RU2180233C1 - Method of recombinant protein liquid medicinal form preparing - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, medicine, pharmaceutical technology. SUBSTANCE: invention relates to technology of preparing medicinal forms of recombinant proteins. In the process of preparing liquid form of corresponding recombinant protein an effective amount of the latter is dissolved in biocompatible buffer solution containing nonionic detergent and, in some cases, stabilizing agent additionally. For preparing the medicinal form buffer solution with pH value distinguishing by more 1 unit from isoelectric point of protein is used. This provides stable state of protein at low concentrations (1- 100 mcg/ml) in solutions without aggregation and oligomerization. Tween-20, Tween-80, Tween-60, Nonidet P-40 and others can be used as detergent. Isotonic buffer solutions based on citrate, acetate, phosphate and others can be used as biocompatible buffer systems. In some cases for correction of osmomolarity solutions can contain polyatomic alcohols, dextrins, polyvinylpyrrolidones and others biocompatible polymeric components as stabilizing agent. EFFECT: decreased cost, safety of preparation. 4 cl, 4 tbl, 3 dwg

Description

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения лекарственных форм рекомбинантных белков. The present invention relates to biotechnology, and in particular to a technology for producing dosage forms of recombinant proteins.

Терапевтически значимые белки, полученные на основе технологии рекомбинантных ДНК, в последние годы получили широкое распространение для лечения широкого круга заболеваний. К наиболее значимым и распространенным препаратам данного класса следует отнести препараты, созданные на основе рекомбинантных эритропоэтина, интерферона-альфа, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и некоторых других цитокинов человека. Therapeutically significant proteins derived from recombinant DNA technology have been widely used in recent years to treat a wide range of diseases. The most significant and common drugs of this class include drugs created on the basis of recombinant erythropoietin, interferon-alpha, granulocyte colony stimulating factor and some other human cytokines.

Общим для данного класса веществ является практическая невозможность и нецелесообразность выделения их из природных источников и, как следствие, получение их в искусственно созданных прокариотических (как правило, E.Coli) или эукариотических (обычно СНО) системах. Common to this class of substances is the practical impossibility and inappropriateness of isolating them from natural sources and, as a result, obtaining them in artificially created prokaryotic (usually E. Coli) or eukaryotic (usually CHO) systems.

Белки данного класса обладают высокой удельной биологической активностью, вследствие чего их разовая терапевтическая доза находится в микрограммовом диапазоне. Некоторые из используемых в медицинской практике белков данного класса (как правило, получаемых в прокариотических системах) находятся в частично денатурированном состоянии и склонны к агрегации и выпадению в осадок. В первую очередь это относится к рекомбинантным интерферонам-альфа. В процессе приготовления лекарственных форм на основе белков данного класса наиболее распространенным в настоящее время подходом является введение в состав готового лекарственного средства в качестве стабилизатора сывороточного альбумина и/или сублимационная сушка. Однако оба этих подхода не свободны от недостатков. Введение в качестве стабилизатора сывороточного альбумина человека повышает риск вирусных контаминаций препарата и ограничивает его применение пациентами некоторых религиозных конфессий. Сублимационная сушка не только снижает активность препарата, но и вызывает частичную денатурацию альбумина, что в свою очередь иногда приводит к аллергическим реакциям у пациентов. Ранее было описано и реализовано приготовление лекарственной формы препарата рекомбинантного интерферона-альфа человека, свободного от сывороточного альбумина человека. Для этого в состав для сушки в качестве наполнителя вводили декстраны (РЕАЛЬДИРОН, БИОТЕХНА, Литва). Подобный подход позволяет произвести сушку препарата, но стабильность в растворе остается низкой за счет потерь на стенках сосуда и агрегации. Proteins of this class have a high specific biological activity, as a result of which their single therapeutic dose is in the microgram range. Some of the proteins of this class used in medical practice (usually obtained in prokaryotic systems) are in a partially denatured state and are prone to aggregation and precipitation. This primarily relates to recombinant interferons-alpha. In the process of preparing dosage forms based on proteins of this class, the most common approach currently is to introduce serum albumin as a stabilizer and / or freeze-drying as a stabilizer. However, both of these approaches are not free from disadvantages. The introduction of human serum albumin as a stabilizer increases the risk of viral contamination of the drug and limits its use by patients of certain religious denominations. Freeze-drying not only reduces the activity of the drug, but also causes partial denaturation of albumin, which in turn sometimes leads to allergic reactions in patients. Previously, it was described and implemented the preparation of a dosage form of a recombinant human interferon-alpha drug free of human serum albumin. For this, dextrans (REALDIRON, BIOTECHNA, Lithuania) were introduced into the composition for drying as a filler. Such an approach allows the preparation to be dried, but the stability in solution remains low due to losses on the vessel walls and aggregation.

