phosphoric acid disubstituted 12-water GOST 4172-76 90.0 g; sodium phosphoric acid monosubstituted 2-water in accordance with GOST 245 -76 4.75 g; sodium chloride GOST 245-76 22.0 g; Tween-20 Sigma, USA 12.5 ml);

- стоп-реагент серная кислота по ГОСТ 4204-77 с концентрацией 2 моль/л;- stop reagent sulfuric acid according to GOST 4204-77 with a concentration of 2 mol / l;

- блокирующий раствор.- blocking solution.

Иммуносорбент - планшет 96-луночный для иммунологических реакций по ТУ 64-2-375-86 или планшет разборный со стрипами типа "Nunc", Дания или аналогичные с иммобилизованным очищенным антигеном вируса кори.Immunosorbent - 96-well plate for immunological reactions according to TU 64-2-375-86 or a collapsible plate with strips of the type "Nunc", Denmark or similar with immobilized purified measles virus antigen.

Консервант - мертиолят натрия "Сигма" (США) содержится в К+, К-, конъюгате, блокирующем растворе в концентрации 0,01%; К+ и К-содержат антибиотик-гентамицина сульфат по ВФС 42-2626-89 в концентрации 1мг/мл.Preservative - Sigma sodium merthiolate (USA) is contained in K +, K-, conjugate, blocking solution at a concentration of 0.01%; K + and K-contain the antibiotic gentamicin sulfate according to VFS 42-2626-89 at a concentration of 1 mg / ml.

Набор рассчитан на проведение 96 анализов (включая контрольные).The kit is designed for 96 tests (including control).

Соли последовательно растворяют при перемешивании в 0,9 л дистиллированной воды при температуре 40-50°С, рН 7,5±0,3, коррекцию проводят как описано выше. Объем раствора доводят до 1 л, добавляют твин-20 и перемешивают.The salts are successively dissolved with stirring in 0.9 l of distilled water at a temperature of 40-50 ° C, pH 7.5 ± 0.3, the correction is carried out as described above. The volume of the solution was adjusted to 1 L, tween-20 was added and mixed.

Пример 3. Состав и методика применения коммерческой тест-системы "Анти-корь ИФА"Example 3. The composition and methodology of the commercial test system "Anti-measles ELISA"

1. Состав набора1. The composition of the set

1. Планшет с иммобилизованным антигеном вируса кори - 1 планшет (разборный).1. Tablet with immobilized measles antigen - 1 tablet (collapsible).

2. Концентрат фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБ-Т) - 3 флакона объемом по 10мл.2. Concentrate of phosphate-saline buffer with tween (FSB-T) - 3 bottles with a volume of 10 ml.

3. Блокирующий раствор -1 флакон объемом 10 мл.3. Blocking solution -1 bottle of 10 ml.

4. Цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР) - 3 флакона объемом 10 мл.4. Citrate-phosphate buffer solution for a substrate with hydrogen peroxide (CFR) - 3 bottles with a volume of 10 ml.

5. Ортофенилендиамин (ОФД) - 1 флакон, 3 таблетки.5. Orthophenylenediamine (OFD) - 1 bottle, 3 tablets.

6. Положительная контрольная сыворотка (К+), жидкая, красного цвета - 1 флакон объемом 0,5 мл.6. Positive control serum (K +), liquid, red - 1 vial with a volume of 0.5 ml.

7. Отрицательная контрольная сыворотка (К-), жидкая, желтоватого цвета - 1 флакон объемом 0,5 мл.7. Negative control serum (K-), liquid, yellowish - 1 vial with a volume of 0.5 ml.

8. Антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (конъюгат), жидкие, синего цвета - 1 флакон объемом 0,5 мл.8. Antibodies against human immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase (conjugate), liquid, blue - 1 vial with a volume of 0.5 ml.

9. Стоп-реагент, прозрачная бесцветная жидкость - 1 флакон объемом 5 мл.9. Stop reagent, clear, colorless liquid - 1 vial with a volume of 5 ml.

