RU2170256C2 - Recombinant antibody with specificity to cd4, method of its preparing and pharmaceutical composition for treatment of patients with psoriasis - Google Patents
Recombinant antibody with specificity to cd4, method of its preparing and pharmaceutical composition for treatment of patients with psoriasis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2170256C2 RU2170256C2 RU94038045/13A RU94038045A RU2170256C2 RU 2170256 C2 RU2170256 C2 RU 2170256C2 RU 94038045/13 A RU94038045/13 A RU 94038045/13A RU 94038045 A RU94038045 A RU 94038045A RU 2170256 C2 RU2170256 C2 RU 2170256C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- human
- immunoglobulin
- monkey
- antibodies
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Настоящее заявка является частичным продолжением заявки на патент США (Newman et al.) рег. N 07/856281, поданной 23 марта 1992 г., которая, в свою очередь, является частичным продолжением заявки на патент США рег. N 07/735064, поданной 25 июля 1991; и обе указанные заявки целиком, включая рисунки, входят в настоящее описание посредством ссылки. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, используемым для терапевтического лечения людей, а также к способам продуцирования указанных антител. This application is a partial continuation of the application for US patent (Newman et al.) Reg. N 07/856281, filed March 23, 1992, which, in turn, is a partial continuation of the application for US patent reg. N 07/735064, filed July 25, 1991; and both of these applications in whole, including figures, are incorporated into this description by reference. The present invention relates to recombinant antibodies used for the therapeutic treatment of humans, as well as to methods for producing said antibodies.
Предшествующий уровень техники
Мышиные моноклональные антитела используются в диагностике заболеваний человека и в биологических исследованиях, направленных на решение важных научных задач. Указанные антитела также используются в клинических анализах при лечении острых и хронических заболеваний человека, включая лейкозы, лимфомы, твердые опухоли (например, опухоли прямой кишки, молочной железы, печени), СПИД и другие аутоиммунные заболевания.State of the art
Mouse monoclonal antibodies are used in the diagnosis of human diseases and in biological studies aimed at solving important scientific problems. These antibodies are also used in clinical analyzes in the treatment of acute and chronic human diseases, including leukemia, lymphomas, solid tumors (for example, tumors of the rectum, mammary gland, liver), AIDS and other autoimmune diseases.
Были продуцированы химерные антитела мыши/человека и показано, что эти антитела обладают связывающими свойствами родительского мышиного антитела, а их эффекторные функции ассоциируются с констатнтной областью антитела человека. См. , например, патент США (Cabilly и др. ) 4816567; патент США (Shoemaker и др.) 4978745; патент США (Beavers и др.) 4975369 и патент США (Boss и др.) 4816397, из которых все вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Обычно, указанные химерные антитела конструируют путем получения геномной библиотеки из ДНК, экстрагированной из уже имеющихся мышиных гибридом. Nishimura et al. , 47 Cancer Researeh 999, 1987. Затем библиотеку скринируют на гены вариабельных областей из тяжелой и легкой цепей, обнаруживающих правильные картины реаранжировки фрагмента антитела. Затем клонированные гены вариабельных областей лигируют в вектор экспрессии, содержащий клонированные кассеты соответствующего гена константной области тяжелой или легкой цепи человека. После этого, химерные гены экспрессируют в подходящей клеточной линии, обычно в линии клеток мышиной миеломы. Mouse / human chimeric antibodies were produced and it was shown that these antibodies possess the binding properties of the parent mouse antibody, and their effector functions are associated with the constant region of the human antibody. See, for example, US patent (Cabilly and others) 4816567; U.S. Patent (Shoemaker et al.) 4,978,745; US patent (Beavers and others) 4975369 and US patent (Boss and others) 4816397, of which all are incorporated into this description by reference. Typically, these chimeric antibodies are constructed by preparing a genomic library from DNA extracted from existing mouse hybridomas. Nishimura et al. 47 Cancer Researeh 999, 1987. The library is then screened for the genes of the variable regions from the heavy and light chains, revealing the correct rearrangement patterns of the antibody fragment. The cloned genes of the variable regions are then ligated into an expression vector containing the cloned cassettes of the corresponding gene of the constant region of the human heavy or light chain. Thereafter, chimeric genes are expressed in a suitable cell line, usually in a murine myeloma cell line.
Описанные химерные антитела были использованы для лечения людей. Однако в ряде случаев у человека-реципиента продуцировались антитела к этим химерным антителам. Такое продуцирование антитела против химерного антитела оказывало неблагоприятное воздействие на проведение терапии с использованием химерного антитела. The chimeric antibodies described have been used to treat humans. However, in some cases, antibodies to these chimeric antibodies have been produced in the recipient person. Such production of an anti-chimeric antibody antibody has had an adverse effect on therapy using a chimeric antibody.
Erlich и др. (34 Clinical Chemistry 1681, 1988), Erlich и др. (7 Hybridoma 385, 1988), Erlich и др. (6 Hibridoma 151, 1987) и Erlich и др. (1 Human Antibody Gybridomas 23, 1990) (не принимаемые за прототипы к настоящему изобретению) указывают, что человеческое моноклональное антитело дало бы лучший эффект в in vivo-терапии человека, чем мышиные моноклональные тела. В своих работах они также исходили из постулата, что антитела приматов, не относящихся к человеку, например моноклональные антитела шимпанзе, являются толерантными для человека, поскольку антитела шимпанзе и человека являются структурно схожими. Так как человеческие антитела являются неиммуногенными для макаки-резус (т.е. они не индуцируют антительный ответ), то было высказано предложение, что антитела приматов будут неиммуногенными для человека. В вышеупомянутых работах также указывается, что испытание на продуцирование антител у человека проводить необязательно в том случае, если антитело примата имеет структуру константной области, аналогичную структуре этой области Ig человека, или, по крайней мере, это антитело имеет структуру, которая отличается от структуры иммуноглобулина человека не более, чем различные антитела человека отличается между собой. Таким образом, было высказано предложение, что антитела шимпанзе могут быть использованы в терапии человека. Erlich et al. (34 Clinical Chemistry 1681, 1988), Erlich et al. (7 Hybridoma 385, 1988), Erlich et al. (6 Hibridoma 151, 1987) and Erlich et al. (1 Human Antibody Gybridomas 23, 1990) (not accepted as prototypes of the present invention) indicate that a human monoclonal antibody would give a better effect in human in vivo therapy than murine monoclonal bodies. In their work, they also proceeded from the postulate that non-human primate antibodies, such as chimpanzee monoclonal antibodies, are tolerant to humans, since chimpanzee and human antibodies are structurally similar. Since human antibodies are non-immunogenic for Rhesus monkeys (i.e., they do not induce an antibody response), it has been suggested that primacy antibodies will be non-immunogenic for humans. The aforementioned studies also indicate that testing for the production of antibodies in humans is optional if the primate antibody has a constant region structure similar to that of this human Ig region, or at least this antibody has a structure that is different from the structure of immunoglobulin human no more than different human antibodies different from each other. Thus, it has been suggested that chimpanzee antibodies can be used in human therapy.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам амплификации и клонирования генов, кодирующих антигенсвязывающие участки вариабельной области иммуноглобулина обезьян Старого Света (называемых далее "обезьянами", например павианов или макак); лигирования этих генов с клонированными генами, кодирующими константную область иммуноглобулинов человека, шимпанзе или других обезьян (или, если это необходимо, с генами, кодирующими остов молекулы иммуноглобулина человека, шимпанзе или другой обезьяны); и экспрессии этих генов, кодирующих рекомбинантные антитела человека/обезьяны либо полностью обезьяньи рекомбинантные антитела. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию указанных рекомбинантных антител (этот термин означает антитела, продуцированные в результате гибридизации ДНК двух различных генов антител, которые могут происходить даже от двух одинаковых видов, например, от обезьян, таких как макака-резус и собаковидная обезьяна, и которые будут кодировать обезьяно-обезьянье рекомбинантное антитело) в качестве иммунотерапевтических средств для лечения людей. В основу настоящего изобретения было положено обнаружение того факта, что в отличие от шимпанзе, такие эволюционно далекие от человека виды обезьян, как бабуин или макака (включая собаковидную обезьяну и макаку-резус), не только достаточно отличаются от человека (настолько, что у этих обезьян продуцируются антитела против антигенов человека, даже против относительно консервативных антигенов человека, например C 4 и C 54), но и имеют достаточное сходство с человеком, такое что при введении человеку антител этих обезьян или рекомбинантных антител, происходящих от этих обезьян, у него не продуцируется иммунный ответ против этих антител.SUMMARY OF THE INVENTION
The present invention relates to methods for amplification and cloning of genes encoding antigen-binding regions of the immunoglobulin variable region of Old World monkeys (hereinafter referred to as “monkeys”, for example baboons or macaques); ligation of these genes with cloned genes encoding the constant region of human immunoglobulins, chimpanzees or other monkeys (or, if necessary, with genes encoding the backbone of a human immunoglobulin molecule, chimpanzee or other monkey); and the expression of these genes encoding recombinant human / monkey antibodies or fully monkey recombinant antibodies. In addition, the present invention relates to the use of these recombinant antibodies (this term refers to antibodies produced by the hybridization of the DNA of two different antibody genes, which can even come from two identical species, for example, from monkeys such as rhesus monkey and dog monkey, and which will encode a monkey-monkey recombinant antibody) as immunotherapeutic agents for treating humans. The basis of the present invention was the discovery of the fact that, unlike chimpanzees, species of monkeys such as a baboon or macaque (including a dog-like monkey and rhesus monkey) that are evolutionarily distant from humans, not only differ sufficiently from humans (so much so that these monkeys produce antibodies against human antigens, even against relatively conservative human antigens, such as
В отличие от некоторых антител, используемых ранее в лечении людей, антитела настоящего изобретения не имеют ряда недостатков, присущих указанным используемым ранее антителам, например, таких как (1) иммуногенность и индуцирование иммунного ответа с образованием антител против антител человека (HAA) после их повторного введения, необходимого для лечения хронических заболеваний; (2) относительно короткое время полужизни по сравнению с человеческими антителами; (3) отсутствие эффекторных функций в отношении клеток человека или комплемента. Благодаря отсутствию вышеуказанных недостатков, антитела настоящего изобретения могут быть с успехом использованы для терапевтического лечения заболеваний у человека. Например, в случае хронических заболеваний человека, включая аутоиммунные заболевания или любые другие заболевания, требующие продолжительного введения антител, одним из главных препятствий для успешного проведения повторной иммунотерапии является иммунный ответ организма-хозяина на терапевтическое антитело. HAA-ответы того или другого пациента часто бывают непредсказуемы. Указанные HAA-ответы преимущественно, хотя и не исключительно, направлены против константной области молекулы антитела и часто сводят на нет или снижают эффективность любой последующей терапии с использованием этого антитела или другого антитела того же изотипа. Unlike some antibodies used previously in the treatment of humans, the antibodies of the present invention do not have a number of disadvantages inherent in the previously used antibodies, for example, such as (1) immunogenicity and inducing an immune response with the formation of antibodies against human antibodies (HAA) after they are repeated the introduction necessary for the treatment of chronic diseases; (2) a relatively short half-life compared to human antibodies; (3) lack of effector functions for human cells or complement. Due to the absence of the above disadvantages, the antibodies of the present invention can be successfully used for the therapeutic treatment of diseases in humans. For example, in the case of chronic human diseases, including autoimmune diseases or any other diseases requiring prolonged administration of antibodies, one of the main obstacles to successful repeated immunotherapy is the host's immune response to a therapeutic antibody. HAA responses from one or another patient are often unpredictable. These HAA responses are predominantly, although not exclusively, directed against the constant region of the antibody molecule and often negate or reduce the effectiveness of any subsequent therapy using this antibody or another antibody of the same isotype.
В принципе, проблемы, связанные с HAA-ответом, могут быть решены путем использования моноклональных антител человека. Однако такой подход имеет ряд этических, клинических и иммунологических ограничений, связанных с иммунонизацией индивидуума нужными антигенами (например, термин "антигены человека" включает в себя антигенные или иммуногенные части любых белков, полипептидов или их эквивалентов, присутствующие в организме человека) в целях продуцирования антител. Авторы настоящего изобретения подошли к решению этой проблемы путем продуцирования антител с соответствующей специфичностью и нужной эффекторной функцией и использования их для получения рекомбинантных антител. Эти рекомбинантные антитела включают в себя соответствующую часть вариабельной области антитела, происходящего от иммунизированной обезьяны, и константную область антитела, происходящего от человека или шимпанзе. Таким образом, может быть сохранена специфичность и высокая степень аффинности моноклональных антител и легко подобрана константная область, происходящая от антитела человека или шимпанзе и обладающая нужными эффективными функциями. In principle, the problems associated with the HAA response can be solved by using human monoclonal antibodies. However, this approach has a number of ethical, clinical, and immunological limitations associated with immunizing an individual with the desired antigens (for example, the term “human antigens” includes antigenic or immunogenic parts of any proteins, polypeptides or their equivalents present in the human body) in order to produce antibodies . The authors of the present invention approached this problem by producing antibodies with appropriate specificity and the desired effector function and using them to produce recombinant antibodies. These recombinant antibodies include the corresponding portion of the variable region of an antibody derived from an immunized monkey and the constant region of an antibody derived from humans or chimpanzees. Thus, the specificity and high affinity of monoclonal antibodies can be maintained and the constant region derived from human antibodies or chimpanzees and possessing the necessary effective functions can be easily selected.
Кроме того, в основу настоящего изобретения был положен метод амплификации генов иммуноглобулина обезьян, осуществляемый, например, посредством полимеразно-цепной реакции (PCR) с использованием РНК, экстрагированной из лимфоцитов обезьяны, и синтетических олигонуклеотидных праймеров, специфичных для семейств генов, кодирующих вариабельную область тяжелой и легкой цепи. Амплифицированные гены или их соответствующие части (например, области, кодирующие гипервариабельный участок (CDR), см. Winter, заявки на патент Великобритании N GB 2188638A, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки) клонируют в вектор экспрессии, содержащий ген константной области человека или шимпанзе, в целях продуцирования рекомбинантного антитела обезьяны/человека; либо в вектор экспрессии, содержащий ген константной области обезьяны, в целях продуцирования рекомбинантного антитела нужного изотипа, полностью происходящего от обезьяны. Эти антитела представляют собой иммунотерапевтические агенты, способные к локализации и/или убиванию соответствующих клеток-мишеней (например, опухолевых клеток) после их in vivo-введения. In addition, the present invention was based on the method of amplification of monkey immunoglobulin genes, carried out, for example, by polymerase chain reaction (PCR) using RNA extracted from monkey lymphocytes and synthetic oligonucleotide primers specific for gene families encoding the variable region of the heavy and light chain. Amplified genes or their corresponding parts (for example, regions encoding a hypervariable region (CDR), see Winter, UK patent application N GB 2188638A, which is incorporated into this description by reference) are cloned into an expression vector containing a constant region gene of a human or chimpanzee , in order to produce a recombinant monkey / human antibody; or into an expression vector containing a monkey constant region gene, in order to produce a recombinant antibody of the desired isotype, completely descending from the monkey. These antibodies are immunotherapeutic agents capable of localizing and / or killing the corresponding target cells (eg, tumor cells) after their in vivo administration.
Таким образом, в первом своем варианте настоящее изобретение относится к способу клонирования гена, кодирующего антигенраспознающий участок вариабельной области антитела обезьяны. Этот способ предусматривает получение нуклеиновой кислоты, например РНК, от обезьяны; проведение синтеза ДНК, комплементарной РНК, (кДНК) (с использованием обратной транскриптазы); получение праймера, комплементарного кДНК-последовательности, кодирующей 5'-лидерную последовательность гена антитела; взаимодействие указанной кДНК и праймера с образованием гибридного комплекса; амплификацию кДНК в целях продуцирования нуклеиновой кислоты, кодирующей ген вариабельного участка антитела обезьяны. Thus, in a first embodiment, the present invention relates to a method for cloning a gene encoding an antigen-recognizing region of a monkey antibody variable region. This method involves obtaining a nucleic acid, for example RNA, from a monkey; DNA synthesis complementary to RNA (cDNA) (using reverse transcriptase); obtaining a primer complementary to the cDNA sequence encoding the 5'-leader sequence of the antibody gene; the interaction of the specified cDNA and primer with the formation of a hybrid complex; amplification of cDNA in order to produce a nucleic acid encoding the variable region gene of the monkey antibody.
Под термином "антигенраспознавающий участок" подразумевается один или несколько участков вариабельной области антитела обезьяны, которые являются ответственными за связывание и/или распознавание антигена-мишени (или эпитопа, или идиотипа) данного антитела. Например, этот участок включает в себя гипервариабельные участки (CDR, см. ниже), или всю вариабельную область, или любую комбинацию из этих двух областей, включая любые изменения в кодирующих областях, которые могут быть индуцированы в целях получения более человекообразной области (вместо обезьянообразной области) без изменения способности к специфическому связыванию этого антитела. Если используется лишь часть от всей вариабельной области, то остальные участки (например, так называемые "каркасные участки") могут происходить от другого антитела, предпочтительно от антитела человека или шимпанзе (см. ниже и в вышеуказанных работах, вводимых в настоящее описание посредством ссылки). By the term “antigen-recognizing region” is meant one or more regions of the variable region of a monkey antibody that are responsible for binding and / or recognition of the target antigen (or epitope or idiotype) of that antibody. For example, this region includes hypervariable regions (CDR, see below), or the entire variable region, or any combination of these two regions, including any changes in the coding regions that can be induced in order to obtain a more humanoid region (instead of apelike region) without changing the ability to specifically bind this antibody. If only a portion of the entire variable region is used, then the remaining regions (for example, the so-called "framework regions") can be derived from another antibody, preferably from a human antibody or chimpanzee (see below and in the above works, which are introduced into the present description by reference) .
