RU2200195C2 - Strain staphylococcus warneri iegm kl-1 as producer of low-molecular peptide compound inhibiting cells growth of gram-positive microorganisms - Google Patents

Abstract

FIELD: microbiology, peptide antibiotics. SUBSTANCE: invention proposes novel strain of bacterium Staphylococcus warneri IEGM KL-1 (strain is deposited in collection of GNIISKMBP named by Tarasevitch at number 260) that is able to produce in growth in medium LB a low-molecular peptide compound inhibiting development of gram-positive microorganisms of different genera and families. This factor produced by the strain and acting on microorganisms exhibits peptide structure, its molecular mass is less 300 Da. Its inhibitory activity retains after 3-fold boiling for 10 min. The strain provides high level of accumulation of antibacterial peptide and can be used as source for preparing antibiotic of new generation. EFFECT: valuable antibacterial properties of peptide compound. 1 dwg, 1 tbl, 2 ex

Description

Штамм Staphylococcus warneri IEGM KL-l, продуцент низкомолекулярного пептидного соединения, ингибирующего рост клеток грампозитивных бактерий. The Staphylococcus warneri IEGM KL-l strain, a producer of a low molecular weight peptide compound that inhibits the growth of gram-positive bacteria cells.

Изобретение относится к области биотехнологии, медицинской микробиологии и микробиологической промышленности и касается получения штамма Staphylococcus warneri IEGM KL-l - продуцента низкомолекулярного пептидного соединения, ингибирующего рост грампозитивных бактерий. The invention relates to the field of biotechnology, medical microbiology and the microbiological industry, and for the production of a strain of Staphylococcus warneri IEGM KL-l, a producer of a low molecular weight peptide compound that inhibits the growth of gram-positive bacteria.

Продукция микроорганизмами биологически активных соединений в окружающую среду хорошо известна и давно используется человечеством в практических целях. Особое место среди микробных продуктов принадлежит белковым антибактериальным веществам - бактериоцинам, которые провоцируют антагонистические реакции между клетками, выделяющими эти соединения, а в более редких случаях и между клетками родственных внутривидовых штаммов. The production by microorganisms of biologically active compounds into the environment is well known and has long been used by mankind for practical purposes. A special place among microbial products belongs to protein antibacterial substances - bacteriocins, which provoke antagonistic reactions between cells secreting these compounds, and in rarer cases between cells of related intraspecific strains.

В последние годы внимание исследователей привлечено к группе функционально подобных бактериоцинам низкомолекулярных пептидов. Секреция или введение в среду культивирования пептидов этого типа не оказывает какого-либо действия на клетки родительского штамма, но приводит к торможению роста и гибели чувствительных клеток других видов данного рода, а также бактерий других родов и даже семейств, что позволяет рассматривать низкомолекулярные антибактериальные пептиды в качестве природных антибиотиков нового поколения, перспективных для борьбы с возбудителями инфекционных заболеваний животных и человека [1]. In recent years, researchers have attracted the attention of a group of low molecular weight peptides that are functionally similar to bacteriocins. The secretion or introduction of peptides of this type into the culture medium does not have any effect on the cells of the parent strain, but it inhibits the growth and death of sensitive cells of other species of this genus, as well as bacteria of other genera and even families, which makes it possible to consider low molecular weight antibacterial peptides in as a new generation of natural antibiotics, promising for combating the pathogens of infectious diseases of animals and humans [1].

Выделение антибактериальных соединений является распространенным признаком бактерий рода Staphylococcus, которые являются продуцентами как стафилоцинов (типичных бактериоцинов), так и бактериоциноподобных пептидных соединений невысокой молекулярной массы. Isolation of antibacterial compounds is a common feature of bacteria of the genus Staphylococcus, which are producers of both staphylocins (typical bacteriocins) and bacteriocin-like peptide compounds of low molecular weight.

В литературе описаны штаммы стафилококков, которые могут представлять интерес для биотехнологии получения антибактериальных пептидов в коммерческих целях. The literature describes strains of staphylococci that may be of interest for biotechnology for the production of antibacterial peptides for commercial purposes.