2. Проведение иммуноферментного анализа2. Enzyme immunoassay

Очищенный антиген (вирус кори штамм NovO/96) разводят в карбонатном буфере (рН=9,6) до концентрации 2-4 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора антигена в лунки 96 луночного планшета. Адсорбцию антигена проводят при 4°С в течение 16-20 ч. После инкубации из планшета удаляют неиммобилизованный антиген и промывают три раза ФСБ-Т, при этом в каждую лунку планшета вносят объем раствора не менее 200 мкл. Затем во все лунки планшета вносят по 100 мкл блокирующего раствора, закрывают планшет крышкой, выдерживают при 37°С в течение 30 мин и затем промывают 2 раза ФСБ-Т. Для определения титра противокоревых антител сыворотки раститровываются в лунках по вертикали во вспомогательном 96-ти луночном планшете. Во все лунки вспомогательного планшета (кроме 1-го ряда - лунки с А-1 по А-11) вносят по 130 мкл р-ра ФСБ-Т. Во все лунки ряда А, начиная с лунки "А-1" (лунки 1-11), вносят по 225 мкл р-ра ФСБ-Т. Последний (12-ый ряд) планшета используется для контролей. Затем во все лунки ряда А, начиная с лунки "А-1" (лунки 1-11), вносят по 25 мкл испытуемых сывороток и раститровывают их каждую по своему ряду с шагом разведений 1:2. Например, из лунки А-1 отбирают 130 мкл испытуемой сыворотки в разведении 1:10 и переносят в лунку "В-1", тщательно пипетируют, отбирают 130 мкл и переносят в лунку "С-1". Процедуру повторяют и переносят 130 мкл в лунку "D-1" и так далее до лунки "Н-1". Аналогичным образом в лунках ряда 2 (от лунки "А-2" до лунки "Н-2") раститровывается следующая испытуемая сыворотка и так далее, до лунок 11-го ряда. Последний (12-ый ряд) планшета используется для контролей. Таким образом в планшете можно раститровать до 11 сывороток. Все разведения сывороток (100 мкл) из вспомогательного планшета переносятся в соответствующие лунки планшета с иммобилизованным антигеном вируса кори. В лунки А-12 и В-12 вносят К+ объемом по 100 мкл, в лунки С-12 и D-12 вносят СОП объемом по 100 мкл, в лунки Е-12 и F-12 вносят К - объемом по 100 мкл, в лунки G-12 и Н-12 вносят ФСБ-Т объемом по 100 мкл для контроля конъюгата. Затем планшет закрывают крышкой или клейкой лентой и инкубируют 30 мин при температуре (37±1)°С. После промывки и удаления влаги в каждую лунку вносят конъюгат в рабочем разведении объемом по 100 мкл. Планшет закрывают и инкубируют 30 мин при температуре (37±1)°С. По окончании инкубации планшет промывают ФСБ-Т не менее трех раз и удаляют остатки влаги из планшета. Далее вносят в каждую лунку планшета раствор субстрата объемом по 100 мкл. Планшет закрывают крышкой и помещают на 20 мин в защищенное от света место при температуре 20-25°С. Реакцию останавливают внесением стоп-реагента по 50 мкл в каждую лунку планшета.The purified antigen (measles virus strain NovO / 96) is diluted in carbonate buffer (pH = 9.6) to a concentration of 2-4 μg / ml and 100 μl of antigen solution are added to the wells of a 96 well plate. Antigen adsorption is carried out at 4 ° C for 16-20 hours. After incubation, the non-immobilized antigen is removed from the plate and washed three times with PBS-T, and a solution volume of at least 200 μl is added to each well of the plate. Then, 100 μl of a blocking solution are added to all wells of the plate, the plate is closed with a lid, kept at 37 ° C for 30 minutes, and then washed with 2 times FSB-T. To determine the titer of measles anti-measles antibodies, serum is triturated in the wells vertically in an auxiliary 96-well plate. 130 μl of FSB-T solution are added to all wells of the auxiliary plate (except for the 1st row — wells from A-1 to A-11). In all wells of row A, starting from well "A-1" (wells 1-11), 225 μl of FSB-T solution are added. The last (12th row) tablet is used for controls. Then, 25 μl of the tested sera are added to all wells of row A, starting from well “A-1” (wells 1-11), and each is titrated in its own row with a dilution step of 1: 2. For example, 130 μl of test serum in a 1:10 dilution is taken from well A-1 and transferred to well B-1, thoroughly pipetted, 130 µl is taken and transferred to well C-1. The procedure is repeated and transferred 130 μl into the hole "D-1" and so on to the hole "H-1". Similarly, in the wells of row 2 (from well “A-2” to well “H-2”) the next test serum is grown and so on, to the wells of the 11th row. The last (12th row) tablet is used for controls. Thus, up to 11 sera can be rastitrovany in the tablet. All serum dilutions (100 μl) from the auxiliary plate are transferred to the corresponding wells of the plate with the immobilized measles virus antigen. In wells A-12 and B-12, K + is added in a volume of 100 μl; in wells C-12 and D-12, SOP is added in a volume of 100 μl; in wells E-12 and F-12, K is made with a volume of 100 μl, PBS-T with a volume of 100 μl was added to wells G-12 and H-12 to control the conjugate. Then the tablet is closed with a lid or duct tape and incubated for 30 min at a temperature of (37 ± 1) ° С. After washing and removing moisture, a conjugate is added to each well in working dilution with a volume of 100 μl. The tablet is closed and incubated for 30 minutes at a temperature of (37 ± 1) ° C. At the end of the incubation, the plate is washed with FSB-T at least three times and the remaining moisture is removed from the tablet. Next, a substrate solution of 100 μl was added to each well of the plate. The tablet is closed with a lid and placed for 20 minutes in a dark place at a temperature of 20-25 ° C. The reaction is stopped by introducing a stop reagent of 50 μl into each well of the tablet.