Используемые в настоящем описании термины "вариабельная область", "лидерная последовательность", "константная область" и "каркас" употребляются в их общепринятом смысле (см., например, ниже или в вышеуказанных работах, вводимых в настоящее описание посредством ссылки). Used in the present description, the terms "variable region", "leader sequence", "constant region" and "frame" are used in their conventional sense (see, for example, below or in the above works, introduced into the present description by reference).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лидерная последовательность происходит от человека, шимпанзе или обезьяны и имеет приблизительно 60 оснований (примеры см. на фиг. 1). In a preferred embodiment of the present invention, the leader sequence is derived from a human, chimpanzee or monkey and has approximately 60 bases (for examples, see Fig. 1).
Автор настоящей заявки обнаружил, что лидерная последовательности вариабельной области антитела обезьяны, шимпанзе и человека имеют достаточное сходство, такое, что праймеры, сконструированные для одной из них, могут быть использованы для амплификации другой. В этом методе осуществляют амплификацию РНК для продуцирования некоторого количества нуклеиновой кислоты, достаточного для введения этой нуклеиновой кислоты в вектор для последующего клонирования. The author of this application has found that the leader sequences of the variable regions of the monkey, chimpanzee and human antibodies have sufficient similarities, such that primers designed for one of them can be used to amplify the other. In this method, RNA is amplified to produce a certain amount of nucleic acid sufficient to introduce this nucleic acid into the vector for subsequent cloning.
Во втором своем варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования антитела против антигена человека, которое не является иммуногенным для человека. Этот способ предусматривает продукцирование в организме обезьяны антитела против антигена человека и выделение нуклеиновой кислоты обезьяны, кодирующей антигенраспознающий участок вариабельной области антитела обезьяны. Затем получают нуклеиновую кислоту человека, кодирующую константную область антитела человека, и полученную нуклеиновую кислоту человека лигируют с нуклеиновой кислотой обезьяны, в результате чего образуется рекомбинантная нуклеиновая кислота. После этого, полученную рекомбинантную нуклеиновую кислоту экспрессируют для получения нужного антитела. Альтернативно для получения рекомбинантного антитела может быть использована нуклеиновая кислота, кодирующая константную область шимпанзе или обезьяны. Имеется очень небольшое различие, если оно вообще имеется, между константными областями аминокислотных последовательностей человека и шимпанзе (то есть они являются гомологичными), а те различия, которые имеются между указанными константными областями человека и шимпанзе, могут быть легко изменены с помощью стандартной техники, в том случае, если для продуцирования рекомбинантного антитела используют нуклеиновую кислоту, кодирующую константную область антитела обезьяны. Основная отличительная особенность настоящего изобретения заключается в том, что продуцируемое антитело является менее иммуногенным, чем константная область обезьяны, поэтому при введении рекомбинантного антитела человеку в его организме не индуцируется значительного иммунного ответа. Далее, указанные области антитела будут называться гомологичными областями. Таким образом, сконструированное рекомбинантное антитело по своей аминокислотной последовательности является функционально аналогичным антителу человека, то есть оно имеет константную область, гомологичную константной области антитела человека или шимпанзе. В целом, это антитело является аналогичным антителу человека, что необходимо для снижения возможности продуцирования нежелательного иммунологического ответа к этому антителу, а также содержит антигенсвязывающий участок, происходящий от антитела обезьяны. In a second embodiment, the present invention relates to a method for producing antibodies against a human antigen that is not immunogenic to humans. This method involves producing an anti-human antigen antibody in the monkey body and isolating the monkey nucleic acid encoding the antigen-recognizing region of the variable region of the monkey antibody. A human nucleic acid encoding the constant region of the human antibody is then obtained, and the resulting human nucleic acid is ligated with the monkey nucleic acid, whereby a recombinant nucleic acid is formed. After that, the resulting recombinant nucleic acid is expressed to obtain the desired antibody. Alternatively, a nucleic acid encoding a constant region of a chimpanzee or a monkey can be used to produce a recombinant antibody. There is a very small difference, if any, between the constant regions of the amino acid sequences of humans and chimpanzees (that is, they are homologous), and the differences that exist between the indicated constant regions of humans and chimpanzees can be easily changed using standard techniques, in the case where a nucleic acid encoding the constant region of a monkey antibody is used to produce a recombinant antibody. The main distinguishing feature of the present invention is that the antibody produced is less immunogenic than the constant region of the monkey, therefore, when a recombinant antibody is introduced to a person, a significant immune response is not induced in his body. Further, these regions of the antibody will be called homologous regions. Thus, the constructed recombinant antibody in its amino acid sequence is functionally similar to a human antibody, that is, it has a constant region homologous to the constant region of a human antibody or chimpanzee. In general, this antibody is similar to a human antibody, which is necessary to reduce the possibility of producing an undesirable immunological response to this antibody, and also contains an antigen binding site derived from a monkey antibody.
Термин "неиммуногенное" антитело означает, что это антитело не вызывает иммунного ответа с образованием антител, достаточного для снижения эффективности продолжительного введения антитела большинству людей, осуществляемого в период времени, достаточный для достижения терапевтического эффекта (например, по сравнению с мышиным или мышь-человеческим химерным антителом). Предпочтительно, если этого иммунного ответа вообще не будет продуцироваться. The term “non-immunogenic” antibody means that this antibody does not elicit an antibody response that is sufficient to reduce the effectiveness of prolonged administration of the antibody to most people over a period of time sufficient to achieve a therapeutic effect (for example, compared to a murine mouse or a human chimeric antibody). Preferably, if this immune response will not be produced at all.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рассматриваемый способ предусматривает иммортализацию клеток обезьяны, которые являются ответственными за продуцирование антител обезьяны, например, путем синтеза гибридомы, вирусной трансформации с использованием Herpes papio, лишь B-клеточного клонирования (такая иммортализация называется также "временной иммортализацией"); и продуцирование библиотеки рекомбинантных иммуноглобулинов. В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения этот способ предусматривает отбор B-клеток из лейкоцитов периферической крови, селезенки, костного мозга или лимфатических узлов обезьяны; отбор клона, который продуцирует соответствующее антитело; "спасение" генов иммуноглобулина, кодирующих данное антитело из иммортализованной клеточной линии; и повторную экспрессию генов в линии клеток-продуцентов (т.е. в линии клеток, способствующих продуцированию антитела, достаточному для его использования в целях терапии человека). In preferred embodiments of the present invention, the subject method provides for the immortalization of monkey cells that are responsible for producing monkey antibodies, for example, by synthesizing hybridomas, viral transformation using Herpes papio, only B-cell cloning (such immortalization is also called "temporary immortalization"); and producing a library of recombinant immunoglobulins. In another preferred embodiment of the present invention, this method involves the selection of B cells from peripheral blood leukocytes, spleen, bone marrow, or monkey lymph nodes; selection of a clone that produces the corresponding antibody; "salvation" of immunoglobulin genes encoding this antibody from an immortalized cell line; and re-expression of the genes in the producer cell line (i.e., in the cell line that promotes antibody production sufficient for use in human therapy).
В третьем своем варианте настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его Fab-, (Fab)2-фрагментам, димеру легкой или тяжелой цепи или к любому минимальному рекомбинантному фрагменту, такому как FV или SCA (одноцепочечному антителу), либо другому его фрагменту с иммуноглобулиновой активностью (например, CDR-область) против антигена человека, продуцируемого иммортализованной B-клеткой обезьяны. Данные фрагменты используются в качестве иммуносупрессорных агентов. Альтернативно антитело настоящего изобретения может присоединять к себе эффекторную или репортерную молекулу. Например, антитело настоящего изобретения может иметь макроцикл для образования хелатного комплекса с тяжелымт атомом металла или с токсином, таким как рицин; причем антитело присоединяет указанную молекулу посредством ковалетной мостиковой связи. Кроме того, Fc-фрагмент или CH3-домен полной молекулы антитела может быть заменен молекулой фермента или токсина, а часть цепи иммуноглобулина может быть связана с полипептидным эффектором или молекулой-репортером. С помощью стандартной процедуры могут быть также сконструированы биспецифические антитела.In a third embodiment, the present invention relates to a monoclonal antibody or its Fab, (Fab) 2 fragments, a light or heavy chain dimer, or to any minimal recombinant fragment, such as FV or SCA (single chain antibody), or another fragment thereof with an immunoglobulin activity (e.g., CDR region) against a human antigen produced by an immortalized monkey B-cell. These fragments are used as immunosuppressive agents. Alternatively, the antibody of the present invention may attach an effector or reporter molecule. For example, an antibody of the present invention may have a macrocycle to form a chelate complex with a heavy metal atom or with a toxin such as ricin; moreover, the antibody attaches the specified molecule through a covalent bridging bond. In addition, the Fc fragment or CH3 domain of a complete antibody molecule may be replaced by an enzyme or toxin molecule, and a portion of the immunoglobulin chain may be linked to a polypeptide effector or reporter molecule. Bispecific antibodies can also be designed using standard procedures.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат антитела настоящего изобретения, используемые в терапевтических или профилактических целях. Такие антитела могут быть также получены в виде иммунотоксинов, то есть молекул, состоящих из двух компонентов и предназначенных, в частности, для убивания определенных клеток in vitro или in vivo. Одним из компонентов указанных антител является цитотоксичный агент, который, при его присоединении или абсорбции, оказывает убивающее действие на клетку. Второй компонент, известный как "транспортный механизм", обеспечивает доставку указанного токсического агента к клетке конкретного типа, например, такой как клетка карциномы. Эти два компонента, обычно, химически связаны друг с другом посредством любой из известных химических или генетических связей. Например, если цитотоксическим агентом является белок, а вторым компонентом является цельный иммуноглобулин, то они могут быть связаны между собой с помощью гетеробифункционального перекрестно-сшивающего агента, такого как карбодиимид, глутаральдегид, и т.п. Способы продуцирования различных иммунотоксинов хорошо известны специалистам. In another embodiment, the present invention relates to pharmaceutical compositions that contain the antibodies of the present invention, used for therapeutic or prophylactic purposes. Such antibodies can also be obtained in the form of immunotoxins, that is, molecules consisting of two components and intended, in particular, to kill certain cells in vitro or in vivo. One of the components of these antibodies is a cytotoxic agent, which, when it is attached or absorbed, has a killing effect on the cell. The second component, known as the "transport mechanism", delivers the specified toxic agent to a cell of a particular type, for example, such as a carcinoma cell. These two components are usually chemically bonded to each other via any of the known chemical or genetic bonds. For example, if the cytotoxic agent is a protein, and the second component is whole immunoglobulin, then they can be linked using a heterobifunctional cross-linking agent such as carbodiimide, glutaraldehyde, and the like. Methods for producing various immunotoxins are well known in the art.
В другом, близком к предыдущему, варианте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантное антитело человека/обезьяны. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует константную область человека или шимпанзе и антигенсвязывающий участок вариабельной области обезьяны; и эту нуклеиновую кислоту очищают, т. е. отделяют от биологических компонентов, которые связаны с ней в природных условиях, либо, что более предпочтительно, эту нуклеиновую кислоту получают в виде гомогенного раствора. In another, close to the previous embodiment, the present invention relates to a nucleic acid encoding a recombinant human / monkey antibody. In preferred embodiments of the present invention, the nucleic acid encodes a constant region of a human or chimpanzee and antigen-binding region of the variable region of the monkey; and this nucleic acid is purified, that is, separated from the biological components that are associated with it under natural conditions, or, more preferably, this nucleic acid is obtained in the form of a homogeneous solution.
В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к CDR-привитому антителу, содержащему, по крайней мере, 1 из гипервариабельных участков (CDR, complementarity determining region), то есть аминокислотных остатков (с использованием стандартной системы мечения аминокислот kabat) 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) и 95-102 (CDR3) указанной тяжелой цепи, и аминокислотных остатков 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) и 89-97 (CDR3) указанной легкой цепи вариабельной области обезьяны, и каркас вариабельной области иммуноглобулина, происходящего от другого вида. Антитело со встроенным CDR способно связываться с тем же самым антигеном, что и исходное антитело обезьяны. Константная область этого антитела происходит от иммуноглобулина человека или шимпанзе. Методология осуществления рассматриваемого варианта настоящего изобретения, в общих чертах, описана Jones и др. (321 Nature 522, 1986). Указанные CDR-вставки могут быть изменены, если это необходимо для обеспечения большего человекообразия данного антитела в целях снижения вероятности индуцирования нежелательной иммунной реакции против этого антитела. In yet another embodiment, the present invention relates to a CDR-grafted antibody containing at least 1 of the hypervariable regions (CDRs, complementarity determining region), i.e. amino acid residues (using the standard kabat amino acid labeling system) 31-35 (CDR1 ), 50-65 (CDR2) and 95-102 (CDR3) of the indicated heavy chain, and amino acid residues 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) and 89-97 (CDR3) of the indicated light chain of the monkey variable region, and framework of the variable region of an immunoglobulin derived from another species. An antibody with an integrated CDR is capable of binding to the same antigen as the original monkey antibody. The constant region of this antibody is derived from a human immunoglobulin or chimpanzee. The methodology for the implementation of the considered variant of the present invention, in General terms, described by Jones and others (321 Nature 522, 1986). These CDR inserts can be modified, if necessary, to ensure greater humanity of the antibody in order to reduce the likelihood of inducing an unwanted immune response against this antibody.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рассматриваемый способ предусматривает иммортализацию или селекцию клеток от макаки, ответственных за продуцирование антител макак, и выделение генов иммуноглобулина из этих клеток; клонирование и секвенирование генов, ответственных за продуцирование антител; отбор каркасной последовательности вариабельной области человека (предпочтительно, с наибольшей гомологией по отношению к каркасной последовательности вариабельной области макаки); замещение CDR-последовательностей человека CDR-последовательностями макаки; а также для сохранения аффинности антитела по отношению к его антигену могут быть осуществлены небольшие модификации в каркасной области человека. In preferred embodiments of the present invention, the subject method comprises immortalizing or selecting macaque cells responsible for the production of macaque antibodies and isolating immunoglobulin genes from these cells; cloning and sequencing of genes responsible for antibody production; selection of the frame sequence of the variable region of the person (preferably with the greatest homology with respect to the frame sequence of the variable region of macaque); substitution of human CDR sequences by macaque CDR sequences; as well as to maintain the affinity of the antibody with respect to its antigen, small modifications can be made in the human framework region.
Под термином "небольшие модификации" подразумевается, что в указанной каркасной области могут быть, в целом, заменены другими аминокислотами менее чем около 6 аминокислот, обычно такие замещения или модификации осуществляют только, если эти аминокислоты участвуют в конформационных взаимодействиях, которые поддерживают каркас в соответствующей форме так, чтобы нужный антиген распознавался антителом. Эти модификации будут, в основном, относится к аминокислотам, присутствующим в антителе макаки, и отличающимся от аминокислот антитела человека. Например, аминокислотная последовательность антитела человека, расположенная как раз перед CDR3 тяжелой цепи, 92-94 представляет собой, в основном, цистеин-аланин-аргинин (известно, что в меньшинстве антител, аргинин бывает заменен серином или треонином); а в некоторых антителах последовательности мартышек, эта последовательность представляет собой цистеин-аланин-серин; таким образом, в этом примере может быть предпочтительным использовать в положении 94 серин (см. фиг. 9D). By the term “small modifications” it is meant that in this framework region less than about 6 amino acids can be replaced with other amino acids, usually such substitutions or modifications are only carried out if these amino acids participate in conformational interactions that support the framework in an appropriate form so that the desired antigen is recognized by the antibody. These modifications will mainly relate to amino acids present in the macaque antibody and different from the amino acids of the human antibody. For example, the amino acid sequence of a human antibody located just before the heavy chain CDR3, 92-94 is mainly cysteine-alanine-arginine (it is known that in the minority of antibodies, arginine is replaced by serine or threonine); and in some antibodies of the monkey sequence, this sequence is cysteine-alanine-serine; thus, in this example, it may be preferable to use serine at position 94 (see FIG. 9D).
