RU2216593C2

RU2216593C2 - Receptor body specifically binding ligand tie-2, isolated nucleic acid molecule, plasmid, pharmaceutical composition and method for prevention or attenuation of neovascularization in mammals

Info

Publication number: RU2216593C2
Application number: RU2001114528A
Authority: RU
Inventors: Сэмюэль ДЭВИС; Джоан БРУНО; Митчелл ГОЛДФАРБ; Томас Х. ОЛДРИЧ; Питер С. МЭЙСОНПЬЕР; Чеслав РАДЗИЕВСКИ; Памела Ф. ДЖОНС; Джордж Д. Янкопулос
Original assignee: Ридженерон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 2003-11-20

Abstract

FIELD: genetic engineering, medicine. SUBSTANCE: invention relates to the prepared receptor body that is able to bind specifically ligand TIE-2 that comprises extracellular moiety of receptor TIE-2 fused with constant region of human immunoglobulin. Invention proposed plasmid vTIE-2/receptor body containing nucleic acid for expression of receptor body. Pharmaceutical composition contains effective amount of receptor body TIE-2 that is used in method for prevention or attenuation of neovascularization in mammals. Invention provides carrying out diagnosis and treatment of disease concerning endothelial cells comprising receptors TIE-2. Invention provides the development of diagnostic systems for identification of agonist or antagonists of receptor TIE-2. Invention relates specifically to genes encoding tyrosine kinase receptors and can be used for diagnosis. EFFECT: valuable properties of receptor body. 6 cl, 12 dwg, 12 ex

Description

Описание
Эта международная заявка заявляет приоритет находящихся на одновременном рассмотрении заявок США: 418595, поданной 6 апреля 1995, 373579, поданной 17 января 1995, 353503, поданной 9 декабря 1994, 348492, поданной 2 декабря 1994, 330261, поданной 27 октября 1994, 319932, поданной 7 октября 1994, содержания каждой из которых включены сюда по ссылке. В описании имеются ссылки на различные публикации. Содержание этих публикаций целиком включено в рассматриваемую заявку по ссылке.Description
This international application claims the priority of pending U.S. applications: 418595, filed April 6, 1995, 373579, filed January 17, 1995, 353503, filed December 9, 1994, 348492, filed December 2, 1994, 330261, filed October 27, 1994, 319932, filed October 7, 1994, the contents of each of which are incorporated here by reference. In the description there are links to various publications. The contents of these publications are incorporated by reference in their entirety.

Введение
В общих чертах настоящее изобретение относится к области генной инженерии, более конкретно к генам рецепторов тирозинкиназ и их родственных лигандов, к их встраиванию в рекомбинантные ДНК векторы и к получению кодируемых протеинов в реципиентных штаммах микроорганизмов и реципиентных эукариотных клетках. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым лигандам, известным как TIE-2 лиганды, которые связывают TIE-2 рецептор, а также к способам получения этих TIE-2 лигандов. В настоящем изобретении предложены также последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие TIE-2 лиганды, и способы получения нуклеиновых кислот, кодирующих эти TIE-2 лиганды и их генные продукты. TIE-2 лиганды, также как и кодирующие их нуклеиновые кислоты, могут быть полезны в диагностике и лечении некоторых заболеваний, затрагивающих эндотелиальные клетки и соответствующие TIE рецепторы, такие, как неопластичные заболевания, включая опухолевый ангиогенез, лечение ран, тромбоэмболические заболевания, атеросклероз и воспалительные заболевания. В более общем плане биологически активные TIE-2 лиганды можно использовать для промотирования роста, выживания и/или дифференциации клеток, экспрессирующих TIE-2 рецептор. Биологически активный TIE-2 лиганд можно использовать для ин витро поддержания культуры клеток, экспрессирующих TIE-2 рецептор. Клетки и ткани, экспрессирующие TIE-2 рецептор, включают, например, эндотелиальные клетки сердца и сосудов, эпителий хрусталика и эпикард сердца. В другом варианте такой лиганд можно использовать для поддержки клеток, которые сконструированы для экспрессии TIE-2 рецептора. Далее, TIE-2 лиганды и соответствующие им рецепторы можно использовать в аналитических системах для идентификации агонистов или антагонистов TIE-2 рецептора.Introduction
In general terms, the present invention relates to the field of genetic engineering, more specifically to genes of tyrosine kinase receptors and their related ligands, to their incorporation into recombinant DNA vectors, and to the production of encoded proteins in recipient strains of microorganisms and recipient eukaryotic cells. More specifically, the present invention relates to new ligands known as TIE-2 ligands that bind the TIE-2 receptor, as well as to methods for producing these TIE-2 ligands. The present invention also provides nucleic acid sequences encoding TIE-2 ligands, and methods for producing nucleic acids encoding these TIE-2 ligands and their gene products. TIE-2 ligands, as well as nucleic acids encoding them, can be useful in the diagnosis and treatment of certain diseases affecting endothelial cells and corresponding TIE receptors, such as neoplastic diseases, including tumor angiogenesis, wound healing, thromboembolic diseases, atherosclerosis, and inflammatory diseases. More generally, biologically active TIE-2 ligands can be used to promote the growth, survival and / or differentiation of cells expressing the TIE-2 receptor. The biologically active TIE-2 ligand can be used to in vitro maintain a culture of cells expressing the TIE-2 receptor. Cells and tissues expressing the TIE-2 receptor include, for example, endothelial cells of the heart and blood vessels, lens epithelium and cardiac epicardium. In another embodiment, such a ligand can be used to support cells that are designed to express the TIE-2 receptor. Further, TIE-2 ligands and their corresponding receptors can be used in assay systems to identify TIE-2 receptor agonists or antagonists.

Предпосылки изобретения
Поведение клеток, ответственных за развитие, сохранение и восстановление дифференцированных клеток и тканей регулируется, в значительной степени, за счет межклеточных сигналов, передаваемых за счет факторов роста и аналогичных лигандов и их рецепторов. Эти рецепторы расположены на поверхности соответствующих клеток, и они связывают пептиды или полипептиды, известные как факторы роста, а также другие гормоноподобные лиганды. Результатом такого взаимодействия являются быстрые биохимические изменения в соответствующих клетках, а также быстрая и длительная перестройка экспрессии клеточных генов. Некоторые рецепторы, связанные с различными клеточными поверхностями, могут связывать специфические факторы роста.BACKGROUND OF THE INVENTION
The behavior of cells responsible for the development, preservation and restoration of differentiated cells and tissues is regulated, to a large extent, due to intercellular signals transmitted by growth factors and similar ligands and their receptors. These receptors are located on the surface of their respective cells, and they bind peptides or polypeptides, known as growth factors, as well as other hormone-like ligands. The result of this interaction is rapid biochemical changes in the corresponding cells, as well as a quick and long-lasting rearrangement of the expression of cell genes. Some receptors associated with various cell surfaces can bind specific growth factors.

Фосфорилирование тирозинов на протеинах за счет тирозинкиназ представляет одну из ключевых схем, за счет которых сигналы передаются через плазменную мембрану. Некоторые известные в настоящее время гены протеина тирозинкиназы кодируют трансмембранные рецепторы полипептидных факторов роста и гормонов, таких, как эпидермальный фактор роста (EGF), инсулин, инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), факторы роста, полученные из тромбоцитов (PDGF-A u -В) и факторы роста фибробластов (FGFs). (Heldin et al., Cell Regulation, 1: 555-566 (1990); Ullrich et al., Cell, 61: 243-54 (1990)). Tyrosine phosphorylation on proteins due to tyrosine kinases is one of the key schemes through which signals are transmitted through the plasma membrane. Some currently known tyrosine kinase protein genes encode transmembrane receptors for polypeptide growth factors and hormones such as epidermal growth factor (EGF), insulin, insulin-like growth factor (IGF-1), platelet derived growth factors (PDGF-A u - C) and fibroblast growth factors (FGFs). (Heldin et al., Cell Regulation, 1: 555-566 (1990); Ullrich et al., Cell, 61: 243-54 (1990)).

В каждом случае эти факторы роста проявляют свое действие за счет связывания с внеклеточной частью соответствующих им рецепторов, что приводит к активации внутренней тирозинкиназы, которая присутствует на цитоплазмической части рецептора. Рецепторы факторов роста эндотелиальных клеток представляют особый интерес за счет возможного вовлечения факторов роста в ряд важных физиологических и патологических процессов, таких, как васкулогенез, ангиогенез, атеросклероз и воспалительные заболевания. (Folkman et al., Science, 235: 442-447 (1987)). Кроме того, рецепторы некоторых гемопоэтических факторов роста являются тирозинкиназами; они включают c-fms, который представляет рецептор фактора 1, стимулирующего колонии, Sherr et al., Cell, 41: 665-676 (1985), u c-kit, рецептор примитивного гемопоэтического фактора роста, о котором сообщает Huang et al., Cell, 63: 225-33 (1990). In each case, these growth factors exert their effect by binding to the extracellular part of their corresponding receptors, which leads to the activation of the internal tyrosine kinase, which is present on the cytoplasmic part of the receptor. Endothelial cell growth factor receptors are of particular interest due to the possible involvement of growth factors in a number of important physiological and pathological processes, such as vasculogenesis, angiogenesis, atherosclerosis, and inflammatory diseases. (Folkman et al., Science, 235: 442-447 (1987)). In addition, the receptors of certain hematopoietic growth factors are tyrosine kinases; they include c-fms, which is a colony stimulating factor receptor 1, Sherr et al., Cell, 41: 665-676 (1985), u c-kit, a primitive hematopoietic growth factor receptor reported by Huang et al., Cell, 63: 225-33 (1990).

Рецепторы тирозинкиназ подразделяют на эволюционные подсемейства на основе характеристических структур их эктодоменов. (Ullrich et al., Cell, 61: 243-54 (1990)). Такие подсемейства включают EGF рецептороподобную киназу (подкласс I) и подобную рецептору инсулина киназу (подкласс II), каждая из которых содержит повторенные гомологичные последовательности с высоким содержанием цистеина в своих внеклеточных доменах. Отдельный участок с высоким содержанием цистеина обнаружен также во внеклеточных доменах eph-подобных киназ. Hirai et al., Science, 238: 1717-1720 (1987); Lindberg et al., Mol. Cell Biol. , 10: 6316-24 (1990); Lhotak et al., Mol. Cell Biol., 11: 2496-2502 (1991). PDGF рецепторы а также c-fms и c-kit рецепторы тирозинкиназ можно сгруппировать в подкласс III, тогда как FGP рецепторы образуют подкласс IУ. Типичным для членов обоих этих подклассов являются внеклеточные складывающиеся фрагменты, стабилизированные внутрицепными дисульфидными связями. Такие так называемые иммуноглобулин (Ig)-подобные складки обнаружены в протеинах иммуноглобулинового суперсемейства, которое включает широкий круг других рецепторов клеточных поверхностей, имеющих либо связанные с клетками, либо растворимые лиганды. Williams et al., Ann. Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988). Tyrosine kinase receptors are divided into evolutionary subfamilies based on the characteristic structures of their ectodomains. (Ullrich et al., Cell, 61: 243-54 (1990)). Such subfamilies include an EGF receptor-like kinase (subclass I) and an insulin-like kinase (subclass II), each of which contains repeated homologous sequences with a high cysteine content in their extracellular domains. A separate site with a high cysteine content was also found in the extracellular domains of eph-like kinases. Hirai et al., Science, 238: 1717-1720 (1987); Lindberg et al., Mol. Cell Biol. 10: 6316-24 (1990); Lhotak et al., Mol. Cell Biol., 11: 2496-2502 (1991). PDGF receptors as well as c-fms and c-kit tyrosine kinase receptors can be grouped into subclass III, while FGP receptors form subclass IU. Typical for members of both of these subclasses are extracellular folding fragments stabilized by intrachain disulfide bonds. Such so-called immunoglobulin (Ig) -like folds are found in proteins of the immunoglobulin superfamily, which includes a wide range of other cell surface receptors that have either cell-bound or soluble ligands. Williams et al., Ann. Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988).

Рецепторы тирозинкиназ отличаются по своей специфичности и афинности. Обычно рецепторы тирозинкиназ являются гликопротеинами, которые состоят из (1) внеклеточного домена, способного связывать специфически фактор (факторы) роста; (2) трансмембранного домена, который обычно является альфа-спиральной частью протеина; (3) юкстамембранного домена, где рецептор может регулироваться, например, за счет фосфорилирования протеина; (4) домена тирозинкиназы, который является энзиматическим компонентом рецептора, и (5) карбокситерминального хвоста, который во многих рецепторах участвует в распознавании и связывании с субстратами для тирозинкиназы. Tyrosine kinase receptors differ in their specificity and affinity. Typically, tyrosine kinase receptors are glycoproteins that consist of (1) an extracellular domain capable of binding specific growth factor (s); (2) a transmembrane domain, which is usually the alpha-helical part of the protein; (3) the juxtamembrane domain, where the receptor can be regulated, for example, by protein phosphorylation; (4) the tyrosine kinase domain, which is an enzymatic component of the receptor, and (5) the carboxyterminal tail, which is involved in the recognition and binding of tyrosine kinase substrates in many receptors.

Сообщается, что такие процессы, как альтернативный экзонный сплайсинг и альтернативный выбор генного промотора или сайтов полиаденилирования, способны привести к образованию нескольких различных полипептидов из одного и того же гена. Такие полипептиды могут содержать (или могут не содержать) различные домены, перечисленные ранее. Как следствие, некоторые внеклеточные домены могут быть экспрессированы как отдельные секретируемые протеины, и некоторые формы рецепторов могут не содержать домена тирозинкиназы, а содержать только внеклеточный домен, встроенный в плазменную мембрану за счет трансмембранного домена плюс короткого карбокситерминального хвоста. It is reported that processes such as alternative exon splicing and the alternative choice of a gene promoter or polyadenylation sites can lead to the formation of several different polypeptides from the same gene. Such polypeptides may or may not contain the various domains listed above. As a result, some extracellular domains can be expressed as separate secreted proteins, and some forms of receptors may not contain a tyrosine kinase domain, but contain only the extracellular domain embedded in the plasma membrane due to the transmembrane domain plus a short carboxyterminal tail.

Ген, кодирующий эндотелиальную клеточную трансмембранную тирозинкиназу, вначале идентифицированную за счет RT-PCR как неизвестный гомологичный тирозинкиназе кДНК фрагмент из клеток лейкемии человека, описан Partanen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 8913-8917 (1990). Этот ген и кодируемый им протеин названы "tie", что является сокращением для "тирозинкиназы с доменами, гомологичными с Ig и EGF". Partanen et al., Mol. Cell Biol., 12: 1698-1707 (1992). A gene encoding endothelial cell transmembrane tyrosine kinase, initially identified by RT-PCR as an unknown homologous tyrosine kinase cDNA fragment from human leukemia cells, is described by Partanen et al., Proc. Natl. Acad Sci., USA, 87: 8913-8917 (1990). This gene and its encoded protein are called “tie,” which is short for “tyrosine kinase with domains homologous to Ig and EGF.” Partanen et al., Mol. Cell Biol., 12: 1698-1707 (1992).

Сообщалось, что tie мРНК присутствует во всех тканях плода человека и мышиного эмбриона. После изучения tie посредник был локализован в клетках сердца и в сосудистых эндотелиальных клетках, tie мРНК были локализованы в эндотелии кровесносных сусодов и эндокарде мышиных эмбрионов на 9,5-18,5 день их существования. Была показана усиленная tie экспрессия во время неоваскуляризации, связанной с развитием фолликул яичников и гранулированием тканей в кожных ранах. Korhonen et al., Blood, 80: 2548-2555 (1992). Таким образом, предполагается что tie играет роль в ангиогенезе, что важно для разработки способов лечения твердых опухолей и некоторых других заболеваний, зависящих от ангиогенеза, таких как диабетическая ретинопатия, псориаз, атеросклероз и артриты. It has been reported that tie mRNA is present in all tissues of the human fetus and mouse embryo. After studying the tie, the mediator was localized in the heart cells and in the vascular endothelial cells, the tie mRNAs were localized in the endothelium of the blood sousoses and the endocardium of mouse embryos on the 9.5-18.5 day of their existence. Enhanced tie expression has been shown during neovascularization associated with the development of ovarian follicles and granulation of tissues in skin wounds. Korhonen et al., Blood, 80: 2548-2555 (1992). Thus, it is believed that tie plays a role in angiogenesis, which is important for developing methods for treating solid tumors and some other diseases dependent on angiogenesis, such as diabetic retinopathy, psoriasis, atherosclerosis, and arthritis.

Два структурно родственных протеина TIE рецептора крыс, как сообщалось, кодируются различными генами с родственными профилями экспрессии. Один ген, названный tie-1, является крысиным гомологом tie человека. Maisonpierre et al. , Oncogene, 8: 1631-1637 (1993). Другой ген, tie-2, может быть крысиным гомологом мышиного tek гена, который подобно tie, как сообщалось, должен экспрессироваться в мышах исключительно в эндотелиальных клетках и их предположительных предшественниках. Dumout et al., Oncogene, 8: 1293-1301 (1993). Two structurally related rat TIE receptor proteins have been reported to be encoded by different genes with related expression profiles. One gene, called tie-1, is the rat homologue of human tie. Maisonpierre et al. Oncogene, 8: 1631-1637 (1993). Another gene, tie-2, may be the rat homologue of the mouse tek gene, which, like tie, was reported to be expressed in mice exclusively in endothelial cells and their putative predecessors. Dumout et al., Oncogene, 8: 1293-1301 (1993).

Как было обнаружено, оба гена широко экспрессированы в эндотелиальных клетках эмбриональных и постнатальных тканей. Значительные уровни tie-2 транскриптов присутствуют также в других популяциях эмбриональных клеток, включая эпителий хрусталика, эпикард сердца и участки мезенхимы. Maisonpierre et al., Oncogene, 8: 1631-1637 (1993). Both genes were found to be widely expressed in endothelial cells of embryonic and postnatal tissues. Significant levels of tie-2 transcripts are also present in other populations of embryonic cells, including the lens epithelium, cardiac epicardium, and mesenchyme sites. Maisonpierre et al., Oncogene, 8: 1631-1637 (1993).

Преимущественная экспрессия TIE рецептора в сосудистом эндотелии предполагает, что TIE играет роль в развитии и сохранении сосудистой системы. Сюда включены роли в детерминации, дифференциации, пролиферации эндотелиальных клеток, в миграции клеток и копировании в элементы сосудов. Сообщалось, что анализ мышиных эмбрионов с дефицитом TIE-2 показал, что TIE-2 важны для ангиогенеза, особенно для образования сети сосудов в эндотелиальных клетках. Sato T.N. et al., Nature, 376: 70-74 (1994). В зрелой сосудистой системе TIE могут функционировать как фактор выживания, сохранения эндотелиальных клеток и в реакциях на влияние патогенов. The predominant expression of the TIE receptor in the vascular endothelium suggests that TIE plays a role in the development and maintenance of the vascular system. This includes roles in the determination, differentiation, proliferation of endothelial cells, in cell migration and copying into vascular elements. An analysis of TIE-2 deficient mouse embryos has been reported to show that TIE-2 is important for angiogenesis, especially for the formation of a vascular network in endothelial cells. Sato T.N. et al., Nature, 376: 70-74 (1994). In a mature vascular system, TIEs can function as a factor in the survival, conservation of endothelial cells and in reactions to the influence of pathogens.

Краткое содержание изобретения
В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая TIE-2 лиганд, практически не содержащий других протеинов. В настоящем изобретении предложена также изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая TIE-2 лиганд. Выделенная нуклеиновая кислота может быть ДНК, кДНК или РНК. В настоящем изобретении предложен также вектор, включающий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую TIE-2 лиганд. Предложена также система хозяин-вектор для продуцирования в подходящих клетках хозяина полипептида, обладающего активностью TIE-2 лиганда. Клетки подходящих хозяев могут быть бактериальными, дрожжевыми, клетками насекомых или млекопитающих. В настоящем изобретении предложен также способ получения полипептида, обладающего биологической активностью TIE-2 лиганда, который включает выращивание клеток системы хозяин-вектор в условиях, обеспечивающих продуцирование полипептида и выделение полученного таким образом полипептида.Summary of invention
The present invention provides a composition comprising a TIE-2 ligand substantially free of other proteins. The present invention also provides an isolated nucleic acid molecule encoding a TIE-2 ligand. An isolated nucleic acid may be DNA, cDNA or RNA. The present invention also provides a vector comprising an isolated nucleic acid molecule encoding a TIE-2 ligand. A host-vector system is also provided for producing a polypeptide having TIE-2 ligand activity in suitable host cells. Cells of suitable hosts may be bacterial, yeast, insect or mammalian cells. The present invention also provides a method for producing a polypeptide having the biological activity of a TIE-2 ligand, which comprises growing the host-vector system cells under conditions that produce the polypeptide and isolate the polypeptide thus obtained.

Настоящее изобретение, в котором описана изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая TIE-2 лиганд, предлагает далее для развития лиганда фрагмент или производное его, или другую молекулу, которая является агонистом или антагонистом рецептора, в качестве терапевтического агента для лечения пациентов, страдающих нарушениями, включающими клетки, ткани или органы, которые экспрессируют TIE рецептор. В настоящем изобретении предложено также антитело, которое специфически связывает такую терапевтическую молекулу. Это антитело может быть моноклональным или поликлональным. В настоящем изобретении предложен также способ использования такого моноклонального или поликлонального антитела для определения количества терапевтических молекул в образце, взятом у пациента с целью контроля за ходом лечения. The present invention, which describes an isolated nucleic acid molecule encoding a TIE-2 ligand, further provides a ligand for development of a fragment or derivative thereof, or another molecule that is a receptor agonist or antagonist, as a therapeutic agent for treating patients suffering from disorders including cells, tissues, or organs that express the TIE receptor. The present invention also provides an antibody that specifically binds such a therapeutic molecule. This antibody may be monoclonal or polyclonal. The present invention also provides a method of using such a monoclonal or polyclonal antibody to determine the number of therapeutic molecules in a sample taken from a patient in order to monitor the course of treatment.

В настоящем изобретении предложено также антитело, которое специфически связывает ТIЕ-2 лиганд. Это антитело может быть моноклональным или поликлональным. Таким образом, настоящее изобретение предлагает также терапевтические композиции, включающие антитело, которое специфически связывает TIE-2 лиганд, в фармацевтически приемлемом носителе. В настоящем изобретении предложен также способ блокирования роста кровеносных сосудов у млекопитающих за счет введения эффективного количества терапевтической композиции, включающей антитело, которое специфически связывает TIE-2 лиганд, в фармацевтически приемлемом носителе. The present invention also provides an antibody that specifically binds a TIE-2 ligand. This antibody may be monoclonal or polyclonal. Thus, the present invention also provides therapeutic compositions comprising an antibody that specifically binds a TIE-2 ligand in a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention also provides a method for blocking blood vessel growth in mammals by administering an effective amount of a therapeutic composition comprising an antibody that specifically binds a TIE-2 ligand in a pharmaceutically acceptable carrier.

В настоящем изобретении предложена далее терапевтическая композиция, включающая TIE-2 лиганд в фармацевтически приемлемом носителе. В настоящем изобретении предложен также способ промотирования неоваскуляризации у пациента, за счет введения ему эффективного количества терапевтической композиции, содержащей TIE-2 лиганд, в фармацевтически приемлемом носителе. В одном варианте способ можно использовать для промотирования заживления ран. В другом варианте способ можно использовать для лечения ишемии. The present invention further provides a therapeutic composition comprising a TIE-2 ligand in a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention also provides a method for promoting neovascularization in a patient by administering to him an effective amount of a therapeutic composition containing a TIE-2 ligand in a pharmaceutically acceptable carrier. In one embodiment, the method can be used to promote wound healing. In another embodiment, the method can be used to treat ischemia.

В другом варианте в настоящем изобретении предложен вариант, в котором ТIЕ-2 лиганд может быть конъюгирован с цитотоксическим агентом, и на основании этого может быть приготовлена терапевтическая композиция. В настоящем изобретении предложено также рецепторное тело, которое специфически связывает TIE-2 лиганд. В настоящем изобретении предложена терапевтическая композиция, включающая рецепторное тело, которое специфически связывает TIE-2 лиганд, в фармацевтически приемлемом носителе. Предложен также способ блокирования роста кровеносных сосудов у млекопитающих за счет введения эффективного количества терапевтической композиции, включающей рецепторное тело, которое специфически связывает TIE-2 лиганд, в фармацевтически приемлемом носителе. In another embodiment, the present invention provides an embodiment in which the TIE-2 ligand can be conjugated to a cytotoxic agent, and based on this, a therapeutic composition can be prepared. The present invention also provides a receptor body that specifically binds a TIE-2 ligand. The present invention provides a therapeutic composition comprising a receptor body that specifically binds a TIE-2 ligand in a pharmaceutically acceptable carrier. A method is also proposed for blocking the growth of blood vessels in mammals by administering an effective amount of a therapeutic composition comprising a receptor body that specifically binds a TIE-2 ligand in a pharmaceutically acceptable carrier.