Другим подходом к решению проблемы стабильности рекомбинантных белков в готовых лекарственных формах является введение в композицию мочевины, комплекса амфотерных электролитов (аминокислот) и детергентов с последующей лиофильной сушкой (RU 2043118), где удалось получить стабильную лекарственную форму рекомбинантного эритропоэтина человека. В то же время имеются существенные ограничения на срок хранения препарата после его растворения. Another approach to solving the stability problem of recombinant proteins in finished dosage forms is the introduction of urea, a complex of amphoteric electrolytes (amino acids) and detergents, followed by freeze drying (RU 2043118), where it was possible to obtain a stable dosage form of recombinant human erythropoietin. At the same time, there are significant restrictions on the shelf life of the drug after its dissolution.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому способу является способ приготовления готовых форм рекомбинантных белков [US 5,656,730, 1996, МПК А 61 К 035/14; А 61 К 38/00; С 07 К 014/505; С 07 К 014/535] , согласно которому лекарственные формы рекомбинантных белков приготовляли с использованием сложных композиций, состоящих из комплекса аминокислот, хлорбутанола, бензилового спирта, бензалкониумхлорида и неорганических компонентов буферных растворов. Согласно прототипу для получения готовой лекарственной формы, содержащей 10-2000 мкг/мл рекомбинантного белка, в указанном растворе растворяют соответствующее количество субстанции и используют полученный раствор в равной степени для приготовления жидкой или лиофилизованной формы. Существенным недостатком данного подхода является необходимость использования крайне сложной композиции, содержащей такие компоненты, как 1,1,1-трихлор-2-метил-2-пропанол, бензиловый спирт и бензалкониум хлорид. The closest set of essential features to the claimed method is a method for preparing finished forms of recombinant proteins [US 5,656,730, 1996, IPC A 61 K 035/14; A 61 K 38/00; C 07 To 014/505; C 07 K 014/535], according to which dosage forms of recombinant proteins were prepared using complex compositions consisting of a complex of amino acids, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride and inorganic components of buffer solutions. According to the prototype, to obtain a finished dosage form containing 10-2000 μg / ml of recombinant protein, the corresponding amount of substance is dissolved in the specified solution and the resulting solution is used equally for the preparation of a liquid or lyophilized form. A significant drawback of this approach is the need to use an extremely complex composition containing components such as 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol, benzyl alcohol and benzalkonium chloride.

Задачей изобретения является разработка более простого и дешевого способа получения лекарственных форм рекомбинантных белков, обладающих стабильной биологической активностью при хранении. The objective of the invention is to develop a simpler and cheaper way to obtain dosage forms of recombinant proteins with stable biological activity during storage.

Технический результат заключается в том, что в результате разработанного способа получают более дешевый и безопасный препарат, не включающий токсичных компонентов. The technical result consists in the fact that as a result of the developed method receive a cheaper and safer drug that does not include toxic components.

Поставленная задача решается посредством того, что при приготовлении жидкой лекарственной формы соответствующего рекомбинантного белка эффективное количество последнего растворяют в биосовместимом буферном растворе, содержащем неионный детергент и в некоторых случаях дополнительно стабилизатор. Для приготовления лекарственной формы берут буферный раствор со значением рН, отличающимся более чем на 1 единицу от изоэлектрической точки белка. Это обеспечивает стабильное нахождение белка при низких концентрациях (1-100 мкг/мл) в растворах без агрегации и олигомеризации. The problem is solved by the fact that when preparing a liquid dosage form of the corresponding recombinant protein, an effective amount of the latter is dissolved in a biocompatible buffer solution containing a non-ionic detergent and, in some cases, an additional stabilizer. To prepare the dosage form, take a buffer solution with a pH value that differs by more than 1 unit from the isoelectric point of the protein. This ensures a stable presence of protein at low concentrations (1-100 μg / ml) in solutions without aggregation and oligomerization.