В еще одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу лечения человека, имеющего конкретный антиген, например антиген, ассоциируемый с каким-либо заболеванием. Этот способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества рекомбинантного антитела, специфичного для данного антигена; причем указанное антитело содержит константную область человека или шимпанзе и антигенраспознающий участок вариабельной области обезьяны; либо константную область первой обезьяны и антигенсвязывающий участок вариабельной области второй, отличающейся от первой обезьяны. In yet another embodiment, the present invention relates to a method for treating a person having a particular antigen, for example, an antigen associated with a disease. This method comprises administering a therapeutically effective amount of a recombinant antibody specific for a given antigen; moreover, the specified antibody contains a constant region of a human or chimpanzee and antigen-recognizing region of the variable region of the monkey; or the constant region of the first monkey and the antigen-binding region of the variable region of the second, different from the first monkey.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения антигеном является опухолевый антиген; антиген, вызывающий аутоиммунный ответ; рецептор, экспрессируемый на клетке-хозяине; или антиген, выбранный из антигенов человека CD58, VLA4 (интегрин α 4 β 1), CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, рецептор T-клеток человека, CD3, CD8, CD23, CD41, CD44, CD45, CD71, TNFα, TNFβ, антиген Tn, IL-1, IL-8, C5a, факторы адгезии, например VCAM, CD54, CD28, CD11a, CD11c, CD18 и CD11b, продукт онкогенного вируса neu, MDR-1 (P-гликопротеин), TGFα и его рецептор и PDGF; а рекомбинантное антитело обладает супрессорным действием (убивающим или элиминирующим) на нежелательные клетки (например, анти-CD4) путем активации комплемента или клеток-киллеров, либо указанное антитело является цитотоксическим агентом или способствует связыванию Fc-рецептора фагоцитом. Альтернативно это антитело блокирует или стимулирует функции рецептора либо нейтрализует активные растворимые продукты, такие как один или более интерлейкинов, TNF и C5a. In preferred embodiments, the antigen is a tumor antigen; autoimmune response antigen; a receptor expressed on a host cell; or an antigen selected from human antigens CD58, VLA4 (
В других своих вариантах настоящее изобретение относится к фармацевтическим комбинациям, содержащим вышеуказанные антитела или их фрагменты. Композиции или продукты настоящего изобретения могут быть получены в виде растворов, подходящих для парентерального, назального, или перорального введения. Соответствующие препараты, содержащие антитело, могут быть использованы в сочетании с соответствующими препаратами других агентов для повышения клинической эффективности. In other embodiments, the present invention relates to pharmaceutical combinations containing the above antibodies or fragments thereof. The compositions or products of the present invention can be obtained in the form of solutions suitable for parenteral, nasal, or oral administration. Appropriate preparations containing the antibody can be used in combination with appropriate preparations of other agents to enhance clinical efficacy.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеприведенного описания предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения и из нижеприведенной формулы изобретения. Other features and advantages of the present invention will be apparent from the following description of preferred embodiments of the present invention and from the following claims.
Описание предпочтительного осуществления настоящего изобретения
Ниже приводится краткое описание чертежей:
фиг. 1 - схематическое изображение 20 кодонов в девяти различных лидерных последовательностях тяжелой цепи Ig человека и десяти лидерных последовательностей тяжелой цепи Ig обезьяны;
фиг. 2 - схематическое изображение структуры различных цепей Ig, где показаны относительные положения лидерной, вариабельной и константной областей, а также положения рестриктирующих сайтов и праймеров, используемых для амплификации;
фиг. 3 - схематическое изображение вектора-кластера тяжелой цепи для экспрессии человеческого или химерного антител;
фиг. 4 - схематическое изображение вектора-кластера легкой цепи для экспрессии человеческого или химерного антител;
фиг. 5 и 6 - схематические изображения векторов, предназначенных для экспрессии иммуноглобулина из кДНК, кодирующей каппа- и лямбда-легкие цепи соответственно. В этих векторах, гены иммуноглобулина выстроены в тандемной конфигурации с помощью неомицин-фосфотрансферазы в качестве селектируемого маркера;
фиг. 7-1, 7-2 и 8 - изображение нуклеиновокислотной последовательности различных праймеров лидерных последовательностей, используемых в настоящем изобретении (эти праймеры на фиг. 8 соответствуют праймерам, представленным ниже, см. SEQ ID N 1-12);
фиг. 9A-9H - сравнение областей, происходящих от человека и обезьяны, в VH1, VH2, VH3, VH4 и VH5-последовательностях VKI и VKII и Yλ III соответственно;
фиг. 10 - сравнение VH3-последовательностей человека и обезьяны и с VH2-последовательностью человека;
фиг. 11 - графическое изображение связывания антитела настоящего изобретения с CD4-антигеном человека;
фиг. 12 - графическое изображение ингибирования связывания IF3 с антителом, показанным на фиг. 10;
фиг. 13-14 - части нуклеотидных последовательностей областей VH и VL против CD4 соответственно;
фиг. 15 - график, иллюстрирующий анти-CD54-активность;
фиг. 16 - гистограмма, иллюстрирующая сравнительную экспрессию плазмид.Description of the preferred implementation of the present invention
The following is a brief description of the drawings:
FIG. 1 is a schematic representation of 20 codons in nine different leader sequences of a human Ig heavy chain and ten monkey leader Ig heavy chains;
FIG. 2 is a schematic diagram of the structure of various Ig chains, which shows the relative positions of the leader, variable, and constant regions, as well as the positions of restriction sites and primers used for amplification;
FIG. 3 is a schematic representation of a heavy chain cluster vector for expressing human or chimeric antibodies;
FIG. 4 is a schematic illustration of a light chain cluster vector for expressing human or chimeric antibodies;
FIG. 5 and 6 are schematic representations of vectors for expressing immunoglobulin from cDNA encoding the kappa and lambda light chains, respectively. In these vectors, immunoglobulin genes are arranged in tandem configuration using neomycin phosphotransferase as a selectable marker;
FIG. 7-1, 7-2, and 8 are a depiction of the nucleic acid sequence of the various leader sequence primers used in the present invention (these primers in FIG. 8 correspond to the primers presented below, see SEQ ID N 1-12);
FIG. 9A-9H is a comparison of regions derived from humans and monkeys in the VH1, VH2, VH3, VH4 and VH5 sequences of VKI and VKII and Yλ III, respectively;
FIG. 10 is a comparison of human and monkey VH3 sequences with a human VH2 sequence;
FIG. 11 is a graphical depiction of the binding of an antibody of the present invention to a human CD4 antigen;
FIG. 12 is a graphical depiction of the inhibition of IF3 binding to the antibody shown in FIG. 10;
FIG. 13-14 - parts of the nucleotide sequences of the VH and VL regions against CD4, respectively;
FIG. 15 is a graph illustrating anti-CD54 activity;
FIG. 16 is a histogram illustrating comparative expression of plasmids.
Антитела обезьян
К обезьянам Старого Света относятся бабуин и макаки (включая макаку-резус и павиана). В данной заявке подробно описано использование в настоящем изобретении генов различных обезьян. Приведенные ниже примеры служат лишь иллюстрацией настоящего изобретения и не ограничивают его объема, а поэтому оно может быть с таким же успехом применено и к другим видам обезьян Старого Света.Monkey Antibodies
Monkeys of the Old World include a baboon and macaques (including rhesus macaque and a baboon). This application details the use of genes of various monkeys in the present invention. The following examples are only illustrative of the present invention and do not limit its scope, and therefore it can be applied with the same success to other species of monkeys of the Old World.
На фиг. 2 в схематическом виде показана основная структура генов, кодирующих тяжелую, каппа-легкую и лямбда-легкую цепи иммуноглобулина. Каждая их этих цепей имеет инициирующий ATG-кодон, после которого следует лидерная последовательность приблизительно из 60 оснований, затем область, кодирующая вариабельную область иммуноглобулина, и, наконец, область, кодирующая константную область этого иммуноглобулина. Примеры различных лидерных последовательностей или сигнальных пептидов тяжелых цепей показаны на фиг. 1. Эти последовательности и их эквивалент у обезьян могут быть определены с помощью стандартной техники, хорошо известной специалистам и описанной ниже. In FIG. 2 shows in schematic form the basic structure of genes encoding the immunoglobulin heavy, kappa-light and lambda-light chains. Each of these chains has an ATG initiation codon, followed by a leader sequence of approximately 60 bases, then a region encoding the variable region of an immunoglobulin, and finally a region encoding a constant region of this immunoglobulin. Examples of different leader sequences or signal peptides of the heavy chains are shown in FIG. 1. These sequences and their equivalent in monkeys can be determined using standard techniques well known in the art and described below.
Последовательности, показанные в нижней части фиг. 1, представляют собой лидерные последовательности человека. Авторами настоящей заявки было обнаружено, что конструирование праймеров, комплементарных этим лидерным последовательностям, позволяет осуществить амплификацию генов Ig обезьян. Аналогично праймеры, гомологичные лидерным последовательностям обезьян (см., например, верхнюю часть фиг. 1), могут быть использованы для амплификации генов иммуноглобулина обезьяны, а также для амплификации генов иммуноглобулина человека. The sequences shown at the bottom of FIG. 1 are human leader sequences. The authors of this application, it was found that the design of primers complementary to these leader sequences, allows the amplification of Ig genes of monkeys. Similarly, primers homologous to leader sequences of monkeys (see, for example, the upper part of Fig. 1) can be used to amplify monkey immunoglobulin genes, as well as to amplify human immunoglobulin genes.
При использовании указанных праймеров в стандартных процедурах амплификации гены, кодирующие различные иммуноглобулины обезьян, могут быть легко выделены, в результате чего могут быть определены последовательности, кодирующие вариабельные области антител. Примеры таких процедур описаны ниже. Результаты анализов представлены на фиг. 9A-9H и фиг. 10. Неожиданно было обнаружено, что несмотря на способность к продуцированию у обезьян антител к относительно консервативным антигенам человека, вариабельные последовательности каркасных участков продуцированных таким образом антител будут неотличимы от соответствующих последовательностей антител человека. То есть, степени вариабельности последовательности иммуноглобулина, наблюдаемой у обезьян и у человека, аналогичны, а поэтому без анализа самого источника невозможно определить, какое из антител принадлежит человеку, а какое обезьяне. When using these primers in standard amplification procedures, genes encoding various monkey immunoglobulins can be easily isolated, as a result of which sequences encoding the variable regions of antibodies can be determined. Examples of such procedures are described below. The analysis results are presented in FIG. 9A-9H and FIG. 10. Unexpectedly, it was found that despite the ability of monkeys to produce antibodies to relatively conservative human antigens, the variable sequences of the framework regions of the antibodies produced in this way will be indistinguishable from the corresponding sequences of human antibodies. That is, the degrees of variability of the immunoglobulin sequence observed in monkeys and in humans are similar, and therefore, without analysis of the source itself, it is impossible to determine which of the antibodies belongs to the person and which monkey.
Так, например, на фиг. 10 дано сравнение аминокислотной последовательности VH3-области человека и обезьяны. Антитела человека обнаруживают область гомологии между собой на 83-98%, а антитела обезьяны на 90-95% гомологичны VH3-области человека. В противоположность этому VH2-область человека гомологична VH3-области человека на 60%. На этом чертеже так же, как и на других чертежах, присутствие одинаковых аминокислот в любом положении показано пунктирной линией, тогда как присутствие различных аминокислот показано стандартным буквенным обозначением. Положения, которым не могут быть приписаны аминокислоты "консенсуса" (обобщающего типичного элемента структуры), обозначены X. Аналогично гомология для VH1, VH2, VH3, VH4 и VH5, и для VKI и VKIII и V λ III показана на фиг. 9A-9H соответственно. И снова, наблюдалась значительная гомология между последовательностями иммуноглобулина обезьян и человека в каждой вариабельной области, включая последовательности J-участков иммуноглобулина. Такая высокая гомология аналогична той, что наблюдается между антителами человека. For example, in FIG. 10 gives a comparison of the amino acid sequence of the VH3 region of a human and a monkey. Human antibodies show a region of homology between themselves by 83-98%, and monkey antibodies are 90-95% homologous to human VH3 regions. In contrast, the human VH2 region is 60% homologous to the human VH3 region. In this drawing, as well as in other drawings, the presence of the same amino acids in any position is shown by the dashed line, while the presence of different amino acids is shown by the standard letter designation. The positions to which the amino acids of "consensus" (of a generic typical structural element) cannot be assigned are denoted by X. Similarly, the homology for VH1, VH2, VH3, VH4 and VH5, and for VKI and VKIII and V λ III are shown in FIG. 9A-9H, respectively. Again, significant homology was observed between the monkey and human immunoglobulin sequences in each variable region, including the immunoglobulin J-sequence sequences. Such a high homology is similar to that observed between human antibodies.
Методика определения этих последовательностей описана в нижеприведенных примерах. При этом, следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается этими примерами, и эквивалентные результаты, а также моноклональные и химреные антитела могут быть получены с использованием аналогичных процедур, хорошо известных специалистам. См., например, выше патенты США 4816567, 4978745, 4975369 и 4816397. Например, после клонирования гена, кодирующего вариабельную область обезьяны, этот ген может быть легко лигирован с геном, кодирующим константную область обезьяны или человека, после чего эти слитые гены экспрессируют в клетке-продуценте для получения нужного антитела. Эти процедуры описаны в представленных ниже примерах. The methodology for determining these sequences is described in the examples below. However, it should be noted that the present invention is not limited to these examples, and equivalent results, as well as monoclonal and chimeric antibodies can be obtained using similar procedures well known in the art. See, for example, U.S. Patent Nos. 4,816,567, 4,978,745, 4,975,369 and 4,816,397. For example, after cloning a gene encoding the variable region of a monkey, this gene can be easily ligated to a gene encoding the constant region of the monkey or human, after which these fused genes are expressed in producer cell to obtain the desired antibody. These procedures are described in the examples below.
В нижеприведенных примерах первая стадия описываемого метода включает в себя выделение полной РНК из клеток периферической крови или клеток селезенки обезьяны. B-клетки от иммунизированных обезьян могут быть получены из периферической крови или лимфоузлов и непосредственно использованы, либо они могут быть, предпочтительно, размножены. Указанное размножение может включать в себя трансформацию вирусом Herpes papio, гибридизацию с гетерологической клеткой, миеломы, и последующую селекцию или клонирование отдельных B-клеток при ограниченном разделении в присутствии стимулированных T-клетках человека. In the examples below, the first stage of the described method involves the isolation of complete RNA from peripheral blood cells or monkey spleen cells. B cells from immunized monkeys can be obtained from peripheral blood or lymph nodes and directly used, or they can preferably be propagated. Said propagation may include transformation with Herpes papio virus, hybridization with a heterologous cell, myeloma, and subsequent selection or cloning of individual B cells with limited separation in the presence of stimulated human T cells.
Затем, полную РНК конвертируют в одноцепочечную (оц) кДНК с помощью обратной транскриптазы и с использованием неспецифических (олиго-dT или неупорядоченных гексамеров) или специфических (константные области C λ или CK или CH1 иммуноглобулина) олигонуклеитидных праймеров. Одноцепочечную кДНК, продуцированную с помощью этой реакции, амплифицируют с использованием полимеразно-цепной реакции, в которой оц кДНК вместе с дезоксинуклеотидтрифосфатами, ДНК-полимеразной (например, термостабильной полимеразной) и специфическими праймерами используют для амплификации генов вариабельной области тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина. Используемые праймеры представляют собой одноцепочечные синтетические олигонуклеотиды из 20-40 оснований, содержащие вырожденные основания, которые связаны с 5'-лидерными последовательностями иммуноглобулина. Для амплификации семейств вариабельных областей тяжелой цепи антитела обезьяны, исходя из их схожести с генными семействами вариабельных областей тяжелой цепи антитела человека, были сконструировали 6 различных 5'-праймеров для лидерных последовательностей (см. фиг. 7-1), вводящих рестрикционный сайт (например, Sall). Причем, с каждым из этих шести 5'-праймеров для лидерных последовательностей был использован 3'-праймер, являющийся специфическим для константной области домена соответствующего изотипа (например, IgG, IgM, IgA или IgE) и также вводящий рестриктирующий сайт (например, Nhel). Аналогично для легких каппа- и лямбда-цепей обезьяны были использованы другие пары праймеров для амплификации соответствующей вариабельной области легкой цепи (фиг. 7-2). Then, complete RNA is converted to single-stranded (sc) cDNA using reverse transcriptase and using non-specific (oligo-dT or disordered hexamers) or specific (constant regions of C λ or CK or CH1 immunoglobulin) oligonucleotide primers. Single stranded cDNA produced by this reaction is amplified using a polymerase chain reaction in which sc cDNA, together with deoxynucleotide triphosphates, DNA polymerase (e.g., thermostable polymerase) and specific primers, are used to amplify the immunoglobulin variable region genes of the heavy or light chain. The primers used are single-stranded synthetic oligonucleotides of 20-40 bases containing degenerate bases that are linked to 5'-leader immunoglobulin sequences. To amplify the families of the variable regions of the heavy chain of the monkey antibody, based on their similarity with the gene families of the variable regions of the heavy chain of the human antibody, 6 different 5'-primers for leader sequences (see Fig. 7-1) introducing a restriction site (e.g. , Sall). Moreover, with each of these six 5'-primers for leader sequences, a 3'-primer was used, which is specific for the constant domain region of the corresponding isotype (e.g., IgG, IgM, IgA or IgE) and also introduces a restriction site (e.g., Nhel) . Similarly, for the monkey kappa and lambda light chains, other primer pairs were used to amplify the corresponding variable region of the light chain (Fig. 7-2).
