RU2222003C2 - Method of biological testing of natural water, sewage and aqueous solutions - Google Patents

Abstract

FIELD: biological testing. SUBSTANCE: proposed method of biological testing includes measurement of intensity of slowed-down fluorescence of test organism in induction maximums after turning on of excitation light of high intensity first and of low intensity later. Ratio of measured values normalized to similar values measured in standard specimens carrying no toxic substances is utilized as index of phytotoxicity. Check and pilot specimens of test organism are irradiated in the course of 2 h with light with intensity of 60 W/sq m prior to measurement of slowed-down fluorescence. EFFECT: raised sensitivity and widened range of toxic compounds expose during biological testing of water. 3 tbl

Description

Изобретение относится к методам выявления токсических соединений и водных растворах. Оно может быть использовано для биотестирования токсичности природных, сточных вод и водных растворов с использованием таких тест-организмов, как микроводоросли и водные растения. The invention relates to methods for detecting toxic compounds and aqueous solutions. It can be used for biotesting the toxicity of natural, waste water and aqueous solutions using test organisms such as microalgae and aquatic plants.

Известен способ определения фитотоксичности препаратов, основанный на регистрации изменения интенсивности миллисекундного фотоиндуцируемого послесвечения (замедленной флуоресценции) хлоропластов или клеток хлореллы под действием химических соединений [1]. A known method for determining the phytotoxicity of drugs, based on the registration of changes in the intensity of the millisecond photoinduced afterglow (delayed fluorescence) of chloroplasts or chlorella cells under the action of chemical compounds [1].

Недостатком данного способа является невысокая точность измерения содержания этих веществ в анализируемых пробах, поскольку интенсивность регистрируемой замедленной флуоресценции (ЗФ) зависит не только от величины токсического действия пробы, но и от мутности и цветности анализируемого раствора, а также от количества тест-организма. The disadvantage of this method is the low accuracy of measuring the content of these substances in the analyzed samples, since the intensity of the recorded delayed fluorescence (SF) depends not only on the toxic effect of the sample, but also on the turbidity and color of the analyzed solution, as well as on the amount of the test organism.

Наиболее близким к изобретению является способ измерения пенсии фнтотоксичности химических соединений и определения их содержания и анализируемых растворах путем регистрации амплитуды индукционного максимума ЗФ водоросли хлореллы в миллисекундном интервале затухания при возбуждении светом сначала высокой, а затем низкой интенсивностью. В качестве показателя фитотоксичности используют отношение регистрируемых величин ЗФ в указанных условиях, пронормированных к контрольной пробе водоросли, не содержащей токсиканта [2] . Closest to the invention is a method of measuring the phthotoxicity pension of chemical compounds and determining their content and analyzed solutions by recording the amplitude of the induction maximum of the PF of the chlorella alga in the millisecond attenuation interval when excited by light, first with high and then low intensity. As an indicator of phytotoxicity, the ratio of the recorded values of PF under the indicated conditions, normalized to a control sample of algae that does not contain a toxicant, is used [2].

Недостатком данного способа является невозможность обнаружения токсических веществ, не оказывающих прямого воздействия на первичные реакции фотосинтеза. The disadvantage of this method is the inability to detect toxic substances that do not directly affect the primary reactions of photosynthesis.

Результатом данного изобретения является повышение чувствительности и расширение круга выявляемых токсических соединений при биотестировании воды. The result of this invention is to increase the sensitivity and expand the range of detectable toxic compounds during biotesting of water.

Указанный результат достигается тем, что в способе биотестирования природных, сточных вод и водных растворов, включающем измерение интенсивности замедленной флуоресценции тест-организма в индукционных максимумах после включения возбуждающего света высокой, а потом низкой интенсивности, при этом в качестве показателя фитотоксичности используют отношение этих величин, пронормированных к аналогичным величинам, измеренным на контрольных образцах, не содержащих токсичных веществ, согласно изобретению перед измерением замедленной флуоресценции контрольные и опытные пробы тест-организма в течение 2 часов облучают светом интенсивностью 60 Вт/м. This result is achieved by the fact that in the method of biotesting natural, wastewater and aqueous solutions, including measuring the intensity of the delayed fluorescence of the test organism at induction maxima after turning on exciting light of high and then low intensity, the ratio of these values is used as an indicator of phytotoxicity, normalized to the same values measured on control samples containing no toxic substances according to the invention before measuring the delayed fluo estsentsii control and experimental sample test organism for 2 hours irradiated with light intensity of 60 W / m.

В таблице 1 представлена зависимость токсического эффект раствора сульфата меди от времени предварительной экспонирования тест-культуры водоросли хлорелла в темноте и на свету. Коэффициент токсичности определяется по формуле

где (ЗФв/ЗФн)опыт - отношение интенсивностей ЗФ суспензии водоросли в среде с токсикантом, возбуждаемой светом высокой (80 Вт/м²) и низкой (7 Вт/м²) интенсивности;
(ЗФв/ЗФн)контроль - то же отношение для проб тест-культуры, не содержащей токсикант.Table 1 shows the dependence of the toxic effect of a solution of copper sulfate on the time of preliminary exposure of the test culture of chlorella algae in the dark and in the light. The toxicity coefficient is determined by the formula

where (ZFv / ZFn) experience is the ratio of the intensities of the ZF of the suspension of algae in a medium with a toxicant excited by light of high (80 W / m ² ) and low (7 W / m ² ) intensity;
(ZFv / ZFn) control - the same ratio for samples of a test culture that does not contain a toxicant.