В качестве детергента можно использовать Tween-20, Tween-80, Tween-60, Nonidet P-40 и др. В качестве биосовместимых буферных систем могут быть использованы изотонические буферные растворы на основе цитратов, ацетатов, фосфатов и др. В ряде случаев для корректировки осмолярности растворы могут содержать в качестве стабилизатора биосовместимые полимерные компоненты - многоатомные спирты, декстрины, поливинилпирролидоны и др. As a detergent, Tween-20, Tween-80, Tween-60, Nonidet P-40 and others can be used. Isotonic buffer solutions based on citrates, acetates, phosphates, etc. can be used as biocompatible buffer systems. In some cases, for adjustment osmolarity solutions may contain biocompatible polymer components as a stabilizer - polyhydric alcohols, dextrins, polyvinylpyrrolidones, etc.

Предложенный способ иллюстрируется следующими примерами. The proposed method is illustrated by the following examples.

Пример 1. Получение жидкой лекарственной формы рекомбинантного интерферона-альфа человека
Для получения жидкой лекарственной формы рекомбинантного интерферона-альфа использовали высокоочищенный препарат, выделенный из телец включения штамма E.Coli IF212S, не содержащий заметных примесей олигомерных форм, продуктов протеолиза и примесей белков клеток-продуцентов. Удельная биологическая активность препарата составляла 2•10⁸ МЕ/мл, кажущаяся молекулярная масса 18,1 кD, изоэлектрическая точка pl=5,96.Example 1. Obtaining a liquid dosage form of recombinant human interferon-alpha
To obtain a liquid dosage form of recombinant interferon-alpha, a highly purified preparation was used, isolated from inclusion bodies of E. coli strain IF212S, which did not contain noticeable impurities of oligomeric forms, proteolysis products, and impurities of producer cell proteins. The specific biological activity of the preparation was 2 • 10 ⁸ IU / ml, the apparent molecular weight was 18.1 kD, the isoelectric point was pl = 5.96.

Контроль биологической активности осуществляли по методу ингибирования цитопатогенного действия вируса везикулярного стоматита на клетках эмбрионального легкого человека линии Л-68. В лунки 96-ячеечных микропланшетов вносили по 0,1 мл суспензии клеток в питательной среде Игла DMEM с добавкой 80-160 мкг/мл гентамицина и 2% сыворотки плодов коров в концентрации 200-300 тыс. клеток/мл. Для определения активности интерферона готовят двукратные разведения (выше и ниже предполагаемого титра) исследуемых препаратов и стандарта активности интерферона в среде Игла DMEM, содержащей 2% сыворотки плодов коров и антибиотики (пенициллин 100 Ед./мл, гентамицин 80 мкг/мл). На каждое разведение препарата используют не менее 4 лунок с культурой клеток. В каждую лунку с клеточной культурой вносили по 0,1 мл приготовленных образцов интерферона. Четыре лунки с культурой в каждом микропланшете оставляли в качестве контрольных. Кроме того, 16 лунок оставляли для контроля дозы индикаторного вируса. В эти лунки вносили по 0,1 мл питательной среды. Инокулированные и контрольные культуры клеток инкубировали в течение 1 суток при (37,0±1,0)^oС в атмосфере с (5,0±0,5)% СO₂, после чего в каждую лунку с испытуемыми материалами вносили определенную заранее дозу вируса везикулярного стоматита, соответствующую 100 ТЦД₅₀ в 0,1 мл. Одновременно осуществляли контроль взятой дозы вируса на предназначенных для этой операции 16 лунках с культурой. После внесения индикаторного вируса и титрования его дозы, культуру клеток инкубировали на протяжении 1-2 суток при температуре (37,0±1,0)^oС в атмосфере с (5,0±0,5)% СO₂ под контролем дозы вируса, после чего проводили учет активности интерферона. За титр интерферона принимали величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок оказалась полностью защищенной от цитопатического действия вируса.Biological activity was monitored by the method of inhibiting the cytopathogenic effect of the vesicular stomatitis virus on human embryonic lung cells of the L-68 line. In the wells of 96-cell microplates, 0.1 ml of a suspension of cells in a nutrient medium Eagle DMEM was added with the addition of 80-160 μg / ml gentamicin and 2% serum of cow fruits at a concentration of 200-300 thousand cells / ml. To determine the activity of interferon, two dilutions (above and below the expected titer) of the studied preparations and the standard of activity of interferon in the Medium Needle DMEM containing 2% serum of cow fetuses and antibiotics (penicillin 100 Units / ml, gentamicin 80 μg / ml) are prepared. At least 4 wells with cell culture are used for each dilution of the preparation. 0.1 ml of prepared interferon samples were added to each cell culture well. Four culture wells in each microplate were left as controls. In addition, 16 holes were left to control the dose of the indicator virus. 0.1 ml of culture medium was added to these wells. Inoculated and control cell cultures were incubated for 1 day at (37.0 ± 1.0) ^o C in an atmosphere with (5.0 ± 0.5)% CO ₂ , after which a predetermined dose was introduced into each well with test materials vesicular stomatitis virus corresponding to 100 TCD ₅₀ in 0.1 ml. At the same time, the taken dose of the virus was monitored in 16 culture wells intended for this operation. After the introduction of the indicator virus and titration of its dose, the cell culture was incubated for 1-2 days at a temperature of (37.0 ± 1.0) ^o С in an atmosphere with (5.0 ± 0.5)% СО ₂ under the control of the virus dose after which the interferon activity was counted. For the interferon titer, the reciprocal of the preparation was taken, in which the cell culture in 50% of the wells was completely protected from the cytopathic effect of the virus.