Другие серии праймеров могут быть использованы для введения других уникальных рестрикционных сайтов для непосредственного клонирования PCR-амплифицированной ДНК в соответствующий экспрессирующий вектор, имеющий тот же самый рестрикционный сайт. Как показано на фиг. 7-1, может быть также использован набор праймеров, связывающихся с 3'-концом лидерной последовательности тяжелой цепи антитела и вводящих Ml и l-сайт, либо набор праймеров, связывающихся с первыми 23 основаниями каркасной последовательности и вводящих Xhol-сайт. Гены вариабельной области легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина обезьяны могут быть клонированы в "челночный" вектор непосредственно после PCR-амплификации, что позволяет проводить дальнейшие молекулярные манипуляции, если они необходимы; либо эти гены могут быть клонированы непосредственно в экспрессирующий вектор, который содержит гены константной области тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека. Молекулярная конфигурация генов иммуноглобулина в экспрессирующем векторе может быть геномной, где присутствуют промотор/энхансер иммуноглобулина и другие регуляторные области, а также последовательности донора/акцептора сплайсированного фрагмента в экзон/интронном стыке. Альтернативно химерные гены иммуноглобулина могут быть вставлены в кДНК-конфигурации, используют гетерологические вирусные промоторные/энхансерные последовательности. Other series of primers can be used to introduce other unique restriction sites for direct cloning of PCR amplified DNA into an appropriate expression vector having the same restriction site. As shown in FIG. 7-1, a set of primers that bind to the 3'-end of the antibody heavy chain leader sequence and introduce the Ml and l site, or a set of primers that bind to the first 23 bases of the frame sequence and introduce the Xhol site, can also be used. Monkey immunoglobulin variable and light chain variable genes can be cloned into a shuttle vector immediately after PCR amplification, which allows further molecular manipulations if necessary; or these genes can be cloned directly into an expression vector that contains genes for the constant region of the heavy or light chain of a human immunoglobulin. The molecular configuration of the immunoglobulin genes in the expression vector may be genomic, where the immunoglobulin promoter / enhancer and other regulatory regions are present, as well as donor / acceptor sequences of the spliced fragment at the exon / intron junction. Alternatively, chimeric immunoglobulin genes can be inserted into cDNA configurations using heterologous viral promoter / enhancer sequences.
Пример 1. Последовательность антител обезьян
На фиг. 7 и 8 показаны праймеры с рестрикционными или без рестрикционных сайтов соответственно, используемые в PCR-амплификации генов иммуноглобулина от кДНК обезьяны и/или человека. Подробно эти процедуры описаны ниже. РНК выделяли из клеток селезенки, периферической крови и лимфатических узлов обезьян при помощи метода с использованием гуанидинизотиоцианата. Фракцию полной РНК выделяли указанным методом, а затем использовали в качестве матрицы для последующей реакции амплификации. Аликвоту РНК инкубировали в присутствии 200 единиц обратной транкриптазы вируса Малони мышиного лейкоза неспецифических (олиго dT или неупорядоченных гексамеров) или специфических (CH1-область иммуноглобулина IoG или константная область CK каппа-цепи) олигонуклеотидных праймеров (50-100 пикомолей) в целях генерации некодирующей смысловой одной цепи кДНК. Затем, однонитевую кДНК, продуцированную таким образом, амплифицировали с помощью полимеразно-цепной реакции (PCR). Аликвоту одноцепочечной кДНК инкубировали вместе с дезоксинуклеотидтрифосфатами (20 мкМ), термостабильной ДНК-полимеразой (2-5 единиц) и происходящими от человека синтетическими олтгонуклеитидными праймерами (50 пикомолей) в целях амплификации генов вариабельной области либо тяжелой, либо легкой цепи иммуноглобулина.Example 1. The sequence of antibodies of monkeys
In FIG. 7 and 8 show primers with or without restriction sites, respectively, used in PCR amplification of immunoglobulin genes from monkey and / or human cDNAs. These procedures are described in detail below. RNA was isolated from spleen cells, peripheral blood, and monkey lymph nodes using the guanidine isothiocyanate method. The complete RNA fraction was isolated by the indicated method, and then used as a matrix for the subsequent amplification reaction. An aliquot of RNA was incubated in the presence of 200 units of the reverse transcriptase of the Maloney virus of mouse leukemia nonspecific (oligo dT or disordered hexamers) or specific (CH1 region of immunoglobulin IoG or constant region of CK kappa chain) oligonucleotide primers (50-100 picomoles) single cDNA strand. Then, single-stranded cDNA produced in this way was amplified by polymerase chain reaction (PCR). An aliquot of single-stranded cDNA was incubated together with deoxynucleotide triphosphates (20 μM), thermostable DNA polymerase (2-5 units) and human-derived synthetic oligonucleotide primers (50 picomoles) in order to amplify the genes of the variable region of either the heavy or light chain of immunoglobulin.
Используя пары праймеров, показанных на фиг. 8, также амплифицировали несколько характерных последовательностей ряда генных семейств вариабельной области тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина павиана. Эти амплифицированные последовательности клонировали в EcoRV-сайт плазмидного вектора p-Bluescript (pBS, поставляемый от Stratagene, CA) и использовали для секвенирования ДНК. Секвенирование ДНК осуществляли с использованием плазмиды, содержащей вставку в виде двухцепочечной ДНК-матрицы, и с помощью стандартного метода обрыва цепи. Using the pairs of primers shown in FIG. 8 also amplified several characteristic sequences of a number of gene families of the variable region of the heavy and light chains of the baboon immunoglobulin. These amplified sequences were cloned into the EcoRV site of the p-Bluescript plasmid vector (pBS, available from Stratagene, Calif.) And used for DNA sequencing. DNA sequencing was carried out using a plasmid containing an insert in the form of a double-stranded DNA template, and using the standard method of chain termination.
Типичные последовательности иммуноглобулина павиана показаны на фиг. 9A-9H. Показанные на фиг. 9A-9H последовательности представляют собой аминокислотные последовательности "консенсуса" для генов вариабельной области иммуноглобулина человека, представляющих собой каждое из генных семейств мажорной вариабельной области. Показано процентное содержание гомологии между каждой последовательностью обезьяны и последовательностями "консенсуса" человека за исключением константных доменных областей и CDR-областей. Уровень гомологии между последовательностями данного семейства человека и обезьяны является таким же высоким, как и между последовательностями того же семейства двух людей. Поэтому невозможно на основании лишь одного сравнения последовательностей отличить последовательности вариабельной области имммуноглобулина, происходящие от обезьяны, от последовательностей, происходящих от человека. Typical baboon immunoglobulin sequences are shown in FIG. 9A-9H. Shown in FIG. The 9A-9H sequences are consensus amino acid sequences for the genes of the variable region of a human immunoglobulin, which are each of the gene families of the major variable region. The percent homology between each monkey sequence and the human consensus sequences is shown, with the exception of constant domain regions and CDR regions. The level of homology between sequences of a given family of humans and monkeys is as high as that between sequences of the same family of two people. Therefore, it is impossible, on the basis of only one sequence comparison, to distinguish between sequences of the variable region of immunoglobulin derived from a monkey and sequences originating from humans.
Выделение РНК
Антигенспецифические B-клетки обезьяны были получены несколькими способами, а именно: путем слияния клеток лимфатических узлов иммунизированной обезьяны с гибридной клеточной линией K5H6/B5 гетеромиеломы человека/мыши с последующим скринингом линий гибридомы; путем вирусной трансформации B-клеток или путем in vitro-клонирования одиночной B-клетки. В последнем случае, рост одиночной B-клетки обезьяны поддержали in vitro путем совместного культивирования c T-клетками человека, которые были стимулированы антителом. Одну B-клетку помещали в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования тканей вместе с около 150000 T-клетками человека, обработанными анти-CD3-стимулированным митомицином C. После двухнедельной инкубации одиночную B-клетку размножали, по крайней мере, до 200 дифференцированных плазматических клеток. Культуральную насадочную жидкость из этих лунок анализировали на присутствие иммуноглобулина с помощью ELISA-анализа, используя иммобилизованное козье антитело против иммуноглобулина обезьяны.RNA isolation
Antigen-specific monkey B cells were obtained in several ways, namely: by fusion of the cells of the lymph nodes of the immunized monkey with the hybrid K5H6 / B5 cell line of human / mouse heteromyeloma, followed by screening of the hybridoma lines; by viral transformation of B cells or by in vitro cloning of a single B cell. In the latter case, the growth of a single monkey B-cell was supported in vitro by co-culture with human T cells that were stimulated by the antibody. One B cell was placed in each well of a 96-well tissue culture plate together with about 150,000 human T cells treated with anti-CD3-stimulated mitomycin C. After a two-week incubation, a single B cell was propagated with at least 200 differentiated plasma cells. The culture fluid from these wells was analyzed for the presence of immunoglobulin using an ELISA assay using an immobilized goat antibody against monkey immunoglobulin.
Клетки либо из антигенспецифических, трансформированных вирусом клеток, либо из гидридом культивировали в количестве, достаточном для экстракции РНК. Клетки, полученные в лунках путем клонирования одиночной B-клетки и являющиеся положительными на иммуноглобулин, удаляли, дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (pH 7,5) и центрифугировали (1000 х g, 10 мин). Промытые клетки суспендировали в 100 мкл раствора для лизиса (4 М гуанидинизоцианата; 25 мМ цитрата натрия, pH 7,0; 0,5% натрийсакрозин; 0,1 2-меркаптоэтанола). Затем добавляли 10 мкл 2 М ацетата натрия, pH 4,0, и размешивали. Белок удаляли путем добавления 100 мкл воды, насыщенной фенолом, с последующим смешиванием и добавлением 20 мкл хлороформа/изоамилового спирта (49:1). После интенсивного перемешивания и инкубации на льду в течение 15 минут образцы центрифугировали при 10000 х g в течение 20 минут. Затем водную фазу переносили в новую пробирку, смешивали с равным объемом изопропанола и инкубировали в течение 1 часа при -20oC. Образовавшийся осадок собирали путем центрифугирования при 10000 х g в течение 15 минут, затем промывали 70% этанолом, снова центрифугировали, а осадок осушали в Speedivac (Savant). Осушенную РНК снова растворяли (во второй раз) в 100 мкл буфере для лизиса. Затем добавляли равный объем изопропанола и инкубировали при -20oC в течение одного часа. Осадок собирали путем центрифугирования при 10000 х g в течение 15 минут и промывали 70% этанолом. Осадок после центрифугирования осушали в Speedivac (Savant) и хранили при -20oC в 70% этаноле вплоть до его использования.Cells either from antigen-specific, virus-transformed cells, or from hydride were cultured in an amount sufficient for RNA extraction. Cells obtained in the wells by cloning a single B cell and which are immunoglobulin positive were removed, washed twice with cold phosphate-buffered saline (pH 7.5) and centrifuged (1000 x g, 10 min). The washed cells were suspended in 100 μl of lysis solution (4 M guanidine isocyanate; 25 mM sodium citrate, pH 7.0; 0.5% sodium sacrosine; 0.1 2-mercaptoethanol). Then was added 10 μl of 2 M sodium acetate, pH 4.0, and stirred. The protein was removed by adding 100 μl of phenol saturated water, followed by mixing and adding 20 μl of chloroform / isoamyl alcohol (49: 1). After vigorous stirring and incubation on ice for 15 minutes, the samples were centrifuged at 10,000 x g for 20 minutes. Then the aqueous phase was transferred to a new tube, mixed with an equal volume of isopropanol and incubated for 1 hour at -20 o C. The resulting precipitate was collected by centrifugation at 10,000 x g for 15 minutes, then washed with 70% ethanol, centrifuged again, and the precipitate drained in Speedivac (Savant). The dried RNA was again dissolved (a second time) in 100 μl of lysis buffer. Then an equal volume of isopropanol was added and incubated at -20 ° C for one hour. The precipitate was collected by centrifugation at 10,000 x g for 15 minutes and washed with 70% ethanol. The precipitate after centrifugation was dried in Speedivac (Savant) and stored at -20 ° C in 70% ethanol until its use.
Синтез одноцепочечной кДНК
Полную РНК, экстрагированную из клеток, взятых из одной лунки, растворяли в 32 мкл дважды дистиллированной воды, к которой добавляли 1 мкл (50-100 пМ) праймера (либо неупорядоченных гексамеров, олиго-dT, либо 3'-иммуноглобулинспецифических праймеров) и 10 мкл (5 х) буфера для обратной транскриптазы (0,25 Трис-HCl, pH 8,3, 0,375М KCl, 15 мМ MgCl2 50 мМ дитиотреитола). Полученую смесь нагревали 5 минут при 65oC, после чего ее помещали на лед на 2 минуты. После нагревания добавляли 1 мкл РНКазина (Promega), 5 мкл 5 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов и 1 мкл (200 ед.) обратной транскриптазы вируса Молони мышиного лейкоза (BRL), и полученную смесь инкубировали 1,5 часа при 37oC. После завершения обратно-транскриптазной реакции смесь одноцепочечной кДНК-РНК экстрагировали фенолом/хлороформом и пропускали через вращающуюся колонку с 1 мл G-25-Сафадекса. Материал, пропущенный через эту колонку, использовали в качестве оц кДНК-матрицы для PCR-амплификации.Synthesis of single stranded cDNA
The complete RNA extracted from cells taken from one well was dissolved in 32 μl of double-distilled water, to which 1 μl (50-100 pM) of primer (or random hexamers, oligo-dT, or 3'-immunoglobulin-specific primers) and 10 were added μl (5 x) reverse transcriptase buffer (0.25 Tris-HCl, pH 8.3, 0.375 M KCl, 15
Амплификация оц кДНК
3-10 мкл оц кДНК смешивали с 10 мкл (10 х) PCR-буфера (500 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 8,3, 15 мМ MgCl2), 1,6 мкл, 1,25 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов, 50 пМ специфического 5'-праймера для амплификации генов иммуноглобулина, 50 пМ специфического 3'-праймера для амплификации генов иммуноглобулина и 2-5 ед. термостабильной ДНК-полимеразы (Synthetic Genetics). Реакционный объем доводили до 100 мкл путем добавления воды и покрывали сверху 100 микролитрами минерального масла. Реакционную смесь инкубировали в следующем режиме:
при 94oC в течение 1 минуты;
при 48oC в течение 2 минут;
при 72oC в течение 2 минут.Amplification of sc cDNA
3-10 μl sc scDNA was mixed with 10 μl (10 x) PCR buffer (500 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 15 mM MgCl 2 ), 1.6 μl, 1.25 mM deoxynucleotide triphosphates, 50 pM specific 5'-primer for amplification of immunoglobulin genes, 50 pM specific 3'-primer for amplification of immunoglobulin genes and 2-5 units thermostable DNA polymerase (Synthetic Genetics). The reaction volume was adjusted to 100 μl by adding water and coated on top with 100 microliters of mineral oil. The reaction mixture was incubated in the following mode:
at 94 o C for 1 minute;
at 48 o C for 2 minutes;
at 72 o C for 2 minutes.
Этот цикл повторяли 30-35 раз. Амплифицированные продукты анализировали в помощью электрофореза на агарозном геле, используя 1,2%-ный агарозный гель и молекулярно-массовые стандарты. Амплифицированные гены вариабельной области иммуноглобулина вводили приблизительно между маркерами 350-500 п.о. PCR-амплифицированные продукты затем использовали для клонирования в соответствующий плазмидный вектор. This cycle was repeated 30-35 times. Amplified products were analyzed by agarose gel electrophoresis using a 1.2% agarose gel and molecular weight standards. The amplified immunoglobulin variable region genes were introduced approximately between 350-500 bp markers. PCR amplified products were then used for cloning into the corresponding plasmid vector.
Пример 2. Клонирование генов антител обезьян
Поскольку последовательности генов вариабельной области иммуноглобулина обезьян невозможно отличить (на уровне кДНК) от членов эквивалентного генного семейства человека, то иммунные ответы на химерные антитела обезьян/человека, если они имеют место, будут, к сожалению, отличаться от ответов, индуцированных против антител человека.Example 2. Cloning of monkey antibody genes
Since the gene sequences of the variable region of monkey immunoglobulin cannot be distinguished (at the cDNA level) from members of the equivalent human gene family, the immune responses to monkey / human chimeric antibodies, if any, will unfortunately differ from responses induced against human antibodies.
PCR-техника может быть использована для введения специфических сайтов рестриктирующих ферментов, включая (но не ограничиваясь ими) SaII, BgII, KPnI и NheI, в последовательности вариабельной области иммуноглобулина обезьян, где для PCR-амплификации используют праймеры (см. фиг. 6). Уже имеющиеся клонированные гены амплифицировали из их специфического вектора, используя указанные праймеры для введения специфического рестриктирующего сайта, который затем использовали для клонирования гена в экспрессирующий вектор. Альтернативно эти праймеры использовали для амплификации непосредственно из клеточной РНК. The PCR technique can be used to introduce specific restriction enzyme sites, including but not limited to SaII, BgII, KPnI, and NheI, in the variable region sequence of monkey immunoglobulin, where primers are used for PCR amplification (see FIG. 6). Existing cloned genes were amplified from their specific vector using the indicated primers to introduce a specific restriction site, which was then used to clone the gene into an expression vector. Alternatively, these primers were used to amplify directly from cellular RNA.