В настоящем изобретении предложен также антагонист TIE-2 рецептора, а также способ ингибирования биологической активности TIE-2 лиганда у млекопитающих, включающий введение млекопитающему эффективного количества TIE-2 антагониста. В соответствии с изобретением антагонистом может быть антитело или другая молекула, способная к специфическому связыванию либо TIE-2 лиганда, либо TIE-2 рецептора. Так, например, антагонистом может быть TIE-2 рецепторное тело. The present invention also provides a TIE-2 receptor antagonist, as well as a method for inhibiting the biological activity of a TIE-2 ligand in mammals, comprising administering to the mammal an effective amount of a TIE-2 antagonist. According to the invention, the antagonist may be an antibody or other molecule capable of specifically binding either a TIE-2 ligand or a TIE-2 receptor. So, for example, a TIE-2 receptor body can be an antagonist.

Краткое описание чертежей
Фиг. 1А и 1В: TIE-2 рецепторное тело (TIE-2 РВ) ингибирует развитие кровеносных сосудов в хориоаллантоевой мембране цыпленка (САМ). Отдельный кусочек поглощающей гелеобразной пены (Gelfoam), смоченный 6 мкг PBS, вводят немедленно под САМ однодневных эмбрионов цыпленка. После трех дней инкубирования четырехдневные эмбрионы и окружающие их САМ удаляют и исследуют. Фиг. 1А: эмбрионы, обработанные ЕНК-1 RB/ rЕНК-1 экто/h IgGl Fc/, оказались жизнеспособными и обладали нормально развитыми кровеносными сосудами в окружающих их САМ. Фиг.1В: все эмбрионы, обработанные TIE-2 RB (r TIE-2 экто/h IgGl Fc), погибли, уменьшившись в размере и были почти полностью лишены окружающих кровеносных сосудов.Brief Description of the Drawings
FIG. 1A and 1B: TIE-2 receptor body (TIE-2 PB) inhibits the development of blood vessels in the chorioallantoic membrane of chicken (CAM). A separate piece of absorbent gel-like foam (Gelfoam) moistened with 6 μg of PBS is injected immediately under the CAM of one-day chicken embryos. After three days of incubation, the four-day embryos and the CAMs surrounding them are removed and examined. FIG. 1A: embryos treated with ENK-1 RB / rENK-1 ecto / h IgGl Fc / were viable and had normally developed blood vessels in the surrounding CAMs. Figv: all embryos treated with TIE-2 RB (r TIE-2 ecto / h IgGl Fc) died, decreasing in size and were almost completely devoid of surrounding blood vessels.

Фиг.2: вектор pJFE14. Figure 2: vector pJFE14.

Фиг.3: рестрикционная карта λgt10. Figure 3: restriction map λgt10.

Фиг. 4: последовательности нуклеиновой кислоты и выделенной аминокислоты (однобуквенный код) человеческого TIE-2 лиганда из клона λgt10, кодирующие htie-2 лиганд 1. FIG. 4: nucleic acid and isolated amino acid sequences (single letter code) of human TIE-2 ligand from clone λgt10 encoding htie-2 ligand 1.

Фиг. 5: последовательности нуклеиновой кислоты и выделенной аминокислоты (однобуквенный код) человеческого TIE-2 лиганда из T98G клона. FIG. 5: nucleic acid and isolated amino acid sequences (single letter code) of the human TIE-2 ligand from the T98G clone.

Фиг. 6: последовательности нуклеиновой кислоты и выделенной аминокислоты (однобуквенный код) человеческого TIE-2 лиганда из клона pBluescript KS, кодирующие человеческий TIE-2 лиганд 2. FIG. 6: nucleic acid and isolated amino acid sequences (single letter code) of human TIE-2 ligand from pBluescript KS clone encoding human TIE-2 ligand 2.

Фиг.7: результаты Вестерн-блоттинга, демонстрирующие активацию ТIЕ-2 рецептора за счет TIE-2 лиганда 1 (полоса L1), но не за счет TIE-2 лиганда 2 (полоса L2), контроль (МОСК) активация также отсутствует. Fig. 7: Western blot results showing activation of the TIE-2 receptor due to TIE-2 ligand 1 (L1 band), but not due to TIE-2 ligand 2 (L2 band), control (ISKCON) activation is also absent.

Фиг. 8: результаты Вестерн-блоттинга, демонстрирующие, что предварительная обработка НАЕС клеток избытком TIE-2 лиганда 2 (полоса 2) препятствует последующей способности разбавленного TIE-2 лиганда 1 активировать TIE-2 рецептор (TIE-2-R) по сравнению с тем, что происходит при предварительной обработке НАЕС клеток MOCK средой (полоса 1). FIG. 8: Western blotting results demonstrating that pretreatment of HAEC cells with an excess of TIE-2 ligand 2 (lane 2) inhibits the subsequent ability of diluted TIE-2 ligand 1 to activate the TIE-2 receptor (TIE-2-R) compared to what happens during pretreatment of HAEC MOCK cells with medium (lane 1).

Фиг. 9: гистограммное представление связывания с иммобилизованной поверхностью крысиного TIE2 IgG TIE2 лиганда в С2С12 ras, Rat2 ras, SHEP и T98G концентрированной (10х) кондиционированной среде. Специфическое связывание крысиных TIE2 (rТ1Е2) демонстрируется значительным снижением связывающей активности в присутствии 25 мкг/мл растворимых TIE2 RB по сравнению с меньшим снижением в присутствии растворимых trkB RB. FIG. 9: A bar graph representation of the binding to the immobilized surface of rat TIE2 IgG TIE2 ligand in C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP and T98G concentrated (10x) conditioned medium. The specific binding of rat TIE2 (rT1E2) is demonstrated by a significant decrease in binding activity in the presence of 25 μg / ml of soluble TIE2 RB compared to a smaller decrease in the presence of soluble trkB RB.

Фиг. 10: связывание рекомбинантного человеческого TIE-2 лиганда 1 (hTL1) и человеческого TIE-2 лиганда 2 (hTL2) в cos клеточных надосадочных жидкостях с иммобилизованной поверхностью человеческих TIE-2 RB. Специфическое связывание человеческих TIE-2 определяют, инкубируя образцы по 25 мгк/мл либо растворимого человеческого TIE2 RB, либо trkB RB; значительное снижение активности связывания наблюдается не только для образцов, инкубированных с TIE2 RB человека. FIG. 10: binding of recombinant human TIE-2 ligand 1 (hTL1) and human TIE-2 ligand 2 (hTL2) in cos cell supernatants with the immobilized surface of human TIE-2 RB. The specific binding of human TIE-2 is determined by incubating samples at 25 μg / ml of either soluble human TIE2 RB or trkB RB; a significant decrease in binding activity is observed not only for samples incubated with human TIE2 RB.

Фиг. 11: результаты Вестерн-блоттинга, демонстрирующие, что TIE-2 рецепторное тело (обозначенное TIE-2 RB или, как здесь, TIE2-Fc) блокирует активацию TIE-2 рецепторов за счет TIE-2 лиганда 1 (TL1) в HUVEC клетках, тогда как неродственное рецепторное тело (TRKB-Fc) не блокирует эту активацию. FIG. 11: Western blot results demonstrating that the TIE-2 receptor body (designated TIE-2 RB or, as here, TIE2-Fc) blocks the activation of TIE-2 receptors due to TIE-2 ligand 1 (TL1) in HUVEC cells, whereas an unrelated receptor body (TRKB-Fc) does not block this activation.

Подробное описание изобретения
Как будет более подробно описано далее, заявители выделили за счет экспрессионного клонирования новый лиганд, который связывает TIE-2 рецептор. Настоящее изобретение включает TIE-2 лиганд, а также его аминокислотную последовательность и также функционально эквивалентные молекулы, в которых аминокислотные остатки замещены на остатки внутри последовательности, приводящие к молчащему изменению. Так, например, один или более из аминокислотных остатков в последовательности можно заменить другой аминокислотой (аминокислотами) аналогичной полярности, которая действует как функциональный эквивалент, и получить молчащую замену. Заместители аминокислот в последовательности можно выбрать из других членов того класса, к которому принадлежит эта аминокислота. Так, например, класс неполярных (гидрофобных) аминокислот включает аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Позитивно заряженные (основные) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. В объем настоящего изобретения включены также протеины, или их фрагменты, или производные, которые демонстрируют такие же или сходные биологические активности, и производные, которые дифференциально модифицированы во время или после трансляции, например, за счет гликозилирования, протеолитического расщепления, связывания с молекулой антитела или другим клеточным лигандом и т.д.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As will be described in more detail below, the applicants isolated a new ligand that binds the TIE-2 receptor by expression cloning. The present invention includes the TIE-2 ligand, as well as its amino acid sequence and also functionally equivalent molecules in which amino acid residues are replaced by residues within the sequence, resulting in a silent change. So, for example, one or more of the amino acid residues in the sequence can be replaced by another amino acid (s) of the same polarity, which acts as a functional equivalent, and get a silent replacement. The amino acid substituents in the sequence can be selected from other members of the class to which this amino acid belongs. For example, the class of non-polar (hydrophobic) amino acids includes alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. Positively charged (basic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. Also included within the scope of the present invention are proteins, or fragments thereof, or derivatives that exhibit the same or similar biological activities, and derivatives that are differentially modified during or after translation, for example, by glycosylation, proteolytic cleavage, binding to an antibody molecule, or another cell ligand, etc.

Настоящее изобретение включает также нуклеотидную последовательность, которая кодирует протеин, описываемый здесь как TIE-2 лиганд 1, а также клетки, которые генетически сконструированы таким образом, чтобы продуцировать протеин, например, за счет трансфекции, трансдукции, инфицирования, электропорации или микроинъекции нуклеиновой кислоты, кодирующей TIE-2 лиганд 1, описываемый здесь, в подходящий вектор экспрессии. The present invention also includes a nucleotide sequence that encodes a protein described herein as TIE-2 ligand 1, as well as cells that are genetically engineered to produce a protein, for example, by transfection, transduction, infection, electroporation or microinjection of a nucleic acid, encoding TIE-2 ligand 1, described herein, in a suitable expression vector.

Далее настоящее изобретение охватывает нуклеотидную последовательность, кодирующую протеин, описываемый здесь как TIE-2 лиганд 2, а также клетки, которые генетически сконструированы таким образом, чтобы продуцировать протеин, например, за счет трансфекции, трансдукции, инфицирования, электропорации или микроинъекции нуклеиновой кислоты, кодирующей TIE-2 лиганд 2, описываемый здесь, в подходящий вектор экспрессии. The present invention further encompasses the nucleotide sequence encoding the protein described herein as TIE-2 ligand 2, as well as cells that are genetically engineered to produce a protein, for example, by transfection, transduction, infection, electroporation or microinjection of a nucleic acid encoding TIE-2 ligand 2, described here, in a suitable expression vector.

Специалисту должно быть ясно, что настоящее изобретение охватывает ДНК и РНК последовательности, которые гибридизуются с выделенной последовательностью, кодирующей TIE-2 лиганд, в условиях умеренной жесткости, как определено, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. , vol. 1, p. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Так, молекула нуклеиновой кислоты, рассматриваемая в настоящем изобретении, включает молекулу, имеющую последовательность, выделенную из аминокислотной последовательности TIE-2 лиганда, полученную, как указано ранее, а также молекулу, имеющую последовательность нуклеиновых кислот, которая гибридизуется с такой последовательностью нуклеиновых кислот, а также последовательность нуклеиновых кислот, которая дегенеративна в отношении вышеуказанных последовательностей как результат генетического кода, но которая кодирует лиганд, который связывает TIE-2 рецептор. It should be apparent to one skilled in the art that the present invention encompasses DNA and RNA sequences that hybridize to an isolated sequence encoding a TIE-2 ligand under conditions of moderate stringency as defined, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed . , vol. 1, p. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Thus, the nucleic acid molecule contemplated by the present invention includes a molecule having a sequence isolated from the TIE-2 ligand amino acid sequence obtained as indicated above, as well as a molecule having a nucleic acid sequence that hybridizes to such a nucleic acid sequence, and also a nucleic acid sequence that is degenerate with respect to the above sequences as a result of the genetic code, but which encodes a ligand that vyazyvaet TIE-2 receptor.

Любой из способов, известных специалистам для встраивания ДНК фрагментов в вектор, может быть использован для конструирования векторов экспрессии, кодирующих TIE-2 лиганд за счет использования соответствующих контрольных сигналов транскрипции/трансляции и кодирующих протеин последовательностей. Эти способы могут включать ин витро рекомбинантные ДНК и синтетические методики, а также ин виво рекомбинации (генетические рекомбинации). Экспрессию последовательности нуклеиновых кислот, кодирующую TIE-2 лиганд или его пептидный фрагмент, можно регулировать за счет второй последовательности нуклеиновых кислот таким образом, что протеин или пептид экспрессируется в хозяине, трансформированном рекомбинантной ДНК молекулой. Так, например, экспрессию TIE-2 лиганда, здесь описываемого, можно контролировать любым промоторным/энхансерным элементом, известным специалистам. Промоторы, которые можно использовать для контроля за экспрессией лиганда, включают (но не ограничиваются этим) длинный терминальный повтор, как описано у Squinto et al. (Cell 65: 1-20, 1991), SV40 ранний промоторный участок (Bernoist and Chambon, Nature, 290: 304-310), CMV промотор, M-MuLV 5' терминальный повтор, промотор, содержащийся в 3' длинном терминальном повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto et al., Cell, 22: 787-797, 1980), промотор гена тимидинкиназы вируса герпеса (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 78: 144-1445, 1981), промотор аденовируса, регуляторные последовательности гена металлотионеина (Brinster et al., Nature, 296: 39-42, 1982); такие прокариотные векторы экспрессии, как промотор β-лактамазы (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 75: 3727-3731, 1978) или tac промотор (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 80: 21-25, 1983), см. также "Useful proteins from recombinant bacteria" в Scientific American, 242: 74-94 (1980); промоторные элементы из дрожжей или других грибков, такие как Gal 4 промотор, ADH (алкогольдегидрогеназа) промотор, РGК (фосфоглицеринкината) промотор, промотор щелочной фосфатазы и следующие участки транскрипционного контроля животных, которые демонстрируют тканеспецифичность и были использованы в трансгенных животных: контрольный участок гена эластазы 1, который активен в ацинарных клетках поджелудочной железы (Swift et al., Cell, 38: 639-646, 1984); Ornitz et al. , Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50: 399-409, 1986); MacDonald, Hepatology, 7: 425-515 (1987); контрольный участок инсулинового гена, который активен в бета-клетках поджелудочной железы (Hanahan, Nature, 315: 115-122, 1985), контрольный участок гена иммуноглобулина, который активен в лимфоидных клетках (Grosschedl et al., 1984, Cell, 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature, 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol. , 7: 1436-1444), контрольный участок вируса мышиной опухоли молочной железы, который активен в клетках яичников, груди, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al., 1986, Сеll, 45: 485-495), контрольный участок гена альбумина, который активен в печени (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel 1: 268-276), контрольный участок гена альфа-фетопротеина, который активен в печени (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell Biol., 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science, 235: 53-58); контрольный участок гена альфа 1-антитрипсина, который активен в печени (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel, 1: 161-171), контрольный участок гена бета-глобина, который активен в миелоидных клетках (Mogram et al., 1985, Nature, 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell, 46: 89-94); контрольный участок гена основного протеина миелина, который активен в олигодендроцитных клетках мозга (Readhead et al., 1987, Cell, 48: 703-712); контрольный участок гена легкой цепи-2 миозина, который активен в скелетных мышцах (Shani, 1985, Nature, 314: 283-286), и контрольный участок гена гормона высвобождения гонадотропина, который активен в гипоталамусе (Mason et al., 1986, Science, 234: 1372-1378). Далее изобретение охватывает получение антисмысловых соединений, которые способны специфически гибридизоваться с последовательностью РНК, кодирующей TIE-2 лиганд для модулирования его экспрессии (Ecker, патент США 5166195, выданный 24 ноября 1992 г. ). Any of the methods known to those skilled in the art for embedding DNA fragments in a vector can be used to construct expression vectors encoding a TIE-2 ligand by using appropriate transcriptional / translational control signals and protein coding sequences. These methods may include in vitro recombinant DNA and synthetic techniques, as well as in vivo recombination (genetic recombination). The expression of the nucleic acid sequence encoding the TIE-2 ligand or its peptide fragment can be controlled by the second nucleic acid sequence so that the protein or peptide is expressed in a host transformed with a recombinant DNA molecule. For example, the expression of the TIE-2 ligand described herein can be controlled by any promoter / enhancer element known to those skilled in the art. Promoters that can be used to control ligand expression include, but are not limited to, a long terminal repeat, as described by Squinto et al. (Cell 65: 1-20, 1991), SV40 early promoter region (Bernoist and Chambon, Nature, 290: 304-310), CMV promoter, M-MuLV 5 'terminal repeat, promoter contained in a 3' long terminal virus repeat Routh sarcomas (Yamamoto et al., Cell, 22: 787-797, 1980), promoter of the herpes virus thymidine kinase gene (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 78: 144-1445, 1981), promoter adenovirus, regulatory sequences of the metallothionein gene (Brinster et al., Nature, 296: 39-42, 1982); prokaryotic expression vectors such as the β-lactamase promoter (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 75: 3727-3731, 1978) or the tac promoter (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad . Sci, USA, 80: 21-25, 1983), see also "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 242: 74-94 (1980); promoter elements from yeast or other fungi, such as the Gal 4 promoter, ADH (alcohol dehydrogenase) promoter, RGK (phosphoglycerin kinate) promoter, alkaline phosphatase promoter and the following animal transcriptional control sites that demonstrate tissue specificity and were used in transgenic animals: elastase gene control section 1, which is active in pancreatic acinar cells (Swift et al., Cell, 38: 639-646, 1984); Ornitz et al. , Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50: 399-409, 1986); MacDonald, Hepatology, 7: 425-515 (1987); control plot of an insulin gene that is active in pancreatic beta cells (Hanahan, Nature, 315: 115-122, 1985), control plot of an immunoglobulin gene that is active in lymphoid cells (Grosschedl et al., 1984, Cell, 38: 647 -658; Adames et al., 1985, Nature, 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol., 7: 1436-1444), a control section of a murine mammary tumor virus that is active in cells ovaries, breasts, lymphoid and mast cells (Leder et al., 1986, Sell, 45: 485-495), a control portion of the albumin gene that is active in the liver (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel 1: 268-276 ), control plot of the gene lfa-fetoprotein, which is active in liver (. Krumlauf et al, 1985, Mol Cell Biol, 5:.. 1639-1648; Hammer et al, 1987, Science, 235: 53-58.); a control region of the alpha 1-antitrypsin gene that is active in the liver (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel, 1: 161-171), a control region of the beta globin gene that is active in myeloid cells (Mogram et al., 1985 , Nature, 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell, 46: 89-94); a control portion of a gene for myelin basic protein that is active in oligodendrocyte brain cells (Readhead et al., 1987, Cell, 48: 703-712); a control portion of the myosin light chain-2 gene that is active in skeletal muscle (Shani, 1985, Nature, 314: 283-286), and a control portion of the gonadotropin releasing hormone gene that is active in the hypothalamus (Mason et al., 1986, Science, 234: 1372-1378). The invention further encompasses the production of antisense compounds that are capable of specifically hybridizing to an RNA sequence encoding a TIE-2 ligand to modulate its expression (Ecker, US Pat. No. 5,166,195, issued November 24, 1992).

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением векторы экспрессии, способные к репликации в бактериальных или эукариотных хозяевах, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую TIE-2 лиганд, как он здесь раскрыт, используют для трансфекции хозяина и, за счет этого, прямой экспрессии такой нуклеиновой кислоты для получения TIE-2 лиганда, который можно затем выделить в биологически активной форме. Thus, in accordance with the present invention, expression vectors capable of replication in bacterial or eukaryotic hosts containing a nucleic acid encoding a TIE-2 ligand as disclosed herein are used to transfect the host and thereby direct expression of such nucleic acid to obtain the TIE-2 ligand, which can then be isolated in biologically active form.

В том смысле, как здесь использован, биологически активная форма включает форму, способную связываться с TIE-2 рецептором и вызывать такую биологическую реакцию, как диференцированное функционирование или влияние на фенотип клетки, экспрессирующей этот рецептор. Такие биологически активные формы должны, например, включать фосфорилирование домена тирозинкиназы рецептора TIE-2. In the sense used here, the biologically active form includes a form capable of binding to the TIE-2 receptor and induce a biological response such as differentiated functioning or influencing the phenotype of a cell expressing this receptor. Such biologically active forms should, for example, include phosphorylation of the TIE-2 receptor tyrosine kinase domain.

Векторы экспрессии, содержащие генную вставку, можно идентифицировать в результат четырех общих подходов: (а) ДНК-ДНК гибридизации, (в) по наличию или отсутствию "маркерных" генных функций, (с) по экспрессии встроенных последовательностей и (d) определению с помощью РСR. В первом подходе наличие чужеродной генной вставки в векторе экспрессии можно детектировать за счет ДНК-ДНК гибридизации, используя зонды, включающие последовательности, которые гомологичны гену, кодирующему встроенный TIE-2 лиганд. Во втором подходе систему рекомбинантный вектор/хозяин можно идентифицировать и отобрать на основании присутствия или отсутствия определенных "маркерных" генных функций (например, по активности тимидинкиназы, по устойчивости к антибиотикам, по фенотипу трансформации, по образованию тел окклюзии в бакуловирусах и т.д.), вызываемому за чет встраивания в вектор чужеродных генов. Так, например, если кодирующая TIE-2 лиганд нуклеиновая кислота встроена в последовательность маркерного гена вектора, рекомбинанты, содержащие эту вставку, можно идентифицировать по отсутствию функций маркерного гена. В третьем подходе рекомбинантные векторы экспрессии можно идентифицировать, анализируя продукт чужеродного гена, экспрессируемый рекомбинантом. Такой анализ может быть основан, например, на физических или функциональных свойствах генного TIE-2 продукта, например, за счет связывания лиганда с TIE-2 рецептором или его частью, которая может быть связана, например, с детектируемым антителом, или его частью, или за счет связывания с антителами, выработанными против протеина TIE-2 лиганда или его части. Expression vectors containing the gene insert can be identified as a result of four general approaches: (a) DNA-DNA hybridization, (c) the presence or absence of “marker” gene functions, (c) the expression of the inserted sequences, and (d) determination using PCR. In the first approach, the presence of a foreign gene insert in the expression vector can be detected by DNA-DNA hybridization using probes that include sequences that are homologous to the gene encoding the inserted TIE-2 ligand. In the second approach, the recombinant vector / host system can be identified and selected based on the presence or absence of certain "marker" gene functions (for example, thymidine kinase activity, antibiotic resistance, transformation phenotype, formation of occlusion bodies in baculoviruses, etc. ) caused by the incorporation of foreign genes into the vector. For example, if a TIE-2 ligand-encoding nucleic acid is inserted into the marker gene sequence of a vector, recombinants containing this insert can be identified by the absence of marker gene functions. In a third approach, recombinant expression vectors can be identified by analyzing a foreign gene product expressed by a recombinant. Such an analysis can be based, for example, on the physical or functional properties of the gene TIE-2 product, for example, by binding the ligand to the TIE-2 receptor or part thereof, which may be associated, for example, with a detectable antibody, or part thereof, or by binding to antibodies produced against the TIE-2 protein of the ligand or part thereof.

Клетки настоящего изобретения могут кратковременно или предпочтительно конститутивно и постоянно экспрессировать ТIЕ-2 лиганды, как это здесь описано. В четвертом подходе можно получить ДНК нуклеотидные праймеры, соответствующие tie-2 специфической ДНК последовательности. Эти праймеры можно затем использовать в PCR tie-2 генных фрагментах. (PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, Edited by Michael A. Innis et al., Academic Press, 1990). Cells of the present invention can briefly or preferably constitutively and continuously express TIE-2 ligands, as described herein. In a fourth approach, DNA nucleotide primers corresponding to tie-2 specific DNA sequences can be obtained. These primers can then be used in PCR tie-2 gene fragments. (PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, Edited by Michael A. Innis et al., Academic Press, 1990).

Рекомбинантный лиганд можно выделить любым способом, который обеспечивает последующее образование стабильного биологически активного протеина. Так, например (но не с точки зрения ограничений), лиганд можно выделить из клеток либо как растворимые протеины, либо как тела включения, из которых лиганды можно экстрагировать количественно с помощью 8 М гаунидинийхлорида и диализа. С целью дальнейшей очистки лиганда можно использовать обычную ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий, хроматографию с обращенной фазой или гель-фильтрацию. The recombinant ligand can be isolated by any method that provides the subsequent formation of a stable biologically active protein. So, for example (but not from the point of view of limitations), a ligand can be isolated from cells either as soluble proteins or as inclusion bodies, from which ligands can be quantitatively extracted using 8 M Gaunidinium chloride and dialysis. For further purification of the ligand, conventional ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography or gel filtration can be used.