Физическое содержание интерферона определяли методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем ProCon IF2 (Протеиновый контур, Россия). Для контроля олигомерных форм использовали твердофазный иммуноферментный тест с антителами PC/IF1 (Протеиновый контур, Россия) в качестве сорбирующего и открывающего реагентов. The physical content of interferon was determined by enzyme immunoassay using ProCon IF2 test systems (Protein circuit, Russia). To control the oligomeric forms, an enzyme-linked immunosorbent assay with PC / IF1 antibodies (Protein circuit, Russia) was used as a sorbing and opening reagent.

Была приготовлена серия 0,05 М аммонийацетатных буферных растворов, содержащих 0,1 М хлорида натрия и 0,02% Твин-20, в интервале рН от 4 до 8. В каждый из буферных растворов был внесен рекомбинантный интерферон-альфа из расчета 3•10⁶ и 6•10⁶ МЕ/мл, растворы подвергли стерилизующей фильтрации и стерильно аликвотировали по 1 мл в стеклянные ампулы. Ампулы были запаяны и в равных количествах помещены на хранение при температурах -70, +4 и +37^oС. С периодичностью в 7 дней ампулы извлекали из термостатов и подвергали анализу на общее содержание интерферона и содержание олигомерных форм по отношению к замороженному препарату. В начале и в конце эксперимента были проведены дополнительно измерения биологической активности. Результирующие данные по хранению препарата с исходной активностью 3•10⁶ МЕ/мл представлены на фиг. 1 и в таблице 1. Полностью аналогичные данные были получены и для препарата с активностью 6•10⁶ МЕ/мл.A series of 0.05 M ammonium acetate buffer solutions containing 0.1 M sodium chloride and 0.02% Tween-20 was prepared in the pH range from 4 to 8. Recombinant interferon-alpha was added to each buffer solution at a rate of 3 • 10 ⁶ and 6 • 10 ⁶ IU / ml, the solutions were subjected to sterilizing filtration and 1 ml were sterilized aliquotted into glass ampoules. The ampoules were sealed and in equal quantities were stored at temperatures of -70, +4 and +37 ^o C. With a frequency of 7 days, the ampoules were removed from thermostats and subjected to analysis for the total content of interferon and the content of oligomeric forms in relation to the frozen preparation. At the beginning and at the end of the experiment, additional measurements of biological activity were carried out. The resulting data on the storage of the drug with an initial activity of 3 • 10 ⁶ IU / ml are presented in FIG. 1 and table 1. Completely similar data were obtained for the drug with an activity of 6 • 10 ⁶ IU / ml.