Были сконструированы два типа экспрессирующих векторов. Первый вектор (см. фиг. 3 и 4) позволял вставить клонированные кДНК вариабельных областей иммуноглобулина обезьян в кластерный вектор, используя уникальные рестрикционные сайты; причем в этом кластерном векторе элементы гена иммуноглобулина располагались в геномной конфигурации. Этот тип вектора включает в себя промотор иммуноглобулина; два экзона, составляющие лидерную последовательность иммуноглобулина; два сайта клонирования Spel и Nhel, затем, "вниз по течению", последовательности донора сплайсированного фрагмента, энхансерная область иммуноглобулина, ген константной области (тяжелой или легкой цепи) иммуноглобулина человека, а затем сигналы полиаденилирования. Эти векторы, кроме того, включают в себя бактериальную область начала репликации, ген бета-лактамазы для бактериальной селекции и ген неомицинфосфотрансферазы для G418-селекции или ген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (gpt) для селекции в клетках млекопитающих с использованием микофеноловой кислоты. В векторах экспрессии тяжелой и легкой цепи используются гены неомицинфосфотрансферазы (Neo) и ксанти-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (Gpt) соответственно в качестве селектируемого маркера. Two types of expression vectors were constructed. The first vector (see Figs. 3 and 4) allowed insertion of cloned cDNA of variable regions of monkey immunoglobulin into the cluster vector using unique restriction sites; moreover, in this cluster vector, the elements of the immunoglobulin gene were located in the genomic configuration. This type of vector includes an immunoglobulin promoter; two exons that make up the leader sequence of immunoglobulin; two Spel and Nhel cloning sites, then, “downstream”, spliced fragment donor sequences, an immunoglobulin enhancer region, a human immunoglobulin constant region (heavy or light chain) gene, and then polyadenylation signals. These vectors also include the bacterial region of the onset of replication, the beta-lactamase gene for bacterial selection, and the neomycin phosphotransferase gene for G418 selection or the xanthine-guanine-phosphoribosyl transferase (gpt) gene for selection in mammalian cells using mycophenolic acid. The heavy and light chain expression vectors use the genes for neomycin phosphotransferase (Neo) and xanthi-guanine phosphoribosyl transferase (Gpt), respectively, as a selectable marker.
Во втором типе экспрессирующей системы (см. фиг. 5 и 6) используются гены иммуноглобулина в кДНК-конфигурации. То есть между 5'-лидерной последовательностью и 3'-последовательностями константной области не имеется инронов или участков сплайсинга. Этот тип вектора использует гетерологические вирусные промоторные энхансерные последовательности, стимулирующие расположенные тандемом гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, последовательности полиаденилирования и селектируемый маркер клеток млекопитающих (Neo). Ген Neo может быть модифицирован для ослабления его трансляции, например, путем изменения расположенного выше кодона и соседнего старт-сигнала гена от ACC до TCT. Кроме того, для проведения последующей амплификации гена с использованием метотрексата присутствует ген гидрофолатредуктазы (dhfr). Гены вариабельной области иммуноглобулина обезьяны, клонированные в экспрессирующие векторы с кДНК-конфигурацией, амплифицировали либо из уже присутствующих в челночном" векторе (PBS) клонированных последовательностей, либо непосредственно из РНК с использованием праймеров, содержащих либо рестрикционные сайты SaII или MIuI и NheI для тяжелой цепи, либо BgIII и KpnI или BsiwI для легких каппа- или лямбда-цепей. Однако не исключается использование и других подходящих уникальных рестрикционных сайтов. In the second type of expression system (see FIGS. 5 and 6), immunoglobulin genes in cDNA configuration are used. That is, there are no inrons or splicing sites between the 5'-leader sequence and the 3'-sequences of the constant region. This type of vector uses heterologous viral promoter enhancer sequences that stimulate the tandem immunoglobulin heavy and light chain genes, polyadenylation sequences and a mammalian selectable cell marker (Neo). The Neo gene can be modified to attenuate its translation, for example, by changing the upstream codon and adjacent start signal of the gene from ACC to TCT. In addition, for subsequent amplification of the gene using methotrexate, the hydrophosphate reductase gene (dhfr) is present. The monkey immunoglobulin variable region genes cloned into expression vectors with a cDNA configuration were amplified either from cloned sequences already present in the shuttle "PBS" vector or directly from RNA using primers containing either the restriction sites SaII or MIuI and NheI for the heavy chain or BgIII and KpnI or BsiwI for light kappa or lambda chains, but other suitable unique restriction sites cannot be ruled out.
Химерные гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина вводили отдельно или последовательно (для конструкций с геномной конфигурацией), или в тот же самый вектор (для конструкций с кДНК-конфигурацией) путем электропорации в линию клеток-продуцентов. Метод электропорации использовали для введения лианеризованных конструкций ДНК либо в клетки яичника китайского хомячка (CHO), либо в клетки мышиной миеломы с последующим клонированием потомства одной клетки с трансфектантом в 96-луночном планшете для культивирования тканей. Условия электропорации с использованием прибора для электропорации BTX-100 (BTX, San Deigo) и одноразовой пластиковой 1 мл-кюветы давали оптимальное число трансфектантов от данного количества ДНК вектора. CHO-клетки, которые были адаптированы для культивирования в суспензии в бессывоторочной среде (SFM) (CHO-S SFMII минус гипоксантин и тимидин, Gibco), использовали в конструкциях, содержащих вирусных регуляторные элементы. The chimeric immunoglobulin heavy and light chain genes were introduced separately or sequentially (for constructs with a genomic configuration), or into the same vector (for constructs with a cDNA configuration) by electroporation into a line of producer cells. The electroporation method was used to introduce lanerized DNA constructs into either Chinese hamster ovary (CHO) cells or mouse myeloma cells, followed by cloning the progeny of one cell with a transfectant in a 96-well tissue culture plate. Electroporation conditions using a BTX-100 electroporation apparatus (BTX, San Deigo) and a disposable plastic 1 ml cuvette gave the optimal number of transfectants from a given amount of DNA vector. CHO cells that were adapted for suspension suspension in serum free medium (SFM) (CHO-S SFMII minus hypoxanthine and thymidine, Gibco) were used in constructs containing viral regulatory elements.
Субклонирование генов вариабельной области Ig
Продукты PCR-реакции экстрагировали смесью фенола и хлороформа и пропускали через вращающуюся колонку (1 мл, Сефадекс G-25). Если ДНК-фрагмент клонировали в плазмиду по тупым концам, то ко всей PCR-реакционной смеси добавляли 1 мкл 1M MgCl2, 0,5 мл, 1,25 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов и 1 мМ ДНК-полимеразы Кленова (5 ед.), и полученную смесь инкубировали 15 минут при 37oC для заполнения любых 5 "липких" концов. Перед клонированием в плазмиду по "тупым концам" 5'-концы фосфорилировали следующим образом: ко всей реакционной смеси добавляли 5 мкл 10 мМ ATP, 1 мкл полинуклеотид-киназы T4 (10 ед. ), и полученную смесь инкубировали 30 минут при 37oC. Амплифицированные фрагменты, которые содержали внутренние рестрикционные сайты, сначала разрезали соответствующим рестрикционным ферментом и использовали непосредственно для лигирования без фосфорилирования. В обоих случаях клонированный фрагмент экстрагировали фенолом/хлороформом, а затем лигировали в соответствующий вектор.Subcloning of Ig Variable Region Genes
The PCR reaction products were extracted with a mixture of phenol and chloroform and passed through a rotating column (1 ml, Sephadex G-25). If the DNA fragment was cloned into the plasmid at the blunt ends, then 1 μl of 1M MgCl 2 , 0.5 ml, 1.25 mm deoxynucleotide triphosphates and 1 mm Klenov DNA polymerase (5 units) were added to the entire PCR reaction mixture, and the resulting the mixture was incubated for 15 minutes at 37 ° C to fill any 5 sticky ends. Before cloning into the plasmid at the blunt ends, the 5'-ends were phosphorylated as follows: 5 μl of 10 mM ATP, 1 μl of T4 polynucleotide kinase (10 units) were added to the entire reaction mixture, and the resulting mixture was incubated for 30 minutes at 37 ° C Amplified fragments that contained internal restriction sites were first cut with the corresponding restriction enzyme and used directly for ligation without phosphorylation. In both cases, the cloned fragment was extracted with phenol / chloroform and then ligated into the corresponding vector.
Для реакции лигирования 10% фосфорилированного или разрезанного рестрикционным ферментом PCR-амплифицированного фрагмента смешивали с около 2 нг соответствующего вектора (полный объем 8 мкл), предварительно переваренного рестриктирующим(и) ферментом (ферментами). Для клонирования по "тупым" концам использовали pBluescript, переваренный ферментом EcoRV. Для клонирования по "липким" концам использовали вектор TCAE 5,2, или 6,0, или pGenex-H, или pGenexL, разрезанные соответствующими рестрикционными ферментами. К смеси добавляли 1 мкл буфера для лигирования (10 х) (500 мМ Трис-HCl, pH 7,6, 100 мМ MgCl2; 10 мМ ATP; 10 мМ дитиотреитола) и 1 мкл ДНК-лигазы T4 (1 ед.) и проводили реакцию при 14oC в течение ночи. Лигированный материал использовали для трансформации компетентных клеток HB101 E.coli, проводимой стандартным методом с использованием хлорида кальция. Трансформированные бактерии отбирали путем культивирования на чашках с агаром LB, содержащем ампициллин. Отдельные колонии отбирали, культивировали в течение ночи в LB-среде, содержащей ампициллин, и плазмидную ДНК экстрагировали посредством стандартного щелочного лизиса. После рестрикционного анализа, проводимого для того, чтобы определить, которые из клонов содержали иммуноглобулиновые вставки, получали ДНК для секвенирования.For the ligation reaction, 10% phosphorylated or digested with a restriction enzyme PCR amplified fragment was mixed with about 2 ng of the corresponding vector (
Секвенирование клонированных генов
Клонированные гены вариабельной области иммуноглобулина секвенировали с использованием стандартного метода обрыва цепи. Двухцепочечную плазмидную ДНК, содержащую клонированную вставку, использовали в качестве секвенирующей матрицы. Перед секвенированием двухцепочечную ДНК химически денатурировали. ДНК секвенировали с использованием ДНК полимеразы T7 SEQUENASE (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), радиоактивно меченного альфа дезоксиАТР и следующих праймеров для секвенирования: (5'-CAGAGTGGGTACGTCCTCA 3') и (5' GCCCCCAGAGGTGCTCTTGG 3'), для вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина G в направлениях 5'--->3' и 3'--->5' соответственно; и (5'CAGAGCTGGGTACGTGAACC 3'), и (5'GGCTTGAAGCTCCTCAGAGG 3') для вариабельной области легкой λ -цепи иммуноглобулина в направлениях 5'--->3' и 3'--->5' соответственно. Реакционные продукты разделяли на 6% в полиакриламидном геле и проводили считывание данных.Sequencing of Cloned Genes
Cloned immunoglobulin variable region genes were sequenced using a standard chain termination method. Double stranded plasmid DNA containing the cloned insert was used as a sequencing template. Before sequencing, double-stranded DNA was chemically denatured. DNA was sequenced using T7 SEQUENASE polymerase DNA (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), radiolabeled alpha deoxyATP and the following sequencing primers: (5'-CAGAGTGGGTACGTCCTCA 3 ') and (5' GCCCCCAGAGGTGCTCTTGG 3 ') immunoglobulin G chains in the directions 5 '--->3' and 3 '--->5',respectively; and (5'CAGAGCTGGGTACGTGAACC 3 '), and (5'GGCTTGAAGCTCCTCAGAGG 3') for the variable region of the light immunoglobulin λ chain in the directions 5 '--->3' and 3 '--->5', respectively. The reaction products were separated by 6% in a polyacrylamide gel and data were read.
Результаты секвенирования ряда генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина обезьяны систематизированы на фиг. 9A-9H. Клонирование и секвенирование генов иммуноглобулина павиана ранее не описывалось в литературе. Поэтому, невозможно также определить степень гомологии между генами V-области иммуноглобулинов человека и павиана. Была описана гомология между единичным геном вариабельной области λ - цепи шимпанзе и его человеческого двойника, которая обнаружила лишь 2% различия в их каркасных областях. The sequencing results of a number of monkey immunoglobulin heavy and light chain variable region genes are systematized in FIG. 9A-9H. Cloning and sequencing of the baboon immunoglobulin genes has not been previously described in the literature. Therefore, it is also impossible to determine the degree of homology between the genes of the V region of human immunoglobulins and the baboon. The homology between the single gene of the variable region of the λ-chain of the chimpanzee and its human double has been described, which found only 2% of the difference in their frame regions.
Трансфекция и селекция
После секвенирования клонированных генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи они были субклонированы в соответствующие векторы экспрессии. Эти векторы могут быть сконструированы так, чтобы они содержали регуляторные элементы иммуноглобулина в геномной конфигурации (как показано на фиг. 3 и 4) или вирусные регуляторные элементы в кДНК-конфигурации (фиг. 5 и 6). Соответствующие рестрикционные сайты (SpeI NheI) могут быть встроены в праймеры для PCR-амплификации во время начальной стадии амплификации, или наоборот, праймеры для амплификации, содержащие рестрикционные сайты, могут быть использованы для амплификации генов иммуноглобулина из "челночных" векторов, в которых они были клонированы. Альтернативно гены вариабельной области иммуноглобулина могут быть клонированы непосредственно в экспрессирующие векторы после PCR-амплификации из РНК для того, чтобы избежать субклонирования.Transfection and selection
After sequencing the cloned genes of the variable regions of the heavy and light chains, they were subcloned into the corresponding expression vectors. These vectors can be designed to contain immunoglobulin regulatory elements in a genomic configuration (as shown in FIGS. 3 and 4) or viral regulatory elements in a cDNA configuration (FIGS. 5 and 6). Appropriate restriction sites (SpeI NheI) can be inserted into PCR amplification primers during the initial stage of amplification, or vice versa, amplification primers containing restriction sites can be used to amplify immunoglobulin genes from shuttle vectors in which they were cloned. Alternatively, the immunoglobulin variable region genes can be cloned directly into expression vectors after PCR amplification from RNA in order to avoid subcloning.
Электропорация
Электропорацию использовали либо для котрансфекции геномных конструкций тяжелой и легкой цепи, либо для последовательной трансфекции геномных конструкций легкой и тяжелой цепи в клетки Sp2/0. При последовательной трансфекции проводили электропорацию химерной конструкции легкой цепи с последующей селекцией в микофеноловой кислоте. Скрининг культуральных супернатантов от клонов, культивированных в 96-луночных планшетах, на продуцирование легкой цепи с использованием антисыворотки против константной области легкой цепи человека и с помощью ELISA-анализа позволяет проводить селекцию наиболее высокоэкспрессирующихся клонов легкой цепи. Последующая электропорация трансфектантов легкой цепи с вектором, содержащим химерную конструкцию тяжелой цепи обезьяны/человека, позволяет проводить селекцию трансфектом, экспрессирующих химерное антитело нужной специфичности и изотипа.Electroporation
Electroporation was used either for cotransfection of the genomic constructs of the heavy and light chains, or for the sequential transfection of genomic constructs of the light and heavy chains into Sp2 / 0 cells. In sequential transfection, electroporation of the light chain chimeric construct was carried out, followed by selection in mycophenolic acid. Screening culture supernatants from clones cultured in 96-well plates for light chain production using antiserum against the constant region of the human light chain and using ELISA analysis allows selection of the most highly expressed light chain clones. Subsequent electroporation of light chain transfectants with a vector containing a monkey / human chimeric heavy chain design allows for transfect selection to express a chimeric antibody of the desired specificity and isotype.
Конструкцию легкой цепи pGENEX-L (фиг. 3 и 4) трансфецировали в клеточную линию мышиной миеломы Sp2/0 путем электропорации, как описано ниже. Клетки Sp2/0 при концентрации 1•107/мл в буфере для трансфекции (272 мМ сахарозы, 7 мМ фосфата натрия, pH 7,4, 1 мМ MgCl2) смешивали с 50 мкг pGENEX-L, содержащих соответствующий клонированный ген легкой цепи, который был предварительно линеаризован путем переваривания рестриктирующим ферментом PvuI. Клетки помещали в одноразовую пластиковую спектрофотометрическую кювету (1 мл), и в эту кювету вставляли плоские электроды на расстоянии 3,5 мм друг от друга. Используя аппарат для трансфекции BTX-100 (BTX, Inc), через клетки пропускали ток в течение 500 микросекунд так, чтобы примерно 50% клеток погибало. Эту величину определяли до трансфекции клеток путем подачи импульса при отсутствии ДНК с возрастающим напряжением и последующего измерения числа клеток, выживших через 24 часа. Затем строили график зависимости выживания клеток от напряжения; и напряжение, при котором наблюдалась гибель 50% клеток, использовали для всех последующих экспериментов по электропорации. Используя прибор BTX-100, установили, что импульс с амплитудой 200, подаваемый в течение 500 микросекунд, дает оптимальное значение. После пропускания тока клетки оставляли на 15 минут на льду, а затем переносили в 96-луночные планшеты для культивирования тканей с модифицированной по способу Дульбекко средой Игла (DMEM), содержащей 5%-ную околоплодную сыворотку теленка и 10% Sp2/0 кондиционированную среду. Клетки высевали в концентрации, при которой рост клеток наблюдается примерно в 1 из 3 лунок после селекции с использованием соответствующего лекарственного средства. Этот параметр определяли для каждого эксперимента по электропорации путем посева различного числа электропорированных клеток на лунку (1000-10000) и последующей селекции на клетки, включенные в плазмиду. Через 2-3 недели после засева на селективную среду подсчитывали число лунок на каждом планшете, где обнаруживался рост клеток. Так, например, для использования в дальнейших экспериментах было определено число клеток, которое давала 1 из 3 положительных лунок при данной концентрации конкретной плазмиды.The pGENEX-L light chain construct (FIGS. 3 and 4) was transfected into the Sp2 / 0 murine myeloma cell line by electroporation, as described below. Sp2 / 0 cells at a concentration of 1 • 10 7 / ml in transfection buffer (272 mM sucrose, 7 mM sodium phosphate, pH 7.4, 1 mM MgCl 2 ) were mixed with 50 μg pGENEX-L containing the corresponding cloned light chain gene , which was previously linearized by digestion with the restriction enzyme PvuI. Cells were placed in a disposable plastic spectrophotometric cuvette (1 ml), and flat electrodes were inserted into this cuvette at a distance of 3.5 mm from each other. Using the BTX-100 transfection apparatus (BTX, Inc), current was passed through the cells for 500 microseconds so that approximately 50% of the cells died. This value was determined before transfection of cells by applying a pulse in the absence of DNA with increasing voltage and then measuring the number of cells surviving after 24 hours. Then, a graph of cell survival versus voltage was plotted; and the voltage at which 50% cell death was observed was used for all subsequent electroporation experiments. Using the BTX-100 device, it was found that a pulse with an amplitude of 200, applied within 500 microseconds, gives the optimal value. After passing the current, the cells were left on ice for 15 minutes and then transferred to 96-well tissue culture plates with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 5% amniotic calf serum and 10% Sp2 / 0 conditioned medium. Cells were seeded at a concentration at which cell growth is observed in about 1 out of 3 wells after selection using the appropriate drug. This parameter was determined for each electroporation experiment by plating a different number of electroporated cells per well (1000-10000) and subsequent selection on the cells included in the plasmid. 2-3 weeks after plating on selective medium, the number of wells on each plate where cell growth was detected was counted. So, for example, for use in further experiments, the number of cells was determined, which gave 1 out of 3 positive wells at a given concentration of a specific plasmid.