В дополнительных вариантах изобретения рекомбинантный TIE-2 лиганд кодирующий ген можно использовать для инактивации или "нокаута" эндогенных генов за счет гомологической рекомбинации и тем самым создать клетки с дефицитом TIE-2 лиганда, ткани или животных. Так, например (и не с целью ограничений), рекомбинантный TIE-2 лиганд кодирующий ген можно сконструировать так, чтобы он содержал встраиваемую мутацию, например, пео ген, который должен инактивировать нативный TIE-2 лиганд кодирующий ген. Такая конструкция под контролем подходящего промотора может быть встроена в такие клетки, как стволовые клетки эмбриона, такими способами, как трансфекция, трансдукция или инъекции. Клетки, содержащие такую конструкцию, можно затем отобрать по устойчивости к G418. Клетки, в которых отсутствует интактный ген, кодирующий TIE-2 лиганд, можно затем идентифицировать, например, за счет Саузерн-блоттинга, PCR определения, Норзерн-блоттинга или анализа экспрессии. Клетки, в которых отсутствует интактный ген, кодирующий TIE-2 лиганд, можно затем слить с клетками эмбриона на ранней стадии для создания трансгенных животных с дефицитом такого лиганда. Таких животных можно использовать для определения специфических ин виво процессов, которые обычно зависят от этого лиганда. In further embodiments of the invention, the recombinant TIE-2 ligand coding gene can be used to inactivate or "knock out" endogenous genes through homologous recombination and thereby create TIE-2 deficient ligand, tissue or animal cells. Thus, for example (and not for the purpose of limitation), the recombinant TIE-2 ligand coding gene can be designed to contain an inserted mutation, for example, peogen, which should inactivate the native TIE-2 ligand coding gene. Such a construct, under the control of a suitable promoter, can be inserted into cells such as embryonic stem cells, by methods such as transfection, transduction or injection. Cells containing this design can then be selected for resistance to G418. Cells lacking the intact gene encoding the TIE-2 ligand can then be identified, for example, by Southern blotting, PCR determination, Northern blotting or expression analysis. Cells lacking the intact gene encoding the TIE-2 ligand can then be fused to the embryo cells at an early stage to create transgenic animals deficient in such a ligand. Such animals can be used to determine specific in vivo processes that usually depend on this ligand.

В настоящем изобретении предложены также антитела к TIE-2 лигандам, здесь описаны те, которые можно использовать для детектирования лигандов, например, в диагностических целях. Для получения моноклональных антител, направленных на TIE-2 лиганд, можно использовать любые методики, которые могут обеспечить получение молекул антител при непрерывном культивировании клеточных линий. Так, например, в объем изобретения входит методика с использованием гибридом, исходно разработанная Kohler and Milstein (1975, Nature, 256: 495-497), а также триомная методика, методика с использованием гибридом В-клеток человека (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72) и методика EBV-гибридом для получения моноклональных антител человека (Cole et al., 1985, в "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy," Alan R. Liss, Inc., p. 77-96) и тому подобные. Antibodies to TIE-2 ligands are also provided by the present invention; those that can be used to detect ligands, for example, for diagnostic purposes, are described herein. To obtain monoclonal antibodies directed to the TIE-2 ligand, you can use any method that can provide antibody molecules during continuous cultivation of cell lines. Thus, for example, the scope of the invention includes a method using hybridomas, originally developed by Kohler and Milstein (1975, Nature, 256: 495-497), as well as a triome method, a method using hybrid B-cells of a person (Kozbor et al., 1983 , Immunology Today, 4: 72) and the EBV hybridoma technique for producing human monoclonal antibodies (Cole et al., 1985, in "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy," Alan R. Liss, Inc., p. 77-96) and like that.

Моноклональные антитела могут быть моноклональными антителами человека или химерными человеческими-мышиными (или других видов) моноклональными антителами. Моноклональные антитела человека можно получить любой из многочисленных методик, известных специалистам (например, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 80: 7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol., 92: 3-16). Химерные молекулы антител можно получить так, чтобы они содержали мышиный антигенсвязывающий домен с постоянными человеческими участками (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452). Monoclonal antibodies can be human monoclonal antibodies or chimeric human-mouse (or other types) monoclonal antibodies. Human monoclonal antibodies can be obtained by any of a variety of techniques known to those skilled in the art (e.g., Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 80: 7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol., 92: 3-16). Chimeric antibody molecules can be made to contain a murine antigen binding domain with constant human regions (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452) .

Различные известные специалистам процедуры можно использовать для получения поликлональных антител к эпитопам описываемых здесь TIE-2 лигандов. Для получения антител можно иммунизовать различных животных-хозяев за счет инъекций TIE-2 лиганда или его фрагмента, или производного, таких как (но не ограничиваясь ими) кролики, мыши и крысы. Various procedures known to those skilled in the art can be used to produce polyclonal antibodies to the epitopes of the TIE-2 ligands described herein. To obtain antibodies, various host animals can be immunized by injection of a TIE-2 ligand or fragment or derivative thereof, such as (but not limited to) rabbits, mice and rats.

Для усиления иммунологической реакции можно использовать различные адъюванты, в зависимости от видов хозяев, которые включают (но не ограничиваются ими) адъюванты Фрейнда (полный и неполный), такие минеральные гели, как гидроксид алюминия, такие поверхностно-активные вещества как лизолецитин, плуроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол, и такие потенциально полезные человеческие адъюванты, как BCG (Bacille Calmette-Guerin) u Corynebacterium paryum. Various adjuvants can be used to enhance the immunological response, depending on the host species, which include (but not limited to) Freund's adjuvants (complete and incomplete), mineral gels, such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, cochlear lymph hemocyanins, dinitrophenol, and potentially useful human adjuvants such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium paryum.

Молекулярные клоны антител к выбранным эпитопам ТIЕ-2 лиганда можно получить известными способами. Рекомбинантная методика (см., например, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Sprind Harbor Laboratory, Cold Sprind Harbor, New York) можно использовать для конструирования последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют молекулы моноклональных антител или их связывающие антиген участки. Molecular antibody clones of selected TIE-2 ligand epitopes can be obtained by known methods. A recombinant technique (see, for example, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Sprind Harbor Laboratory, Cold Sprind Harbor, New York) can be used to construct nucleic acid sequences that encode monoclonal antibody molecules or their binding antigen plots.

В настоящем изобретении предложены молекулы антител, а также фрагменты таких молекул антител. Фрагменты антител, которые содержат идиотип молекулы, можно создать известными способами. Так, например, такие фрагменты включают, но не ограничиваются F(ab')₂-фрагмент, который можно получить за счет переваривания пепсина молекулы антитела; Fab'-фрагменты, которые можно получить, восстанавливая дисульфидные мостики F(ab')₂-фрагмента, и Fab-фрагменты, которые можно получить, обрабатывая молекулы антител папаином и восстанавливающим агентом. Молекулы антител можно выделить известными методиками, например за счет иммуноабсорбции или иммуноафинной хроматографии, такими хроматографическими методиками, как ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), или их сочетаниями.The present invention provides antibody molecules as well as fragments of such antibody molecules. Antibody fragments that contain an idiotype of a molecule can be created by known methods. So, for example, such fragments include, but are not limited to the F (ab ') ₂ fragment, which can be obtained by digesting the pepsin of the antibody molecule; Fab'fragments that can be obtained by restoring the disulfide bridges of the F (ab ') ₂ fragment, and Fab fragments that can be obtained by treating antibody molecules with papain and a reducing agent. Antibody molecules can be isolated by known methods, for example, by immunoabsorption or immunoaffinity chromatography, chromatographic techniques such as HPLC (high performance liquid chromatography), or combinations thereof.

Настоящее изобретение включает также иммуноанализ для определения количества TIE-2 лиганда в биологических образцах за счет:
а) осуществления контактирования биологического образца с по крайней мере одним антителом, которое специфически связывает TIE-2 лиганд так, чтобы это антитело образовывало комплекс с любым TIE-2 лигандом, присутствующим в образце, и
б) определения количества комплекса и тем самым определения количества ТIЕ-2 лиганда в биологическом образце.The present invention also includes an immunoassay to determine the amount of TIE-2 ligand in biological samples due to:
a) contacting the biological sample with at least one antibody that specifically binds the TIE-2 ligand so that the antibody is complexed with any TIE-2 ligand present in the sample, and
b) determining the amount of the complex and thereby determining the amount of TIE-2 ligand in the biological sample.

Далее настоящее изобретение охватывает анализ для определения количества TIE-2 рецепторов в биологических образцах за счет:
а) осуществления контактирования биологического образца с по крайней мере одним лигандом изобретения таким образом, чтобы этот лиганд образовывал комплекс с ТIЕ-2 рецептором, и
в) определения количества комплексов, тем самым определяя количество TIE-2 рецепторов в биологическом образце.Further, the present invention encompasses an analysis to determine the amount of TIE-2 receptors in biological samples by:
a) contacting the biological sample with at least one ligand of the invention so that the ligand is complexed with the TIE-2 receptor, and
c) determining the number of complexes, thereby determining the number of TIE-2 receptors in a biological sample.

В настоящем изобретении предложено также использование TIE-2 лиганда для поддержания выживания и/или роста, и/или дифференциации клеток, экспрессирующих TIE-2 рецептор. Таким образом, лиганд можно использовать в качестве дополнения для поддержания, например, культуры эндотелиальных клеток. Далее, открытие заявителями родственного лиганда для TIE-2 рецептора обеспечивает использование систем анализа, пригодных для идентификации агонистов или антагонистов TIE-2 рецептора. Такие аналитические системы могут пригодиться при идентификации молекул, способных промотировать ингибирование ангиогенеза. Так, например, в одном варианте антагонисты TIE-2 рецептора можно идентифицировать как тестовые молекулы, которые способны вмешиваться во взаимодействие TIE-2 рецептора с биологически активным ТIЕ-2 лигандом. Такие антагонисты идентифицируют по их способности 1) блокировать связывание биологически активного TIE-2 лиганда с рецептором при измерении, например, с использованием BlAcore биосенсорной технологии (BlAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NY) или 2) блокировать способность биологически активно TIE-2 лиганда вызывать биологическую реакцию. Такие биологические реакции включают (но ими не ограничиваются) фосфорилирование ТIЕ-2 рецептора или расположенных в прямом направлении компонентов схемы трансдукции TIE-2 сигнала или выживание, рост или диференциацию содержащих TIE-2 клеток. The present invention also provides the use of a TIE-2 ligand to support the survival and / or growth and / or differentiation of cells expressing the TIE-2 receptor. Thus, the ligand can be used as a supplement to maintain, for example, endothelial cell culture. Further, the applicants discovery of a related ligand for the TIE-2 receptor provides for the use of assay systems suitable for identifying TIE-2 receptor agonists or antagonists. Such assay systems may be useful in identifying molecules capable of promoting inhibition of angiogenesis. For example, in one embodiment, TIE-2 receptor antagonists can be identified as test molecules that are capable of interfering with the interaction of the TIE-2 receptor with the biologically active TIE-2 ligand. Such antagonists are identified by their ability to 1) block the binding of the biologically active TIE-2 ligand to the receptor when measured, for example, using BlAcore biosensor technology (BlAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NY) or 2) block the ability of the biologically active TIE-2 ligand to induce biological reaction. Such biological reactions include, but are not limited to, phosphorylation of the TIE-2 receptor or the upstream components of the TIE-2 signal transduction pattern, or the survival, growth, or differentiation of TIE-2 containing cells.

В одном варианте клетки, сконструированные, чтобы экспрессировать TIE-2 рецептор, могли бы зависеть от роста при добавлении TIE-2 лиганда. Такие клетки обеспечивают подходящие аналитические системы для идентификации дополнительных агонистов TIE-2 рецептора или антагонистов, способных влиять на активность TIE-2 лиганда на таких клетках. В другом варианте аутокринные клетки, сконструированные так, что они способны к совместной экспрессии и TIE-2 лиганда, и рецептора, могут представлять подходящие системы для анализа потенциальных агонистов или антагонистов. In one embodiment, cells constructed to express the TIE-2 receptor could be growth dependent upon the addition of the TIE-2 ligand. Such cells provide suitable assay systems for identifying additional TIE-2 receptor agonists or antagonists capable of affecting the activity of TIE-2 ligand on such cells. In another embodiment, autocrine cells designed so that they are capable of co-expression of both the TIE-2 ligand and the receptor may represent suitable systems for the analysis of potential agonists or antagonists.

Поэтому настоящее изобретение можно использовать для введения ТIЕ-2 рецепторов в клетки, которые обычно не экспрессируют этот рецептор, тем самым позволяя этим клеткам демонстрировать сильные и легко различимые реакции на лиганд, который связывает этот рецептор. Тип выбранной реакции зависит от используемых клеток, а не от специфического рецептора, вводимого в эти клетки. Соответствующие клеточные линии можно выбрать таким образом, чтобы получить реакцию, представляющую ценность для анализов, также как и обнаружить молекулы, которые могут действовать на рецепторы тирозинкиназы. Эти молекулы могут быть молекулами любого типа, включая (но не ограничиваясь ими) пептиды и непептидные молекулы, которые будут действовать в описываемых системах рецептор-специфическим образом. Therefore, the present invention can be used to introduce TIE-2 receptors into cells that usually do not express this receptor, thereby allowing these cells to exhibit strong and easily distinguishable reactions to the ligand that binds this receptor. The type of reaction chosen depends on the cells used, and not on the specific receptor introduced into these cells. Appropriate cell lines can be selected so as to obtain a reaction of value for analysis, as well as to detect molecules that can act on tyrosine kinase receptors. These molecules can be molecules of any type, including (but not limited to) peptides and non-peptide molecules that will act in a described system in a receptor-specific manner.

Одной из наиболее подходящих для использования систем является система, которая включает введение TIE-2 рецептора в клеточную линию фибробластов (например, в NIH3T3 клетки) таким образом, что такой рецептор, который обычно не участвует в пролиферативных реакциях, может, после введения в фибробласты, тем не менее быть проанализирован за счет различных хорошо известных методик на количественные характеристики эффектов факторов роста фибробластов (например, включение тимидина или другие типы пролиферационных анализов; см. van Zoelen, 1990, "The Use of Biological Assays For Detection OfPolypeptide Growth Factors" in Progress Factor Research, vol.2, p.131-152; Zhan and M. Goldfarb, 1986, Mol. Cell Biol., vol.6, p.3541-3544). Эти анализы отличаются тем дополнительным преимуществом, что любые препараты можно анализировать как на клеточную линию, имеющую введенный рецептор, так и как родительскую клеточную линию, в которой этот рецептор отсутствует; только специфические эффекты на клеточной линии с рецептором следует рассматривать как управляемые за счет введенного рецептора. Такие клетки можно сконструировать далее так, чтобы они экспрессировали TIE-2 лиганд, создавая таким образом аутокринную систему, пригодную для анализа молекул, которые действуют как антагонисты/агонисты такого взаимодействия. One of the most suitable systems for use is a system that includes the introduction of the TIE-2 receptor into the fibroblast cell line (for example, in NIH3T3 cells) in such a way that a receptor that is not usually involved in proliferative reactions may, after introduction into fibroblasts, nevertheless be analyzed through various well-known techniques on the quantitative characteristics of the effects of fibroblast growth factors (e.g., incorporation of thymidine or other types of proliferation assays; see van Zoelen, 1990, "The Use of Biological Assays For Detection Of Polypeptide Growth Factors "in Progress Factor Research, vol. 2, p. 131-152; Zhan and M. Goldfarb, 1986, Mol. Cell Biol., Vol. 6, p. 3541-3544). These analyzes are distinguished by the additional advantage that any preparations can be analyzed both for a cell line having an introduced receptor, and as a parent cell line in which this receptor is absent; only specific effects on the cell line with the receptor should be considered as controlled by the introduced receptor. Such cells can be further constructed to express the TIE-2 ligand, thereby creating an autocrine system suitable for the analysis of molecules that act as antagonists / agonists of such an interaction.

Таким образом, в настоящем изобретении предложены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую TIE-2 лиганд, и нуклеиновую кислоту, кодирующую TIE-2 рецептор. Thus, the present invention provides host cells comprising a nucleic acid encoding a TIE-2 ligand and a nucleic acid encoding a TIE-2 receptor.

Взаимодействие TIE-2 рецептор/ТIЕ-2 лиганд также представляет полезную систему для идентификации небольших молекул агонистов или антагонистов TIE-2 рецептора. Так, например, фрагменты, мутанты или производные TIE-2 лиганда можно идентифицировать, которые связывают TIE-2 рецептор, но не индуцируют биологической активности. В другом варианте характеризация TIE-2 лиганда позволяет определять активную часть молекулы. Далее, идентификация лиганда позволяет определять кристаллическую структуру (с помощью рентгеновских лучей) комплекса рецептор/лиганд, тем самым позволяя определить сайт связывания на рецепторе. Знание сайта связывания позволяет предусмотреть рациональную конструкцию новых агонистов и антагонистов. The TIE-2 receptor / TIE-2 ligand interaction also provides a useful system for identifying small TIE-2 receptor agonist or antagonist molecules. So, for example, fragments, mutants or derivatives of the TIE-2 ligand can be identified that bind the TIE-2 receptor, but do not induce biological activity. In another embodiment, characterization of the TIE-2 ligand allows the determination of the active moiety. Further, the identification of the ligand allows you to determine the crystal structure (using x-rays) of the receptor / ligand complex, thereby allowing you to determine the binding site on the receptor. Knowledge of the binding site allows for the rational construction of new agonists and antagonists.

Специфическое связывание тестовой молекулы с TIE-2 рецептором можно определить различными способами. Так, например, реальнoе связывание тестовой молекулы с клетками, экспрессирующими tie-2, можно определить изи измерить, определяя или измеряя (i) тестовые молекулы связанные с поверхностью интактных клеток, (ii) тестовые молекулы, сшитые с TIE-2 протеином в клеточных лизатах, или (iii) тестовые молекулы, связанные с TIE-2 ин витро. Специфическое взаимодействие между тестовой молекулой и TIE-2 можно оценить, используя реагенты, которые демонстрируют уникальные свойства такого взаимодействия. The specific binding of the test molecule to the TIE-2 receptor can be determined in various ways. For example, the actual binding of a test molecule to cells expressing tie-2 can be determined and measured by determining or measuring (i) test molecules bound to the surface of intact cells, (ii) test molecules crosslinked with TIE-2 protein in cell lysates or (iii) test molecules associated with TIE-2 in vitro. The specific interaction between the test molecule and TIE-2 can be evaluated using reagents that demonstrate the unique properties of this interaction.

Как специфический нелимитирующий пример способы настоящего изобретения можно использовать следующим образом. Рассмотрим случай, в котором необходимо определить содержание TIE-2 лиганда в образце. Различные разбавления образца (тестовых молекул), параллельно с негативным контролем (NC), не содержащим TIE-2 лигандной активности, и позитивным контролем (PC), содержащим известное количество TIE-2 лиганда, можно обработать клетками, которые экспрессируют tie-2 в присутствии детектируемого меченого TIE-2 лиганда (в этом примере радиоиодированного лиганда). Количество TIE-2 лиганда в тестовом образце можно оценить, определяя количество ¹²⁵I-меченого ТIЕ-2 лиганда, которое связывается с контролями, и в каждом из разбавлений, а затем сравнить полученные для образцов значения с градуировочной кривой. Чем больше TIE-2 лиганда содержится в образце, тем меньше ¹²⁵I-лиганда будет связано с ТIЕ-2.As a specific non-limiting example, the methods of the present invention can be used as follows. Consider the case in which it is necessary to determine the content of TIE-2 ligand in the sample. Various dilutions of the sample (test molecules), in parallel with the negative control (NC) containing no TIE-2 ligand activity, and the positive control (PC) containing a known amount of TIE-2 ligand, can be treated with cells that express tie-2 in the presence of a detectable labeled TIE-2 ligand (in this example, a radioiodinated ligand). The amount of TIE-2 ligand in the test sample can be estimated by determining the amount of ¹²⁵ I-labeled TIE-2 ligand that binds to the controls and in each dilution, and then compare the values obtained for the samples with a calibration curve. The more TIE-2 ligand is contained in the sample, the less ¹²⁵ I-ligand will be associated with TIE-2.

Количество ¹²⁵I-лиганда, связанного с TIE-2, можно определить, измеряя количество радиоактивности на клетку, или за счет связывания TIE-2 лиганда с протеинами клеточной поверхности, используя DSS, по способу Meakin and Shooter, 1991, Neuron, 6: 153-163, и определяя количество меченого протеина в клеточных экстрактах, используя, например, электрофорез в полиакриламидном геле, что помогает выявить меченый протеин с размерами, соответствующими TIE-2 лиганд/TIЕ-2 рецептор. Специфические взаимодействия тестируемая молекула/ТIЕ-2 можно далее тестировать, добавляя в анализ различные разбавления немеченого контрольного лиганда, который не связывает TIE-2 рецептор, и поэтому не оказывает заметного влияния на конкуренцию между меченым TIE-2 лигандом и тестовой молекулой для TIE-2 связывания. В другом варианте молекулы, o которых известно, что они способны разрушить связывание TIE-2 лиганд/ТIЕ-2, например, такие как (но ими не ограничиваясь) анти-ТIЕ-2 антитело или TIE-2 рецепторное тело, как они здесь описаны, как можно ожидать, будут участвовать в конкуренции между ¹²⁵I-TIE-2 лигандом и тестовой молекулой на предмет связывания TIE-2 рецептора.The amount of ¹²⁵ I-ligand bound to TIE-2 can be determined by measuring the amount of radioactivity per cell, or by binding of the TIE-2 ligand to cell surface proteins using DSS according to Meakin and Shooter, 1991, Neuron, 6: 153 -163, and determining the amount of labeled protein in cell extracts using, for example, polyacrylamide gel electrophoresis, which helps to identify labeled protein with sizes corresponding to the TIE-2 ligand / TIE-2 receptor. The specific interactions of the test molecule / TIE-2 can be further tested by adding various dilutions of the unlabeled control ligand that does not bind the TIE-2 receptor to the analysis and therefore does not significantly affect the competition between the labeled TIE-2 ligand and the test molecule for TIE-2 binding. In another embodiment, molecules that are known to be capable of breaking TIE-2 ligand / TIE-2 binding, such as, but not limited to, an anti-TIE-2 antibody or TIE-2 receptor body, as described herein can be expected to compete between the ¹²⁵ I-TIE-2 ligand and the test molecule for binding of the TIE-2 receptor.

Детектируемо меченые TIE-2 лиганды включают (но не ограничиваются ими) TIE-2 лиганд, ковалентно связанный или нековалентно связанный с радиоактивным веществом, флуоресцирующим веществом, веществом, которое обладает энзиматической активностью, веществом, которое может служить в качестве субстрата для энзима (предпочтительны энзимы и субстраты, связанные с колориметрически детектируемыми реакциями), или с веществом, которое можно распознать с помощью молекул антител, то есть с детектируемо мечеными молекулами антител. Detectably labeled TIE-2 ligands include, but are not limited to, a TIE-2 ligand, covalently linked or non-covalently linked to a radioactive substance, a fluorescent substance, a substance that has enzymatic activity, a substance that can serve as a substrate for the enzyme (enzymes are preferred and substrates associated with colorimetrically detectable reactions), or with a substance that can be recognized by antibody molecules, i.e., detectably labeled antibody molecules.

В другом варианте специфическое связывание тестовой молекулы с TIE-2 можно измерить, оценивая вторичные биологические эффекты связывания TIE-2 лиганд/TIE-2 рецептор, включая (но не ограничиваясь ими) рост клеток и/или диференциацию или немедленную раннюю генную экспрессию или фосфорилирование TIE-2. Так, например, способность тестовой молекулы индуцировать диференциацию можно тестировать в клетках, в которых отсутствует tie-2 и в сравнительных клетках, которые экспрессируют tie-2; диференцирование в tie-2 экспрессирующих клетках, но не в сравнительных клетках, которые не содержат tie-2, будет служить показателем взаимодействия специфической тестовой молекулы с TIE-2. Аналогичные анализы можно осуществлять за счет детектирования индуцирования немедленно ранних генов (например, fos и jun) в tiе-2-минус и tie-2-плюс клетках или за счет детектирования фосфорилирования TIE-2, используя стандартный анализ фосфорилирования, известный специалистам. Такие анализы могут быть полезны для идентификации агонистов или антагонистов, которые конкурентно связываются с ТIЕ-2. Alternatively, the specific binding of the test molecule to TIE-2 can be measured by evaluating the secondary biological effects of binding of the TIE-2 ligand / TIE-2 receptor, including but not limited to cell growth and / or differentiation or immediate early gene expression or TIE phosphorylation -2. For example, the ability of a test molecule to induce differentiation can be tested in cells that lack tie-2 and in comparative cells that express tie-2; differentiation in tie-2 expressing cells, but not in comparative cells that do not contain tie-2, will serve as an indicator of the interaction of a specific test molecule with TIE-2. Similar assays can be performed by detecting the induction of immediately early genes (e.g. fos and jun) in tie-2-minus and tie-2-plus cells or by detecting TIE-2 phosphorylation using a standard phosphorylation assay known to those skilled in the art. Such assays may be useful in identifying agonists or antagonists that competitively bind to TIE-2.