Пример 2. Приготовление жидкой лекарственной формы рекомбинантного эритропоэтина человека
Для получения жидкой лекарственной формы рекомбинантного эритропоэтина человека использовали высокоочищенный препарат, выделенный из кондиционированной культуральной жидкости клеток СНО SP/M pZip NeoEPO SV(x) DFR в соответствии с методом, описанным в патенте [RU 2145610, М.кл⁶ C 12 N 11/00] и не содержащий заметных примесей олигомерных форм, продуктов протеолиза, и примесей белков клеток-продуцентов. Удельная биологическая активность препарата составляла 1,4•10⁵ МЕ/мл, кажущаяся молекулярная масса - 35,2 кD, pl= 3,5-5,0.Example 2. Preparation of a liquid dosage form of recombinant human erythropoietin
To obtain a liquid dosage form of recombinant human erythropoietin, a highly purified preparation was used that was isolated from conditioned culture liquid of CHO SP / M cells pZip NeoEPO SV (x) DFR in accordance with the method described in the patent [RU 2145610, Mcl ⁶ C 12 N 11 / 00] and not containing noticeable impurities of oligomeric forms, proteolysis products, and impurities of producer cell proteins. The specific biological activity of the preparation was 1.4 • 10 ⁵ IU / ml, the apparent molecular weight was 35.2 kD, pl = 3.5-5.0.

Контроль биологической активности осуществляли in vitro по методу [Krystal G. , 1983] , основанном на оценке стимуляции пролиферации клеток крови полицитемических мышей в присутствии эритропоэтина. Анемическое состояние у мышей-гибридов F1 CDF•C57Bl вызывали двукратным, через 30 часов, внутрибрюшинным введением фенилгидразина в дозе 60 мкг/кг. Спленоциты выделяли через 3 суток после последнего введения фенилгидразина и культивировали в ячейках 96-луночных планшетов в среде DMEM с 5% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 mM L-глутамина и 80 мкг/мл гентамицина и присутствии раститрованных образцов стандартного и исследуемого препаратов в СО₂-инкубаторе в течение 24 часов. За два часа до окончания культивирования в ячейки вносили 40 мкБк ³H-тимидина. Клеточные культуры переносили на фильтры, отмывали и производили учет включения ³H-тимидина при помощи сцинциляционного счетчика RackBeta 1217, Фармация. По графику уровня включения ³H-тимидина для стандартного образца определяли биологическую активность исследуемых препаратов.Control of biological activity was carried out in vitro according to the method of [Krystal G., 1983], based on the evaluation of stimulation of proliferation of blood cells of polycythemic mice in the presence of erythropoietin. Anemic condition in F1 CDF • C57Bl hybrid mice was caused by a double, after 30 hours, intraperitoneal administration of phenylhydrazine at a dose of 60 μg / kg. Splenocytes were isolated 3 days after the last injection of phenylhydrazine and were cultured in cells of 96-well plates in DMEM medium with 5% calf embryonic serum, 2 mM L-glutamine and 80 μg / ml gentamicin and the presence of cultivated samples of standard and test preparations in CO ₂ - incubator for 24 hours. Two hours before the end of the cultivation, 40 μBq ³ H-thymidine were introduced into the cells. Cell cultures were transferred to filters, washed, and ³ H-thymidine incorporation was counted using a RackBeta 1217 scintillation counter, Pharmacy. According to the graph of the level of ³ H-thymidine incorporation for a standard sample, the biological activity of the studied preparations was determined.