3. Учет результатов3. Profitability analysis

Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре. Оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 492 нм. Результаты учитывают только в том случае, если среднее значение ОП в лунках с контролем конъюгата (ОП_кк) не превышает 0,15, в лунках с К - среднее значение ОП(ОП_к-) не более 0,2, а в лунках с К+ среднее значение ОП(ОП_к+) не менее 0,5.ELISA results are recorded on a spectrophotometer. Optical density (OD) is measured at a wavelength of 492 nm. The results are taken into account only if the average OD value in wells with conjugate control (OD _kk ) does not exceed 0.15, in wells with K the average OD value (OD _k- ) is not more than 0.2, and in wells with K + average value of OD (OD _{to +} ) not less than 0.5.

Результаты теста считаются положительными, если ОП анализируемой сыворотки больше Оп_крит. При количественном определении титра антител к вирусу кори в сыворотке титром следует считать последнее разведение исследуемой сыворотки, значение ОП в которой превышает значение ОП_крит. ОП_крит рассчитывают по формуле: ОП_крит.=ОП_к-+0,2.Test results are considered positive if the OD of the analyzed serum is greater than Op _crit. In the quantitative determination of the titer of measles virus antibodies in serum, the titer should be considered the last dilution of the test serum, in which the OD value exceeds the OD value of _crit. OD _crit calculated by the formula: OD _crit. OP = _k + 0.2.

Тест-систему "Анти-корь ИФА" выпускают в виде набора, упакованного в полистироловую или картонную коробку. Один набор рассчитан на проведение 96 анализов, включая контрольные.The test system "Anti-measles ELISA" is released in the form of a kit, packed in a polystyrene or cardboard box. One set is designed for 96 analyzes, including control.

Пример 4. Использование тест-системы "Анти-корь ИФА" в клинической практике.Example 4. The use of the test system "Anti-measles ELISA" in clinical practice.