Аналогично в настоящем изобретении предложен способ идентификации молекул, которые обладают биологической активностью TIE-2 лиганда, включающий (i) экспонирование клеток, которые экспрессируют tie-2, тестовым молекулам, и (ii) детектирование специфического связывания тестовой молекулы с TIE-2 рецептором, где специфическое связывание с TIE-2 позитивно коррелирует с ТIЕ-2 подобной активностью. Специфическое связывание можно определить, либо анализируя непосредственно связывание, либо вторичные биологические эффекты связывания, как это обсуждалось ранее. Такой способ может быть особенно полезным при идентификации новых членов семейства TIE лигандов или в фармацевтической промышленности, при скринировании большого числа пептидов и непептидных молекул (например, пептидомиметиков) по TIE соответствующей биологической активности. В предпочтительном, специфическом, нелимитирующем варианте изобретения можно приготовить большую пластину культуральных ячеек, которые содержат, в чередующихся рядах, РС12 (или фибробласты) клетки, которые являются либо tie-2-минус, либо сконструированы так, чтобы быть tie-2-плюс. Затем можно добавить тестовые молекулы так, чтобы каждая колонка пластины или ее часть содержала бы тестовую молекулу. Затем каждую оценить на присутствие или отсутствие роста и/или диференциации. Таким образом можно скринирировать очень большое число тестовых молекул по их активности. Similarly, the present invention provides a method for identifying molecules that have the biological activity of a TIE-2 ligand, comprising (i) exposing cells that express tie-2 to test molecules, and (ii) detecting specific binding of the test molecule to the TIE-2 receptor, where specific binding to TIE-2 positively correlates with TIE-2-like activity. Specific binding can be determined either by directly analyzing the binding, or by the secondary biological effects of binding, as discussed previously. Such a method can be especially useful in identifying new members of the TIE family of ligands or in the pharmaceutical industry, when screening a large number of peptides and non-peptide molecules (for example, peptidomimetics) by TIE of the corresponding biological activity. In a preferred, specific, non-limiting embodiment of the invention, it is possible to prepare a large plate of culture cells that contain, in alternating rows, PC12 (or fibroblasts) cells that are either tie-2-minus or constructed to be tie-2-plus. You can then add test molecules so that each column of the plate or part of it contains a test molecule. Then, each is assessed for the presence or absence of growth and / or differentiation. In this way, a very large number of test molecules can be screened for their activity.

В дополнительных вариантах в настоящем изобретении предложены способы определения или измерения TIE-подобной активности, или идентификации молекул, как обладающих такой активностью, включающие: (i) экспонирование тестовой молекулы протеину TIE-2 рецептора ин витро в условиях, которые позволяют осуществлять связывание, и (ii) детектирование связывания тестовой молекулы с TIE-2 протеином, когда связывание тестовой молекулы с TIE-2 коррелирует с TIE-подобной активностью. В соответствии с такими способами TIE-2 может быть (а может и не быть) существенно очищенным, может быть связан с твердой подложкой (например, в аффинной колонке или как в ELISA анализе), или может быть включен в искусственную мембрану. Связывание тестовой молекулы с TIE-2 можно оценить любым известным специалистам способом. В предпочтительных вариантах связывание тестовой молекулы можно детектировать или измерять за счет оценки ее способности конкурировать с детектируемо мечеными известными TIE-2 лигандами для ТIЕ-2 рецепторного связывания. In further embodiments, the present invention provides methods for determining or measuring TIE-like activity, or for identifying molecules as having such activity, comprising: (i) exposing the test molecule to the TIE-2 receptor protein in vitro under conditions that allow binding, and ( ii) detecting binding of the test molecule to the TIE-2 protein when binding of the test molecule to TIE-2 correlates with TIE-like activity. In accordance with such methods, TIE-2 may (or may not) be substantially purified, may be bound to a solid support (for example, in an affinity column or as in an ELISA assay), or may be incorporated into an artificial membrane. The binding of the test molecule to TIE-2 can be evaluated by any method known to those skilled in the art. In preferred embodiments, the binding of the test molecule can be detected or measured by evaluating its ability to compete with the detectably labeled known TIE-2 ligands for TIE-2 receptor binding.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ детектирования способности тестовой молекулы функционировать в качестве антагониста TIE-подобной активности, включающий детектирование способности молекулы ингибировать эффект связывания TIE лиганда с TIE-2 на клетках, которые экспрессируют tie-2. Такой антагонист может (а может и нет) мешать связыванию TIE-2 лиганда с TIE-2 рецептором. Эффекты связывания TIE-2 лиганда с TIE-2 рецептором представляют предпочтительно биологические или биохимические эффекты, включая (но не ограничиваясь ими) выживание или пролиферацию клеток, трасформацию клеток, индуцирование немедленного раннего гена или пролиферацию TIE-2. The present invention also provides a method for detecting the ability of a test molecule to function as an antagonist of TIE-like activity, comprising detecting the ability of a molecule to inhibit the binding effect of a TIE ligand to TIE-2 on cells that express tie-2. Such an antagonist may (or may not) interfere with the binding of the TIE-2 ligand to the TIE-2 receptor. The effects of binding of the TIE-2 ligand to the TIE-2 receptor are preferably biological or biochemical effects, including but not limited to cell survival or proliferation, cell transformation, induction of immediate early gene or TIE-2 proliferation.

Далее настоящее изобретение предлагает как способ идентификации антител или других молекул, способных нейтрализовать лиганд или блокировать его связывание с рецептором, так и молекулы, идентифицированные этим способом. В качестве неограничивающего примера этот способ можно осуществить в анализе, который концептуально аналогичен ELISA анализу. Так, например, TIE рецепторное тело можно связать с твердым носителем, например с пластиковой многоячеечной пластиной. В качестве контроля можно затем ввести в ячейки известное количество ТIЕ лиганда, который был Мус-маркирован, а затем любой меченый TIE лиганд, который связывает рецепторное тело, можно идентифицировать с помощью репортерного антитела, направленного против Myc-tag. Затем эту аналитическую систему можно использовать для скринирования тестовых образцов для молекул, которые способны (i) связываться с меченым лигандом или (ii) связываться с рецепторным телом и за счет этого блокировать связывание с рецепторным телом за счет меченого лиганда. Так, например, тестовый образец, содержащий предположительно представляющие интерес молекулы, вместе с известным количеством меченого лиганда можно ввести в ячейку и определить количество меченого лиганда, который связывается с рецепторным телом. За счет сравнения количества связанного меченого лиганда в тестовом образце с количеством его в контрольном можно определить образцы, содержащие молекулы, которые способны блокировать связывание лиганда с рецептором. Представляющие интерес молекулы, определенные таким образом, можно выделить, используя хорошо известные специалистам способы. The present invention further provides both a method for identifying antibodies or other molecules capable of neutralizing a ligand or blocking its binding to a receptor, as well as molecules identified by this method. By way of non-limiting example, this method can be carried out in an assay that is conceptually similar to an ELISA assay. So, for example, the TIE receptor body can be associated with a solid carrier, for example with a plastic multi-cell plate. As a control, you can then introduce into the cells a known amount of the TIE ligand that has been Mus-labeled, and then any TIE-labeled ligand that binds the receptor body can be identified using a reporter antibody directed against Myc-tag. This assay system can then be used to screen test samples for molecules that are capable of (i) binding to a labeled ligand or (ii) binding to a receptor body and thereby block binding to the receptor body via a labeled ligand. For example, a test sample containing molecules of presumably of interest, together with a known amount of labeled ligand, can be introduced into the cell and the amount of labeled ligand that binds to the receptor body can be determined. By comparing the amount of bound labeled ligand in the test sample with the amount in the control, samples containing molecules that are capable of blocking the binding of the ligand to the receptor can be determined. Molecules of interest defined in this way can be isolated using methods well known in the art.

После того как определен блокатор связывания лиганда, специалистам должно быть известно, что осуществить вторичный анализ для определения того, связывается ли блокатор с рецептором или он связывается с лигандом, а также как осуществить анализ для определения того, может ли молекула блокатора нейтрализовать биологическую активность лиганда. Так, например, используя анализ связывания, за счет BIAcore биосенсорной технологии (или его эквивалент), в котором либо TIE тело рецептора, либо TIE лиганд ковалентно связаны с твердой подложкой (например, карлоксиметилдекстраном или золотой поверхностью), специалист может определить, связывается ли молекула блокатора специфически с лигандом, или с телом рецептора. Для определения того, может ли молекула блокатора нейтрализовать биологическую активность лиганда, специалист может осуществить анализ с помощью фосфорилирования (см. пример 5) или, в другом варианте, за счет такого функционального биоанализа, как анализ выживания, за счет первичных культур, например эндотелиальных клеток. В другом варианте молекулы блокатора, которые связываются с телом рецептора, могут быть агонистами, и специалисту должно быть ясно, как определить это за счет осуществления соответствующего анализа для идентификации дополнительных агонистов TIE-2 рецептора. Once a ligand binding blocker has been determined, those skilled in the art should know that a secondary analysis is performed to determine if the blocker binds to the receptor or if it binds to the ligand, and how to perform an analysis to determine whether the blocker molecule can neutralize the biological activity of the ligand. So, for example, using a binding analysis, using BIAcore biosensor technology (or its equivalent), in which either the TIE receptor body or TIE ligand is covalently linked to a solid support (for example, carloxymethyldextran or a gold surface), a specialist can determine whether a molecule binds a blocker specifically with a ligand, or with a receptor body. To determine whether a blocker molecule can neutralize the biological activity of a ligand, a specialist can carry out the analysis using phosphorylation (see example 5) or, in another embodiment, through a functional bioanalysis such as survival analysis, using primary cultures, for example endothelial cells . In another embodiment, the blocker molecules that bind to the receptor body may be agonists, and it should be clear to one skilled in the art how to determine this by performing an appropriate analysis to identify additional TIE-2 receptor agonists.

Так как TIE-2 рецептор был идентифицирован в связи с эндотелиальными клетками, и, как здесь показано, блокирование лиганда, по-видимому, предотвращает васкуляризацию, заявители продемонстрировали, что TIE-2 лиганд может быть полезен для индуцирования васкуляризации при заболеваниях или болезненных состояниях, при которых эта васкуляризация показана. Такие заболевания или расстройства включают заживление ран, ишемию и диабеты. С другой стороны, антагонисты TIE-2 рецептора, такие, как рецепторные тела, как раскрыто в примерах 2 и 3, и ТIЕ-2 лиганд 2, как раскрыто в примере 9, могут быть полезны для предотвращения или ослабления васкуляризации, тем самым предотвращая или ослабляя, например, рост опухоли. Since the TIE-2 receptor has been identified in association with endothelial cells, and as shown here, blocking the ligand appears to prevent vascularization, applicants have demonstrated that the TIE-2 ligand may be useful for inducing vascularization in diseases or disease states, in which this vascularization is indicated. Such diseases or disorders include wound healing, ischemia, and diabetes. On the other hand, TIE-2 receptor antagonists, such as receptor bodies as disclosed in Examples 2 and 3, and TIE-2 ligand 2, as disclosed in Example 9, may be useful in preventing or attenuating vascularization, thereby preventing or weakening, for example, tumor growth.

Так как клетки, содержащие TIE-2 рецептор, по-видимому, должны быть отрегулированы в сторону усиления васкуляризации, TIE-2 лигандные тела могут также быть полезны для предотвращения или ослабления, например, роста опухолей. TIE-2 лиганды могут быть полезны для доставки токсинов к содержащим рецепторы клеткам. В другом варианте, такие другие молекулы, как факторы роста, цитокины или питательные вещества, можно доставить к клеткам, содержащим TIE-2 рецептор, за счет TIE-2 лигандов. TIE-2 лиганды можно также использовать в качестве диагностического реагента для TIE-2 рецептора, для определения рецептора ин виво или ин витро. Там, где TIE-2 рецептор связан с болезненным состоянием, TIE-2 лигандные тела можно использовать в качестве диагностических реагентов для определения заболевания, например, при окрашивании тканей или при получении изображения всего тела. Since cells containing the TIE-2 receptor are likely to be adjusted toward increased vascularization, TIE-2 ligand bodies may also be useful in preventing or attenuating, for example, tumor growth. TIE-2 ligands may be useful for delivering toxins to receptor-containing cells. In another embodiment, other molecules, such as growth factors, cytokines, or nutrients, can be delivered to cells containing the TIE-2 receptor, due to TIE-2 ligands. TIE-2 ligands can also be used as a diagnostic reagent for the TIE-2 receptor, to determine the receptor in vivo or in vitro. Where the TIE-2 receptor is associated with a disease state, the TIE-2 ligand bodies can be used as diagnostic reagents for determining a disease, for example, when staining tissues or when acquiring an entire body image.

В настоящем изобретении предложены также фармацевтические композиции, включающие TIE-2 лиганды или лигандные тела, здесь описываемые, их пептидные фрагменты или производные, в фармацевтически приемлемом носителе. Протеины TIE-2 лиганда, пептидные фрагменты или их производные можно вводить системно или локально. Можно использовать любые подходящие типы введения, известные специалистам, включая (но не ограничиваясь этим) внутривенное, внутрисухожильное, внутриартериальное, внутриназальное, пероральное, подкожное, внутрибрюшинное, или за счет локальных инъекций, или в виде хирургических имплантатов. Можно также приготовить композиции с замедленным высвобождением. The present invention also provides pharmaceutical compositions comprising TIE-2 ligands or ligand bodies described herein, their peptide fragments or derivatives, in a pharmaceutically acceptable carrier. TIE-2 ligand proteins, peptide fragments or their derivatives can be administered systemically or locally. Any suitable type of administration known to those skilled in the art can be used, including, but not limited to, intravenous, intracranial, intraarterial, intranasal, oral, subcutaneous, intraperitoneal, either by local injection or as surgical implants. Sustained release compositions may also be prepared.

В настоящем изобретении предложены также выделенные и очищенные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие TIE-2 лиганд человека, где последовательность нуклеиновых кислот выбирают из группы, состоящей из
(а) последовательностей нуклеиновых кислот, содержащих участок, кодирующий TIE-2 лиганд человека, как изображено на фиг.4, 5 или 6,
(в) последовательностей нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в условиях умеренной жесткости с последовательностью нуклеиновых кислот по (а) и которые кодируют TIE-2 лиганд, который связывает TIE-2 рецептор, и
(с) последовательностей нуклеиновых кислот, которые являются дегенеративными за счет генетического кода по отношению к последотвальностям нуклеиновых кислот (а) или (в) и которые кодируют TIE-2 лиганд, который связывает TIE-2 рецептор.The present invention also provides isolated and purified nucleic acid molecules comprising nucleic acid sequences encoding a human TIE-2 ligand, wherein the nucleic acid sequence is selected from the group consisting of
(a) nucleic acid sequences containing a region encoding a TIE-2 human ligand, as shown in FIGS. 4, 5 or 6,
(c) nucleic acid sequences that hybridize under moderate stringency to the nucleic acid sequence of (a) and which encode a TIE-2 ligand that binds the TIE-2 receptor, and
(c) nucleic acid sequences that are degenerate due to the genetic code with respect to the nucleic acid sequences (a) or (c) and which encode a TIE-2 ligand that binds the TIE-2 receptor.

В другом варианте в изобретении предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует TIE-2 лиганд, где последовательность нуклеиновой кислоты является
(а) последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей участок, кодирующий TIE-2 лиганд человека, как представлено на фиг.4, 5 или 6,
(в) последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях умеренной жесткости с последовательностью нуклеиновой кислоты (а) и которая кодирует TIE-2 лиганд, который связывает TIE-2 рецептор, или
(с) последовательностью нуклеиновой кислоты, которая, если бы не вырожденность генетического кода, гибридизовалась бы с последовательностью нуклеиновых кислот (а) или (в) и которая кодирует TIE-2 лиганд, который связывает TIE-2 рецептор.In another embodiment, the invention provides an isolated nucleic acid molecule that encodes a TIE-2 ligand, where the nucleic acid sequence is
(a) a nucleic acid sequence comprising a region encoding a human TIE-2 ligand as shown in FIGS. 4, 5 or 6,
(c) a nucleic acid sequence that hybridizes under moderate stringency to a nucleic acid sequence (a) and which encodes a TIE-2 ligand that binds the TIE-2 receptor, or
(c) a nucleic acid sequence which, if not for the degeneracy of the genetic code, would hybridize to the nucleic acid sequence (a) or (c) and which encodes a TIE-2 ligand that binds the TIE-2 receptor.

В настоящем изобретении предложены также выделенные и очищенные TIE-2 лиганды, кодируемые выделенной молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. В настоящем изобретении предложен также вектор, который включает выделение молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лиганд TIE-2 человека. В одном из вариантов сконструирован вектор, обозначенный как pBluescript KS, кодирующий лиганд 2 ТIЕ-2 человека. The present invention also provides isolated and purified TIE-2 ligands encoded by an isolated nucleic acid molecule of the present invention. The present invention also provides a vector that comprises isolating a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding a human TIE-2 ligand. In one embodiment, a vector is designated, designated as pBluescript KS, encoding human ligand 2 TIE-2.

Настоящее изобретение представляет вектор экспрессии, включающий ДНК молекулу, кодирующую лиганд TIE-2 человека, где ДНК молекула оперативно связана с последовательностью, контролирующей экспрессию. В настоящем изобретении предложена также система хозяин-вектор для продуцирования полипептида, обладающего биологической активностью лиганда TIE-2 человека, которая включает вектор экспрессии настоящего изобретения в клетках подходящего хозяина. В одном из вариантов подходящими клетками хозяина могут быть бактериальные клетки, дрожжевые клетки, клетки насекомых или клетки млекопитающих. В настоящем изобретении предложен также способ получения полипептида, обладающего активностью биологически активного TIE-2 лиганда, который включает выращивание клеток системы хозяин-вектор настоящего изобретения в условиях, обеспечивающих продуцирование полипептида и выделение полученного таким образом полипептида. The present invention provides an expression vector comprising a DNA molecule encoding a human TIE-2 ligand, wherein the DNA molecule is operably linked to an expression control sequence. The present invention also provides a host-vector system for producing a polypeptide having the biological activity of a human TIE-2 ligand, which comprises an expression vector of the present invention in cells of a suitable host. In one embodiment, suitable host cells may be bacterial cells, yeast cells, insect cells, or mammalian cells. The present invention also provides a method for producing a polypeptide having the activity of a biologically active TIE-2 ligand, which comprises growing the host-vector system cells of the present invention under conditions that produce the polypeptide and isolate the polypeptide thus obtained.

В настоящем изобретении описывается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая TIE-2 лиганд и предлагается создание лиганда, его фрагмента или производного, или другой молекулы, которая является агонистом или антагонистом рецептора, в качестве терапевтического агента для лечения пациентов, страдающих от заболеваний, включающих клетки, ткани или органы, которые экспрессируют TIE рецептор. В качестве нелимитирующего примера в настоящем изобретении предложено тело лиганда, которое специфически связывается с TIE-2 рецептором или TIE-2. В альтернативном варианте в настоящем изобретении предложено тело лиганда, которое включает TIE-2 лиганд, связанный с постоянным участком иммуноглобулина. В одном из вариантов тело лиганда включает TIE-2 лиганд 1 или TIE-2 лиганд 2 и Fc часть IgGl человека. Тело лиганда можно использовать в способе лечения организмов человека или животных, или в диагностических целях. The present invention describes an isolated nucleic acid molecule encoding a TIE-2 ligand and proposes the creation of a ligand, fragment or derivative thereof, or other molecule that is a receptor agonist or antagonist, as a therapeutic agent for treating patients suffering from diseases including cells, tissues or organs that express the TIE receptor. As a non-limiting example, the present invention provides a ligand body that specifically binds to a TIE-2 receptor or TIE-2. Alternatively, the present invention provides a ligand body that includes a TIE-2 ligand linked to a constant portion of an immunoglobulin. In one embodiment, the ligand body comprises TIE-2 ligand 1 or TIE-2 ligand 2 and the Fc portion of human IgGl. The body of the ligand can be used in a method for treating human or animal organisms, or for diagnostic purposes.

В настоящем изобретении предложено также антитело, которое специфически связывает такие терапевтические молекулы. Такое антитело может быть моноклональным или поликлональным. В настоящем изобретении предложен также способ использования таких моноклональных или поликлональных антител для определения количества терапевтических молекул в образце, отобранном у пациента с целью контроля за ходом лечения. The present invention also provides an antibody that specifically binds such therapeutic molecules. Such an antibody may be monoclonal or polyclonal. The present invention also provides a method of using such monoclonal or polyclonal antibodies to determine the number of therapeutic molecules in a sample taken from a patient in order to monitor the course of treatment.

Далее в настоящем изобретении предложена терапевтическая композиция, включающая лиганд TIE-2 человека или тело лиганда, и конъюгированный с ним цитотоксический агент. В одном из вариантов цитотоксическим агентом может быть радиоизотоп или токсин. The present invention further provides a therapeutic composition comprising a human TIE-2 ligand or a ligand body and a cytotoxic agent conjugated thereto. In one embodiment, the cytotoxic agent may be a radioisotope or toxin.

В настоящем изобретении предложено также антитело, которое специфически связывает TIE-2 лиганд человека. Это антитело может быть моноклонвльным или поликлональным. The present invention also provides an antibody that specifically binds a human TIE-2 ligand. This antibody may be monoclonal or polyclonal.

В настоящем изобретении предложен также способ выделения TIE-2 лиганда человека, включающий
а) соединение по крайней мере одного TIE-2 связывающего субстрата с твердой матрицей,
в) инкубирование субстрата а) с клеточным лизатом для того, чтобы этот субстрат образовал комплекс с любым ТIЕ-2 лигандом в клеточном лизате,
c) промывку твердой матрицы и
d) элюирование TIE-2 лиганда человека из соединенного субстрата.The present invention also provides a method for isolating TIE-2 human ligand, comprising
a) combining at least one TIE-2 binding substrate with a solid matrix,
c) incubating the substrate a) with a cell lysate so that this substrate forms a complex with any TIE-2 ligand in the cell lysate,
c) washing the solid matrix and
d) elution of the TIE-2 human ligand from the connected substrate.

В качестве субстрата может быть использовано любое вещество, которое специфически связывает TIE-2 лиганд человека. В одном из вариантов субстрат выбирают из группы, состоящей из анти-ТIЕ-2 лиганд-антитела, TIE-2 рецептора и TIE-2 рецепторного тела. В настоящем изобретении предложено также рецепторное тело, которое специфически связывает TIE-2 лиганд, а также терапевтическая композиция, включающая рецепторное тело в фармацевтически приемлемом носителе, и способ блокировки роста кровеносных сосудов у человека, включающий введение эффективного количества этой терапевтической композиции. As a substrate, any substance that specifically binds human TIE-2 ligand can be used. In one embodiment, the substrate is selected from the group consisting of an anti-TIE-2 ligand antibody, a TIE-2 receptor, and a TIE-2 receptor body. The present invention also provides a receptor body that specifically binds a TIE-2 ligand, as well as a therapeutic composition comprising a receptor body in a pharmaceutically acceptable carrier and a method for blocking human blood vessel growth, comprising administering an effective amount of this therapeutic composition.

В настоящем изобретении предложена также терапевтическая композиция, включающая TIE-2 лиганд человека или тело лиганда в фармацевтически приемлемом носителе, а также способ промотирования неоваскуляризации у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества терапевтической композиции. The present invention also provides a therapeutic composition comprising a human TIE-2 ligand or a ligand body in a pharmaceutically acceptable carrier, as well as a method for promoting neovascularization in a patient, comprising administering to the patient an effective amount of the therapeutic composition.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ идентификации клеток, которые экспрессируют TIE-2 рецептор, который включает контактирование клетки с детектируемо меченым TIE-2 лигандом или тело лиганда, в условиях, обеспечивающих связывание детектируемо меченого лиганда с TIE-2 рецептором, и определение того, связан ли детектируемо меченый лиганд с TIE-2 рецептором, идентифицируя тем самым клетки как клетки, экспрессирующие TIE-2 рецептор. В настоящем изобретении предложена также терапевтическая композиция, включающая TIE-2 лиганд или тело лиганда и конъюгированный с ним цитотоксический агент. Цитотоксическим агентом может быть радиоизотоп или токсин. In addition, the present invention provides a method for identifying cells that express a TIE-2 receptor, which comprises contacting a cell with a detectably labeled TIE-2 ligand or a ligand body, under conditions that allow binding of the detectably labeled ligand to the TIE-2 receptor, and determining whether a detectably labeled ligand is bound to the TIE-2 receptor, thereby identifying cells as cells expressing the TIE-2 receptor. The present invention also provides a therapeutic composition comprising a TIE-2 ligand or a ligand body and a cytotoxic agent conjugated thereto. The cytotoxic agent may be a radioisotope or toxin.