Физическое содержание эритропоэтина определяли методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем ProCon EPO (Протеиновый контур, Россия). Для контроля олигомерных форм использовали твердофазный иммуноферментный тест с антителами PC/ED7 (Протеиновый контур, Россия) в качестве сорбирующего и открывающего реагентов. Была приготовлена серия 0,05 М натрий-цитратных буферных растворов, содержащих 0,12 М хлорида натрия и 0,02% Твин-20, в интервале рН от 4 до 8. В каждый из буферных растворов был внесен рекомбинантный эритропоэтин человека из расчета 2•10³ и 4•10³ МЕ/мл, растворы подвергли стерилизующей фильтрации и стерильно аликвотировали по 1 мл в стеклянные ампулы. Ампулы были запаяны и в равных количествах помещены на хранение при температурах -70, +4 и +37^oС. С периодичностью в 7 дней ампулы извлекали из термостатов и подвергали анализу на общее содержание эритропоэтина и содержание олигомерных форм по отношению к замороженному препарату. В начале и в конце эксперимента были проведены дополнительно измерения биологической активности. Результирующие данные по хранению препарата с исходной активностью 4•10³ МЕ/мл представлены на фиг. 4 и в таблице 2. Полностью аналогичные данные были получены и для препарата с активностью 2•10³ МЕ/мл.The physical content of erythropoietin was determined by enzyme-linked immunosorbent assay using ProCon EPO test systems (Protein circuit, Russia). To control the oligomeric forms, an enzyme-linked immunosorbent assay with antibodies PC / ED7 (Protein circuit, Russia) was used as a sorbing and opening reagent. A series of 0.05 M sodium citrate buffer solutions containing 0.12 M sodium chloride and 0.02% Tween-20 was prepared in the pH range from 4 to 8. Recombinant human erythropoietin was added to each buffer solution at a rate of 2 • 10 ³ and 4 • 10 ³ IU / ml, the solutions were subjected to sterilizing filtration and 1 ml were sterilized aliquotted into glass ampoules. The ampoules were sealed and in equal quantities were stored at temperatures of -70, +4 and +37 ^o C. With a frequency of 7 days, the ampoules were removed from thermostats and subjected to analysis for the total content of erythropoietin and the content of oligomeric forms in relation to the frozen preparation. At the beginning and at the end of the experiment, additional measurements of biological activity were carried out. The resulting data on the storage of the drug with an initial activity of 4 • 10 ³ IU / ml are presented in FIG. 4 and table 2. Completely similar data were obtained for the drug with activity of 2 • 10 ³ IU / ml.

Пример 3. Получение жидкой лекарственной формы рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) человека
Для получения жидкой лекарственной формы рекомбинантного Г-КСФ человека использовали высокоочищенный препарат, выделенный из кондиционированной культуральной жидкости клеток СНО pZip NeoGCSF CMV(x) DFR, не содержащий заметных примесей олигомерных форм, продуктов протеолиза, и примесей белков клеток-продуцентов (фиг. 5). Удельная биологическая активность препарата составляла 1,1•10⁸ МЕ/мл, кажущаяся молекулярная масса 20 кD, pl=5,7-6,3.Example 3. Obtaining a liquid dosage form of a recombinant granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) person
To obtain a liquid dosage form of recombinant human G-CSF, a highly purified preparation was used, isolated from conditioned culture liquid of CHO cells pZip NeoGCSF CMV (x) DFR, not containing noticeable impurities of oligomeric forms, proteolysis products, and protein cell impurities of producer cells (Fig. 5) . The specific biological activity of the preparation was 1.1 • 10 ⁸ IU / ml, the apparent molecular weight of 20 kD, pl = 5.7-6.3.

Контроль биологической активности осуществляли по методу оценки стимуляции пролиферации клеток костного мозга мышей [Okabe M., et al., 1990]. Костномозговые клетки мышей-гибридов F1 СВА•C57Bl выделяли стандартным методом и культивировали в концентрации 5•10⁵ клеток/мл в ячейках 96-луночных планшетов в среде DMEM с 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 mM L-глутамина и 80 мкг/мл гентамицина в присутствии раститрованных образцов стандартного и исследуемого препаратов в СO₂-инкубаторе в течение 72 часов. За 20 часов до окончания культивирования в ячейки вносили по 40 мкБк ³Н-тимидина. Клеточные культуры переносили на фильтры, отмывали и производили учет включения ³Н-тимидина при помощи сцинциляционного счетчика RackBeta 1217, Фармация. По графику уровня включения ³Н-тимидина для стандартного образца определяли биологическую активность исследуемых препаратов.The control of biological activity was carried out by the method of evaluating the stimulation of proliferation of bone marrow cells in mice [Okabe M., et al., 1990]. The bone marrow cells of F1 CBA • C57Bl hybrid mice were isolated by the standard method and cultured at a concentration of 5 × 10 ⁵ cells / ml in cells of 96-well plates in DMEM medium with 10% calf fetal serum, 2 mM L-glutamine and 80 μg / ml gentamicin in the presence of propagated samples of standard and test drugs in a CO ₂ incubator for 72 hours. 20 hours before the end of the cultivation, 40 μBq of ³ N-thymidine were introduced into the cells. Cell cultures were transferred to filters, washed, and ³ H-thymidine incorporation was counted using a RackBeta 1217 scintillation counter, Pharmacy. According to the graph of the level of incorporation of ³ N-thymidine for a standard sample, the biological activity of the studied drugs was determined.