Сразу после электропорации клетки помещали в среду, не содержащую лекарственного средства. Через два дня после электропорации добавляли свежую среду, содержащую либо G418, либо микофеноловую кислоту, для клеток, обладающих неомицинфосфотрансферазной или гуаназилфосфотрансферазной активностью соответственно. Клетки подкармливали каждые два дня в течение первой недели, а затем два раза в каждую последующую неделю. Необходимую для использования концентрацию лекарственного средства определяли путем инкубирования клеток в присутствии возрастающих концентраций лекарственного средства с контролированием жизнеспособности клеток. Используемая концентрация лекарственного средства в два раза превышала концентрацию, дающую 100%-ную гибель клеток. Для Sp2/0 потребовалось приблизительно 1 мкг микофеноловой кислоты на мл, а для G418 - приблизительно 800 мкг/мл. Immediately after electroporation, the cells were placed in a drug-free medium. Two days after electroporation, fresh medium containing either G418 or mycophenolic acid was added for cells with neomycin phosphotransferase or guanazyl phosphotransferase activity, respectively. Cells were fed every two days during the first week, and then twice every subsequent week. The concentration of the drug required for use was determined by incubating the cells in the presence of increasing concentrations of the drug, controlling cell viability. The used concentration of the drug was two times higher than the concentration giving 100% cell death. For Sp2 / 0, approximately 1 μg of mycophenolic acid per ml was required, and for G418 approximately 800 μg / ml was required.
Клетки подвергали электропорации в течение нескольких дней: причем либо были совместно электропорированы геномные векторы с тяжелой и легкой цепью (pGenex-H и pGenex-L), либо электропорирован отдельно вектор с легкой цепью. В последнем случае, клоны были скринированы на высокий уровень экспрессии легкой цепи химерного иммуноглобулина с использованием ELISA-техники. Затем эти клоны культивировали и электропорировали с вектором, содержащим тяжелую цепь. Если были использованы кДНК-конструкции с тандемными генами, то экспрессирующий вектор (TCAE5.2 или TCAE6) сначала линеаризировали путем переваривания рестриктирующим ферментом NotI. Одной электропорации было достаточно для достижения интеграции обоих генов тяжелой и легкой цепи. Через 2-3 недели супернатанты из лунок, которые продолжали культивировать в присутствии соответствующего лекарственного средства, анализировали на секрецию легкой цепи химерного иммуноглобулина или всего иммуноглобулина с использованием ELISA-техники. Гены иммуноглобулина в кДНК-конфигурации электропорировали либо в Sp2/0-клетки, как описано выше, либо в клетки яичника китайского хомячка (CHO), адаптированные для культивирования в суспензии в бессывороточной среде. CHO-клетки электропорировали с использованием аппарата для электропорации BTX 600 и в условиях, способствующих достижению максимального числа G418-резистентных колоний. Такими условиями были следующие параметры: 210 В, 400 мкФ, 13 Ом. После электропорации клетки подсчитывали, промывали в буфере для трансфекции, ресуспендировали в том же самом буфере и помещали на 15 минут на лед. Клетки доводили до уровня 1•107 живых клеток/мл, после чего 400 мкл клеточной суспензии переносили в стерильную одноразовую кювету (0,4 мл, BTX Inc.). 25 мкг ДНК-вектора TCAE 5.2 или TCAE 6, линеаризованного рестриктирующим ферментом NotI и содержащего клонированные гены вариабельной области иммуноглобулина макаки, ресуспендировали в TE-буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТК, pH 8,0) при 1 мкг/мл и добавляли суспензию. Электропорацию осуществляли путем разрядки аппарата с автоматической подачей заряда с помощью пусковой кнопки. Кювету помещали на лед на 15 минут, причем клетки разводили в 120 мл бессывороточной среде и помещали в шесть 96-луночных планшетов (200 мкл на лунку содержали приблизительно 6,667 электропорированных или 3,333 живых клеток на лунку). Для этих клеток были установлены независимые параметры электропорации, а селекцию проводили с использованием G418 при 400 мкг/мл.Cells were electroporated for several days: either the heavy and light chain genomic vectors (pGenex-H and pGenex-L) were co-electroporated, or the light chain vector was electroporated separately. In the latter case, clones were screened for high expression level of the chimeric immunoglobulin light chain using an ELISA technique. These clones were then cultured and electroporated with a heavy chain vector. If cDNA constructs with tandem genes were used, the expression vector (TCAE5.2 or TCAE6) was first linearized by digestion with the NotI restriction enzyme. One electroporation was enough to achieve the integration of both the heavy and light chain genes. After 2-3 weeks, the supernatants from the wells, which continued to be cultured in the presence of the appropriate drug, were analyzed for secretion of the light chain of the chimeric immunoglobulin or the entire immunoglobulin using an ELISA technique. Immunoglobulin genes in the cDNA configuration were electroporated either into Sp2 / 0 cells, as described above, or into Chinese hamster ovary (CHO) cells adapted for cultivation in suspension in serum free medium. CHO cells were electroporated using a BTX 600 electroporation apparatus and under conditions conducive to maximizing the number of G418-resistant colonies. These conditions were the following parameters: 210 V, 400 uF, 13 Ohms. After electroporation, the cells were counted, washed in transfection buffer, resuspended in the same buffer, and placed on ice for 15 minutes. Cells were adjusted to a level of 1 × 10 7 living cells / ml, after which 400 μl of the cell suspension was transferred to a sterile, single-use cell (0.4 ml, BTX Inc.). 25 μg of the DNA vector TCAE 5.2 or
Скрининг на продуцирование антител
Присутствие антител человека, обезьяны или химерных антител, секретированных трансфектантами, анализировали с помощью ELISA-техники, как описано ниже. 96-луночные планшеты с плоским дном (Dynatech) покрывали козьим античеловеческим иммуноглобулином IgG или каппа-цепью при 200 нг/лунку в буфере для покрытия (карбонат натрия 0,8 мг/мл, бикарбонат натрия 1,55 мг/мл, pH 9,6) и инкубировали, по крайней мере, 16 часов при 4oC. Затем буфер для покрытия удаляли, а лунки блокировали 120 микролитрами буфера для блокирования (1% альбумин бычьей сыворотки в фосфатносолевом буфере, содержащем 0,2% азида натрия) и инкубировали в течение 1 часа при 37oC. К лункам, содержащим блокирующий буфер, добавляли до 125 мкл супернатанта клеточной культуры и инкубировали 2 часа при 37oC. Затем планшеты промывали 5 раз PBS. После этого добавляли 100 мкл меченных пероксидазой хрена античеловеческих иммуноглобулинов (IgG) козы (или каппа-цепи), разделенных 1:1000 - 1:5000 в буфере для разведения (1% альбумин бычьей сыворотки, 0,05% Твин-20; 0,03% азида натрия в PBS). Планшеты инкуюировали 1 час при 37oC, а затем промывали 5 раз PBS. Химерное водорода и субстрата 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина (1:1, об/об) на лунку. Цветную реакцию завершали через 2-5 минут добавлением 100 мкл 2М серной кислоты на лунку.Antibody Production Screening
The presence of human, monkey, or chimeric antibodies secreted by transfectants was analyzed by ELISA as described below. 96-well flat bottom plates (Dynatech) were coated with goat anti-human IgG immunoglobulin or Kappa chain at 200 ng / well in coating buffer (0.8 mg / ml sodium carbonate, 1.55 mg / ml sodium bicarbonate,
Каждый специалист может провести эксперимент по методике, эквивалентной описанной выше. Примером такой технологии является иммортализация выбранных B-клеток путем образования гибридом (как описано выше) с клеточной линией K5H6/B5, описанной Carroll и др., 164 J.Experimental Medicine, 1566, 1986, или с эквивалентной клеточной линией, такой как SPAZ4 (поставляемой Sanoloz, см. , Ehrlich и др., 34 Clin. Chem, 1681, 1988). Аналогичные клеточные линии могут быть легко сконструированы с помощью стандартной техники. Альтернативно гены иммуноглобулина могут быть клонированы: (а) из клеток, иммортализированных с помощью трансформации вирусом Herpes papio, как описано Markova и др. , 30 Vopr Virusol 549, 1985, или эквивалентным вирусом; (b) путем клонирования одиночной B-клетки с получением временной иммортализации, как описано Amaroso и Lipske 145 J.Immunology 3155, 1990; или (c) путем использования бактериофаговых библиотек рекомбинантных ДНК, кодирующих иммуноглобулин, как описано Huse и др., 246 Science 1275, 1989; и McCafferty и др., 348 Nature 552, 1990. Скрининг на клоны, содержащие соответствующее антитело, может быть осуществлен способами, описанными выше, или эквивалентными способами, хорошо известными каждому специалисту, и из иммортализованной клеточной линии может быть "спасен" нужный ген иммуноглобулина. Кроме того, антитело, продуцированное с помощью выделенных B-клеток обезьян, может быть использовано непосредственно для лечения человека без каких-либо манипуляций с образованием химерного антитела. Each specialist can conduct an experiment using a technique equivalent to that described above. An example of this technology is the immortalization of selected B cells by forming hybridomas (as described above) with the K5H6 / B5 cell line described by Carroll et al., 164 J. Experimental Medicine, 1566, 1986, or with an equivalent cell line such as SPAZ4 ( supplied by Sanoloz, see Ehrlich et al., 34 Clin. Chem, 1681, 1988). Similar cell lines can be easily constructed using standard techniques. Alternative immunoglobulin genes can be cloned: (a) from cells immortalized by transformation with Herpes papio virus, as described by Markova et al., 30 Vopr Virusol 549, 1985, or an equivalent virus; (b) by cloning a single B cell to obtain transient immortalization, as described by Amaroso and Lipske 145 J. Immunology 3155, 1990; or (c) by using bacteriophage libraries of recombinant DNA encoding immunoglobulin, as described by Huse et al., 246 Science 1275, 1989; and McCafferty et al., 348 Nature 552, 1990. Screening for clones containing the corresponding antibody can be carried out using the methods described above or equivalent methods well known to those skilled in the art, and the desired immunoglobulin gene can be "rescued" from an immortalized cell line . In addition, an antibody produced using isolated B monkey cells can be used directly to treat humans without any manipulation to form a chimeric antibody.
Константная область, происходящая от иммуноглобулина человека, может быть получена стандартными способами с использованием любого нужного изотипа, и вариабельную область антитела обезьяны лигируют с указанной константной областью человека. Полученные химерные антитела особенно предпочтительно использовать для иммунотерапии человека против специфических рецепторов клеточной поверхности, таких как CD4, ICAM, CD19, CD20, CD8, CD11a, CD11b, CD28, CD18, CD45, CD71 и TCR. The constant region originating from the human immunoglobulin can be obtained by standard methods using any desired isotype, and the variable region of the monkey antibody is ligated to the specified constant region of the person. The resulting chimeric antibodies are particularly preferably used for human immunotherapy against specific cell surface receptors such as CD4, ICAM, CD19, CD20, CD8, CD11a, CD11b, CD28, CD18, CD45, CD71 and TCR.
Пример 3. Клонирование и экспрессия генов химерного антитела обезьяны/человека со специфичностью к CD4
Ниже приводится конкретный пример использования методов и антител настоящего изобретения.Example 3. Cloning and expression of chimeric monkey / human antibody genes with CD4 specificity
The following is a specific example of the use of the methods and antibodies of the present invention.
Генерирование линий иммортализованных B-клеток обезьяны
Взрослого павиана (White Sands New Mexico, Primate Centre) иммунизировали внутримышечно в нескольких местах 150-300 микрограммами растворимого (pCD4) или клеточными мембранами (1•108 клеток) от CD4-положительной клеточной линии SUpTI с использованием стандартного адъюванта. Иммунизацию повторяли каждые 2-3 недели, всего 6 раз. Затем павиану вводили бустер-инъекцию 100 мкг pCD4 в паховую область бедра, а неделю спустя дренированный лимфоузел из того же самого бедра удаляли. Из этого лимфоузла удаляли лимфоциты путем приготовления тонких срезов ткани и промывания их стерильной средой DMEM. Суспензию клеток пропускали через газовую найлоновую ткань, а затем собирали путем центрифугирования при 1000 х g в течение 10 минут.Generation of Immortalized Monkey B Cell Lines
An adult baboon (White Sands New Mexico, Primate Center) was immunized intramuscularly at several sites with 150-300 micrograms of soluble (pCD4) or cell membranes (1 × 10 8 cells) from a CD4-positive SUpTI cell line using a standard adjuvant. Immunization was repeated every 2-3 weeks, only 6 times. Then the baboon was given a booster injection of 100 μg pCD4 in the inguinal region of the thigh, and a week later the drained lymph node from the same thigh was removed. Lymphocytes were removed from this lymph node by preparing thin sections of tissue and washing them with sterile DMEM. The cell suspension was passed through a gas nylon fabric, and then collected by centrifugation at 1000 x g for 10 minutes.
Приблизительно 1•108 лимфоцитов суспендировали в Трис-аммонийхлоридном буфере (16 мМ, pH 7,5) и нагревали до 37oC в течение 5 минут для лизиса эритроцитов. Лимфоциты собирали путем центрифугирования и ресуспендировали в L-лейцинметиловом сложном эфире (LME), после чего инкубировали 45 минут при 37oC. LME-обработанные клетки фильтровали через найлоновое сито и центрифугировали. Затем добавляли 1 мл околоплодной сыворотки теленка, клетки суспендировали и дважды промывали в бессывороточной среде RPMI. После этого клетки подсчитывали и смешивали в одной 50 миллилитровой конической центрифужной пробирке вместе с равным количеством клеток K6H6/B5 гетеромиеломы, которые предварительно промывали два раза в бессыворотчной среде. Клетки слегка суспендировали в 1 мл 50% ПЭГ (полиэтиленгликоля), который медленно в течение 1 минуты добавляли, слегка размешивая. Затем клетки ресуспендировали путем добавления 20 мл бессыворотной среды в течение 5 минут, слегка помешивая для выделения из ПЭГ. После двухкратного промывания бессывороточной средой клетки ресуспендировали при концентрации 5•105/0,1 мл в RPMI-среде, содержащей 20% околоплодной сыворотки теленка и гентамицин, и помещали в 96-луночные планшеты для микротитрования при 0,1 мл на лунку. К каждой лунке добавляли равный объем HAT-среды (0,1 мл) и перед скринингом гибриды культивировали в течение 14-17 дней.About 1 x 10 8 lymphocytes were suspended in Tris ammonium chloride buffer (16 mM, pH 7.5) and heated to 37 ° C for 5 minutes to lyse red blood cells. Lymphocytes were collected by centrifugation and resuspended in L-leucine methyl ester (LME), after which they were incubated for 45 minutes at 37 ° C. LME-treated cells were filtered through a nylon sieve and centrifuged. Then 1 ml of fetal calf serum was added, the cells were suspended and washed twice in serum-free RPMI medium. After this, the cells were counted and mixed in one 50 ml conical centrifuge tube together with an equal number of K6H6 / B5 heteromyeloma cells, which were previously washed twice in serum-free medium. Cells were slightly suspended in 1 ml of 50% PEG (polyethylene glycol), which was added slowly over 1 minute, stirring slightly. The cells were then resuspended by adding 20 ml of serum-free medium for 5 minutes, stirring slightly to isolate from PEG. After washing twice with serum-free medium, the cells were resuspended at a concentration of 5 · 10 5 / 0.1 ml in RPMI medium containing 20% fetal calf serum and gentamicin and placed in 96-well microtiter plates at 0.1 ml per well. An equal volume of HAT medium (0.1 ml) was added to each well, and hybrids were cultured for 14-17 days before screening.