Известен штамм Staphylococcus epidermidis 5, секретирующий в окружающую среду пептидное соединение Пеп5 (Рер5) с мол. массой ниже 6 кДа. Спектр чувствительных к Пеп5 бактерий ограничен штаммами других видов рода Staphylococcus и некоторыми видами рода Micrococcus [2]. A known strain of Staphylococcus epidermidis 5, secreting into the environment the peptide compound Pep5 (Pep5) mol. mass below 6 kDa. The spectrum of Pep5-sensitive bacteria is limited to strains of other species of the genus Staphylococcus and some species of the genus Micrococcus [2].

Синтез и продукция в среду небольшого антибактериального пептида Эпицидина 280 (Epicidin 280) с мол. массой 3133 Да характерны для штамма Staphylococcus epidermidis BN 280 при культивировании на богатых средах. Ингибирующее рост бактерий действие эпицидина 280 распространяется также, как и в случае Пеп5, только на другие штаммы стафилококков и микрококков [3]. Synthesis and production on Wednesday of a small antibacterial peptide Epicidin 280 (Epicidin 280) mol. weighing 3133 Yes are characteristic of the Staphylococcus epidermidis BN 280 strain when cultured in rich media. The inhibitory bacterial growth effect of epicidin 280 extends, as in the case of Pep5, only to other strains of staphylococci and micrococci [3].

Штамм-продуцент низкомолекулярного циклического пептидного антибиотика галлидермина (gallidermin) - Staphylococcus gallinarum Tu 3928, депонированный в Национальной коллекции Германии (DSM 4616), является источником нового антибактериального белкового соединения, которое обладает более широким спектром действия, включающим бактерии родов Staphylococcus, Micrococcus и Streptococcus. Продукция этого соединения происходит только на сверхбогатой питательной среде, содержащей следующие компоненты, г/л: мясной экстракт - 33; дрожжевой экстракт - 30; гидрат окиси кальция - 3,8; хлористый натрий - 60 и в условиях повышенной аэрации ферментеров при скорости мешалки не менее 900 об/мин, что делает малорентабельным использование данного штамма для промышленного получения антибактериального продукта. Staphylococcus gallinarum Tu 3928, a low molecular weight cyclic peptide antibiotic (gallidermin) producing strain, deposited in the German National Collection (DSM 4616), is a source of a new antibacterial protein compound that has a wider spectrum of activity, including bacteria of the genus Staphylococococcus Microc. The production of this compound occurs only on an ultra-rich nutrient medium containing the following components, g / l: meat extract - 33; yeast extract - 30; calcium oxide hydrate 3.8; sodium chloride - 60 and under conditions of increased aeration of the fermenters at a stirrer speed of at least 900 rpm, which makes it unprofitable to use this strain for the industrial production of an antibacterial product.

Наиболее близким аналогом по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является штамм Staphylococcus aureus KSI 1829 [4], выделяющий в среду роста пептидное соединение с мол. массой 6,4 кДа, вызывающее ингибирование роста клеток других видов стафилококков, а также штаммов бактерий родов Streptococcus, Corynebacterium, Bordetella, Moraxella и Haemophilus. Секреция этого соединения происходит при культивировании на обогащенной питательной среде 2X-YT, имеющей состав, г/л: бактотриптон - 16, дрожжевой экстракт - 10, натрий хлористый - 5. В условиях интенсивной аэрации при скорости мешалки 180 об/мин уровень пептида в среде достигает максимума 72000 У.Е./л среды. The closest analogue in terms of the set of essential features and the achieved result is the Staphylococcus aureus KSI 1829 strain [4], which releases a peptide compound with mol. mass of 6.4 kDa, causing inhibition of cell growth of other types of staphylococci, as well as bacterial strains of the genera Streptococcus, Corynebacterium, Bordetella, Moraxella and Haemophilus. The secretion of this compound occurs upon cultivation on a 2X-YT enriched nutrient medium having the composition, g / l: bactotriptone - 16, yeast extract - 10, sodium chloride - 5. Under intense aeration at a stirrer speed of 180 rpm, the level of the peptide in the medium reaches a maximum of 72,000 cu / l of medium.