А. Во время вспышки инфекционного заболевания в г. Новосибирске в 2000-2001 г.г. тест-система "Анти-корь ИФА" была использована для серологического подтверждения клинического диагноза “корь” у 8 больных. Больные с клиническим диагнозом “корь” поступали в Новосибирский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями. На 2-3 сутки и через 2-2,5 недели после поступления у больных проводили забор парных сывороток для серологического подтверждения диагноза “корь”. Нарастание титров специфических антител изучали в реакции РТГА (по стандартной методике с использованием эритроцитов обезьяны Масаса mulatta) и методом ИФА (с помощью экспериментальных серий тест-системы "Анти-корь ИФА", основным компонентом которой является очищенный антиген вируса кори штамм NovO/96). Окончательный диагноз “корь” был поставлен после проведения ПЦР со специфическими праймерами на С-концевую часть гена, кодирующего NP белок вируса кори. У всех 8 больных было отмечено как минимум 4-х кратное нарастание специфических антител, определенное методом РТГА. У всех 8 больных в забранных образцах методом ПЦР был обнаружен генетический материал, специфичный для вируса кори. С помощью тест-системы "Анти-корь ИФА" также было зарегистрировано у всех 8 больных как минимум 4-х кратное нарастание антител к вирусу кори. Таким образом, тест-система "Анти-корь ИФА" может быть использована для определения специфических антител в парных сыворотках, полученных от больных, и таким образом для определения, снятия или подтверждения диагноза при протекании заболевания с клиническими проявлениями, характерными для кори.A. During the outbreak of an infectious disease in Novosibirsk in 2000-2001 “Anti-measles ELISA” test system was used for serological confirmation of the clinical diagnosis of measles in 8 patients. Patients with a clinical diagnosis of measles were admitted to the Novosibirsk Regional Center for the Prevention and Control of AIDS and Infectious Diseases. On 2-3 days and 2-2.5 weeks after admission, paired sera were taken in patients for serological confirmation of the diagnosis of measles. The increase in titers of specific antibodies was studied in the RTGA reaction (according to the standard method using red blood cells of the monkey Masas mulatta) and the ELISA method (using the experimental series of the Anti-measles ELISA test system, the main component of which is the purified measles virus antigen strain NovO / 96) . The final diagnosis of measles was made after PCR with specific primers at the C-terminal part of the gene encoding the measles virus NP protein. In all 8 patients, at least a 4-fold increase in specific antibodies was detected, as determined by rtga. In all 8 patients in the collected samples by PCR, genetic material specific for measles virus was detected. Using the Anti-measles ELISA test system, at least 4-fold increase in measles virus antibodies was also recorded in all 8 patients. Thus, the Anti-measles ELISA test system can be used to determine specific antibodies in paired sera obtained from patients, and thus to determine, remove or confirm the diagnosis of a disease with clinical manifestations characteristic of measles.

Б. В период с 1996 по 1998 годы в п.Кольцово Новосибирской области проводились работы по изучению титра специфических антител к вирусу кори в сыворотках крови детей возраста 6 лет перед проведением второй вакцинации против кори. Титры специфических антител изучали в реакции РПГА (с помощью "Диагностикума эритроцитарного коревого антигенного для РПГА", производства “Предприятия по производству бакпрепаратов Ленинградского НИИЭМ им. Пастера”), РТГА (по стандартной методике с использованием эритроцитов обезьяны Macaca, mulatta) и методом ИФА (с помощью заявляемой тест-системы "Анти-корь ИФА", основным компонентом которой является очищенный антиген вируса кори штамм NovO/96).B. In the period from 1996 to 1998 in the village of Koltsovo, Novosibirsk Region, work was done to study the titer of specific antibodies to measles virus in the blood serum of children aged 6 years before the second measles vaccination. The titers of specific antibodies were studied in the RPHA reaction (using the Diagnosticum of measles erythrocyte measles antigen for RPHA, produced by the Pasteur Leningrad Scientific Research Institute of Epidemiology for the Production of Bacterial Preparations), RTGA (using the standard method using erythrocytes of the monkey Macaca, mulatta) and IF method using the claimed test system "Anti-measles ELISA", the main component of which is a purified measles virus antigen strain NovO / 96).