Скрининг клеточных гибридов для продуцирования антител против CD4
Анализ для определения специфичности против CD4 осуществляли следующим образом: ELISA-планшеты покрывали рекомбинантным pCD4 при концентрации 100 нг на лунку и блокировали 1% альбумином бычьей сыворотки в PBS. Из каждой лунки удаляли 50 мкл-аликвоты гибридомного суспернатанта, и планшеты с покрытыми pCD4 инкубировали в течение 60 минут. Связывание оценивали путем инкубирования с 125I-меченными козьими античеловеческими или козьими антиобезьяньими Ig в течение 60 минут. После четырехкратного промывания дистиллированной водой лунки анализировали путем подсчета на гамма-счетчике. Положительные лунки снова анализировали для получения дубликатов, и гибридомные клетки из этих лунок субклонировали три раза, сначала при концентрации 5 клеток на лунку, а затем два раза при концентрации 1 клетки на лунку. На этой стадии анти-pCD4-положительные лунки скринировали на способность к связыванию с CD4 клеточной поверхности. Этот скрининг осуществляли путем ингибирования связывания мышиного анти-CD4 моноклонального антитела, обозначаемого IF3, с CD4-положительной клеточной линией SupTI. Короче говоря, скрининг проводили путем совместного инкубирования различных количеств анти-CD4-антитела обезьяны и 10 нг 125I-меченного IF3 с клетками SupTI (3•105 клеток на лунку) в 96-луночном планшете. После 1-часового инкубирования при комнатной температуре (около 20-25oC) клетки удаляли путем вакуумной фильтрации с использованием стекловолоконных фильтров. После экстенсивного промывания PBS фильтры подсчитывали на гамма-счетчике для определения степени ингибирования супернатантами от гибридом обезьяны связывания IF3 с клетками SupTI.Cell Hybrid Screening for Anti-CD4 Antibody Production
The assay for determining anti-CD4 specificity was performed as follows: ELISA plates were coated with recombinant pCD4 at a concentration of 100 ng per well and blocked with 1% bovine serum albumin in PBS. 50 μl aliquots of the hybridoma suspension were removed from each well, and pCD4 coated plates were incubated for 60 minutes. Binding was evaluated by incubation with 125 I-labeled goat anti-human or goat anti-monkey Ig for 60 minutes. After washing four times with distilled water, the wells were analyzed by counting on a gamma counter. Positive wells were again analyzed to obtain duplicates, and hybridoma cells from these wells were subcloned three times, first at a concentration of 5 cells per well, and then twice at a concentration of 1 cell per well. At this stage, anti-pCD4-positive wells were screened for binding to CD4 cell surface. This screening was carried out by inhibiting the binding of a murine anti-CD4 monoclonal antibody, designated IF3, to a CD4 positive SupTI cell line. In short, screening was performed by co-incubating various amounts of monkey anti-CD4 antibody and 10 ng of 125 I-labeled IF3 with SupTI cells (3 x 10 5 cells per well) in a 96-well plate. After 1-hour incubation at room temperature (about 20-25 o C), the cells were removed by vacuum filtration using glass fiber filters. After extensive washing with PBS, the filters were counted on a gamma counter to determine the degree of inhibition by supernatants of monkey hybrid IF3 binding to SupTI cells.
В качестве кандидатов выбирали клоны, которые обнаруживали сильное ингибирующее действие против IF3. Выбранный клон изотипировали с использованием реагентов для изотипирования, происходящих от человека, в результате чего был выбран IgG2, имеющий легкую лямбда-цепь. Эту клеточную линию культивировали до получения количеств, достаточно больших для клонирования генов его иммуноглобулина. Clones that showed a potent inhibitory effect against IF3 were selected as candidates. The selected clone was isotyped using isotyping reagents derived from humans, whereby IgG2 having a light lambda chain was selected. This cell line was cultured until large enough to clone the genes of its immunoglobulin.
Клонирование генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина из иммортализованных B-клеток обезьяны
Полную РНК выделяли из 1•107 иммортализованных B-клеток обезьяны при помощи метода с использованием гуанидинизотиоцианата. Одну десятую от полной РНК использовали для построения одноцепочечной кДНК с помощью олигонуклеотидного праймера oligo-dT и обратной транскриптазы, как описано выше. Одну десятую от количества оц кДНК использовали для индуцирования PCR-реакцией. В каждой из шести PCR-реакций использовался один из шести олигонуклеотидных праймеров, специфичных к 5' VH-семейству и содержащих SaII-рестрикционный сайт вместе с олигонуклеотидом константной области IgG3', содержащим NheI-сайт (оба показаны на фиг. 7-1). Аналогично в пяти PCR-реакциях использовался один из пяти 5'-олигонуклеотидных праймеров для лидерной последовательности лямбда-цепи, содержащих BoIII-сайт и 3'-праймер лямбда-константной области, содержащий AvrII-сайт. Условия реакции были такими, как описано выше. Каждая PCR-реакция была дублирована три раза. Продукты каждой реакции амплификации тяжелой и легкой цепи пропускали на 1,2% агарозном геле. При электрофорезе на агарозном геле праймер VH4 тяжелой цепи (SEQ ID N 13: 5' ACTAAGTTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT 3') и праймер лямбда-цепи (SEQ ID N 14: (5' ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC 3') обнаруживали яркие полосы. Продукты этих реакций были использованы для клонирования в вектор TCAE 6, который содержал последовательности константных областей IgGI человека и лямбда-цепи иммуноглобулина человека.Cloning of immunoglobulin heavy and light chain variable region genes from immortalized monkey B cells
Complete RNA was isolated from 1 × 10 7 immortalized B cells of the monkey using the guanidinisothiocyanate method. One-tenth of total RNA was used to construct single-stranded cDNA using oligo-dT oligonucleotide primer and reverse transcriptase as described above. One tenth of the amount of sc cDNA was used to induce a PCR reaction. In each of the six PCR reactions, one of the six oligonucleotide primers specific for the 5 ′ VH family and containing the SaII restriction site was used together with the oligonucleotide of the IgG3 ′ constant region containing the NheI site (both shown in Fig. 7-1). Similarly, in five PCR reactions, one of five 5'-oligonucleotide primers for the lambda chain leader sequence containing the BoIII site and the 3'-primer lambda constant region containing the AvrII site was used. Reaction conditions were as described above. Each PCR reaction was duplicated three times. The products of each heavy and light chain amplification reaction were passed on a 1.2% agarose gel. For agarose gel electrophoresis, the heavy chain VH4 primer (SEQ ID N 13: 5 'ACTAAGTTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT 3') and the lambda chain primer (SEQ ID N 14: (5 'ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCTCC for TLC) showed bright bands for these. in the
Клонирование генов двух вариабельных областей в вектор экспрессии TCAE 6 осуществляли последовательно. Сначала PCR-продукт тяжелой цепи и вектор TCAE 6 переваривали рестриктирующими ферментами SalI и NheI, экстрагировали фенолом/хлороформом и пропускали через роторную колонку с Сефадексом G-25. PCR-продукты лигировали в разрезанный вектор в течение ночи при 14oC в присутствии ДНК-лигазы T4. Приблизительно 500 нг полной ДНК лигировали (в объеме 10 мкл) со вставкой/вектором в молярном отношении 10:1. Лигированный материал использовали для трансформации XL-I Blue-компетентных клеток (Stratagene), и трансформированные клетки засевали на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Колонии ампициллинрезистентных бактерий собирали и культивировали как 5 мл - мини-культуры. Из каждой их этих культур экстрагировали плазмидную ДНК методом щелочного лизиса, разрезали рестриктирующими ферментами SalI и NheI, и продукты подвергали электрофорезу на 1,2% агарозном геле. Плазмиды со вставками приблизительно в 450 п.о. использовали в качестве матриц для полследующего клонирования вариабельных областей легкой цепи. Продукты PCR-реакций легкой цепи, а также плазмиду, содержащую вставку тяжелой цепи, разрезали рестриктирующими ферментами BglII и AvrII и лигировали вместе. Плазмидные мини-культуры скринировали путем разрезания BglII и AvrII-ферментами. Перевары, дающие вставку приблизительно в 400-450 п.о., считали положительными. Плазмиды, содержащие обе SalI/NheI и BglII/AvrII-вставки, культивировали в больших количествах для секвенирования ДНК.Cloning of genes of two variable regions into the expression vector of
Экспрессирующие векторы тандемных химерных антител (TCAE 5,2 и TCAE 6) получали из вектора CLDN, который, в свою очередь, происходит от вектора RLDN10b (253 Science 77-79, 1991). А вектор RLDN10b происходит от экспрессирующего вектора TND (7 DNA 651-661, 1988). Expression vectors of tandem chimeric antibodies (TCAE 5.2 and TCAE 6) were obtained from the CLDN vector, which, in turn, comes from the RLDN10b vector (253 Science 77-79, 1991). And the RLDN10b vector comes from the TND expression vector (7 DNA 651-661, 1988).
RLDN10b отличают от вектора TND следующим образом. Транскрипционную кассету дигидрофолат-редуктазы (DHFR) промотор, кДНК и область полиаденилирования помещали между кассетой тканевого активатора плазминогена (экспрессирующая кассета t-PA) и кассетой неомицинфосфотрансферазы (NEO) так, чтобы три кассеты располагались тандемом и в одной и той же транскрипционно-активной ориентации. Кроме того, промотор гена DHFR в CLDN заменяли главным промотором мышиного бета-глобина (3 Mol. Cell. Biol., 1246-54, 1983), а t-PA-кДНК заменяли полилинкером. Все три эукариотические транскрипционные кассеты (Expression, DHFR, NEO) могут быть выделены из бактериальной плазмидной ДНК (производное pUC9) путем переваривания рестриктирующей эндонуклезой Notl. RLDN10b is distinguished from the TND vector as follows. The dihydrofolate reductase (DHFR) transcriptional cassette, the cDNA promoter, and the polyadenylation region were placed between the tissue plasminogen activator cassette (t-PA expression cassette) and the neomycin phosphotransferase (NEO) cassette so that the three cassettes were in tandem and in the same active transcription . In addition, the DHFR gene promoter in CLDN was replaced with the main mouse beta-globin promoter (3 Mol. Cell. Biol., 1246-54, 1983), and t-PA cDNA was replaced with a polylinker. All three eukaryotic transcriptional cassettes (Expression, DHFR, NEO) can be isolated from bacterial plasmid DNA (a derivative of pUC9) by digestion with Notl restriction endonucleosis.
CLDN отличается от RLDN10b тем, что в нем LTR Рауса перед полилинкером были заменены энхансером промотора предраннего гена цитомегаловируса человека (41 CeII, 521, 1985). CLDN differs from RLDN10b in that in it, Raus's LTRs before the polylinker were replaced by an enhancer of the promoter of the early human cytomegalovirus gene promoter (41 CeII, 521, 1985).
Экспрессирующие векторы TCAE 5,2 и TCAE 6 отличается от CLDN тем, что:
1) они содержат четыре транскрипционные кассеты (вместо трех), расположенные последовательно:
a) константную область легкой цепи иммуноглобулина человека, полученную посредством амплификации кДНК с помощью полимерзано-цепной реакции. В TCAE 5,2 имеется константная область легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека (аминокислоты) 108-214 по нумерации Kabat, аллотип Km3), а в TCAE 6 имеется константная область легкой лямбда-цепи иммуноглобулина человека (аминокислоты 108-215 по нумерации Kabat, генотип Oz минус, Mcg минус, аллотип Ke минус);
b) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина; в обеих конструкциях тяжелая цепь иммуноглобулина человека является константной областью гамма 1 (аминокислоты 114-478 по нумерации Kabat, аллотип Gmla, Gmlz), которую получали посредством амплификации кДНК с помощью полимеразно-цепной реакции;
c) DHFR; содержит свой собственный эукариотический промотор и область полиаденилирования;
d) NEO; также содержат свой собственный промотор и область полиаленилирования;
3) кассеты легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина человека содержат синтетические сигнальные последовательности для секреции цепей иммуноглобулина;
4) кассеты легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина человека содержат специфические ДНК-линкеры, которые позволяют осуществить инсерцию вариабельных областей легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина, сохраняющих транскрипционную рамку считывания и не меняющих аминокислот, обычно присутствующих в цепях иммуноглобулина. Введение описанных изменений привело к конструированию векторов TCAE 5.2 и TCAE 6. Клонирование генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина из клеточной линии гетерогибридомы E9.1 против CD4 в TCAE 6 привело к получению конструкции, которая была депонирована в ATCC. Эта конструкция содержит вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина обезьяны и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина обезьяны (эти последовательности показаны на фиг. 13 и 14 соответственно), которые были клонированы из клеточной линии E9.1 гибридомы против CD4. Константная область тяжелой цепи происходит от изотипа гамма-1 и аллотипа Gmla, Gmlz человека. Константная область легкой лямбда-цепи также происходит от человека, от генотипа Oz минус, mcg минус и аллотипа Ke минус. Гены иммуноглобулина клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающего TCAE 6 (показанный на фиг. 6), который после электропорации в клеточную линию CHO продуцировал анти-CD4 химерное антитело обезьяны/человека. Описанную ДНК-конструкцию использовали для трансформации бактериального штамма XL-1 Blue, селектированного в антибиотике ампициллина и депонированного в виде суспензии бактериальных клеток в стерильной LB-среде, содержащей 15% глицерина.The expression vectors TCAE 5.2 and
1) they contain four transcriptional cassettes (instead of three), arranged in series:
a) the constant region of the light chain of a human immunoglobulin obtained by amplification of cDNA using a polymerase chain reaction. TCAE 5.2 has a constant region of the kappa light chain of the human immunoglobulin (amino acids) 108-214 according to Kabat numbering, Km3 allotype), and
b) an immunoglobulin heavy chain constant region; in both constructs, the human immunoglobulin heavy chain is a constant region of gamma 1 (amino acids 114-478 according to Kabat numbering, allotype Gmla, Gmlz), which was obtained by amplification of cDNA using a polymerase chain reaction;
c) DHFR; contains its own eukaryotic promoter and polyadenylation region;
d) NEO; also contain their own promoter and polyalenylation region;
3) human immunoglobulin light and heavy chain cassettes contain synthetic signal sequences for the secretion of immunoglobulin chains;
4) human immunoglobulin light and heavy chain cassettes contain specific DNA linkers that allow the insertion of variable regions of the immunoglobulin light and heavy chains that preserve the transcriptional reading frame and do not change amino acids that are usually present in immunoglobulin chains. Introduction of the described changes led to the construction of the TCAE 5.2 and
Другой подходящей системой экспрессии является система, в которой ген, кодирующий селективный маркер, модифицировали для повышения выхода рекомбинантных систем, кодирующих нужную последовательность. Например, повреждение области инициации трансляции доминантного селектируемого маркера дает колонии, менее резистентные к лекарственному средству по сравнению с неповрежденным вектором, однако, в этом случае отдельная колония экспрессирует более высокие уровни генного продукта, чем неповрежденный вектор. Например, инициация трансляции является первой стадией синтеза белка. Участок инициации трансляции гена неомицинфосфотрансферазы G418-резистентный ген изменяли от последовательности "консенсуса" Kozak (последовательность - ccAccATGG) до обедненной последовательности Kozak (последовательность - ccTccATGC). Повреждение области инициации трансляции G418-резистентного гена приводит к: 1) значительному (5-кратному) снижению числа G418-резистентных колоний, полученных от эквивалентного количества плазмидной ДНК, трансфецированной на 1 клетку; и 2) значительному увеличению количества продуктов
сцепленных генов, экспрессируемых в каждом клоне. В клонах, содержащих "консенсус" Kozak, 73% скринированных колоний продуцировали менее чем 25 нг/мл, причем только 3% из них продуцировали более чем 100 нг/мл. Для клонов с измененной обедненной последовательностью Kozak, 8% скринированных колоний продуцировали менеечем 25 нг/мл, тогда как 63% колоний продуцировали более чем 100 нг/мл. В частности, как показано на фиг. 16 (где TCAE 5,2 имеет "консенсус" Kozak, а TCAE 12 имеет обедненную последовательность Kozak, а TCAE 12 имеет обедненную последовательность Kozak), 258 колоний были получены в результате 2 электропораций 25 мкг ДНК, содержащей ген неомицинфосфотрансферазы с сайтом инициации трансляции (неизмененным) "консенсуса". 201 их этих колоний (78%) не экспрессировали какой-либо обнаружимый генный продукт (т.е. < 25 нг/мл химерного иммуноглобулина), и только 8 колоний (3%) экспрессировали более чем 100 нг/мл. 98 колоний получали в результате 6 электропораций 25 мкг ДНК, содержащей ген неомицинфосфотрансферазы с измененным сайтом инициации трансляции. 63% этих колоний экспрессировали более чем 100 нг/мл, и лишь 8% этих колоний экспрессировали менее чем 25 нг/мл.Another suitable expression system is one in which a gene encoding a selectable marker is modified to increase the yield of recombinant systems encoding the desired sequence. For example, damage to the translation initiation region of a dominant selectable marker produces colonies that are less drug resistant than an intact vector, however, in this case, a single colony expresses higher levels of the gene product than an intact vector. For example, translation initiation is the first step in protein synthesis. The translation site of the neomycin phosphotransferase gene G418-resistant gene was changed from the Kozak "consensus" sequence (ccAccATGG sequence) to the Kozak depleted sequence (ccTccATGC sequence). Damage to the translation initiation region of the G418-resistant gene leads to: 1) a significant (5-fold) decrease in the number of G418-resistant colonies obtained from an equivalent amount of plasmid DNA transfected per 1 cell; and 2) a significant increase in the number of products
linked genes expressed in each clone. In Kozak consensus clones, 73% of the screened colonies produced less than 25 ng / ml, with only 3% of them producing more than 100 ng / ml. For Kozak depleted clone clones, 8% of the screened colonies produced less than 25 ng / ml, while 63% of the colonies produced more than 100 ng / ml. In particular, as shown in FIG. 16 (where TCAE 5.2 has a Kozak “consensus” and
ДНК-секвенирование
Плазмидную ДНК получали из 100 мл культур. Ее дополнительно очищали путем осаждения (1 объем) смесью 2,5 М хлорида натрия и 20% полиэтиленгликоля (6 объемов) в течение 15 минут на льду. После центрифугирования при 10000 х g в течение 20 минут осадок промывали 70% этанолом, снова центрифугировали и осушали в Speedivac (Savant). Осадок ДНК ресуспендировали в деионизованной воде при концентрации 150-250 мкг/мл. Секвенирование проводили на 5 мкг двухцепочечной ДНК методом Сэнгера. В этих целях были использованы праймеры для секвенирования, которые были гомологичны последовательностям, расположенным в экспрессирующем векторе "вверх по течению" и "вниз по течению" либо от вставок легкой цепи, либо от вставки тяжелой цепи. Вставки секвенировали как в направлении 5'--->3', так и в направлении 3'--->5'. Два клона анти-CD4 легкой цепи и два клона анти-CD4 тяжелой цепи, каждый из которых был генерирован в результате PCR-реакций, секвенировали параллельно для того, чтобы определить были ли введены какие-либо изменения в нуклеотидах во время PCR-реакции. Было обнаружено, что выбранные два клона тяжелой цепи и два клона легкой цепи идентичны между собой по всей длине, что свидетельствует о том, что в процессе амплификации никаких погрешностей внесено не было. Последовательность тяжелой и легкой анти-CD4-цепей показаны на фиг. 13 и 14 и в списке последовательностей: последовательности NN 15 и 16.DNA sequencing
Plasmid DNA was obtained from 100 ml of cultures. It was further purified by precipitation (1 volume) with a mixture of 2.5 M sodium chloride and 20% polyethylene glycol (6 volumes) for 15 minutes on ice. After centrifugation at 10,000 x g for 20 minutes, the precipitate was washed with 70% ethanol, centrifuged again and dried in Speedivac (Savant). The DNA pellet was resuspended in deionized water at a concentration of 150-250 μg / ml. Sequencing was performed on 5 μg double-stranded DNA by the Sanger method. For this purpose, sequencing primers were used that were homologous to the sequences located in the expression vector “upstream” and “downstream” from either the light chain insert or the heavy chain insert. The inserts were sequenced both in the direction 5 '--->3' and in the direction 3 '--->5'. Two clones of anti-CD4 light chain and two clones of anti-CD4 heavy chain, each of which was generated as a result of PCR reactions, were sequenced in parallel to determine whether any changes in nucleotides were introduced during the PCR reaction. It was found that the selected two clones of the heavy chain and two clones of the light chain are identical along the entire length, which indicates that no errors were made during the amplification process. The sequence of the heavy and light anti-CD4 chains is shown in FIG. 13 and 14 and in the list of sequences: sequences NN 15 and 16.