Таким образом, представленные известные штаммы обладают:
- относительно невысоким уровнем продукции антибактериальных пептидов;
- ингибирующее действие продуцируемых пептидов ограничено сравнительно узким кругом микроорганизмов;
- биосинтез антибактериальных пептидов происходит при культивировании на средах, обогащенных питательными компонентами, что значительно увеличивает материальные затраты на их производство;
- режим культивирования требует больших энергетических трат для обеспечения высокого уровня аэрации ферментеров.Thus, the known known strains possess:
- a relatively low level of production of antibacterial peptides;
- the inhibitory effect of the produced peptides is limited to a relatively narrow range of microorganisms;
- the biosynthesis of antibacterial peptides occurs during cultivation on media enriched with nutrient components, which significantly increases the material costs of their production;
- the cultivation mode requires large energy expenditures to ensure a high level of aeration of the fermenters.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение нового штамма микроорганизмов-продуцентов низкомолекулярного пептидного соединения, обладающего широким спектром антибактериального действия. The problem to which the claimed invention is directed, is to obtain a new strain of microorganisms producing low molecular weight peptide compounds with a wide spectrum of antibacterial action.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в повышенном выходе целевого соединения широкого спектра антибактериального действия на обычной питательной среде. The technical result that can be obtained by carrying out the invention is to increase the yield of the target compound of a wide spectrum of antibacterial action on a normal nutrient medium.

Сущность объекта изобретения - штамм Staphylococcus warneri IEGM KL-1, секретирующий при культивировании на обычных питательных средах - мясопептонном бульоне (МПБ) и среде LB повышенные количества низкомолекулярного пептидного соединения, ингибирующего рост чувствительных грампозитивных бактерий различных родов и семейств. The essence of the invention is a strain of Staphylococcus warneri IEGM KL-1, secreting, when cultured on ordinary nutrient media - meat-peptone broth (MPB) and LB medium, increased amounts of a low molecular weight peptide compound that inhibits the growth of sensitive gram-positive bacteria of various genera and families.

Штамм Staphylococcus warneri IEGM KL-1 выделен в 1996 г. из воздуха лабораторных помещений Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН при проведении скрининга воздушной микрофлоры детекцией роста микроорганизмов, продуцирующих антибактериальные соединения, на открытых чашках Петри, содержащих газон тестерной культуры, выращенной на полноценной питательной среде - мясопептонном агаре [6]. The strain Staphylococcus warneri IEGM KL-1 was isolated in 1996 from the air of laboratory rooms of the Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences when screening air microflora by detecting the growth of microorganisms producing antibacterial compounds on open Petri dishes containing a lawn of a test culture grown on a nutritious culture medium - meat and peptone agar [6].

Штамм депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича под номером 260 как продуцент низкомолекулярного антибактериального пептида широкого спектра действия, отличающийся от известных штаммов значительно более высоким уровнем продукции указанного соединения при культивировании на обычных питательных средах. The strain is deposited in the collection of the State Research Institute of Standardization and Control of Medical Biological Preparations. L. A. Tarasevich under number 260 as a producer of a low molecular weight antibacterial peptide with a wide spectrum of activity, which differs from known strains by a significantly higher level of production of this compound when cultured on ordinary nutrient media.

Условия хранения - в лиофилизированном состоянии (коллекция ГНИИСКМБП им. Тарасевича), на плотной агаризованной среде LB под вазелиновым маслом и на косяках со скошенным LB-агаром (в лабораторных условиях). Storage conditions - in a lyophilized state (collection of GNIISKMBP named after Tarasevich), on dense agarized LB medium under liquid paraffin and on jambs with beveled LB agar (in laboratory conditions).

Штамм Staphylococcus warneri IEGM KL-1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами. The strain Staphylococcus warneri IEGM KL-1 is characterized by the following cultural-morphological and physiological-biochemical properties.

Бактерии представляют собой клетки сферической формы, диаметром 0,8-1,2 мкм, грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, в фиксированных мазках расположены одиночно, парами, тетрадами, а в местах скоплений в виде типичных для стафилококков гроздьев. Bacteria are spherical cells with a diameter of 0.8-1.2 μm, gram-positive, motionless, non-spore-forming, in fixed smears are located singly, in pairs, tetrads, and in clusters in the form of clusters typical of staphylococci.

Рост на мясопептонном агаре. Growth on meat peptone agar.