В настоящем изобретении предложен способ определения экспрессии TIE-2 лиганда за счет клеток, который включает получение мРНК из клеток, содержащих мРНК с мечеными молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими TIE-2 лиганд, в условиях гибридизации, определение наличия мРНК, гибридизованных с мечеными молекулами и тем самым определение экспрессии TIE-2 лиганда в клетках. The present invention provides a method for determining the expression of TIE-2 ligand due to cells, which involves obtaining mRNA from cells containing mRNA with labeled nucleic acid molecules encoding a TIE-2 ligand under hybridization conditions, determining the presence of mRNA hybridized with labeled molecules and thereby determining the expression of TIE-2 ligand in cells.

В настоящем изобретении предложен также способ определения TIE-2 лиганда в срезах тканей, который включает осуществление контакта этих срезов тканей с мечеными молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими TIE-2 лиганд, в условиях гибридизации, определение присутствия мРНК, гибридизованной с меченой молекулой, определяя тем самым экспрессию TIE-2 лиганда в срезах тканей. The present invention also provides a method for determining TIE-2 ligand in tissue sections, which comprises contacting these tissue sections with labeled nucleic acid molecules encoding a TIE-2 ligand under hybridization conditions, determining the presence of mRNA hybridized with a labeled molecule, thereby determining expression of TIE-2 ligand in tissue sections.

ПРИМЕР 1. Идентификация клеточной линии АВАЕ как репортерных клеток для TIE-2 рецептора. EXAMPLE 1. Identification of the ABAE cell line as reporter cells for the TIE-2 receptor.

Взрослые ВАЕ клетки зарегистрированы в Европейском депозитории клеточных культур под регистрационным номером ЕСАСС 92010601 (см. PNAS, 75: 2621, 1978). Норзерн(РНК)-анализ выявил умеренные уровни tie-2 транскриптов в АВАЕ (взрослый бычий артериальный эндотелий = Adult Bovine Arterial Endothelial) клеточной линии, консистентных с ин ситу результатами гибридизации, что демонстрирует почти исключительную локализацию tie-2 РНК на сосудистых эндотелиальных клетках. Поэтому были исследованы АВАЕ клеточные лизаты на предмет присутствия TIE-2 протеина, а также с точки зрения степени, с которой этот TIE-2 протеин тирозин-фосфорилирован в нормальных условиях роста. АВАЕ клеточные лизаты собирают и иммуноосаждают с последующим Вестерн-блоттингом иммуноосажденных протеинов за счет ТIЕ-2 специфической и фосфотирозин-специфической антисыворотки. Пропуск или включение TIE-2 пептидов, как специфически блокирующих молекул, во время TIE-2 иммуноосаждения позволяет однозначно определять TIE-2 как умеренно детектируемый протеин примерно 150 кД, уровни фосфотирозина которого в стабильном состоянии уменьшаются до почти недектируемых уровней из-за предшествующего сывороточного голодания клеток. Adult BAE cells are registered with the European Cell Culture Depository under ECACC registration number 92010601 (see PNAS 75: 2621, 1978). Northern (RNA) analysis revealed moderate levels of tie-2 transcripts in ABAE (adult bovine arterial endothelium = Adult Bovine Arterial Endothelial) cell lines consistent with hybrid results, which demonstrates the almost exclusive localization of tie-2 RNA on vascular endothelial cells. Therefore, ABAE cell lysates were examined for the presence of TIE-2 protein, as well as for the extent to which this TIE-2 protein is tyrosine-phosphorylated under normal growth conditions. ABAE cell lysates are collected and immunoprecipitated, followed by Western blotting of the immunoprecipitated proteins due to TIE-2 specific and phosphotyrosine-specific antiserum. The omission or inclusion of TIE-2 peptides as specifically blocking molecules during TIE-2 immunoprecipitation allows us to unambiguously identify TIE-2 as a moderately detectable protein of approximately 150 kDa, whose stable phosphotyrosine levels are reduced to almost undetectable levels due to previous serum starvation cells.

Культивирование АВАЕ клеток и сбор клеточных лизатов осуществляют следующим образом. АВАЕ клетки с низким числом пассажей высевают в виде монослоя с плотностью 2•10⁶ клеток/150 мм в пластиковые чашки Петри (Falcon) и культивируют в Дюльбеко модифицированной среде Игла (DMEM), содержащей 10% телячью сыворотку (10% BCS), 2 мM L-глутамина (Q) и 1% каждого из пенициллина и стрептомицина (P-S) в атмосфере 5% СО₂. Перед сбором клеточного лизата клетки подвергают сывороточному голоданию в течение 24 часов в DMEM(Q)P-S с последующей аспирацией среды и промывкой пластин ледяным буферированным фосфатом физиологическим раствором (РВS), дополненным ортованадатом натрия, фторидом натрия и бензамидином натрия. Клетки подвергают лизису в небольшом объеме этого промывочного буфера, который был дополнен 1% NP40 детергента и ингибиторами протеазы, PMSF и апротинином. Нерастворимые осколки удаляют из клеточных лизатов за счет центрифугирования при 14000 g в течение 10 минут при 4^oС и надосадочные жидкости иммуноосаждают антисывороткой, специфической для TIE-2 рецептора, с добавлением (или без добавления) блокирующих пептидов к примерно 20 мкг/мл лизата. Иммуноосажденные протеины разделяют за счет PAGE (7,5% Laemmli гель), а затем осуществляют электроперенос на PVDF мембрану и инкубируют либо с различными TIE-2, либо с фосфотирозин-специфической антисывороткой. ТIЕ-2-протеин визуализируют за счет инкубирования мембран с HRP-связанной вторичной антисывороткой с последующей обработкой ECL реагентом (Amersham).The cultivation of ABAE cells and the collection of cell lysates is as follows. ABAE cells with a low number of passages are seeded as a monolayer with a density of 2 • 10 ⁶ cells / 150 mm in plastic Petri dishes (Falcon) and cultured in Dulbeco modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% calf serum (10% BCS), 2 mM L-glutamine (Q) and 1% of each of penicillin and streptomycin (PS) in an atmosphere of 5% CO ₂ . Before collecting the cell lysate, the cells are subjected to serum starvation for 24 hours in DMEM (Q) PS, followed by aspiration of the medium and washing the plates with ice-cold phosphate buffered saline (PBS) supplemented with sodium orthovanadate, sodium fluoride and sodium benzamidine. Cells are lysed in a small volume of this wash buffer, which was supplemented with 1% NP40 detergent and protease inhibitors, PMSF and aprotinin. Insoluble fragments are removed from the cell lysates by centrifugation at 14,000 g for 10 minutes at 4 ^° C and the supernatants are immunoprecipitated with a TIE-2 receptor specific antiserum with or without blocking peptides added to approximately 20 μg / ml lysate. The immunoprecipitated proteins are separated by PAGE (7.5% Laemmli gel), and then electrically transferred to the PVDF membrane and incubated with either different TIE-2 or phosphotyrosine-specific antiserum. TIE-2 protein is visualized by incubating membranes with HRP-linked secondary antiserum, followed by ECL reagent treatment (Amersham).

ПРИМЕР 2. Клонирование и экспрессия TIE-2 рецепторных тел для основанных на афинности исследований взаимодействий TIE-2 лиганда. EXAMPLE 2. Cloning and expression of TIE-2 receptor bodies for affinity-based studies of the interactions of TIE-2 ligand.

Создают такую экспрессионную конструкцию, которая может секретировать протеин, состоящий из полной внеклеточной части крысиного TIE-2 рецептора, слитого с постоянным участком гамма-2 иммуноглобулина человека (IgGl Fc). Этот протеин слияния называют TIE-2 "рецепторным телом" (RB) и обычно можно ожидать, что он существует как димер в растворе, за счет образования дисульфидных связей между отдельными IgGl Fc хвостами. Fc часть TIE-2 RB получают следующим образом. ДНК фрагмент, кодирующий Fc часть IgGl человека, который простирается от шарнирного участка до карбоксиконца протеина, был амплифицирован из кДНК плаценты человека за счет PCR с олигонуклеотидами, соответствующими последовательности IgGl человека, полученный ДНК фрагмент клонируют в плазмидный вектор. Соответствующие ДНК рестрикционные фрагменты из плазмиды, кодирующей полноразмерный TIE-2 рецептор, и из плазмиды Iggl Fc человека лигируют с каждой из сторон короткого РСR-полученного фрагмента, который был сконструирован так, чтобы сливать, в рамке, TIE-2 и человеческий IgGl Fc протеин-кодирующие последовательности. Таким образом, полученный протеин слияния TIE-2 эктодомен-FC, точно замещает IgGl Fc вместо участка, охватывающего TIE-2 трансмембранный и цитоплазмический домены. Альтернативный способ получения RB раскрыт у Goodwin et al., Cell, 73: 447-456, 1993. An expression construct is created that can secrete a protein consisting of the complete extracellular portion of the rat TIE-2 receptor fused to a constant region of human gamma-2 immunoglobulin (IgGl Fc). This fusion protein is called TIE-2 “receptor body” (RB) and it can usually be expected to exist as a dimer in solution, due to the formation of disulfide bonds between individual IgGl Fc tails. The Fc portion of TIE-2 RB is prepared as follows. The DNA fragment encoding the Fc portion of human IgGl, which extends from the hinge region to the carboxy terminus of the protein, was amplified from human placenta cDNA by PCR with oligonucleotides corresponding to the human IgGl sequence, the resulting DNA fragment is cloned into a plasmid vector. The corresponding DNA restriction fragments from the plasmid encoding the full-length TIE-2 receptor and from the human Iggl Fc plasmid are ligated on each side of the short PCR-derived fragment, which was designed to merge, framed, TIE-2 and human IgGl Fc protein coding sequences. Thus, the obtained TIE-2 ectodomain-FC fusion protein precisely replaces IgGl Fc in place of the region spanning the TIE-2 transmembrane and cytoplasmic domains. An alternative method for producing RB is disclosed in Goodwin et al., Cell, 73: 447-456, 1993.

Миллиграммовые количества TIE-2 RB получают за счет клонирования TIE-2 RВ ДНК фрагмента в pVL1393 бакуловирусный вектор и последующего инфицирования Spodoptera frugiperda SF-21AE клеточной линии насекомых. В другом варианте можно использовать клеточную линию SF-9 (АТСС регистрационный N CRL-1711) или клеточную линию BTI-TN-5bl-4. ДНК, кодирующую TIE-2 RB, клонируют как EcoRI-Notl фрагмент в бакуловирусную плазмиду переноса pVL 1393. Плазмидную ДНК, очищенную за счет центрифугирования с градиентом плотности цезийхлорида рекомбинируют с вирусной ДНК, смешивая 3 мкг плазмидной ДНК с 0,5 мкг Baculo-Gold ДНК (Pharminigen), с последующим введением в липосомы, используя 30 мкг липофектина (Lipofectin, GIBCO-BRL). Смеси ДНК-липосома добавляют к F-21AE клеткам (2•10⁶ клеток/60 мм чашку) в среде TMN-FH, модифицированная Grace среда для клеток насекомых (GIBCO-BRL), в течение 5 часов при 27^oС, в течение 5 дней в TMN-FH среде, дополненной 5% фетальной телячей сывороткой. Среду тканевых культур собирают для бляшкового очищения рекомбинантных вирусов, что осуществляют описанным ранее способом (O'Reilly D.R., L. K. Miller and V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual. , 1992, New York: W.H. Freeman) за исключением того, что агарозный поверхностный слой содержит 125 мкг/мл X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида, GIBCO-BRL). Через 5 дней инкубирования при 27^oС нерекомбинантные бляшки оценивают по позитивной хромогенной реакции на Х-gаl субстрате и отмечают их положения. Затем визуализируют рекомбинантные бляшки, добавляя второй поверхностный слой, содержащий 100 мкг/мл МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид, Sigma). Предполагаемые рекомбинантные вирусные бляшки отбирают за счет аспирации бляшек и очищают за счет множественных циклов выделения бляшек для обеспечения гомогенности. Запас вирусов создают за счет серийного с низкой множественностью пассажа очищенного бляшками вируса. Получают запас низкого пассажа одного вирусного клона (vTIE-2 рецепторное тело).Milligram amounts of TIE-2 RB are obtained by cloning a TIE-2 RB DNA fragment into a pVL1393 baculovirus vector and subsequent infection with an insect cell line Spodoptera frugiperda SF-21AE. In another embodiment, you can use the cell line SF-9 (ATCC registration N CRL-1711) or cell line BTI-TN-5bl-4. DNA encoding TIE-2 RB is cloned as an EcoRI-Notl fragment into the baculovirus transfer plasmid pVL 1393. Plasmid DNA purified by centrifugation with a density gradient of cesium chloride is recombined with viral DNA by mixing 3 μg of plasmid DNA with 0.5 μg of Baculo-Gold DNA (Pharminigen), followed by introduction into liposomes using 30 μg lipofectin (Lipofectin, GIBCO-BRL). Mixtures of DNA liposomes are added to F-21AE cells (2 x 10 ⁶ cells / 60 mm dish) in TMN-FH medium, Grace modified insect cell medium (GIBCO-BRL), for 5 hours at 27 ^° C, over 5 days in TMN-FH medium supplemented with 5% fetal calf serum. Tissue culture media were harvested for plaque purification of recombinant viruses, as described previously (O'Reilly DR, LK Miller and VA Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual., 1992, New York: WH Freeman) except that agarose the surface layer contains 125 μg / ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, GIBCO-BRL). After 5 days of incubation at 27 ^° C, non-recombinant plaques are evaluated by a positive chromogenic reaction on the X-gal substrate and their positions are noted. Recombinant plaques were then visualized by adding a second surface layer containing 100 μg / ml MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma). Putative recombinant viral plaques are selected by aspiration of the plaques and purified by multiple plaque isolation cycles to ensure homogeneity. The stock of viruses is created by serial passage with a low multiplicity of passage of plaque-purified virus. A low passage stock of one viral clone (vTIE-2 receptor body) is obtained.

SF-21AE клетки культивируют в среде, не содержащей сыворотки (SF-900 II, Gibco BRL), содержащей раствор IX антибиотик/антимикотик (Gibco BRL) и 25 мг/л гентамицина (Gibco BRL). В качестве поверхностно активного агента добавляют Pluronic F-68 до конечной концентрации 1 г/л. Культуры (4 л) выращивают в биореакторе (Artisan Cell Station System) в течение по крайней мере трех дней перед инфицированием. Клетки выращивают при 27^oС, газируя до 50% растворенным кислородом, при скорости газового потока 80 мл/мин (аэрация с распылением по кольцу). Перемешивание осуществляют с помощью турбинки со скоростью 100 об/мин. Клетки собирают в средней логарифмической фазе роста (примерно 2•10⁶ клеток на 1 мл), концентрируют за счет центрифугирования и инфицируют 5 бляшкообразующими единицами vTIE-2 рецепторным телом на клетку. Клетки и инокулюм доводят до 400 мл за счет свежей среды и вирус абсорбируют в течение 2 часов при 27^oС в спиннере. Затем культуру снова суспендируют до конечного объема 8 л свежей, не содержащей сыворотки среде, и клетки инкубируют в биореакторе, используя описанные ранее условия.SF-21AE cells are cultured in serum-free medium (SF-900 II, Gibco BRL) containing antibiotic / antimycotic solution IX (Gibco BRL) and 25 mg / L gentamicin (Gibco BRL). As a surface active agent, Pluronic F-68 is added to a final concentration of 1 g / L. Cultures (4 L) were grown in a bioreactor (Artisan Cell Station System) for at least three days before infection. Cells are grown at 27 ^o C, aerating up to 50% dissolved oxygen, at a gas flow rate of 80 ml / min (aeration with spraying on the ring). Mixing is carried out using a turbine at a speed of 100 rpm Cells are harvested in the middle logarithmic growth phase (approximately 2 x 10 ⁶ cells per 1 ml), concentrated by centrifugation and infected with 5 plaque-forming units of vTIE-2 receptor body per cell. The cells and inoculum are adjusted to 400 ml with fresh medium and the virus is absorbed for 2 hours at 27 ^{° C.} in a spinner. The culture is then resuspended to a final volume of 8 L of fresh, serum-free medium, and the cells are incubated in the bioreactor using the previously described conditions.

Культуральную среду клеток SF21AE, инфицированных TIE 2 рецепторным телом, собирают за счет центрифугирования (500 g, 10 минут) через 72 часа после инфицирования. Надосадочные жидкости доводят до рН 8 за счет NaOH. Добавляют ЕДТА до конечной концентрации 10 мМ и рН надосадочной жидкости снова доводят до 8. Надосадочную жидкость фильтруют (0,45 мкм, Millipore) и помещают на протеин А колонку (протеин А сефароза 4, быстрый поток или HiTrapp протеин А, обе от Pharmacia). Колонки промывают PBS, содержащим 0,5 М NaCl, до тех пор, пока поглощение при 280 нМ не падает до базовой линии. Колонку промывают PBS и элюируют 0,5 М уксусной кислотой. Фракции колонки немедленно нейтрализуют, элюируя в ампулы, содержащие 1 М трис, рН 9. Пиковые фракции, содержащие TIE-2 PB, собирают и диализуют против PBS. The culture medium of SF21AE cells infected with the TIE 2 receptor body is harvested by centrifugation (500 g, 10 minutes) 72 hours after infection. The supernatants were adjusted to pH 8 with NaOH. EDTA was added to a final concentration of 10 mM and the supernatant pH was again adjusted to 8. The supernatant was filtered (0.45 μm, Millipore) and placed on a Protein A column (Protein A Sepharose 4, Fast Flow or HiTrapp Protein A, both from Pharmacia) . The columns are washed with PBS containing 0.5 M NaCl until the absorption at 280 nM drops to the baseline. The column was washed with PBS and eluted with 0.5 M acetic acid. Column fractions were immediately neutralized, eluting into ampoules containing 1 M Tris, pH 9. Peak fractions containing TIE-2 PB were collected and dialyzed against PBS.

ПРИМЕР 3. Демонстрация того факта, что TIE-2 играет решающую роль в развити сосудистой сети. EXAMPLE 3. Demonstration of the fact that TIE-2 plays a crucial role in the development of the vascular network.

Учитывая отсутствие известного лиганда для TIE-2 рецептора, разумно было бы предположить, что это может дать возможность выяснить функции TIE-2 за счет введения "избытка" растворимых TIE-2 рецепторных тел (TIE-2 RB) в развивающуюся систему. Потенциальная способность TIE-2 RB связывать и тем самым нейтрализовать доступные ТIЕ-2 лиганды может привести к наблюдаемому нарушению нормального развития сосудов и к характеризации лиганда. Для исследования того, можно ли использовать TIE-2 RВ для нарушения развития сосудов у ранних эмбрионов цыплят, небольшие кусочки биологически поглощающей пены смачивают TIE-2 RB и немедленно помещают под хориоаллантоевую мембрану в положении непосредственно сбоку от примитивного эмбриона. Given the lack of a known ligand for the TIE-2 receptor, it would be reasonable to assume that this may make it possible to clarify the functions of TIE-2 by introducing an "excess" of soluble TIE-2 receptor bodies (TIE-2 RB) into the developing system. The potential ability of TIE-2 RB to bind and thereby neutralize the available TIE-2 ligands can lead to the observed disruption of the normal development of blood vessels and to the characterization of the ligand. To investigate whether TIE-2 RB can be used to impair vascular development in early chick embryos, small pieces of biologically absorbing foam are wetted with TIE-2 RB and immediately placed under the chorioallanto membrane in a position directly to the side of the primitive embryo.

Ранний эмбрион цыпленка развивается сверху желтка из небольшого диска клеток, который покрыт хориоаллантоевой мембраной (САМ). Эндотелиальные клетки, которые должны выстилать сосудистую сеть в эмбрионе, образуются как из вне-, так и внутриэмбрионных клеток. Экстраэмбрионально полученные эндотелиальные клетки, которые обеспечивают основной источник эндотелиальных клеток в эмбрионе, происходит из участков мезенхимы, которая расположена по бокам вокруг собственно эмбриона, непосредственно под САМ. По мере того, как эти мезенхимные клетки зреют, они становятся источниками общего потомства как эндотелиальных, так и гемопоэтических клеточных линий, называемых гемангиобластами. В свою очередь, гемангиобласты служат источником смешанных популяций ангиобластов (потомства эндотелиальных клеток) и гемоцитобластов (полипотенциальный гемопоэтический предшественник). Образование рудиментов циркуляторной системы начинается, когда потомство эндотелиальных клеток разделяется с образованием пузырька толщиной в одну клетку, который окружает примитивную кровяную клетку. Пролиферация и миграция этих клеточных компонентов приводит к образованию сети заполненных кровью микрососудов под САМ, что в конечном счете охватывает эмбрион и соединяется с ограниченными, интраэмбрионально полученными сосудистыми элементами. An early chicken embryo develops on top of the yolk from a small disk of cells that is covered with a chorioallantoic membrane (CAM). Endothelial cells, which should line the vasculature in the embryo, are formed from both extra- and intraembryonic cells. Extraembryonic obtained endothelial cells, which provide the main source of endothelial cells in the embryo, come from sections of the mesenchyme, which is located on the sides around the embryo itself, directly below the CAM. As these mesenchymal cells mature, they become sources of common offspring of both endothelial and hematopoietic cell lines called hemangioblasts. In turn, hemangioblasts serve as a source of mixed populations of angioblasts (offspring of endothelial cells) and hemocytoblasts (polypotential hematopoietic precursor). The formation of the vestiges of the circulatory system begins when the offspring of endothelial cells is separated with the formation of a bubble one cell thick, which surrounds the primitive blood cell. The proliferation and migration of these cellular components leads to the formation of a network of blood-filled microvessels under the CAM, which ultimately encompasses the embryo and combines with limited, intraembryonic-derived vascular elements.

Недавно оплодотворенные куриные яйца, полученные от Spafas, Inc. (Boston, МА) инкубируют при 99,5^oF (37,5^oС), 55% RH. Примерно после 24 часов развития яичную скорлупу промывают 70% этанолом и с помощью зубоврачебного бора делают отверстие 1,5 см в тупом конце каждого яйца. Мембрану скорлупы удаляют для создания воздушного пространства непосредственно над эмбрионом. Вырезают небольшие прямоугольные кусочки стерильной Gelfoam (Upjohn) скальпелем и смачивают равными концентрациями либо TIE-2, либо ЕНК-1 рецепторных тел. ЕНК-1 рецепторное тело получают, как было указано ранне в примере 2, используя ЕНК-1 внеклеточный домен вместо TIE-2 внеклеточного домена (Maisonpierre et al. , Oncogene, 8: 3277-3288, 1993). Каждый кусочек пены геля абсорбирует примерно 6 мкг протеина в 30 мкл. Стерильный пинцет часового мастера используют для создания маленького отверстия в САМ в положении в нескольких мм сбоку от примитивного эмбриона. Большую часть кусочка RВ-смоченной Gelfoam помещают под САМ и яичную скорлупу закрывают кусочками липкой ленты. Другие яйца той же стадии развития обрабатывают параллельно RB неродственной, нейронно экспрессированной рецепторной тирозинкиназой, ЕНК-1 (Maisonpierre et al., Oncogene, 8: 3277-3288, 1993). Развитию дают возможность протекать 4 дня, а затем эмбрион исследуют на предмет визуального исследования. Эмбрионы удаляют, осторожно разбивая скорлупу в чашки с подогретым RВ, и осторожно вырезают эмбрион из окружающего САМ. Из 12 яиц, обработанных каждое RВ, 6 TIE-2 RВ и 5 ЕНК-1 RВ обработанных эмбрионов развились после стадии наблюдения в начале эксперимента. Разительная разница наблюдается между этими развитыми эмбрионами, что видно на фиг.1А и 1В. Те, что были обработаны ЕНК-1 RB, по-видимому, развивались относительно нормально. Четыре из пяти ЕНК-1 эмбрионов были жизнеспособны, о чем можно было судить по биениям сердца. Более того, экстраэмбриональная сосудистая сеть, которая визуально была очевидна из-за присутствия красных кровяных клеток, проникала и простиралась на несколько сантиметров вбок под САМ. Напротив, те, что были обработаны TIE-2 RВ, были сильно ограничены, имели всего 2-5 мм в диаметре по сравнению с диаметром 10 мм для ЕНК-1 RB эмбрионов. Все эмбрионы, обработанные TIE-2 RВ, погибли, и их САМ были лишены кровеносных сосудов. Способность TIE-2 RB блокировать развитие сосудов у цыплят демонстрирует, что TIE-2 лиганд необходим для развития сосудистой системы.Recently Fertilized Chicken Eggs Obtained from Spafas, Inc. (Boston, MA) are incubated at 99.5 ^° F (37.5 ^° C), 55% RH. After approximately 24 hours of development, the eggshell is washed with 70% ethanol and a 1.5 cm hole is made in the blunt end of each egg using dental bur. The shell membrane is removed to create air space directly above the embryo. Small rectangular pieces of sterile Gelfoam (Upjohn) are cut with a scalpel and moistened with equal concentrations of either TIE-2 or EHC-1 receptor bodies. The ENK-1 receptor body is obtained, as indicated earlier in Example 2, using the ENK-1 extracellular domain instead of the TIE-2 extracellular domain (Maisonpierre et al., Oncogene, 8: 3277-3288, 1993). Each piece of gel foam absorbs approximately 6 μg of protein in 30 μl. The watchmaker's sterile tweezers are used to create a small hole in the SAM in a position a few mm on the side of the primitive embryo. Most of a piece of RV-wetted Gelfoam is placed under the CAM and the eggshell is covered with pieces of adhesive tape. Other eggs of the same developmental stage are treated parallel to RB with an unrelated, neuronically expressed receptor tyrosine kinase, EHC-1 (Maisonpierre et al., Oncogene, 8: 3277-3288, 1993). Development is allowed to flow for 4 days, and then the embryo is examined for visual examination. The embryos are removed by carefully breaking the shell into cups with warmed RB, and the embryo is carefully cut out from the surrounding CAM. Of the 12 eggs treated with each RB, 6 TIE-2 RB and 5 ENK-1 RB treated embryos developed after the observation stage at the beginning of the experiment. A striking difference is observed between these developed embryos, as can be seen in FIGS. 1A and 1B. Those that were treated with EHC-1 RB seemed to develop relatively normal. Four of the five EHC-1 embryos were viable, as judged by heartbeats. Moreover, the extraembryonic vasculature, which was visually evident due to the presence of red blood cells, penetrated and extended several centimeters sideways under the CAM. In contrast, those treated with TIE-2 RB were very limited, having only 2-5 mm in diameter compared to 10 mm in diameter for ENK-1 RB embryos. All embryos treated with TIE-2 RB died and their CAMs were devoid of blood vessels. The ability of TIE-2 RB to block vascular development in chickens demonstrates that the TIE-2 ligand is necessary for the development of the vascular system.