Результаты сравнения двух методов определения противокоревых антител в сыворотке крови детей показывают, что с помощью метода иммуноферментного анализа специфические антитела определяются в 177 сыворотках из общего количества сывороток (187 сывороток), в которых были найдены противокоревые антитела и с помощью метода ИФА, и с помощью метода РТГА. В то же время методом РТГА антитела к вирусу кори определялись в 165 сыворотках. Таким образом, наибольший процент выявляемость положительных сывороток (95,5%) был получен в реакции ИФА. В реакции РТГА процент положительных реакций был ниже и составлял 89,2%. Средние арифметические величины титров антител в ИФА также были выше, чем в РТГА (1:245,5 и 1:28,4 соответственно).A comparison of two methods for the determination of measles antibodies in the blood serum of children shows that, using the enzyme-linked immunosorbent assay, specific antibodies are detected in 177 sera from the total number of sera (187 sera) in which anti-measles antibodies were found using both the ELISA method and the ELISA method. RTGA. At the same time, antibodies to measles virus were determined in 165 sera by the rtga method. Thus, the highest percentage of detectable positive sera (95.5%) was obtained in the ELISA. In the RTHA reaction, the percentage of positive reactions was lower and amounted to 89.2%. The arithmetic mean values of antibody titers in ELISA were also higher than in rtga (1: 245.5 and 1: 28.4, respectively).

Сопоставление результатов, полученных при использовании методов ИФА и РТГА, показало, что антитела к вирусу кори обоими методами выявляются в 155 сыворотках.Comparison of the results obtained using the methods of ELISA and rtga showed that antibodies to measles virus by both methods are detected in 155 sera.

Таким образом, тест-система "Анти-корь ИФА" может быть использована для определения напряженности индивидуального иммунитета к заболеванию “корь”.Thus, the test system "Anti-measles ELISA" can be used to determine the intensity of individual immunity to the disease "measles".

Claims (2)

1. Штамм вируса кори NovO/96 для получения антигена - компонента иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори, депонированный в коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор” под регистрационным номером №VB-04.1. The strain of measles virus NovO / 96 for producing antigen - a component of the enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of antibodies to measles virus, deposited in the collection of microorganism cultures of the State Scientific Center for Virology and Biotechnology "Vector" under registration number No. VB-04. 2. Иммуноферментная тест-система для диагностики антител к вирусу кори, включающая планшет с иммобилизованным инактивированным антигеном вируса кори, концентрат фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБ-Т), блокирующий раствор; цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР); ортофенилендиамин (ОФД), жидкую положительную контрольную сыворотку (К+), жидкую отрицательную контрольную сыворотку (К-), антитела против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена (конъюгат) в жидкой форме, жидкий стоп-реагент, отличающаяся тем, что в качестве иммобилизованного инактивированного антигена вируса кори тест-система содержит высокоочищенный антиген, приготовленный на основе штамма вируса кори NovO/96 (регистрационный номер №VB-04).2. An enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of measles virus antibodies, including a tablet with immobilized inactivated measles virus antigen, phosphate-buffered saline with tween (FSB-T), blocking solution; citrate-phosphate buffer solution for a substrate with hydrogen peroxide (CFR); orthophenylenediamine (CRF), liquid positive control serum (K +), liquid negative control serum (K-), antibodies against human immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase (conjugate) in liquid form, a liquid stop reagent, characterized in that as immobilized the inactivated measles antigen test system contains a highly purified antigen prepared on the basis of the measles virus strain NovO / 96 (registration number No. VB-04).

Images