При высеве со скошенного агара штрихом растут в виде гладких, круглых с ровными краями светло-серых колоний, размер которых в аэробных условиях при 37^oС через 24 часа составляет 1,2-1,5 мм, через 48 часов - 1,6-1,8 мм и через 72 часа - 1,9-2,1 мм. На третьи сутки центральная часть колоний становится слегка шатрообразно приподнятой. Колонии легко снимаются с поверхности агара микробиологической петлей.When plated from mowed agar, streaks grow in the form of smooth, light-gray colonies round, with even edges, the size of which under aerobic conditions at 37 ^° C after 24 hours is 1.2-1.5 mm, after 48 hours - 1.6- 1.8 mm and after 72 hours - 1.9-2.1 mm. On the third day, the central part of the colonies becomes slightly tent-shaped raised. Colonies are easily removed from the surface of the agar by a microbiological loop.

Рост на среде LB. Growth on LB.

При инокулировании среды жидкой культурой в условиях перемешивания наблюдается быстрый рост в виде гомогенной взвеси, при отстаивании которой бактериальные клетки равномерно оседают на дно сосуда и легко переходят во взвешенное состояние при встряхивании. Оптическая плотность гомогенной жидкой культуры в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды, при выращивании на термостатируемом шейкере УВМТ-12-250 при 160 об/мин и 37^oС достигает к 8 часу роста 2,5-2,7 ЕД, а через сутки - 3,1-3,4 (детектор ФЭК-56, длина волны 540 нм, кювета 3 мм).When the medium is inoculated with a liquid culture under stirring, rapid growth is observed in the form of a homogeneous suspension, when it settles, the bacterial cells evenly settle to the bottom of the vessel and easily go into suspension when shaken. The optical density of a homogeneous liquid culture in 250 ml flasks containing 50 ml of medium, when grown on a thermostatic shaker UVMT-12-250 at 160 rpm and 37 ^o C, reaches 2.5-2.7 U by 8 hours, and every other day - 3.1-3.4 (detector FEK-56, wavelength 540 nm, cuvette 3 mm).

Рост на среде LB, содержащей 10% хлористого натрия. Growth on LB medium containing 10% sodium chloride.

Параметры роста практически совпадают с представленными для этой среды без хлористого натрия. The growth parameters almost coincide with those presented for this medium without sodium chloride.

Рост на синтетической аминокислотной среде, предложенной для выращивания стафилококков [7]. Growth on a synthetic amino acid medium proposed for the cultivation of staphylococci [7].

При выращивании в условиях, представленных для среды LB, развитие происходит значительно медленнее - через 8 часов роста опт. плотность культуры составляет 0,35-0,4 Е. Д., а через сутки - лишь 0,61-0,64. В этих условиях культивирования антибактериальное соединение в среде роста ее обнаруживается. When grown under the conditions presented for the LB medium, development is much slower - after 8 hours of growth of opt. the density of the culture is 0.35-0.4 E. D., and after a day - only 0.61-0.64. Under these cultivation conditions, an antibacterial compound is detected in the growth medium.

Бактерии быстро лизируются под действием лизостафина и малочувствительны к действию лизоцима. Bacteria quickly lyse under the influence of lysostaphin and are insensitive to the action of lysozyme.

Биохимические признаки
Оксидазоотрицательны. Образуют кислоту при окислении в аэробных условиях галактозы, глицерина, мальтозы, трегалозы, рибозы, целлобиозы, маннита, сахарозы и глюкозы. Сбраживают маннит, глюкозу, сахарозу, рибозу, глицерин, трегалозу, мальтозу и галактозу. Не обладают нитратредуктазой, слабо образуют ацетоин, не вызывают гемолиза и не коагулируют кроличью сыворотку, чувствительны к новобиоцину.Biochemical signs
Oxidase-negative. They form acid during aerobic oxidation of galactose, glycerol, maltose, trehalose, ribose, cellobiose, mannitol, sucrose and glucose. Mannitol, glucose, sucrose, ribose, glycerin, trehalose, maltose and galactose are fermented. They do not possess nitrate reductase, weakly form acetoin, do not cause hemolysis and do not coagulate rabbit serum, and are sensitive to novobiocin.