ПРИМЕР 4. Идентификация активности специфического связывания TIE-2 в кондиционированной среде из ras-онкоген-трансформированной клеточной линии С2С12 мышиных миобластов. EXAMPLE 4. Identification of the activity of specific binding of TIE-2 in a conditioned medium from a ras-oncogen-transformed mouse myoblast C2C12 cell line.

Скринирование в 10 раз концентрированной клеточной кондиционированной среды (10х ССМ) из различных клеточных линий на предмет присутствия растворимой TIE-2 специфической связывающей активности (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NY) выявляет связывающую активность в не содержащей сыворотки среде от онкогенно-ras-трансформированных С2С12 клеток (C2C12-ras), RAT 2-ras (что является ras-трансформированной фибробластной клеточной линией), глиобластомы E98G человека и нейробластомной клеточной линии, известной как SHEP-1. Screening 10 times concentrated cell conditioned medium (10x CCM) from various cell lines for the presence of soluble TIE-2 specific binding activity (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NY) reveals binding activity in serum-free medium from oncogene-ras-transformed C2C12 cells (C2C12-ras), RAT 2-ras (which is a ras-transformed fibroblast cell line), human glioblastoma E98G, and a neuroblastoma cell line known as SHEP-1.

C2C12-ras 10х ССМ, исходно полученные из стабильно-трансфектированной линии С2С12 миобластов, которые были онкогенно трансформированы за счет трансфекции Т-24 мутантами H-ras стандартными методами с использованием кальцийфосфата. Неомицин-устойчивая экспрессионная плазмида на основе SV40, была физически связана с ras экспрессионной плазмидой для того, чтобы сделать возможной селекцию трансфектированных клонов. Полученные G418 устойчивые ras-C2C12 клетки обычным образом поддерживают в виде монослоя на пластиковых чашках в ДМЕМ/глутамин/пенициллин-стрептомицин среде, дополненной 10% фетальной телячей сывороткой (FCS). Не содержащие сыворотки C2C12-ras 10х ССМ получают, высевая клетки при 60% конфлюентности на не содержащую сыворотки определенную среду на 12 часов. (Zhan and Goldfarb, Mol. Cell Biol., 6: 3541-3544, 1986; Zhan et al., Oncogene, 1: 369-376, 1987). Среду сливают и заменяют на свежую DMEM/Q/P-S на 24 часа. Эту среду собирают и клетки снова подкармливают свежей DMEM/Q/P-S, которую также собирают еще через 24 часа. Эти ССМ дополняют ингибиторами протеазы PMSF (1 мM) и апротинином (10 мкг/мл) и концентрируют в 10 раз на стерильных мембранах эксклюзии по размерам (Amicon). TIE-2 связывающую активность можно нейтрализовать за счет инкубирования среды с избытком ТIЕ-2 RВ, но не за счет инкубирования с ЕНК-1 RВ, перед BIAcore анализом. C2C12-ras 10x CCM, originally obtained from a stably transfected C2C12 line of myoblasts that were tumorigenically transformed by transfection of T-24 with H-ras mutants using standard methods using calcium phosphate. Neomycin-resistant SV40-based expression plasmid was physically linked to the ras expression plasmid in order to enable selection of transfected clones. The obtained G418 resistant ras-C2C12 cells are routinely maintained as a monolayer on plastic plates in DMEM / glutamine / penicillin-streptomycin medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS). Serum-free C2C12-ras 10x CCMs are obtained by plating cells at 60% confluency on a serum-free specific medium for 12 hours. (Zhan and Goldfarb, Mol. Cell Biol., 6: 3541-3544, 1986; Zhan et al., Oncogene, 1: 369-376, 1987). The medium is drained and replaced with fresh DMEM / Q / P-S for 24 hours. This medium is harvested and the cells are fed again with fresh DMEM / Q / P-S, which is also harvested after another 24 hours. These CCMs are supplemented with PMSF protease inhibitors (1 mM) and aprotinin (10 μg / ml) and are concentrated 10 times on sterile size exclusion membranes (Amicon). TIE-2 binding activity can be neutralized by incubating the medium with an excess of TIE-2 RB, but not by incubating with ENK-1 RB, before BIAcore analysis.

Связывающую активность 10х ССМ определяют, используя биосенсорную технологию (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), которая позволяет контролировать биомолекулярные взаимодействия в реальном времени за счет резонанса плазмона поверхности. Очищенные TIE-2 RВ ковалентно связаны за счет первичных аминов с карбоксиметилдекстрановым слоем СМ5 сенсорного чипа исследовательской степени чистоты (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Поверхность сенсорного чипа активируют, используя смесь N-гидроксисукцинимида (NHS) и N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЕДС), с последующей иммобилизацией TIE-2 RB (25 мкг/мл, рН 4,5) и дезактивацией непрореагировавших сайтов за счет 1,0 М этаноламина (рН 8,5). Поверхность негативного контроля ЕНК-1 рецепторного тела подготавливают аналогичным образом. The binding activity of 10x CCM is determined using biosensor technology (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), which allows you to control biomolecular interactions in real time due to surface plasmon resonance. Purified TIE-2 RBs are covalently coupled via primary amines to the CM5 carboxymethyldextran layer of a sensor chip of research grade (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). The surface of the sensor chip is activated using a mixture of N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDS), followed by immobilization of TIE-2 RB (25 μg / ml, pH 4.5) and deactivation of unreacted sites due to 1.0 M ethanolamine (pH 8.5). The negative control surface of the EHC-1 receptor body is prepared in a similar manner.

Промывочным буфером в этой системе является HBS (10 мM Hepes, 3,4 мМ ЕДТА, 150 мМ NaCl, 0,005% Р20 ПАВ, рН 7,4). 10х ССМ образцы центрифугируют в течение 15 минут при 4^oС и далее осветляют, используя стерильный, связывающий низкие протеины фильтр 0,45 мкМ Millipore, Bedford, MA). К каждому образцу ССМ добавляют декстран (2 мг/мл) и Р20 поверхностно-активный агент (0,005%). Аликвоты по 40 мкл инъектируют через иммобилизованную поверхность (либо TIE-2, либо ЕНК-1) при скорости потока 5 мкл/мин и в течение 8 минут регистрируют рецепторное связывание. Активность связывания (ед. резонанса, RU) определяют как разность между базовым значением, определяемым за 30 сек перед инъекцией образца, и величиной, полученной через 30 сек после инъекции. Регенерация поверхности осуществляется за счет одного 12-мкл импульса 3М МgСl₂.The wash buffer in this system is HBS (10 mM Hepes, 3.4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.005% P20 surfactant, pH 7.4). 10x CCM samples were centrifuged for 15 minutes at 4 ^° C and then clarified using a sterile, low protein binding filter 0.45 μM Millipore, Bedford, MA). Dextran (2 mg / ml) and P20 surface active agent (0.005%) are added to each CCM sample. Aliquots of 40 μl are injected through the immobilized surface (either TIE-2 or ENK-1) at a flow rate of 5 μl / min and receptor binding is recorded for 8 minutes. Binding activity (resonance unit, RU) is defined as the difference between the baseline value determined 30 seconds before injection of the sample and the value obtained 30 seconds after injection. Surface regeneration is carried out due to one 12-μl pulse 3M MgCl ₂ .

Приборный уровень шума составляет 20 RU; поэтому любую связывающую активность с сигналом выше 20 RU можно интерпретировать как реальное взаимодействие с рецептором. Для C2C12-ras кондиционированной среды связывающие активности оказываются в интервале 60-90 RU для TIE-2 RB иммобилизованной поверхности. Для тех же самых образцов, проанализированных на ЕНК-1 RB иммобилизованной поверхности, измеренные активности оказались менее 35 RU. Специфическое связывание с TIE-2 рецепторным телом оценивают, инкубируя образцы с избытком либо растворимого TIE-2, либо ЕНК-1 RB перед анализом активности связывания. Добавление растворимого ЕНК-1 RB не оказывает влияния на TIE-2 связывающую активность для любого образца, тогда как в присутствии растворимого TIE-2 связывание с поверхностью оказывается в 2-30 раз меньше, нежели величина, измеренная в отсутствие TIE-2. Повторный анализ с использованием более чем в 50 раз концентрированного C2C12-ras ССМ приводит к четырехкратному усилению по сравнению с фоновым значением для сигнала специфического связывания TIE-2. The instrument noise level is 20 RU; therefore, any binding activity with a signal above 20 RU can be interpreted as a real interaction with the receptor. For the C2C12-ras conditioned medium, binding activities are in the range of 60-90 RU for the TIE-2 RB immobilized surface. For the same samples analyzed on the ENK-1 RB immobilized surface, the measured activities were less than 35 RU. Specific binding to the TIE-2 receptor body is assessed by incubating samples with an excess of either soluble TIE-2 or ENK-1 RB before binding activity analysis. The addition of soluble ENK-1 RB does not affect the TIE-2 binding activity for any sample, whereas in the presence of soluble TIE-2, surface binding is 2-30 times less than the value measured in the absence of TIE-2. Repeated analysis using more than 50-fold concentrated C2C12-ras CCM leads to a four-fold increase compared to the background value for the specific binding signal TIE-2.

ПРИМЕР 5. C2C12-ras ССМ содержит активность, которая индуцирует тирозин-фосфорилирование ТIЕ-2 рецептора. EXAMPLE 5. C2C12-ras CCM contains an activity that induces tyrosine phosphorylation of the TIE-2 receptor.

C2C12-ras 10х ССМ исследуют по способности индуцировать тирозинфосфорилирование TIE-2 в клетках АВАЕ. АВАЕ клетки после голодания по сыворотке кратковременно инкубируют с C2C12-ras CCM, подвергают лизису и иммуноосаждают, а затем проводят Вестерн-блоттинг описанным ранее способом. Стимулирование голодающих по сыворотке АВАЕ клеток, не содержащих сыворотки C2C12-ras 10х ССМ, осуществляют следующим образом. Среду АВАЕ клеток, подвергнутую голоданию, как описано ранее, удаляют и заменяют либо определенной средой, либо 10х CCM, которая была предварительно нагрета до 37^oС. Через 10 минут среду удаляют, а клетки дважды промывают на льду избытком охлажденной PBS, дополненной ортованадат(NaF)бензамидином. Клеточный лизис и TIE-2 специфическое иммуноосаждение осуществляют описанным ранее способом.C2C12-ras 10x SSMs are tested for their ability to induce tyrosine phosphorylation of TIE-2 in ABAE cells. ABAE cells, after serum starvation, are briefly incubated with C2C12-ras CCM, lysed and immunoprecipitated, and then Western blotting is performed as previously described. Stimulation of starving for serum ABAE cells that do not contain serum C2C12-ras 10x CCM, as follows. Fasting medium ABAE cells, as described previously, are removed and replaced with either a specific medium or 10x CCM, which was previously heated to 37 ^° C. After 10 minutes, the medium is removed and the cells are washed twice on ice with excess chilled PBS supplemented with orthovanadate ( NaF) with benzamidine. Cell lysis and TIE-2 specific immunoprecipitation are carried out as previously described.

АВАЕ клетки, инкубируемые в течение 10 минут с указанной средой, приводят к индуцированию TIE-2 тирозинфосфорилирования, тогда как инкубирование с C2C12-ras CCM стимулирует по крайней мере стократное усиление TIE-2 фосфорилирования. Эта активность почти полностью изчезает при предварительном инкубировании C2C12-ras 10х CCM в течение 90 минут при комнатной температуре с 13 мкг TIE-2 RB, фиксированными на протеин G-сефарозных шариках. Среда же при инкубировании с одной только протеин G-сефарозой не утрачивает этой активности фосфорилирования. ABAE cells incubated for 10 minutes with the indicated medium induce TIE-2 tyrosine phosphorylation, while incubation with C2C12-ras CCM stimulates at least a hundred-fold increase in TIE-2 phosphorylation. This activity almost completely disappears upon preliminary incubation of C2C12-ras 10x CCM for 90 minutes at room temperature with 13 μg of TIE-2 RB fixed on protein G-sepharose beads. When incubated with protein G-Sepharose alone, the medium does not lose this phosphorylation activity.

ПРИМЕР 6. Экспрессионное клонирование TIE-2 лиганда. EXAMPLE 6. Expression cloning of a TIE-2 ligand.

COS-7 клетки культивируют в модифицированной Дюльбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), по 1% каждого пенициллина и стрептомицина (P/S) и 2 мМ глутамина в атмосфере 5% СО₂. Клеточную линию мышиных миобластов С2С12 ras культивируют в минимальной необходимой среде Игла (ЕМЕМ) с 10% FBS, (P/S) и 2 мМ глутамина. Получают полной длины кДНК клоны мышиных TIE-2 лигандов за счет скринирования библиотеки С2С12 ras кДНК в pJFE14 векторе, экспрессированном в COS клетки. Этот вектор, как представлено на фиг.2, является модифицированной версией вектора pSRα (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol., 8: 466-472). Эту библиотеку создают, используя два BSTX1 рестрикционных сайта в pJFE14 векторе.COS-7 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 1% of each penicillin and streptomycin (P / S) and 2 mM glutamine in an atmosphere of 5% CO ₂ . The cell line of murine C2C12 ras mouse myoblasts was cultured in the minimum required Eagle medium (EMEM) with 10% FBS, (P / S) and 2 mM glutamine. Clone lengths of murine TIE-2 ligands were obtained by cDNA screening of the C2C12 ras cDNA library in the pJFE14 vector expressed in COS cells. This vector, as shown in FIG. 2, is a modified version of the pSRα vector (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol., 8: 466-472). This library is created using two BSTX1 restriction sites in the pJFE14 vector.

COS-7 клетки кратковременно трансфицируют либо pJFE14 библиотекой, либо контрольным вектором за счет DEAE-декстрантрансфекционной схемы. Короче говоря, COS-7 клетки высевают с плотностью 1,0•10⁶ клеток на 100 мм пластины за 24 часа до трансфекции. Для трансфекции клетки культивируют в не содержащей сыворотки DMEM, содержащей 400 мкг/мл DEAE-декстрана, 1 мкМ хлороквина и 2 мМ глутамина, и 1 мкг соответствующей ДНК в течение 3-4 часов при 37^oС в атмосфере 5% СО₂. Среду для трансфекции отсасывают и заменяют буферированным фосфатом физиологическим раствором с 10% ДМСО в течение 2-3 минут. После такого ДМСО "шока" COS-7 клетки помещают в DMEM с 10% FBS, по 1% каждого пенициллина и стрептомицина и 2 мМ глутамина на 48 часов.COS-7 cells are briefly transfected with either a pJFE14 library or a control vector due to a DEAE dextransfection scheme. In short, COS-7 cells are seeded at a density of 1.0 x 10 ⁶ cells per 100 mm plate 24 hours before transfection. For transfection, cells were cultured in serum-free DMEM containing 400 μg / ml DEAE-dextran, 1 μM chloroquine and 2 mm glutamine, and 1 μg of the corresponding DNA for 3-4 hours at 37 ^° C in an atmosphere of 5% CO ₂ . The transfection medium is aspirated and replaced with buffered phosphate saline with 10% DMSO for 2-3 minutes. After this DMSO “shock”, COS-7 cells were placed in DMEM with 10% FBS, 1% of each penicillin and streptomycin and 2 mM glutamine for 48 hours.

Так как TIE-2 лиганд секретируется, необходимо сделать клетки проницаемыми для определения связывания зонда рецепторного тела с лигандом. Через два дня после трансфекции клетки промывают PBS, a затем инкубируют с PBS, содержащим 1,8% формальдегида, в течение 15-30 минут при комнатной температуре. Затем клетки промывают XXX PBS и инкубируют в течение 15 минут с PBS, содержащим 0,1% Triton Х-100 и 10% телячей сыворотки для того, чтобы сделать клетки проницаемыми и блокировать сайты неспецифического связывания. Скринирование осуществляют за счет непосредственной локализации окрашивания, используя ТIЕ-2 рецепторное тело, которое состоит из внеклеточного домена TIE-2, слитого с постоянным участком IgGl. Это рецепторное тело получают, как представлено ранее в примере 2. 100 мм чашки с трансфектированными, фиксированными и сделанными проницаемыми клетками COS зондируют за счет инкубирования их в течение 30 минут с ТIЕ-2-RВ. Затем клетки дважды промывают РВS и инкубируют в течение дополнительных 30 минут с РBS (10% сыворотка теленка) конъюгат анти IgG-человека щелочная фосфатаза. После трех РВS промывок клетки инкубируют в субстрате щелочной фосфатазы в течение 30-60 минут. Затем чашки исследуют под микроскопом на присутствие окрашенных клеток. Для каждой из окрашенных клеток небольшой участок клеток, включающий эту окрашенную клетку, вырезают из чашки, используя кончик пластиковой пипетки, затем выделяют плазмидную ДНК и используют для электропорации бактериальных клеток. Отдельные колонии бактерий, полученные в результате электропорации, отбирают и полученную из этих колоний плазмидную ДНК используют для трансфекции COS-7 клеток, которые зондируют на предмет ТIЕ-2 лигандной экспресии, как доказательство связывания с ТIЕ-2 рецепторными телами. Это позволяет идентифицировать отдельные колонии, кодирующие TIE-2 лиганд. Подтверждение экспрессии TIE-2 лиганда получают за счет фосфорилирования TIE-2 рецептора, используя изложенный ранее в примере 5 способ. Плазмидный клон, кодирующий TIE-2 лиганд, депонирован в АТСС 7 октября 1994 г. и обозначен как "pJFE14, кодирующий TIE-2 лиганд" под регистрационным номером АТСС 75910. Since the TIE-2 ligand is secreted, it is necessary to make the cells permeable to determine the binding of the receptor body probe to the ligand. Two days after transfection, the cells are washed with PBS and then incubated with PBS containing 1.8% formaldehyde for 15-30 minutes at room temperature. The cells are then washed with XXX PBS and incubated for 15 minutes with PBS containing 0.1% Triton X-100 and 10% calf serum in order to make the cells permeable and block nonspecific binding sites. Screening is performed by directly localizing staining using the TIE-2 receptor body, which consists of the extracellular domain of TIE-2 fused to a constant IgGl site. This receptor body is prepared as described previously in Example 2. 100 mm plates with transfected, fixed and made permeable COS cells are probed by incubating them for 30 minutes with TIE-2-RB. The cells are then washed twice with PBS and incubated for an additional 30 minutes with PBS (10% calf serum) anti-human IgG conjugate alkaline phosphatase. After three PBS washes, cells are incubated in an alkaline phosphatase substrate for 30-60 minutes. The plates are then examined under a microscope for the presence of stained cells. For each of the stained cells, a small portion of the cells, including this stained cell, is excised from the dish using the tip of a plastic pipette, then plasmid DNA is isolated and used for electroporation of bacterial cells. Separate bacterial colonies obtained by electroporation were selected and plasmid DNA obtained from these colonies was used to transfect COS-7 cells that were probed for TIE-2 ligand expression, as evidence of binding to TIE-2 receptor bodies. This allows the identification of individual colonies encoding the TIE-2 ligand. Confirmation of the expression of the TIE-2 ligand is obtained by phosphorylation of the TIE-2 receptor using the method described previously in example 5. The plasmid clone encoding the TIE-2 ligand was deposited with ATCC on October 7, 1994 and designated as "pJFE14 encoding the TIE-2 ligand" under ATCC registration number 75910.

ПРИМЕР 7. Выделение и секвенирование полной длины кДНК клона, кодирующего TIE-2 лиганд человека. EXAMPLE 7. Isolation and sequencing of the full length of the cDNA of a clone encoding a human TIE-2 ligand.

кДНК библиотеку легких плода человека в лямбда-gt 10 (см. фиг.3) получают из Clontech Laboratories, Inc.(Palo Alto, CA). Бляшки высевают с плотностью 1,25•10⁶/20 х 20 см пластины и фильтры с отпечатками снимают в соответствии со стандартными процедурами (Sambrok et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , p. 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).A human fetal lung cDNA library in lambda-gt 10 (see FIG. 3) was obtained from Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA). Plaques were plated at a density of 1,25 • 10 ^6/20 × 20 cm plates and the filters with the prints removed in accordance with standard procedures (Sambrok et al, Molecular Cloning: . A Laboratory Manual, 2nd Ed, p 8.46, Cold Spring Harbor.. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

Выделение клонов tie-2 к лиганда человека осуществляют следующим образом. 2,2 kb Xhol-фрагмент из депонированного клона tie-2 лиганда (АТСС 75910, см. пример 6) метят за счет статистического примирования до специфической активности примерно 5•10⁸ имп./мин/нг. Гибридизацию осуществляют при 65^oС в гибридизационном растворе, содержащем 0,5 мг/мл ДНК спермы лосося. Фильтры промывают при 65^oС в 2 х SSC, 0,1% SDS и экспонируют на пленку Kodak XAR-5 в течение ночи при -70^oС. Позитивные фаги очищают. Лизаты фагов с высокими титрами из чистых фагов используют для выделения ДНК на Qiagen колонке, используя стандартную методику (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, 1995, каталог, стр. 36). Фаговую ДНК переваривают EcoRI для выделения клонированного кДНК фрагмента для последующего субклонирования. Лямбда фаговый вектор, содержащий ДНК tie-2 лиганда человека, депонируют в АТСС 26 октября 1994 г. под названием λgt10 кодирующий htie-2 лиганд 1 (АТСС регистрационный 75928). Фаговую ДНК можно непосредственно подвергнуть ДНК секвенированию по способу с использованием дидеоксицепной терминации (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74: 5463-5467).Isolation of tie-2 clones to the human ligand is as follows. 2.2 kb Xhol fragment from the deposited tie-2 ligand clone (ATCC 75910, see Example 6) was labeled by statistical priming to a specific activity of about 5 • 10 ⁸ cpm / ng. Hybridization is carried out at 65 ^{° C.} in a hybridization solution containing 0.5 mg / ml salmon sperm DNA. The filters are washed at 65 ^{° C.} in 2 x SSC, 0.1% SDS and exposed to Kodak XAR-5 film overnight at -70 ^° C. The positive phages are purified. High titer phage lysates from pure phages are used to isolate DNA on a Qiagen column using standard techniques (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, 1995, catalog, p. 36). Phage DNA is digested with EcoRI to isolate the cloned cDNA fragment for subsequent subcloning. A lambda phage vector containing human tie-2 ligand DNA was deposited in ATCC on October 26, 1994 under the name λgt10 encoding htie-2 ligand 1 (ATCC registration 75928). Phage DNA can be directly subjected to DNA sequencing by a method using dideoxy chain termination (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74: 5463-5467).

Субклонирование TIE-2 лиганда человека в вектор экспрессии млекопитающих
Клон λgt10, кодирующий htie-2 лиганд 1, содержит EcoRI-сайт, расположенный на 490 пар оснований в прямом направлении от старта кодирующей последовательности для tie-2 лиганда человека. Кодирующий участок можно вырезать, используя уникальные рестрикционные сайты в обратном и прямом направлении от инициатора и стоп кодона соответственно. Так, например, Spel-сайт, расположенный на 70 вр 5' от инициаторного кодона, и Bpu1102 (также известный как Вlрl) сайт, расположенный на 265 bp в направлении 3' от стоп-кодона, можно использовать для вырезания полного кодирующего участка. Затем его можно субклонировать в pJFE14 клонирующий вектор, используя Xbal (совместимый со Spel выступом) и Pstl-сайты (Pstl- и Bup1102-сайты оба образуют тупые концы).Subcloning human TIE-2 ligand into a mammalian expression vector
Clone λgt10 encoding htie-2 ligand 1 contains an EcoRI site located at 490 base pairs in the forward direction from the start of the coding sequence for human tie-2 ligand. The coding region can be cut using unique restriction sites in the reverse and forward direction from the initiator and stop codon, respectively. For example, a Spel site located 70 bp 5 ′ from the initiator codon and a Bpu1102 (also known as Bll) site located 265 bp in the direction 3 ′ from the stop codon can be used to cut out the complete coding region. It can then be subcloned into a pJFE14 cloning vector using Xbal (Spel compatible protrusion) and Pstl sites (Pstl and Bup1102 sites both form blunt ends).