Физическое содержание Г-КСФ определяли методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем ProCon G-CSF (Протеиновый контур, Россия). Для контроля олигомерных форм использовали твердофазный иммуноферментный тест с антителами PC/G36F11 (Протеиновый контур, Россия) в качестве сорбирующего и открывающего реагентов. The physical content of G-CSF was determined by enzyme-linked immunosorbent assay using ProCon G-CSF test systems (Protein circuit, Russia). To control the oligomeric forms, an enzyme-linked immunosorbent assay with antibodies PC / G36F11 (Protein circuit, Russia) was used as a sorbing and opening reagent.

Была приготовлена серия 0,02 М натрий-фосфатных буферных растворов, содержащих 0,15 М хлорида натрия и 0,02% Твин-80 в интервале рН от 4 до 8. В каждый из буферных растворов был внесен рекомбинантный Г-КСФ человека из расчета 3•10⁷ МЕ/мл, растворы подвергли стерилизующей фильтрации и стерильно аликвотировали по 1 мл в стеклянные ампулы. Ампулы были запаяны и в равных количествах помещены на хранение при температурах -70, +4 и +37^oС. С периодичностью в 7 дней ампулы извлекали из термостатов и подвергали анализу на общее содержание Г-КСФ и содержание олигомерных форм по отношению к замороженному препарату. В начале и в конце эксперимента были проведены дополнительно измерения биологической активности. Результирующие данные по хранению препарата на фиг. 6 и в таблице 3.A series of 0.02 M sodium phosphate buffer solutions containing 0.15 M sodium chloride and 0.02% Tween-80 was prepared in the pH range from 4 to 8. Recombinant human G-CSF was added to each of the buffer solutions 3 • 10 ⁷ IU / ml, the solutions were sterilized by filtration and 1 ml was sterilized aliquotted into glass ampoules. The ampoules were sealed and in equal quantities were stored at temperatures of -70, +4 and +37 ^o C. With a frequency of 7 days, the ampoules were removed from thermostats and analyzed for the total content of G-CSF and the content of oligomeric forms with respect to the frozen preparation . At the beginning and at the end of the experiment, additional measurements of biological activity were carried out. The resulting drug storage data in FIG. 6 and table 3.

Из данных таблиц 1-3 и фиг. 1-3 видно, что наиболее стабильные композиции растворов белков находятся в областях, удаленных от изоэлектрических точек рассматриваемых объектов более чем на 1 единицу. Пониженная стабильность интерферона-альфа в кислой области определяется, по-видимому, одновременно комплексом факторов - гидролитическим расщеплением белка при повышенной температуре, олигомеризацией за счет тиол-дисульфидного обмена с участием свободных сульфгидрильных групп не полностью ренатурированного белка и повышенной сорбции положительно заряженного белка на поверхностных силанольных группах стекла. В то же время переход в основную область за изоэлектрическую точку приводит к стабилизации данного белка. Хорошо видна явная зависимость стабильности препаратов эритропоэтина от рН. В области, близкой от изоэлектрической точки, стабильность понижена в связи с образованием агрегатов, а по мере отдаления от рl электростатические взаимодействия подавляются. Та же тенденция может быть отмечена и в случае Г-КСФ. From the data of tables 1-3 and FIG. 1-3 it is seen that the most stable compositions of protein solutions are in areas remote from the isoelectric points of the objects in question by more than 1 unit. The reduced stability of interferon-alpha in the acidic region is apparently determined simultaneously by a combination of factors — hydrolytic cleavage of the protein at elevated temperature, oligomerization due to thiol disulfide exchange with the participation of free sulfhydryl groups of the incompletely renatured protein, and increased sorption of the positively charged protein on surface silanol groups of glass. At the same time, the transition to the main region beyond the isoelectric point leads to stabilization of this protein. The apparent dependence of the stability of erythropoietin preparations on pH is clearly visible. In the region close to the isoelectric point, stability is reduced due to the formation of aggregates, and as they move away from pl, electrostatic interactions are suppressed. The same trend can be noted in the case of G-CSF.