Сопоставление перечисленных физиолого-биохимических особенностей депонируемого штамма с дифференцирующими признаками видов и подвидов рода Staphylococcus, приведенными в "Определителе бактерий Берджи" [8], а также с перечнем биологических признаков видов и подвидов рода Staphylococcus, наиболее важных для идентификации различных видов, и схемой видовой идентификации коагулазонегативных стафилококков, предложенными А.К. Акатовым и B.C. Зуевой [9] , позволяет классифицировать его в качестве одного из штаммов вида Staphylococcus warneri. A comparison of the physiological and biochemical characteristics of the deposited strain with the differentiating characters of species and subspecies of the genus Staphylococcus given in the “Guide to bacteria of Bergee” [8], as well as with the list of biological characters of species and subspecies of the genus Staphylococcus, most important for identifying various species, and the species scheme identification of coagulase-negative staphylococci proposed by A.K. Akatov and B.C. Zueva [9], allows us to classify it as one of the strains of the species Staphylococcus warneri.

Продукт, синтезируемый штаммом
При культивировании в периодических условиях на богатой питательной среде LB бактерии выделяют в среду роста антибактериальное соединение, оказывающее ингибирующее действие на рост ряда грампозитивных бактерий - стафилококков, стрептококков, коринебактерии и бацилл, которое проявляется при внесении аликвот среды культивирования продуцента в среду роста чувствительных бактерий.The product synthesized by the strain
When cultivated under batch conditions on a rich LB nutrient medium, bacteria release an antibacterial compound into the growth medium, which has an inhibitory effect on the growth of a number of gram-positive bacteria - staphylococci, streptococci, corynebacteria and bacilli, which is manifested when aliquots of the culture medium of the producer are introduced into the growth medium of sensitive bacteria.

Ингибирующая активность центрифугатов (10000 g, 10 мин) сред культивирования сохраняется после 3-кратного кипячения в течение 10 мин. The inhibitory activity of centrifugates (10,000 g, 10 min) of cultivation media is maintained after 3-fold boiling for 10 min.

Обработка активных препаратов нуклеазами - ДНК-азой и РНК-азой не сказывается на их биологической активности; в то же время активность в препаратах полностью исчезает после протеолиза трипсином. При ультрафильтрации в системе Centricon-3 (Amicon) антибактериальная активность препаратов полностью обнаруживается в ультрафильтрате. The treatment of active drugs with nucleases — DNAase and RNAse — does not affect their biological activity; at the same time, the activity in the preparations completely disappears after proteolysis with trypsin. With ultrafiltration in the Centricon-3 (Amicon) system, the antibacterial activity of the drugs is completely detected in the ultrafiltrate.

Представленные факты подтверждают пептидную природу фактора, обладающего молекулярной массой менее 3000 дальтон. The presented facts confirm the peptide nature of the factor having a molecular weight of less than 3000 daltons.

Продуктивность штамма. Strain productivity.

Продуктивность штамма исследована путем изучения динамики количества выделяемого продуцентом в среду роста соединения, ингибирующего развитие тест-бактерий Staphylococcus epidermidis. Выделение фактора в среду происходит в течение логарифмической фазы роста продуцента на LB, причем этот процесс, по-видимому, находится под контролем популяционных механизмов, так как при достижении определенной концентрации дальнейшего накопления его в среде не происходит. Типичным является проявление ингибирующего действия фильтратов в разведении 1: 32-1: 64 при плотности культуры 1,9-2,2 и при указанном выше методе изучения динамики биомассы в процессе роста бактериальной культуры. Таким образом, уровень продукции антибактериального соединения достигает 320000-640000 У.Е./л среды. The strain productivity was studied by studying the dynamics of the amount secreted by the producer into the growth medium of a compound that inhibits the development of test bacteria Staphylococcus epidermidis. The factor is released into the medium during the logarithmic phase of producer growth on LB, and this process, apparently, is under the control of population mechanisms, since when a certain concentration is reached, its further accumulation in the medium does not occur. Typical is the manifestation of the inhibitory effect of filtrates at a dilution of 1: 32-1: 64 at a culture density of 1.9-2.2 and with the above method of studying the dynamics of biomass in the process of bacterial culture growth. Thus, the level of production of the antibacterial compound reaches 320,000-640000 U.E. / L of medium.