Секвенирование TIE-2 лиганда человека
Кодирующий участок из клона λgr10, кодирующий tie-2 лиганд 1, секвенируют, используя АВl 373А ДНК секвенатор и набор Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Нуклеотидная и выделенная аминокислотная последовательности TIE-2 лиганда человека из клона λgt10, кодирующая tie-2 лиганд 1, представлены на фиг.4.Human TIE-2 Ligand Sequencing
The coding region from λgr10 clone encoding tie-2 ligand 1 is sequenced using an ABl 373A DNA sequencer and Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). The nucleotide and isolated amino acid sequence of the human TIE-2 ligand from clone λgt10 encoding tie-2 ligand 1, are presented in figure 4.

Кроме того, полноразмерные кДНК-клоны TIE-2 лиганда человека получают за счет скринирования библиотеки кДНК глиобластомы человека T98G в pJPE14 вектор. Клоны, кодирующие tie-2 лиганд человека, идентифицируют за счет ДНК гибридизации, используя 2,2 kb Xhol-фрагмент из депонированного клона tie-2 лиганда (АТСС 75910) в качестве зонда (см. пример 6). Кодирующий участок секвенируют, используя AB1 373A ДНК секвенатор и набор Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Эта последовательность почти идентична последовательности клона λgt10, кодирующего tie-2 лиганд 1. Как представлено на фиг.4, клон λgt10, кодирующий tie-2 лиганд 1, содержит дополнительный глициновый остаток, который кодируется нуклеотидами 1114-1116. Кодирующая последовательность T98G клона не содержит этого глицинового остатка, но с другой стороны, идентична кодирующей последовательности клона λgt10, кодирующего tie-2 лиганда 1. На фиг.5 представлены нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности и TIE-2 лиганда человека из T98G клона. In addition, full-sized human ligand TIE-2 cDNA clones are obtained by screening the T98G human glioblastoma cDNA library in pJPE14 vector. Clones encoding human tie-2 ligand were identified by DNA hybridization using a 2.2 kb Xhol fragment from a deposited tie-2 ligand clone (ATCC 75910) as a probe (see Example 6). The coding region is sequenced using an AB1 373A DNA sequencer and the Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). This sequence is almost identical to the sequence of clone λgt10 encoding tie-2 ligand 1. As shown in FIG. 4, clone λgt10 encoding tie-2 ligand 1 contains an additional glycine residue, which is encoded by nucleotides 1114-1116. The coding sequence of the T98G clone does not contain this glycine residue, but on the other hand, is identical to the coding sequence of the λgt10 clone encoding tie-2 ligand 1. Figure 5 shows the nucleotide and deduced amino acid sequences and the human TIE-2 ligand from the T98G clone.

ПРИМЕР 8. Выделение и секвенирование второго полноразмерного кДНК-клона, кодирующего TIE-2 лиганд человека. EXAMPLE 8. Isolation and sequencing of a second full-size cDNA clone encoding a human TIE-2 ligand.

Библиотеку кДНК легких плода человека в лямбда gt10 (см.фиг.3) получают из Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA). Бляшки высевают с плотностью 1,25•10⁶/20 x 20 см пластины и получают реплики на фильтрах в соответствии со стандартной процедурой (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , page 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Дубликаты фильтров скринируют в мягких условиях (2х SSC, 55^oС) зондами, полученными для tie-2 L-1 последовательности человека. Один из дубликатных фильтров зондируют 5' зондом, кодирующим аминокислоты 25-265 tie-2 L-1 человека, как представлено на фиг.4. Второй дубликатный фильтр зондируют 3' зондом, который кодирует аминокислоты 282-498 tie-2 L-1 последовательности человека (см. фиг.4). Оба зонда гибридизуют при 55^oС в гибридизационном растворе, содержащем 0,5 мг/мл ДНК спермы лосося. Фильтры промывают в 2 x SSC при 55^oС и в течение ночи экспонируют на рентгеновскую пленку. Кроме того, дубликаты фильтров гибридизуют в условиях нормальной жесткости (2 x SSC, 65^oС) с полной длины кодирующим зондом мышиного tie-2L (F3-15, Xhol-вставка). Отбирают три позитивных клона, которые удовлетворяют следующим критериям: i) гибридизация не наблюдается с полной длины (мышиным) зондом в условиях нормальной жесткости и ii) гибридизация наблюдается в мягких условиях как с 5'-, так и с 3'-зондами. EcoRl переваривание фаговой ДНК, полученной из этих клонов, указывает на два независимых клона с размерами вставок примерно 2,2 kb и примерно 1,8 kb. Вставку 2,2 kb EcoRl субклонируют в EcoRI-сайты как pBluescript KS (Stratagene), так и в вектор экспрессии млекопитающего, пригодный для использования в СО клетках. Определяют две ориентации для вектора экспрессии млекопитающего. Вставку 2,2 kb в pBluescript KS депонировали в АТСС 9 декабря 1994 г. и обозначили как pBluescript KS, кодирующий TIE-2 лиганд 2 человека. Стартовый сайт кодирующей последовательности TIE-2 лиганда 2 содержит примерно 355 пар оснований в прямом направлении от pBluescript EcoRI-сайта.A human fetal lung cDNA library in gt10 lambda (see FIG. 3) is obtained from Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA). Plaques were plated at a density of 1,25 • 10 ^6/20 x 20 cm plate and replica on the filters prepared in accordance with standard procedure (Sambrook et al, Molecular Cloning: . A Laboratory Manual, 2nd Ed, page 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory. , Cold Spring Harbor, New York). Duplicate filters are screened under mild conditions (2x SSC, 55 ^° C) with probes obtained for tie-2 L-1 human sequences. One of the duplicate filters is probed with a 5 ′ probe encoding amino acids 25-265 of human tie-2 L-1, as shown in FIG. 4. The second duplicate filter is probed with a 3 'probe, which encodes amino acids 282-498 tie-2 L-1 of the human sequence (see figure 4). Both probes hybridize at 55 ^{° C.} in a hybridization solution containing 0.5 mg / ml salmon sperm DNA. The filters are washed in 2 x SSC at 55 ^{° C.} and exposed to X-ray film overnight. In addition, duplicate filters hybridize under normal stringency conditions (2 x SSC, 65 ^° C) with a full length mouse tie-2L coding probe (F3-15, Xhol insert). Three positive clones are selected that satisfy the following criteria: i) hybridization is not observed with the full length (mouse) probe under normal stringency conditions; and ii) hybridization is observed under mild conditions with both 5'- and 3'-probes. EcoRl digestion of phage DNA obtained from these clones indicates two independent clones with insert sizes of approximately 2.2 kb and approximately 1.8 kb. The 2.2 kb EcoRl insert is subcloned into the EcoRI sites of both pBluescript KS (Stratagene) and a mammalian expression vector suitable for use in CO cells. Two orientations are determined for the mammalian expression vector. A 2.2 kb insert in pBluescript KS was deposited in ATCC on December 9, 1994 and designated as pBluescript KS encoding human TIE-2 ligand 2. The start site of the TIE-2 ligand 2 coding sequence contains approximately 355 base pairs in the forward direction from the pBluescript EcoRI site.

COS-7 клетки кратковременно трансфицируют либо вектором экспрессии, либо вектором клонирования по схеме ДЕАЕ-декстран-трансфекции. Короче, COS -7 клетки высевают при плотности 1,0•10⁶ клеток на 100 мм пластину за 24 часа до трансфекции. Для трансфекции клетки культивируют в не содержащей сыворотки DMEM, содержащей 400 мкг/мл DEAE-декстрана, 1 мкМ хлороквина и 2 мМ глутамина, и 1 мкг соответствующей ДНК в течение 3-4 часов при 37^oС в атмосфере 5% СО₂. Трансфекционную среду отсасывают и заменяют буферированным фосфатом физиологическим раствором с 10% ДМСО в течение 2-3 минут. После такого ДМСО "шока" COS -7 клетки помещают в DMEM с 10% FBS, по 1% каждого пенициллина и стрептомицина и 2 мМ глутамина в течение 48 часов.COS-7 cells are transiently transfected with either an expression vector or a cloning vector according to the DEAE-dextran transfection scheme. In short, COS-7 cells are seeded at a density of 1.0 x 10 ⁶ cells per 100 mm plate 24 hours before transfection. For transfection, cells were cultured in serum-free DMEM containing 400 μg / ml DEAE-dextran, 1 μM chloroquine and 2 mm glutamine, and 1 μg of the corresponding DNA for 3-4 hours at 37 ^° C in an atmosphere of 5% CO ₂ . The transfection medium is aspirated and replaced with buffered phosphate saline with 10% DMSO for 2-3 minutes. After this DMSO “shock”, COS-7 cells were placed in DMEM with 10% FBS, 1% of each penicillin and streptomycin and 2 mM glutamine for 48 hours.

Так как TIE-2 лиганд секретируется, необходимо сделать клетки проницаемыми, чтобы можно было определить связывание зонда рецепторного тела с лигандом. Трансфектированные COS-7 клетки высевают с плотностью 1,0•10⁶ клеток на 100 мм пластину. Эти клетки смачивают PBS, а затем инкубируют с PBS, содержащим 1,8% формальдегида в течение 15-30 минут при комнатной температуре. Затем клетки промывают PBS и инкубируют в течение 15 минут в PBS, содержащем 0,1% Triton X-100 и 10% телячей сыворотки для придания клеткам проницаемости и блокирования сайтов неспецифического связывания. Скринирование осуществляют за счет непосредственной локализации окрашивания, используя ТIЕ-2 рецепторное тело, которое состоит из внеклеточного домена TIE-2, слитого с постоянным участком IgGl. Это рецепторное тело получают, как указано в примере 2. Трансфектированные COS клетки зондируют, инкубируя их в течение 30 минут с TIЕ-2 RB. Затем клетки дважды промывают PBS, фиксируют метанолом, а затем инкубируют в течение дополнительных 30 минут с PBS/10% сыворотки телячей конъюгат анти-IgG-человека щелочная фосфатаза. После трех промывок PBS клетки инкубируют в щелочном фосфатазном субстрате в течение 30-60 минут. Затем чашки исследуют под микроскопом для определения наличия окрашенных клеток. Клетки, экспрессирующие одну ориентацию клона, но не другую ориентацию, как видно, связывают TIE-2 рецепторное тело.Since the TIE-2 ligand is secreted, it is necessary to make the cells permeable in order to determine the binding of the receptor body probe to the ligand. Transfected COS-7 cells are seeded at a density of 1.0 x 10 ⁶ cells per 100 mm plate. These cells are wetted with PBS and then incubated with PBS containing 1.8% formaldehyde for 15-30 minutes at room temperature. The cells are then washed with PBS and incubated for 15 minutes in PBS containing 0.1% Triton X-100 and 10% calf serum to impart permeability to the cells and block nonspecific binding sites. Screening is performed by directly localizing staining using the TIE-2 receptor body, which consists of the extracellular domain of TIE-2 fused to a constant IgGl site. This receptor body was prepared as described in Example 2. Transfected COS cells were probed by incubating them for 30 minutes with TIE-2 RB. The cells are then washed twice with PBS, fixed with methanol, and then incubated for an additional 30 minutes with PBS / 10% calf serum anti-IgG human alkaline phosphatase conjugate. After three washes with PBS, cells are incubated in an alkaline phosphatase substrate for 30-60 minutes. The plates are then examined under a microscope to determine the presence of stained cells. Cells expressing one orientation of the clone, but not another orientation, are seen to bind the TIE-2 receptor body.

Специалисту должно быть очевидно, что описанные методы можно использовать для дальнейшей идентификации других родственных членов семейства TIE лигандов. It will be apparent to one skilled in the art that the methods described can be used to further identify other related members of the TIE family of ligands.

Секвенирование второго TIE-2 лиганда человека
Кодирующий участок из клона pBluescript KS, кодирующего TIE-2 лиганд 2 человека, секвенируют, используя АВ1 373А ДНК секвенатор и набор Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applid Biosystems, Inc., Foster City, CA). Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности TIE-2 лиганда человека из клона pBluesript KS, кодирующего TIE-2 лиганд 2 человека, представлены на фиг.6.Sequencing of the second TIE-2 human ligand
The coding region from pBluescript KS clone encoding human TIE-2 ligand 2 is sequenced using an AB1 373A DNA sequencer and Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applid Biosystems, Inc., Foster City, CA). The nucleotide and deduced amino acid sequences of the human TIE-2 ligand from clone pBluesript KS encoding human TIE-2 ligand 2 are shown in Fig.6.

ПРИМЕР 9. ТIЕ-2 лиганд 2 является рецепторным антагонистом. EXAMPLE 9. TIE-2 ligand 2 is a receptor antagonist.

Кондиционированную среду из СOS клеток, экспрессирующих либо TIE-2 лиганд 2 (TL2), либо TIE-2 лиганд 1 (TL1) сравнивают в отношении их способности активировать TIE-2 рецепторы, естественно присутствующие в эндотелиальной клеточной линии человека. A conditioned medium of COS cells expressing either TIE-2 ligand 2 (TL2) or TIE-2 ligand 1 (TL1) is compared in terms of their ability to activate TIE-2 receptors naturally present in the human endothelial cell line.

Липофектаминовый реагент (GIBCO-BRL, Inc.) и рекомендованные схемы используют для трансфекции COS -7 клеток либо одним pJFE14 экспрессионным вектором, pJFE14 вектором, содержащим кДНК ТIE-2 лиганда 1 человека или с рМТ21 экспрессионным вектором (Kaufman R.J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 82: 6892693), содержащим кДНК TIE-2 лиганда 2 человека. COS среду, содержащую секретированные лиганды, собирают спустя три дня и концентрируют в 20 раз за счет диафильтрации (DIAFLO ультрафильтрационные мембраны, Amicon, Inc.). Количество активного TIE-2 лиганда 1 и ТIЕ-2 лиганда 2, присутствующее в этих средах, определяют и выражают как количество (в резонансных единицах, R. U. ) TIE-2 рецептора активности специфического связывания, определяемое в BlAcore анализе связывания. Lipofectamine reagent (GIBCO-BRL, Inc.) and recommended regimens are used to transfect COS-7 cells with either one pJFE14 expression vector, pJFE14 vector containing human TIE-2 cDNA ligand 1 or with pMT21 expression vector (Kaufman RJ, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82: 6892693) containing human TIE-2 ligand 2 cDNA. COS medium containing secreted ligands was collected three days later and concentrated 20 times by diafiltration (DIAFLO ultrafiltration membranes, Amicon, Inc.). The amount of active TIE-2 ligand 1 and TIE-2 ligand 2 present in these media is determined and expressed as the number (in resonance units, R. U.) of the TIE-2 specific binding activity receptor as determined by the BlAcore binding assay.

Норзерн-блоттинг (РНК) анализ выявил значительные уровни TIЕ-2 транскриптов в НАЕС (эндотелиальные клетки аорты человека) первичных эндотелиальных клетках человека (Clonetics, Inc.), поэтому эти клетки были использованы для определения того, становится ли TIE-2 рецептор тирозин-фосфорилированным при экспонировании в СOS среде, содержащей TIE-2 лиганды. Клетки НАЕС поддерживают в полной питательной среде для выращивания эндотелиальных клеток (Clonetics, Inc.), которая содержит 5% фетальной телячей сыворотки, растворимый экстракт бычьего мозга, 10 нг/мл EGF человека, 1 мг/мл гидрокортизона, 50 мкг/мл гентамицина и 50 нг/мл амфотерицина-В. Определение того, кто из ТL1 и TL2 может активировать TIE-2 рецептор в НАЕС клетках, осуществляют следующим образом. Полуконфлюентные клетки НАЕС заставляют голодать по сыворотке в течение двух часов в Дюльбекко среде MEM с высоким содержанием глюкозы с добавленными L-глутамином и пенициллин-стрептомицином при 37^oC с последующей заменой среды голодания на содержащую лиганд кондиционированную COS среду в течение 7 минут при 37^oС в инкубаторе с 5% СО₂. Затем клетки подвергают лизису и TIE-2 рецепторный протеин выделяют за счет иммуноосаждения лизатов TIE-2 пептидной антисывороткой с последующим Вестерн-блоттингом с антифосфотирозиновой антисывороткой в точности по способу примера 1. Полученные результаты представлены на фиг.7. Уровни фосфотирозина на TIE-2 рецепторе (ТIЕ-2-R) индуцируют за счет обработки НЕАС клеток TIE-2 лигандом 1 (полоса L1), а не TIE-2 лигандом 2 (полоса L2) кондиционированной COS среды. MOCK представляет кондиционированную среду из COS, трансфицированных JFE14 пустым вектором.Northern blotting (RNA) analysis revealed significant levels of TIE-2 transcripts in NAES (human aortic endothelial cells) of human primary endothelial cells (Clonetics, Inc.), so these cells were used to determine if TIE-2 becomes a tyrosine receptor. phosphorylated when exposed to COS medium containing TIE-2 ligands. NAEC cells are maintained in a complete growth medium for growing endothelial cells (Clonetics, Inc.), which contains 5% fetal calf serum, soluble bovine brain extract, 10 ng / ml human EGF, 1 mg / ml hydrocortisone, 50 μg / ml gentamicin and 50 ng / ml amphotericin-B. The determination of which of TL1 and TL2 can activate the TIE-2 receptor in HAEC cells is carried out as follows. NAEC semi-confluent cells are forced to fast on serum for two hours in Dulbecco high-glucose MEM supplemented with L-glutamine and penicillin-streptomycin at 37 ^° C followed by replacement of fasting medium with ligand-conditioned COS medium for 7 minutes at 37 ^° C C in an incubator with 5% CO ₂ . The cells are then lysed and the TIE-2 receptor protein is isolated by immunoprecipitation of TIE-2 lysates with a peptide antiserum followed by Western blotting with antiphosphothyrosine antiserum exactly as in Example 1. The results are shown in Fig.7. Phosphothyrosine levels at the TIE-2 receptor (TIE-2-R) are induced by treating the HEAC cells with TIE-2 ligand 1 (L1 band) rather than TIE-2 ligand 2 (L2 band) of conditioned COS medium. MOCK represents an air-conditioned environment of COS transfected with JFE14 blank vector.

Доказательство того, что как ТL1, так и ТL2 специфически связывают TIE-2 рецептор, продемонстрировано за счет использования BlAcore для анализа TIE-2 рецепторных специфических активностей в трансфицированной COS среде и за счет иммуноокрашивания TL1- и ТL2-экспрессирующих COS клеток TIE-2 рецепторными телами. Evidence that both TL1 and TL2 specifically bind the TIE-2 receptor has been demonstrated by using BlAcore to analyze TIE-2 receptor specific activities in transfected COS medium and by immunostaining TL1 and TL2 expressing COS TIE-2 receptor cells bodies.

Так как ТL2 не активирует TIE-2 рецептор, заявители решили определить, может ли TIE-2 служить антагонистом TL1 активности. Осуществляют анализ НАЕС фосфорилирования, в котором клетки вначале инкубируют с "избытком" TL2 с последующим добавлением разбавленного ТL1. Оказалось разумным, что до занятия TIE-2 рецептора за счет высоких уровней ТL2 может предотвратить последующую стимуляцию рецептора с последующим экпонированием для ТL1, присутствующего в ограниченных концентрациях. Since TL2 does not activate the TIE-2 receptor, applicants decided to determine whether TIE-2 can act as an antagonist of TL1 activity. An HAEC phosphorylation assay is performed in which cells are first incubated with an “excess” of TL2 followed by diluted TL1. It turned out to be reasonable that, prior to occupying the TIE-2 receptor, due to high levels of TL2, it can prevent subsequent stimulation of the receptor, followed by exposure to TL1 present in limited concentrations.

Полуконфлюентные НАЕС клетки подвергают голоданию по сыворотке, как указано ранее, а затем инкубируют в течение 3 минут при 37^oC с 1-2 мл 20 х СОS /JFE14-TL2 кондиционированной среды. Контрольные пластины обрабатывают только 20 х СOS средой (MOCK). Пластины удаляют из инкубатора, а затем добавляют различные разбавления COS/JFE14-TL1 среды, с последующим дополнительным инкубированием пластин в течение 5-7 минут при 37^oС. Клетки затем промывают, подвергают лизису и исследуют TIE-2 специфическое тирозин-фосфорилирование в лизатах за счет иммуноосаждения рецепторов и Вестерн-блоттинга, как указано ранее. TL1 разбавления осуществляют, используяют 20х СOS /JFE14-TL1 среду, разбавленную до 2х, 0,5х, 0,1х или 0,02х за счет добавления только 20х COS/JFE14 среды. Анализ исходных 20х ТL1 и 20х ТL2 COS сред с использованием BlAcore биосенсорной технологии покзывает, что они содержат аналогичные количества TIE-2 специфических связывающих активностей, т.е. 445 R. U. и 511 R.U. для ТL1 и TL2 соответственно. Результаты антифосфотирозинового Вестерн-блоттинга, представленные на фиг.8, показывают, что по сравнению с предварительной обработкой НАЕС клеток MOCK средой (полоса 1), предварительная обработка НАЕС клеток избытком TIE-2 лиганда 2 (полоса 2) противодействует соответствующей способности разбавленного TIE-2 лиганда 1 активировать TIE-2 рецептор (TIE-2-R).The semi-confluent HAEC cells are starved for serum as previously indicated and then incubated for 3 minutes at 37 ^° C. with 1-2 ml of 20 x COS / JFE14-TL2 conditioned medium. Control plates only process 20 x COS medium (MOCK). The plates are removed from the incubator, and then various dilutions of COS / JFE14-TL1 medium are added, followed by further incubation of the plates for 5-7 minutes at 37 ^° C. The cells are then washed, lysed and TIE-2 specific tyrosine phosphorylation in lysates is examined due to immunoprecipitation of receptors and Western blotting, as indicated earlier. Dilution TL1 is carried out using 20x COS / JFE14-TL1 medium diluted to 2x, 0.5x, 0.1x or 0.02x by adding only 20x COS / JFE14 medium. Analysis of the original 20x TL1 and 20x TL2 COS media using BlAcore biosensor technology shows that they contain similar amounts of TIE-2 specific binding activities, i.e. 445 RU and 511 RU for TL1 and TL2, respectively. The results of antiphosphothyrosine Western blotting, shown in Fig. 8, show that, compared with pretreatment of HAEC MOCK cells with medium (lane 1), pretreatment of HAEC cells with excess TIE-2 ligand 2 (lane 2) counteracts the corresponding ability of diluted TIE-2 ligand 1 activate the TIE-2 receptor (TIE-2-R).

Эти данные указывают на то, что в отличие от TL1, TL2 не способны стимулировать TIE-2 рецептора киназную активность в НАЕС клетках. Более того, предварительное инкубирование эндотелиальных клеток с высокими концентрациями TL2 с последующим добавлением TL1 блокирует способность TL1 стимулировать TIE-2 рецептор, доказывая, что TL2 является антагонистом TIE-2 рецептора. These data indicate that, unlike TL1, TL2 are not able to stimulate TIE-2 receptor kinase activity in HAEC cells. Moreover, preincubation of endothelial cells with high concentrations of TL2 followed by the addition of TL1 blocks the ability of TL1 to stimulate the TIE-2 receptor, proving that TL2 is an antagonist of the TIE-2 receptor.

ПРИМЕР 10. Идентификация TIE-2 специфической связывающей активности в кодиционированной среде и надосадочных жидкостях COS клеток. EXAMPLE 10. Identification of TIE-2 specific binding activity in a coded medium and supernatant of COS cells.

Связывающую активность 10х ССМ из клеточных линий С2С12 ras, Rat2 ras, SHEP и Т98G или надосадочных жидкостей COS клеток после трансфекции либо TIE-2 лигандом 1 человека (hTL1), либо TIE-2 лигандом 2 человека (hTL2) определяют с помощью биосенсорной технологии (BlAcore; Pharmacia Biosensor, Piscatway, NJ), которая регистрирует биомолекулярные взаимодействия в реальном времени за счет поверхностно плазменного резонанса (SPR). Очищенные ТIЕ-2 RB человека или крысы ковалентно соединяют за счет первичных аминов со слоем карбоксиметилдекстрана СМ5 сенсорного чипа исследовательской степени чистоты (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). The binding activity of 10x CCM from C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP and T98G cell lines or COS cell supernatants after transfection with either TIE-2 human ligand 1 (hTL1) or TIE-2 human ligand 2 (hTL2) is determined using biosensor technology ( BlAcore; Pharmacia Biosensor, Piscatway, NJ), which records real-time biomolecular interactions through surface plasma resonance (SPR). Purified TIE-2 RBs in humans or rats are covalently coupled via primary amines to a layer of a research grade purity sensor carboxymethyldextran CM5 (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ).