Представленные данные показывают, что даже после одного часа экспонирования на свету токсичность тяжелого металла (ионов меди) существенно возрастает. Эффект усиливается при увеличении времени засветки проб тест-организма. В свою очередь, удлинение периода контакта токсиканта с клетками водоросли хлорелла при их содержании в темноте не сопровождается сколь-нибудь существенным возрастанием степени его воздействия на тест-организм. The data presented show that even after one hour of exposure to light, the toxicity of heavy metal (copper ions) increases significantly. The effect is enhanced by increasing the exposure time of the test organism samples. In turn, lengthening the period of contact of the toxicant with chlorella alga cells when they are kept in the dark is not accompanied by any significant increase in the degree of its effect on the test organism.

Увеличение чувствительности метода достигается благодаря тому, что облучение контрольных и опытных проб тест-организма достаточно интенсивным светом запускает процесс фотоингибирования фотосинтетическою аппарата. Поскольку данное явление имеет место и в естественной среде обитания растений, то для защиты от повреждения фотоассимиляционного аппарата растительными организмами выработан особый защитный механизм. Он состоит в том, что одновременно на свету начинают работать метаболические процессы, восстанавливающие нарушенные молекулярные структуры реакционных центров фотосинтетического пигментного аппарата. В нормальных условиях оба эти процесса практически полностью компенсируют друг друга, однако в присутствии ряда ксенобиотиков, блокирующих процессы репарации, последствия фотоингибирования будут выражены значительно сильнее [3]. К числу вредных для растительного тест-организма чужеродных соединений относятся и такие широко распространенные загрязнители, как ионы тяжелых металлов. При этом, подавляя рост водорослей, они оказывают лишь незначительное прямое воздействие на первичные фотосинтетические реакции, тестируемые через регистрацию замедленной флуоресценции хлорофилла. На интенсивном свету токсическое действие этих веществ на фотосинтез проявляется существенно больше за счет подавления ими многостадийных процессов ресинтеза фотоповрежденных биомолекул. В результате, как следует из таблицы 1, чувствительность биотеста на основе регистрации ЗФ водорослей и водных растений в оценки токсичности воды значительно повышается. При увеличении времени засветки показатели токсичности тестируемой пробы возрастают, однако при этом снижается оперативность самого биотеста. Простое выдерживание проб с токсикантом в темноте не сопровождается каким-либо заметным повышением чувствительности к нему тест-организма. An increase in the sensitivity of the method is achieved due to the fact that the irradiation of control and experimental samples of the test organism with sufficiently intense light starts the process of photoinhibition of the photosynthetic apparatus. Since this phenomenon also occurs in the natural habitat of plants, a special protective mechanism has been developed to protect plant organisms from damage to the photoassimilation apparatus. It consists in the fact that at the same time metabolic processes begin to work in the light, restoring the broken molecular structures of the reaction centers of the photosynthetic pigment apparatus. Under normal conditions, both of these processes almost completely cancel each other out; however, in the presence of a number of xenobiotics that block repair processes, the effects of photoinhibition will be much more pronounced [3]. Foreign compounds harmful to the plant test organism include such widespread pollutants as heavy metal ions. At the same time, suppressing the growth of algae, they have only a slight direct effect on the primary photosynthetic reactions, tested through registration of the delayed fluorescence of chlorophyll. In intense light, the toxic effect of these substances on photosynthesis manifests itself significantly more due to their suppression of the multi-stage processes of resynthesis of photo-damaged biomolecules. As a result, as follows from Table 1, the sensitivity of the biotest based on the registration of PF of algae and aquatic plants in assessing water toxicity is significantly increased. With an increase in exposure time, the toxicity indices of the test sample increase, however, the biotest itself decreases its efficiency. Simple aging of samples with a toxicant in the dark is not accompanied by any noticeable increase in the sensitivity of the test organism to it.

Пример 1. В несколько флаконов вносят по 6 мл раствора хлорида кадмия в концентрации 0,2 мг/л (в расчете на ион Cd) и по 1 мл суспензии хлорелла оптической плотности 0,6 при длине волны 660 нм и толщине слоя 1 см. Часть флаконов устанавливают в устройство для выращивания микроводорослей [4], обеспечивающего одинаковые световые условия для всех проб тест-организма, где подвергают двухчасовому облучению светом интенсивностью 60 Вт/м². Вторая часть проб экспонируется в течение того же времени в темноте. Аналогичный эксперимент проводят с зеленой водорослью селенаструм, а также с водным растением ряска. Последняя вносится во флаконы с тестируемыми растворами по три растения в каждый.Example 1. In several vials, 6 ml of a solution of cadmium chloride at a concentration of 0.2 mg / L (calculated as Cd ion) and 1 ml of a suspension of chlorella of optical density 0.6 at a wavelength of 660 nm and a layer thickness of 1 cm are added. Some of the bottles are installed in a device for growing microalgae [4], which provides the same light conditions for all samples of the test organism, where they are subjected to two-hour irradiation with 60 W / m ² light. The second part of the samples is exposed during the same time in the dark. A similar experiment is carried out with green algae selenastrum, as well as with an aquatic duckweed plant. The latter is introduced into vials with test solutions of three plants each.