Способ определения активности штамма
Определение динамики антибактериальной активности в среде культивирования продуцента проводили в иммунологических планшетах, используя принцип двукратных разведений аликвот супернатантов культуры в среде LB. В лунки планшета вносили по 100 мкл среды LB. В первую лунку ряда добавляли 100 мкл выемок сред культивирования, которые предварительно подвергали центрифугированию (10000 g, 10 мин) в стерильных условиях и кипячению в течение 10 мин. Путем последовательного переноса 100 мкл содержимого первой лунки ряда в последующие готовили ряд разведений от 1:2 до 1:256.The method for determining the activity of the strain
The dynamics of antibacterial activity in the culture medium of the producer was determined in immunological plates using the principle of double dilutions of aliquots of culture supernatants in LB medium. 100 μl of LB medium was added to the wells of the plate. In the first well of the row, 100 μl of notches of culturing media were added, which were previously centrifuged (10,000 g, 10 min) under sterile conditions and boiled for 10 min. By successively transferring 100 μl of the contents of the first well of the row to the next, a series of dilutions from 1: 2 to 1: 256 was prepared.

В каждую лунку вносили 10 мкл тест-культуры S. epidermidis. В качестве инокулума использовали клетки логарифмической фазы роста, дважды промытые свежей средой культивирования центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин и суспендированные в ней до плотности 1,8•2,0•10⁴ КОЕ/мл. Эффективность ингибирующего действия оценивали через 12-16 часов культивирования при 37^oС.10 μl of S. epidermidis test culture was added to each well. As the inoculum, cells of the logarithmic growth phase were used, washed twice with fresh culture medium by centrifugation at 10,000 g for 10 min and suspended in it to a density of 1.8 • 2.0 • 10 ⁴ CFU / ml. The effectiveness of the inhibitory effect was evaluated after 12-16 hours of cultivation at 37 ^o C.

О количестве антибактериального фактора в исследуемом препарате судили по последней лунке планшета, в которой наблюдалось полное отсутствие роста, принимая его равным величине, обратной разведению. Способ, условия и состав сред для хранения штамма
В лабораторных условиях штамм хранится после посева петлей на косяках МПА с пересевом каждые три месяца, либо под вазелиновым маслом в столбиках МПА при посеве уколом и пересеве каждые 6 месяцев.The amount of antibacterial factor in the test drug was judged by the last well of the plate, in which there was a complete lack of growth, taking it equal to the value inverse to dilution. Method, conditions and composition of media for storage of strain
In laboratory conditions, the strain is stored after sowing the loop on the jambs of MPA with reseeding every three months, or under liquid paraffin in the columns of MPA when sowing by injection and reseeding every 6 months.

Для лиофилизации штамма в качестве криопротектора использован сахарозо-желатиновый агар по прописи Файбича [10], содержащий 10% сахарозы, 1,5% желатина и 0,1% агара. Ежегодное исследование продукции антибактериального фактора лиофилизированным штаммом показало полное сохранение этого признака с момента лиофилизации в 1996 году. For lyophilization of the strain, sucrose-gelatin agar according to the Faibich prescription [10] containing 10% sucrose, 1.5% gelatin and 0.1% agar was used as a cryoprotectant. An annual study of the production of an antibacterial factor by a lyophilized strain has shown that this trait has been fully preserved since lyophilization in 1996.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма
Для культивирования штамма могут быть использованы обычные питательные среды, в частности МПБ и МПА. Культура бактерий интенсивно развивается при культивировании на термостатируемых шейкерах и в термостатах при 37^oС.The method, conditions and composition of the media for the propagation of the strain
For the cultivation of the strain can be used conventional nutrient media, in particular MPB and MPA. The bacterial culture intensively develops when cultivated on thermostatically controlled shakers and in thermostats at 37 ^o C.