Поверхность сенсорного чипа активируют, используя смесь N-гидроксисукцинимида (NHS) и N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЕДС), с последующей иммобилизацией TIE-2 RB (25 мкг/мл, рН 4,5) и дезактивацией непрореагировавших частей 1,0 М этаноламином (рН 8,5). Обычно 9000-10000 R.U. каждого из рецепторных тел соединяется с сенсорным чипом. The surface of the sensor chip is activated using a mixture of N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDS), followed by immobilization of TIE-2 RB (25 μg / ml, pH 4.5) and the deactivation of unreacted parts of 1.0 M ethanolamine (pH 8.5). Usually 9000-10000 R.U. each of the receptor bodies is connected to a sensor chip.

В качестве проточного буфера в системе используют НВS (10 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 0,005% Р2O поверхностно-активный агент, рН 7,4). Образцы центрифугируют в течение 15 минут при 4^oС, а затем очищают, используя стерильный 0,45 мкм фильтр, связывающий мало белка (Millipore; Bedford, MA). К каждому образцу добавляют декстран (2 мг/мл) и поверхностно активный агент Р20 (0,005%). Аликвоты по 40 мл инъецируют через иммобилизованную поверхность (либо Т1Е-2 человека, либо крысы) при скорости потока 5 мкл/мин и регистрируют связывание рецепторов в течение 8 минут. Связывающую активность (резонансные единицы, R. U. ) определяют как разницу между базовой линией, определяемой за 30 секунд до инъецирования образца, и измеренным результатом, полученным через 30 сек после инъекции. Регенерацию поверхности осуществляют за счет одного 15 мкл ввода 3 М МgСl₂.HBS (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.005% P2O surface active agent, pH 7.4) is used as a flow buffer in the system. Samples were centrifuged for 15 minutes at 4 ^° C and then cleaned using a sterile 0.45 μm low protein coupler filter (Millipore; Bedford, MA). Dextran (2 mg / ml) and surface active agent P20 (0.005%) are added to each sample. Aliquots of 40 ml are injected through an immobilized surface (either human T1E-2 or rat) at a flow rate of 5 μl / min and receptor binding is recorded for 8 minutes. Binding activity (resonance units, RU) is defined as the difference between the baseline, determined 30 seconds before the injection of the sample, and the measured result obtained 30 seconds after the injection. The surface regeneration is carried out due to one 15 μl of input 3 M MgCl ₂ .

ССМ образцы (С2С12 ras, Rat2 ras, SHEP, T98G) тестируют на иммобилизованной поверхности ТIЕ2 RB крысы, тогда как рекомбинантные hTL 1 и hTL 12 тестируют на иммобилизованной поверхности ТIЕ2 RB человека. В каждом случае специфическое связывание с TIE-2 рецепторным телом оценивают за счет инкубирования образцов 25 мкг/мл либо растворимого TIE-2 (крысы или человека) RB, либо trkB RB перед оценкой связывающей активности. Как представлено на фиг.9 и 10, добавление растворимого trkB RB вызывает небольшое снижение TIE-2 связывающей активности, тогда как добавление растворимого TIE-2 RB значительно снижает связывающую активность по сравнению с результатами в отсутствие ТIЕ-2 RB. CCM samples (C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP, T98G) are tested on the immobilized surface of rat TIE2 RB, while recombinant hTL 1 and hTL 12 are tested on the immobilized surface of TIE2 RB human. In each case, specific binding to the TIE-2 receptor body was evaluated by incubating samples of 25 μg / ml of either soluble TIE-2 (rat or human) RB or trkB RB before evaluating binding activity. As shown in FIGS. 9 and 10, the addition of soluble trkB RB causes a slight decrease in TIE-2 binding activity, while the addition of soluble TIE-2 RB significantly reduces binding activity compared to results in the absence of TIE-2 RB.

ПРИМЕР 11. TIE-2 специфически блокирует активацию TIE-2 рецептора за счет TIE-2 лиганда 1. EXAMPLE 11. TIE-2 specifically blocks the activation of the TIE-2 receptor due to TIE-2 ligand 1.

Заявители хотели определить, может ли растворимый ТIЕ-2 RB служить в качестве конкурирующего ингибитора при блокировании активации TIE-2 рецептора за счет TIE-2 лиганда 1 (TL1). Для осуществления этого TL1-содержащую СОS среду предварительно инкубируют либо с TIE-2, либо с Тг В-RВ, а затем сравнивают их способности активировать TIE-2 рецепторы, естественно присутствующие в эндотелиальной клеточной линии человека. Applicants wanted to determine whether soluble TIE-2 RB can serve as a competing inhibitor when blocking TIE-2 receptor activation by TIE-2 ligand 1 (TL1). To accomplish this, the TL1-containing COS medium is preincubated with either TIE-2 or Tg B-RB, and then their ability to activate TIE-2 receptors naturally present in the human endothelial cell line is compared.

Кондиционированную СOS среду получают из СОS клеток, трансфицированных либо pJFE14 вектором экспрессии одним (MOCK), либо pJFE14 вектором, содержащим кДНК TIE-2 лиганда 1 человека (ТL1), и собирают, как покзано в примере 9, за исключением того, что среду фильтруют в стерильных условиях, но не концентрируют. Количество TL1 определяют и выражают как количество (в резонансных единицах, R.U.) TIE-2 рецептор-специфической связывающей активности, определенной в BlAcore анализе связывания. Conditioned COS medium is prepared from COS cells transfected with either pJFE14 vector alone expression (MOCK) or pJFE14 vector containing human TIE-2 ligand 1 cDNA (TL1), and harvested as shown in Example 9, except that the medium is filtered under sterile conditions, but not concentrated. The amount of TL1 is determined and expressed as the amount (in resonance units, R.U.) of the TIE-2 receptor-specific binding activity determined in the BlAcore binding assay.

Норзерн-блоттинг (РНК) выявляет значительные уровни TIE-2 трансскриптов в HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека), первичных эндотелиальных клетках человека (Clonetics, Inc). Поэтому эти клетки используют для определения того, можно ли TIE-2 рецептор тирозин-фосфорилировать при экспонировании в присутствии TIE-2- или ТгкВ-RB в COS среде, содержащей TL1. HUVEC клетки поддерживают при 37^oС, 5% СО₂ в полной среде для выращивания эндотелиальных клеток (Clonetics, Inc.), которая содержит 5% фетальной телячей сыворотки, растворимый экстракт бычьего мозга с 10 мкг/мл гепарина, 10 нг/мл EGF человека, 1 мкг/мл гидрокортизона, 50 мкг/мл гентамицина и 50 нг/мл амфотерицина-В. Определение того, может ли ТL1 активировать TIE-2 рецептор в HUVЕС клетках, осуществляют следующим образом. Конфлюентные чашки HUVЕС клеток подвергают голоданию по сыворотке в течение 2-4 часов в Дюльбекко MEM с низким содержанием глюкозы при 37^oС, 5% СO₂ с последующим десятиминутным инкубированием в среде голодания, которая содержит 0,1 мМ ортованадата натрия, потенциального ингибитора фосфотирозинфосфатазы. Тем временем кондиционированную COS среду, предварительно инкубированную в течение 30 минут при комнатной температуре либо с TIE-2, либо TrkB-RB, добавляют до 50 мкг/мл. Среду для голодания удаляют из HUVEC чашек и инкубируют с RB -содержащей COS средой в течение 7 минут при 37^oС. HUVЕС клетки затем подвергают лизису и протеин TIE-2 рецептора выделяют за счет иммуноосаждения TIE-2 пептидной антисывороткой с последующим Вестерн-блоттингом с антифосфотирозиновым антителом, как раскрыто в примере 1. Полученные результаты представлены на фиг.11. Уровни фосфотирозина на TIE-2 рецепторе индуцируют за счет обработки HUVEC клеток TIE-2 лигандом 1 (TL1) относительно тех, которые наблюдаются для контрольной среды (MOCK), и это индуцирование специфически блокируют за счет предварительного инкубирования с TIE2-RB (TIE2-Fc), но не за счет инкубирования с TrkB-RB (TrkB-Fc). Эти данные показывают, что растворимые TIE-2 RB могут служить селективным ингибитором для блокирования активации Т1Е-2 рецептора за счет TIE-2 лиганда 1.Northern blotting (RNA) reveals significant levels of TIE-2 transcripts in HUVEC (human umbilical vein endothelial cells), human primary endothelial cells (Clonetics, Inc). Therefore, these cells are used to determine whether the TIE-2 receptor can be tyrosine phosphorylated by exposure in the presence of TIE-2 or ThqB-RB in a COS medium containing TL1. HUVEC cells are maintained at 37 ^° C, 5% CO ₂ in a complete medium for growing endothelial cells (Clonetics, Inc.), which contains 5% fetal calf serum, soluble bovine brain extract with 10 μg / ml heparin, 10 ng / ml EGF human, 1 μg / ml hydrocortisone, 50 μg / ml gentamicin and 50 ng / ml amphotericin-B. The determination of whether TL1 can activate the TIE-2 receptor in HUVEC cells is as follows. Confluent plates of HUVEC cells are fasted for 2-4 hours with low glucose Dulbecco MEM at 37 ^° C, 5% CO ₂ followed by ten-minute incubation in fasting medium containing 0.1 mM sodium orthovanadate, a potential inhibitor of phosphothyrosine phosphatase . Meanwhile, conditioned COS medium, pre-incubated for 30 minutes at room temperature with either TIE-2 or TrkB-RB, was added up to 50 μg / ml. Fasting medium is removed from the HUVEC plates and incubated with RB-containing COS medium for 7 minutes at 37 ^° C. The HUVEC cells are then lysed and the TIE-2 receptor protein is isolated by immunoprecipitation of the TIE-2 peptide antiserum followed by Western blotting with antiphosphothyrosine antibody, as disclosed in example 1. The results are shown in Fig.11. TIE-2 receptor phosphotyrosine levels are induced by treating HUVEC cells with TIE-2 ligand 1 (TL1) relative to those observed for control medium (MOCK), and this induction is specifically blocked by pre-incubation with TIE2-RB (TIE2-Fc ), but not due to incubation with TrkB-RB (TrkB-Fc). These data show that soluble TIE-2 RB can serve as a selective inhibitor to block the activation of the T1E-2 receptor due to TIE-2 ligand 1.

ПРИМЕР 12. Конструирование TIE-2 лигандных тел. EXAMPLE 12. Construction of TIE-2 ligand bodies.

Экспрессионную конструкцию создают таким образом, чтобы обеспечить получение секретируемого протеина, состоящего из полной кодирующей последовательности TIE-2 лиганда 1 человека (TL1) или TIE-2 лиганда 2 (ТL2), слитых с константным участком гамма-1 иммуноглобулина человека (IgGl Fc). Эти протеины слияния называют TIE-2 "лигандные тела" (TL1- или TL2-). Fc часть TL1-Fc и TL2-Fc получают следующим образом. ДНК фрагмент, кодирующий Fc часть IgGl человека, которая простирается от шарнирного участка до карбоксиконца протеина, амплифицируют из кДНК плаценты человека в результате PCR с олигонуклеотидами, соответствующими опубликованной последовательности IgGl человека, полученный ДНК фрагмент клонируют в плазмидный вектор. Соответствующие ДНК рестрикционные фрагменты из плазмиды, кодирующей полноразмерный TL1 или TL2 и из Fc плазмиды IgGl человека, лигируют с каждой стороны короткого, полученного в PCR фрагмента, который был сконстурирован таким образом, чтобы сливать, в рамке TL1 или TL2 с протеинкодирующей последовательностью IgGl Fc человека. The expression construct is designed to provide a secreted protein consisting of the complete coding sequence of human TIE-2 ligand 1 (TL1) or TIE-2 ligand 2 (TL2) fused to the constant region of human gamma-1 immunoglobulin (IgGl Fc). These fusion proteins are called TIE-2 "ligand bodies" (TL1- or TL2-). The Fc portion of TL1-Fc and TL2-Fc are prepared as follows. The DNA fragment encoding the Fc portion of human IgGl, which extends from the hinge to the carboxy terminus of the protein, is amplified from human placenta cDNA by PCR with oligonucleotides corresponding to the published human IgGl sequence, the resulting DNA fragment is cloned into a plasmid vector. The corresponding DNA restriction fragments from the plasmid encoding full length TL1 or TL2 and from the Fc of the human IgGl plasmid are ligated on each side of the short PCR fragment that was designed to be fused, in frame of TL1 or TL2, with the human protein FG IgGl coding sequence .

Миллиграмовые количества TL2-Fc получают в результате клонирования ДНК фрагмента TL2-Fc в pVL 1393-бакуловирусный вектор и последующего культивирования инфицированной клеточной линии насекомого Spodoptera Frugiperda SF-21AE. В другом варианте можно использовать клеточную линию SF-9 (АТСС регистрационный CRL-1711) или клеточную линию BPl-TN-5bl-4. ДНК, кодирующую TL2-FC, клонируют как EcoRI-Notl-фрагмент в бакуловирусную плазмиду переноса pVL 1393. Плазмидную ДНК рекомбинируют в вирусную ДНК за счет смешивания 3 мг плазмидной ДНК с 0,5 мг Baculo-Gold ДНК (Pharminigen) с последующим введением в липосомы с помощью 30 мг липофектина (GIBCO-BRL). ДНК-липосомные смеси добавляют к SF-21AE клеткам (2х 106 клеток) 60 мм чашку (в TMN-FH среде). Модифицированная среда для клеток насекомых Fraces (GIBCO-BRL) в течение 5 часов при 27^oС с последующим инкубированием при 27^oС в течение 5 дней в TMN-FH среде, дополненной 5% фетальной телячей сывороткой. Культуральную среду тканей собирают для очистки бляшек рекомбинантных вирусов, что осуществляют, используя описанные ранее способы (O'Reilly D.R., L.K. Miller and V. A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, et al.,1992, New York: W.H. Freeman) за исключением того, что агарозный поверхностный слой содержит 125 мг/мл X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид, GIBCO-BRL). После 5 дней инкубирования при 27^oС подсчитывают нерекомбинентные бляшки по позитивной хромогенной реакции с X-gal субстратом, и отмечают их положения. Затем рекомбинантные бляшки визуализируют, добавляя дополнительно второй поверхностный слой, содержащий 100 мг/мл МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид, Сигма].Milligram amounts of TL2-Fc are obtained by cloning the DNA of the TL2-Fc fragment into the pVL 1393 baculovirus vector and subsequent cultivation of the infected Spodoptera Frugiperda SF-21AE insect cell line. In another embodiment, you can use the cell line SF-9 (ATCC registration CRL-1711) or cell line BPl-TN-5bl-4. DNA encoding TL2-FC is cloned as an EcoRI-Notl fragment into the baculovirus transfer plasmid pVL 1393. Plasmid DNA is recombined into viral DNA by mixing 3 mg of plasmid DNA with 0.5 mg of Baculo-Gold DNA (Pharminigen), followed by introduction into liposomes using 30 mg lipofectin (GIBCO-BRL). DNA liposome mixtures were added to SF-21AE cells (2 x 106 cells) in a 60 mm dish (in TMN-FH medium). Fraces Modified Insect Cell Medium (GIBCO-BRL) for 5 hours at 27 ^° C followed by incubation at 27 ^° C for 5 days in TMN-FH medium supplemented with 5% fetal calf serum. The tissue culture medium is harvested for purification of plaques of recombinant viruses, which is carried out using the previously described methods (O'Reilly DR, LK Miller and VA Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, et al., 1992, New York: WH Freeman) for except that the agarose surface layer contains 125 mg / ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, GIBCO-BRL). After 5 days of incubation at 27 ^° C, non-recombinant plaques were counted for a positive chromogenic reaction with the X-gal substrate, and their positions were noted. Recombinant plaques are then visualized by adding an additional second surface layer containing 100 mg / ml MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma].

Бляшки предполагаемых рекомбинантных вирусов отбирают, отсасывая, и очищают в многократных циклах выделения бляшек для обеспечения гомогенности. Запас вирусов создают в результате серии пассажей с низкой множественностью очищенного бляшками вируса. Получают запас с малым числом пассажей одного вирусного клона (vTL2-Fc клон 7). Plaques of putative recombinant viruses are selected by suction and cleaned in multiple plaque isolation cycles to ensure homogeneity. The stock of viruses is created as a result of a series of passages with a low multiplicity of plaque-purified virus. Receive a stock with a small number of passages of one viral clone (vTL2-Fc clone 7).

F-21AE клетки культивируют в не содержащей сыворотки среде (SF-900 II, Gibco BRL), содержащей 1х антибиотик/антимикотиновый раствор (Gibco BRL) и 25 мг/л гентамицина (Gibco BRL). В качестве поверхностно активного агента добавляют Pluronic F-68 до конечной концентрации 1 г/л. Культуры (4 л) выращивают в биореакторе (Artisan Cell Station System) в течение по крайней мере трех дней до инфицирования. Клетки выращивают при 27^oС, газируя до 50% растворенным кислородом при скорости газового потока 80 мл/мин (аэрация по распыляющему кольцу). Перемешивание осуществляют турбинкой со скоростью 100 об/мин. Клетки собирают в среднелогарифмической фазе роста (примерно 2•10⁶ клеток на 1 мл), концентрируют центрифугированием и инфицируют 5 бляшкообразующими единицами vTL2-Fc на клетку. Клетки и инокулюм доводят до 400 мл, добавляя свежую среду, и вирус адсорбируют в течение 3 часов при 27^oС в спиннере. Затем культуру снова суспендируют в конечном объеме 8 л свежей не содержащей сыворотки среды, и клетки инкубируют в биореакторе, используя описанные ранее условия.F-21AE cells are cultured in serum-free medium (SF-900 II, Gibco BRL) containing 1x antibiotic / antimycotin solution (Gibco BRL) and 25 mg / L gentamicin (Gibco BRL). As a surface active agent, Pluronic F-68 is added to a final concentration of 1 g / L. Cultures (4 L) were grown in a bioreactor (Artisan Cell Station System) for at least three days before infection. Cells are grown at 27 ^{° C.} , carbonated with up to 50% dissolved oxygen at a gas flow rate of 80 ml / min (aeration along the spray ring). Mixing is carried out with a turbine at a speed of 100 rpm. Cells are harvested in a mid-log phase of growth (approximately 2 x 10 ⁶ cells per ml), concentrated by centrifugation and infected with 5 plaque-forming units of vTL2-Fc per cell. The cells and inoculum were adjusted to 400 ml by adding fresh medium, and the virus was adsorbed for 3 hours at 27 ^{° C.} in a spinner. The culture is then resuspended in a final volume of 8 L of fresh serum-free medium, and the cells are incubated in the bioreactor using the previously described conditions.

Культуральную среду из vTL2-Fc инфицированных SF21AE клеток собирают за счет центрифугирования (500 g, 10 минут) на 72 час после инфицирования. Надосадочную жидкость клеток доводят до рН 8 за счет NaOH. Добавляют ЕДТА до конечной концентрации 10 мМ, рН надосадочной жидкости доводят до 8. Надосадочную жидкость фильтруют (0,45 мм, Millipore) и вводят в колонку с протеином А (протеин А, сефароза 4, скорость потока или HiTrap протеина А, обе от Pharmacia). Колонку промывают PBS, содержащим 0,5 М NaCl до тех пор, пока поглощение на 280 нм не падает до базовой линии. Колонку промывают PBS и элюируют 0,5 М уксусной кислотой. Фракции из колонки немедленно нейтрализуют, элюируя в ампулы, содержащие 1 М Tris, рН 9. Пиковые фракции, содержащие TL2-Fc собирают и диализуют против PBS. The culture medium from vTL2-Fc infected with SF21AE cells is collected by centrifugation (500 g, 10 minutes) 72 hours after infection. The cell supernatant was adjusted to pH 8 with NaOH. EDTA was added to a final concentration of 10 mM, the pH of the supernatant was adjusted to 8. The supernatant was filtered (0.45 mm, Millipore) and injected onto a Protein A column (Protein A, Sepharose 4, flow rate or HiTrap Protein A, both from Pharmacia ) The column is washed with PBS containing 0.5 M NaCl until the absorbance at 280 nm drops to the baseline. The column was washed with PBS and eluted with 0.5 M acetic acid. Fractions from the column were immediately neutralized, eluting into ampoules containing 1 M Tris, pH 9. Peak fractions containing TL2-Fc were collected and dialyzed against PBS.

Депозиты
Нижеследующие были депонированы в Американской Коллекции Типовых Культур, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 в соответствии с Будапештским соглашением. Плазмидный клон, кодирующий TIE-2 лиганд, был депонирован с АТСС 7 октября 1994 г. и обозначен как "pJFE14 кодирующий TIE-2 лиганд" под АТСС регистрационный 75910. Рекомбинантный бакуловирус Autographa californica, кодирующий TIE-2 рецепторное тело, был депонирован с АТСС 7 октября 1994 г. и обозначен как "vTIE-2 рецепторное тело" под АТСС регистрационный VR2484. Лямбда фаговый вектор, содержащий ДНК tie-2 лиганда человека был депонирован с АТСС 26 октября 1994 г. и обозначен как λgt10, кодирующий tie-2 лиганд 1 под АТСС регистрационным 75928. Плазмидный клон, кодирующий второй TIE-2 лиганд, был депонирован с АТСС 9 декабря 1994 г. и обозначен как "pBluescript KS, кодирующий TIE-2 лиганд 2 человека" под АТСС регистрационным номером 75963.Deposits
The following were deposited with the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 in accordance with the Budapest Agreement. The plasmid clone encoding the TIE-2 ligand was deposited with ATCC on October 7, 1994 and designated as "pJFE14 encoding the TIE-2 ligand" under ATCC registration 75910. The recombinant baculovirus Autographa californica encoding the TIE-2 receptor body was deposited with ATCC October 7, 1994 and designated as "vTIE-2 receptor body" under ATCC registration VR2484. A lambda phage vector containing human tie-2 ligand DNA was deposited with ATCC on October 26, 1994 and designated λgt10 encoding tie-2 ligand 1 under ATCC registration 75928. A plasmid clone encoding a second TIE-2 ligand was deposited with ATCC December 9, 1994 and designated as "pBluescript KS encoding TIE-2 ligand 2 person" under ATCC registration number 75963.

Настоящее изобретение не ограничивается объемом раскрытых здесь специфических вариантов. Естественно, различные модификации изобретения в дополнение к раскрытым здесь будут очевидны специалистам из предшествующего описания и сопровождающих чертежей. Такие модификации должны быть включены в объем прилагаемых пунктов формулы. The present invention is not limited to the specific variants disclosed herein. Naturally, various modifications of the invention in addition to those disclosed herein will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and the accompanying drawings. Such modifications should be included in the scope of the attached claims.

Claims

1. Рецепторное тело, которое включает внеклеточную часть TIE-2 рецептора, слитую с константной областью иммуноглобулина человека, и которое специфически связывает TIE-2 лиганд, имеющий аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 4, 5 или 6. 1. A receptor body that includes the extracellular portion of the TIE-2 receptor fused to the constant region of a human immunoglobulin, and which specifically binds a TIE-2 ligand having the amino acid sequence shown in FIG. 4, 5 or 6.

2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая рецепторное тело, включающее внеклеточную часть TIE-2 рецептора, слитую с константной областью иммуноглобулина человека, и охарактеризованное признаками п. 1. 2. The selected nucleic acid molecule encoding the receptor body, including the extracellular part of the TIE-2 receptor, fused to the constant region of the human immunoglobulin, and characterized by the characteristics of paragraph 1.

3. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 2, включенная в плазмиду vTIE-2 рецепторное тело и депонированная в АТСС с регистрационным VR2484. 3. The nucleic acid molecule according to claim 2, included in the plasmid vTIE-2 receptor body and deposited in ATCC with registration VR2484.

4. Плазмида для экспрессии рецепторного тела по п. 1, обозначенная как vTIE-2 рецепторное тело и депонированная в АТСС с регистрационным VR2484. 4. The plasmid for expression of the receptor body according to claim 1, designated as vTIE-2 receptor body and deposited in ATCC with registration VR2484.

5. Фармацевтическая композиция для предотвращения или ослабления неоваскуляризации у млекопитающего, включающая эффективное количество TIE-2 рецепторного тела по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель. 5. A pharmaceutical composition for preventing or attenuating neovascularization in a mammal, comprising an effective amount of a TIE-2 receptor body according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.

6. Способ предотвращения или ослабления неоваскуляризации у млекопитающего, включающий введение млекопитающему фармацевтической композиции по п. 5. 6. A method for preventing or attenuating neovascularization in a mammal, comprising administering to the mammal a pharmaceutical composition according to claim 5.

Приоритет по пунктам:
07.10.1994 по пп. 1-4;
06.04.1995 по пп. 5 и 6.Priority on points:
10/07/1994 PP 1-4;
04/06/1995 PP 5 and 6.