После экспозиции 4 мл содержимого каждого флакона вносят в кюветы прибора для измерения интенсивности замедленной флуоресценции на высоком и низком возбуждающем свету [2] . После вычисления отношения ЗФв к ЗФн рассчитывают коэффициент токсичности КТ. Результаты экспериментов, представленные в таблице 2, показывают, что токсичность раствора данного тяжелого металла, определяемая методом регистрации ЗФ, существенно выше для проб тест-организмов, подвергнутых предварительной световой засветке. After exposure, 4 ml of the contents of each vial is introduced into the cuvettes of the device for measuring the intensity of delayed fluorescence in high and low exciting light [2]. After calculating the ratio of ZFv to ZFn, the toxicity coefficient of CT is calculated. The experimental results presented in table 2 show that the toxicity of the solution of this heavy metal, determined by the method of registration of SF, is significantly higher for samples of test organisms subjected to preliminary light exposure.

Пример 2. В несколько флаконов вносят по 6 мл проб воды, взятых на входе (до очистки) и выходе (после очистки) правобережных очистных сооружениях г. Красноярска, а также из русла р.Енисей. К пробам добавляют по 1 мл суспензии водоросли хлорелла оптической плотности 0,6. Часть флаконов, аналогично примеру 1, подвергают двухчасовому облучению светом интенсивностью 60 Вт/м², а вторую часть проб экспонируют в темноте.Example 2. 6 ml of water samples taken at the inlet (before treatment) and at the outlet (after treatment) of the right-bank treatment facilities of the city of Krasnoyarsk, as well as from the channel of the Yenisei river, are added to several bottles. To the samples add 1 ml of a suspension of chlorella seaweed with an optical density of 0.6. Part of the vials, analogously to example 1, is subjected to a two-hour exposure to light with an intensity of 60 W / m ² , and the second part of the samples exposed in the dark.

После экспозиции проводят измерение интенсивности ЗФ и расчет КТ, как описано в примере 1. Результаты экспериментов, представленные в таблице 3, показывают, что токсический эффект проб природной и сточной воды заметно выше по отношению к клеткам водоросли, на которые предварительно воздействовали интенсивным светом. After exposure, a measurement of the intensity of PF and calculation of CT is carried out, as described in Example 1. The experimental results presented in Table 3 show that the toxic effect of samples of natural and waste water is noticeably higher with respect to algae cells that were previously exposed to intense light.

Представленные данные свидетельствуют о том, что предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность метода биотестирования воды, а также расширить круг выявляемых токсичных соединений. The data presented indicate that the proposed method allows to increase the sensitivity of the method of biotesting water, as well as expand the range of detected toxic compounds.

Источники информации
1. А.с. СССР 492805, G 01 N 33/00, 1975. Бюл. 13.Sources of information
1. A.S. USSR 492805, G 01 N 33/00, 1975. Bull. thirteen.

2. Патент на изобретение РФ 2069851, G 01 N 21/64, 1992. Бюл. 33 от 27.11.96 г. (прототип). 2. Patent for the invention of the Russian Federation 2069851, G 01 N 21/64, 1992. Bull. 33 dated November 27, 1996 (prototype).

3. Полынов В.А., Маторин Д.Н., Вавилин Д.В., Венедиктов П.С. // Физиология растений, 1993. Т. 40. 5. 3. Polynov V.A., Matorin D.N., Vavilin D.V., Venediktov P.S. // Plant Physiology, 1993.V. 40.5.

4. Патент на изобретение РФ 2165973, С 12 М 3/00, 1999. Бюл. 10 от 10.04.01 г. 4. Patent for the invention of the Russian Federation 2165973, C 12 M 3/00, 1999. Bull. 10 from 04/10/01

Claims (1)

Способ биотестирования природных, сточных вод и водных растворов, включающий измерение интенсивности замедленной флуоресценции тест-организма в индукционных максимумах после включения возбуждающего света высокой, а потом низкой интенсивности, при этом в качестве показателя фитотоксичности используют отношение измеренных величин, пронормированных к аналогичным величинам, измеренным на контрольных образцах, не содержащих токсичных веществ, отличающийся тем, что перед измерением замедленной флуоресценции контрольные и опытные пробы тест-организма в течение 2 ч облучают светом интенсивностью 60 Вт/м².A method of biotesting natural, waste water and aqueous solutions, including measuring the intensity of the slowed down fluorescence of a test organism at induction maxima after turning on exciting light of high and then low intensity, while the ratio of measured values normalized to similar values measured on control samples containing no toxic substances, characterized in that before measuring delayed fluorescence control and experimental samples the test organism is irradiated with light with an intensity of 60 W / m ² for 2 hours.

Images