Отношение к фагам
Чувствительность бактерий данного штамма к фагам исследована в Пермском НПО "БИОМЕД" д.м.н. Н.П. Ефимовой. Штамм оказался не чувствительным к типовым диагностическим бактериофагам (Международный набор "4", Великобритания) даже при использовании 1:000 ТР (тест-разведения), но хорошо лизировался лечебным фагом в разведении 1:10000.The relation to phages
The sensitivity of the bacteria of this strain to phages was studied at the Perm Scientific and Production Association "BIOMED" MD N.P. Efimova. The strain was not sensitive to typical diagnostic bacteriophages (International kit "4", UK) even when using 1: 000 TP (test dilution), but was well lysed by a therapeutic phage at a dilution of 1: 10000.

Генетические особенности
Антибиотикочувствительность штамма исследована традиционным методом с использованием стандартных дисков [11], содержащих различные по механизму действия на бактерии антибиотики. Учет зон торможения роста проводили через 18 часов. Средний диаметр зоны торможения, мм: ампициллин -15,1; ристомицин -13,2; гентамицин -11,5; рифампицин -31,8; левомицетин - 25,2; стрептомицин - 14,5; линкомицин - 23,7; тетрациклин - 27,8; неомицин -11,3; цефалексин - 26,5; новобиоцин - 23,5; фузидин - 29,3; оксациллин - 27,3; эритромицин - 20,3.Genetic Features
The antibiotic sensitivity of the strain was studied by the traditional method using standard disks [11] containing antibiotics with different mechanisms of action on bacteria. The growth inhibition zones were taken into account after 18 hours. The average diameter of the zone of inhibition, mm: ampicillin -15.1; ristomycin -13.2; gentamicin -11.5; rifampicin -31.8; chloramphenicol - 25.2; streptomycin - 14.5; lincomycin - 23.7; tetracycline - 27.8; neomycin -11.3; cephalexin - 26.5; novobiocin - 23.5; fusidine - 29.3; oxacillin - 27.3; erythromycin - 20.3.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними. The possibility of using the invention is illustrated by examples that do not limit the scope and essence of the claims associated with them.

Пример 1
При культивировании продуцента - бактерий Staphylococcus warneri IEGM KL 1 на среде LB, содержащей 1% триптона (Difco), 0,5% дрожжевого экстракта и 0,64% КСl, при перемешивании и температуре 37^oС выделение антибактериального соединения начинается, как это представлено на чертеже, в начале фазы логарифмического роста и достигает максимума к 7 часу роста культуры.Example 1
When cultivating the producer - bacteria Staphylococcus warneri IEGM KL 1 on LB medium containing 1% tryptone (Difco), 0.5% yeast extract and 0.64% KCl, with stirring and a temperature of 37 ^° C, the release of the antibacterial compound begins, as shown in the drawing, at the beginning of the phase of logarithmic growth and reaches a maximum by 7 hours of culture growth.

Пример 2
Антибактериальное действие супернатантов среды культивирования Staphylococcus warneri IEGM KL 1 представлено в таблице.Example 2
The antibacterial effect of supernatants of the culture medium Staphylococcus warneri IEGM KL 1 is presented in the table.

Таким образом, предлагаемый штамм является продуцентом низкомолекулярного антибактериального пептидного соединения, проявляющего ингибирующее действие в отношении широкого спектра грампозитивных микроорганизмов. Штамм характеризуется высоким уровнем продукции этого соединения, достигающим 620000 У.Е./л среды при культивировании на обычных питательных средах - мясопептонном бульоне и среде LB. Продукция пептидного соединения в режиме периодического культивирования в отличие от известных примеров начинается при переходе бактериальной культуры в стадию логарифмического роста и заканчивается при переходе в стационар. Thus, the proposed strain is a producer of a low molecular weight antibacterial peptide compound exhibiting an inhibitory effect against a wide range of gram-positive microorganisms. The strain is characterized by a high level of production of this compound, reaching 620,000 UE / l of medium when cultured on ordinary nutrient media - meat and peptone broth and LB medium. The production of the peptide compound in the periodic cultivation mode, in contrast to the known examples, begins when the bacterial culture goes to the stage of logarithmic growth and ends when it goes to the hospital.

Источники информации
1. Baba T. and Schneewind O. - Insstruments of microbial warfare: bacteriocin synthesis, toxicity and immunity. - Treuds in Microb., 1998, 6.66-71.Sources of information
1. Baba T. and Schneewind O. - Insstruments of microbial warfare: bacteriocin synthesis, toxicity and immunity. - Treuds in Microb., 1998, 6.66-71.