Пример 4. Получение жидкой лекарственной формы рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) человека, содержащей лактозу
Для исследования влияния стабилизирующих свойств некоторых компонентов небелковой природы была приготовлена серия растворов лактозы, маннита, поливинилпирролидона 8000 (ПВП) и декстрана 10000 в 0,02 М натрий-фосфатном буферном растворе, содержащем 0,15 М хлорида натрия, 0,02% Твин-20, рН=7,0. Рекомбинантный Г-КСФ человека, как в примере 3, был внесен из расчета 3•10⁷ МЕ/мл в каждый из растворов. Растворы аликвотировали и хранили так же, как в примере 3, подвергая еженедельному анализу на активность и содержание олигомерных форм. Результаты представлены в таблице 4.Example 4. Obtaining a liquid dosage form of a recombinant granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) of a person containing lactose
A series of solutions of lactose, mannitol, polyvinylpyrrolidone 8000 (PVP) and dextran 10000 in 0.02 M sodium phosphate buffer solution containing 0.15 M sodium chloride, 0.02% Tween- was prepared to study the effect of the stabilizing properties of some components of non-protein nature. 20, pH = 7.0. Recombinant human G-CSF, as in example 3, was introduced at the rate of 3 • 10 ⁷ IU / ml in each of the solutions. The solutions were aliquoted and stored as in Example 3, subjected to weekly analysis for the activity and content of oligomeric forms. The results are presented in table 4.

В процессах получения готовых форм препаратов генно-инженерного происхождения в качестве стабилизирующих наполнителей часто используют компоненты мономерной и полимерной углеводной природы, многоатомные спирты и некоторые биосовместимые полимеры. Из таблицы 4 видно, что введение подобных компонентов в готовые формы препаратов белков генно-инженерного происхождения, находящихся при рН, существенно отличающихся от рl данного белка, не оказывает значительного эффекта на стабильность композиции. In the processes of preparing finished forms of preparations of genetically engineered origin, the components of monomeric and polymeric carbohydrate nature, polyhydric alcohols, and some biocompatible polymers are often used as stabilizing fillers. From table 4 it is seen that the introduction of such components in the finished form of preparations of proteins of genetically engineered origin, located at pH, significantly different from this protein does not have a significant effect on the stability of the composition.

Claims (4)

1. Способ получения жидких лекарственных форм рекомбинантных белков (белков генно-инженерного происхождения), включающий растворение данных белков в биосовместимом буферном растворе, отличающийся тем, что в биосовместимый буферный раствор добавляют неионный детергент, после чего вводят рекомбинантный белок эффективной концентрации, при этом используют буферный раствор, имеющий значение показателя водородного потенциала более чем на одну единицу отличающегося от изоэлектрической точки данного белка. 1. A method of producing liquid dosage forms of recombinant proteins (genetically engineered proteins), comprising dissolving these proteins in a biocompatible buffer solution, characterized in that a non-ionic detergent is added to the biocompatible buffer solution, after which a recombinant protein of effective concentration is added, and a buffer is used a solution having a value of the hydrogen potential index of more than one unit different from the isoelectric point of this protein. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что детергент вводят в буферный раствор в количестве 0,01-0,05 мас. %. 2. The method according to p. 1, characterized in that the detergent is introduced into the buffer solution in an amount of 0.01-0.05 wt. % 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в биосовместимый буферный раствор дополнительно вводят стабилизатор углеводной природы в количестве 2-5 вес. %. 3. The method according to p. 1, characterized in that the biocompatible buffer solution is additionally injected with a stabilizer of carbohydrate nature in an amount of 2-5 weight. % 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биосовместимый буферный раствор содержит в качестве стабилизатора многоатомные спирты и/или водорастворимый полимер. 4. The method according to p. 1, characterized in that the biocompatible buffer solution contains polyhydric alcohols and / or a water-soluble polymer as stabilizer.

Images