2. Sahl H.-G., Brandis H. - Production, purification and clinical properties of an antistaphylococcal agent produced by Staphylococcus epidermidis. - J. Gen. Microbiology, 1981, 127, 377-384. 2. Sahl H.-G., Brandis H. - Production, purification and clinical properties of an antistaphylococcal agent produced by Staphylococcus epidermidis. - J. Gen. Microbiology, 1981, 127, 377-384.

3. Heidrich C., Pag U., Josten M., Metzger J., Jack R.W., Bierbaum G., Jung G. , Sahl H.-G. - Isolation, characterization and heterologous expression of the novel lantibiotic epicidin 280 and analysis of its biosynthetic gene cluster. - Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, 3140-3146. 3. Heidrich C., Pag U., Josten M., Metzger J., Jack R.W., Bierbaum G., Jung G., Sahl H.-G. - Isolation, characterization and heterologous expression of the novel lantibiotic epicidin 280 and analysis of its biosynthetic gene cluster. - Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, 3140-3146.

4. Jung G., Kellner R., Zahner H., Gotz F., Horner T., Werner R., Allgaier H. - Polycyclic peptide antibiotic gallidermin. - US Patent, 5231013. 4. Jung G., Kellner R., Zahner H., Gotz F., Horner T., Werner R., Allgaier H. - Polycyclic peptide antibiotic gallidermin. - US Patent, 5231013.

5. Jandolo J. and Crupper S. - Broad spectrum antibiotic peptide. - US Patent 5703040. 5. Jandolo J. and Crupper S. - Broad spectrum antibiotic peptide. - US Patent 5703040.

6. Коробов В.П., Лемкина Л.М. - Продукция антистафилококкового фактора культурой грамположительных кокков. - В кн.: Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы. - Тез.докл. Межд.конф., Пермь, 1996, с.50-51. 6. Korobov V.P., Lemkina L.M. - Production of antistaphylococcal factor by gram-positive cocci culture. - In: Microbial diversity: status, conservation strategy, environmental problems. - Abstracts. International conference, Perm, 1996, p. 50-51.

7. Игнатов В.В. Биохимия стафилококка. - Изд-во Саратовского университета, 1975, с.112-113. 7. Ignatov V.V. Biochemistry of staphylococcus. - Publishing house of the Saratov University, 1975, p.112-113.

8. Определитель бактерий Берджи. 9-е издание. Под редакцией Дж.Хоулта, Н. Крига, Р.Снита, Дж.Стэйли и С.Уилльямса. Перевод с англ. под редакцией Г. А. Заварзина. М.: Мир, 1997, тт.1-2, 800 с. 8. The determinant of bacteria Bergey. 9th edition. Edited by J. Holt, N. Krieg, R. Snit, J. Staley and S. Williams. Translation from English edited by G. A. Zavarzin. M .: Mir, 1997, vols. 1-2, 800 p.

9. Акатов А.К. и Зуева В.С. - Стафилококки, М.: Медицина, 1983, 242 с. 9. Akatov A.K. and Zueva V.S. - Staphylococci, M .: Medicine, 1983, 242 p.

10. Ившина И.Б., Каменских Т.Н. и др. - Микробиология, 1994, т.63, вып. 1, с.118-128. 10. Ivshina I.B., Kamensky T.N. et al. - Microbiology, 1994, vol. 63, no. 1, p.118-128.

11. Бриан Л.Е. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиопрепаратам, М.: Медицина, 1984, 272 с. 11. Briand L.E. Bacterial resistance and sensitivity to chemotherapy, M .: Medicine, 1984, 272 p.

Claims (1)

Штамм бактерий Staphylococcus wameri IEGM KL-1 (депонирован в коллекции ГНИИСКМБП им. Тарасевича под номером 260) - продуцент низкомолекулярного пептидного соединения, ингибирующего развитие грампозитивных бактерий. The bacterial strain Staphylococcus wameri IEGM KL-1 (deposited in the collection of the Tarasevich GNIISKMBP under number 260) is a producer of a low molecular weight peptide compound that inhibits the development of gram-positive bacteria.

Images