Экспрессия химерного антитела обезьяны/человека против CD4
Экспрессирующие векторы TCAE 5.2 и TCAE 6 могут быть использованы не только для стабильной интегрированной экспрессии в клеточных линиях Sp2/0 и CHO, но и могут, так как они имеют SV40-начало, быть также использованы для временной экспрессии в клеточной линии COS. Экспрессию в клетках COS осуществляли следующим образом: COS-клетки высевали за 1 день до трансфекции так, чтобы на следующий день они имели 50-70% сплошности. Затем культуральную среду удаляли и клетки промывали два раза буфером для трансфекции (TB-140 мМ NaCl, 25 мМ Трис, 5 мМ KCl, 0,5 мМ Na2HPO4, 1 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2). 30 мкг очищенной хлоридом цезия плазмиды TCAE 6, содержащей тяжелую и легкую цепи химерного анти-CD4 иммуноглобулина обезьяны/человека, смешивали с 3 мл DEAE-декстрана на чашку (1 мг/мл в TB). ДНК инкубировали с клетками в течение 1 часа при 37oC. Затем ДНК-раствор удаляли и заменяли 3 миллилитрами 20% глицерина на 1,5-2,5 минут, после чего клетки дважды промывали TB. Клетки инкубировали в 5 мл свежей среды, содержащей 100 мкМ хлорохина, в течение 3-5 часов при 37oC, после чего их промывали два раза средой и инкубировали с нормальной DMEM в течение 72 часов. Супернатант (100 мкл) от трансфецированных COS-клеток анализировали при различных разведениях на наличие антитела способа на основе ELISA. Козья лямбда IgG против человека использовали для покрытия 96-луночных планшет для анализа, а меченные пероксидазой козьи IgG против человека использовали в качестве идентифицирующих антител в стандартных условиях ELISA. Было установлено, что COS-клетки продуцируют от 10 до 40 нг/мл химерных антител обезьяны/человека. Большие количества супернатанта 10-кратно концентрировали и использовали в прямом РИА на связывание с CD4-положительными клетками SUpTI. Родительское полное антитело обезьяны и неревалентный иммуноглобулин человека использовали в качестве позитивного и негативного контролей соответственно (фиг. 11). Кроме того, антитело обезьяны против CD4 и химерное антитело обезьяны/человека против CD4 использовали для ингибирования связывания высокоаффинного мышиного антитела против CD4 (IF3) (см. 12). Было обнаружено, что рекомбинантное антитело обезьяны/человека (ATCC N) не только связывается с CD4-положительными клетками, но и способно ингибировать связывание IF3 с CD4-положительными клетками приблизительно в тех же концентрациях, что и полное антитело обезьяны или само IF3.Monkey / human chimeric antibody expression against CD4
The expression vectors TCAE 5.2 and
В нижеприведенных примерах раскрываются способы и антитела настоящего изобретения. The following examples disclose methods and antibodies of the present invention.
Пример 4. Продуцирование антител обезьяны против антигенов лимфоцитов человека
Взрослого павиана (white Send New Mexico Primate Centre) иммунизировали внутримышечно, в нескольких местах, целыми CD54-положительными лимфоцитами (5•108) человека. Поочередно использовали клетки: клетки SB (лимфоидная линия B человека) и активированные периферические лимфоциты человека, активированные путем предварительной инкубации со смесью митогена фитолакки (2,5 мг/мл), форбола моноацетата (40 нМ) и фитогемагглютинина (4 мг на лунку) в сочетании со стандартным адъювантом. Иммунизацию повторяли каждые 2-3 недели в течение 8 месяцев. Сыворотки от иммунизованных животных скринировали в различные периоды времени путем ингибирования связывания мышиного антитела (84H10), которое, как известно, связывается с ICAM-1. Насыщенное количество 84H10 подвергали связыванию с клетками яичника китайского хомячка (CHO), предварительно трансфецированных экспрессирующим вектором, содержащим кДНК CD54 человека, и отобранных на высокую экспрессию CD54 клеточной поверхности вместе с возрастающими разведениями сыворотки обезьяны. Ингибирование связывания показано на фиг. 15.Example 4. The production of monkey antibodies against antigens of human lymphocytes
An adult baboon (white Send New Mexico Primate Center) was immunized intramuscularly, in several places, with whole CD54-positive human lymphocytes (5 • 10 8 ). The cells were used in turn: SB cells (human lymphoid line B) and activated human peripheral lymphocytes activated by pre-incubation with a mixture of phytolacca mitogen (2.5 mg / ml), phorbol monoacetate (40 nM) and phytohemagglutinin (4 mg per well) combined with standard adjuvant. Immunization was repeated every 2-3 weeks for 8 months. Sera from immunized animals were screened at different time periods by inhibiting the binding of a murine antibody (84H10), which is known to bind to ICAM-1. A saturated amount of 84H10 was bound to Chinese hamster ovary (CHO) cells pre-transfected with an expression vector containing human CD54 cDNA and selected for high expression of CD54 cell surface along with increasing monkey serum dilutions. Inhibition of binding is shown in FIG. fifteen.
Другие мышиные моноклональные антитела, которые распознают другие антигены лимфоцитов человека, тестировали путем ингибирования с использованием сывороток обезьян, полученных аналогичными методами иммунизации. Other mouse monoclonal antibodies that recognize other human lymphocyte antigens were tested by inhibition using monkey sera obtained by similar immunization methods.
Использование
Антитела, продуцированные вышеописанным способом или эквивалентными способами, могут быть очищены при помощи комбинации аффинной и эксклюзионной хроматографии для использования в целях характеризации в функциональных биологических анализах. Эти анализы предусматривают определение специфичности и аффинности связывания, а также эффекторные функции, ассоциированные с экспрессированным изотипом, например ADCC, или фиксации комплемента. Указанные антитела могут быть использованы как пассивные или активные терапевтические агенты при лечении ряда заболеваний человека, включая B-клеточную лимфому, инфекционные заболевания, такие как СПИД, аутоиммунные и воспалительные заболевания, и трансплантацию. Эти антитела могут быть использованы в их нативной форме либо как часть комплекса "антитело/хелат", "антитело/лекарственное средство", или "антитело/токсин". Кроме того, целые антитела или их фрагменты (Fab2, Fab, Fv) могут быть использованы в качестве визуализирующих реагентов либо в качестве потенциальных вакцин или иммуногенов в активной иммунотерапии в целях генерации антиидиотипической реакции.Using
Antibodies produced by the above method or equivalent methods can be purified using a combination of affinity and exclusion chromatography for use in characterizing functional biological assays. These analyzes determine the specificity and affinity of binding, as well as the effector functions associated with the expressed isotype, such as ADCC, or complement fixation. These antibodies can be used as passive or active therapeutic agents in the treatment of a number of human diseases, including B-cell lymphoma, infectious diseases such as AIDS, autoimmune and inflammatory diseases, and transplantation. These antibodies can be used in their native form either as part of an antibody / chelate, antibody / drug, or antibody / toxin complex. In addition, whole antibodies or fragments thereof (Fab 2 , Fab, Fv) can be used as imaging reagents or as potential vaccines or immunogens in active immunotherapy in order to generate an anti-idiotypic reaction.
Количество используемого антитела, необходимое для получения терапевтического эффекта, может быть определено стандартной техникой, хорошо известной специалистам. Обычно антитела используют в фармацевтически приемлемом буфере и вводят любым подходящим способом. Вследствие достаточной эффективности заявленных антител и их хорошей переносимости человеком, они могут быть введены пациенту повторно в целях лечения различных заболеваний и состояний. The amount of antibody used to achieve a therapeutic effect can be determined by standard techniques well known in the art. Typically, antibodies are used in a pharmaceutically acceptable buffer and administered in any suitable manner. Due to the sufficient effectiveness of the claimed antibodies and their good tolerability by humans, they can be re-introduced to the patient in order to treat various diseases and conditions.
Рекомбинантные антитела (или их фрагменты) против CD4, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть также использованы для индуцирования иммуносупрессии, то есть для индуцирования супрессии иммунной системы человека или животного. Поэтому настоящее изобретение относится к способу индуцирования в профилактических или терапевтических целях иммуносупрессии у человека или животного, нуждающихся в этом, путем введения указанному человеку или животному эффективного нетоксичного количества антитела настоящего изобретения. Recombinant antibodies (or fragments thereof) against CD4 obtained in accordance with the present invention can also be used to induce immunosuppression, that is, to induce suppression of the human or animal immune system. Therefore, the present invention relates to a method for inducing prophylactic or therapeutic immunosuppression in a human or animal in need thereof by administering to said human or animal an effective non-toxic amount of an antibody of the present invention.
Способность соединений настоящего изобретения к индуцированию иммуносупрессии может быть продемонстрирована в используемых для этой цели стандартных тестах, например в смешанном тесте на реакцию лимфоцитов, или в тесте, где ингибирование пролиферации T-клеток измеряют путем поглощения тимидина. The ability of the compounds of the present invention to induce immunosuppression can be demonstrated in standard tests used for this purpose, for example, in a mixed test for the reaction of lymphocytes, or in a test where the inhibition of T-cell proliferation is measured by absorption of thymidine.
Тот факт, что антитела настоящего изобретения способны к индуцированию иммуносупрессии, означает, что эти антитела могут быть использованы для лечения или предупреждения резистентности или отторжения трансплантированных органов или тканей (например, почки, сердца, легких, костного мозга, кожи, роговицы и т.п.; для лечения или предупреждения аутоиммунных, воспалительных, пролиферативных и гиперпролиферативных заболеваний, и кожных симптомов иммунологически восприимчивых заболеваний, например, таких как ревматоидный артрит, красная волчанка, системная волчанка, хронический тироидит, рассеянный склероз, миастения, диабеты типа I, увеит, невротический синдром, псориаз, атопический дерматит, контактный дерматит и дерматиты типа экземы, красный плоский лишай (лишай Вильсона), пузырчатка, буллезная пузырчатка, врожденный буллезный эпидермолиз, крапивница, ангионевротический шок, васкулиты, эритемы, кожный эозинофильный лейкоцитоз, гнездная элопеция и т.п.); для лечения обратимых обструкций дыхательных путей, кишечных воспалительных заболеваний и аллергических заболеваний (например, таких как заболевания брюшной полости, проктит, эозинофильный гастроэнтерит, мастоцитоз, болезнь Крона и язвенный колит), а также пищевых аллергий (например, мигрень, ринит и экзема). The fact that the antibodies of the present invention are capable of inducing immunosuppression means that these antibodies can be used to treat or prevent the resistance or rejection of transplanted organs or tissues (e.g., kidney, heart, lung, bone marrow, skin, cornea, etc. .; for the treatment or prevention of autoimmune, inflammatory, proliferative and hyperproliferative diseases, and skin symptoms of immunologically susceptible diseases, such as rheumatoid arthritis, red ox anka, systemic lupus erythematosus, chronic thyroiditis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, type I diabetes, uveitis, neurotic syndrome, psoriasis, atopic dermatitis, contact dermatitis and dermatitis such as eczema, lichen planus (Wilson's versicolor), pemphigus, bullous pemphigus, congenital bullosa urticaria, angioedema shock, vasculitis, erythema, cutaneous eosinophilic leukocytosis, nodal elopecia, etc.); for the treatment of reversible airway obstruction, intestinal inflammatory diseases and allergic diseases (e.g., such as diseases of the abdominal cavity, proctitis, eosinophilic gastroenteritis, mastocytosis, Crohn's disease and ulcerative colitis), as well as food allergies (e.g., migraine, rhinitis and eczema).
С помощью рутинного экспериментирования любой специалист может определить эффективное нетоксичное количество антитела, необходимое для индуцирования иммуносупрессии. Однако, в основном, такое эффективное количество может варьироваться в диапазоне от около 0,05 до 100 миллиграммов на килограмм веса в день. Using routine experimentation, any person skilled in the art can determine the effective non-toxic amount of antibody needed to induce immunosuppression. However, in general, such an effective amount may vary from about 0.05 to 100 milligrams per kilogram of body weight per day.
Антитела (или их фрагменты) настоящего изобретения могут быть также использованы для лечения опухолей у млекопитающих. Более конкретно, эти антитела могут быть использованы для уменьшения размеров опухоли, ингибирования роста опухоли и/или продления жизни животного, страдающего опухолевым заболеванием. Настоящее изобретение также относится к способу лечения опухолей у человека или животных путем введения человеку или животному эффективного и нетоксичного количества антитела настоящего изобретения. С помощью рутинного экспериментирования любой специалист может определить эффективное нетоксичное количество антитела, необходимое для лечения канцерогенных опухолей. Однако, в основном, такое эффективное количество может варьироваться в диапазоне от около 0,05 до 100 миллиграммов на килограмм веса тела в день. Antibodies (or fragments thereof) of the present invention can also be used to treat tumors in mammals. More specifically, these antibodies can be used to reduce tumor size, inhibit tumor growth, and / or prolong the life of an animal suffering from a tumor disease. The present invention also relates to a method for treating tumors in humans or animals by administering to a human or animal an effective and non-toxic amount of an antibody of the present invention. Using routine experimentation, any specialist can determine the effective non-toxic amount of antibody needed to treat carcinogenic tumors. However, in general, such an effective amount may vary from about 0.05 to 100 milligrams per kilogram of body weight per day.
Антитела настоящего изобретения могут быть введены человеку или животному в соответствии с вышеупомянутыми методами лечения в количествах, достаточных для получения определенного терапевтического или профилактического эффекта. Антитела настоящего изобретения могут быть введены человеку или животному в виде стандартной унифицированной лекарственной формы, полученной путем смешивания антитела настоящего изобретения со стандартным фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем в соответствии со стандартной техникой изготовления фармацевтических препаратов. Следует отметить при этом, что форма и природа фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя будет зависеть от количества активного ингредиента, с которым он должен быть смешан, от способа введения лекарственного средства и от других хорошо известных параметров. Antibodies of the present invention can be administered to a human or animal in accordance with the above treatment methods in amounts sufficient to produce a specific therapeutic or prophylactic effect. The antibodies of the present invention can be administered to a human or animal in the form of a unit dosage form prepared by admixing an antibody of the invention with a standard pharmaceutically acceptable carrier or diluent in accordance with standard pharmaceutical manufacturing techniques. It should be noted in this case that the form and nature of the pharmaceutically acceptable carrier or diluent will depend on the amount of active ingredient with which it must be mixed, on the route of administration of the drug and on other well known parameters.
Антитела (или его фрагменты) настоящего изобретения могут быть введены перорально, парентерально, путем ингаляции или путем местного применения. Используемый в настоящем описании термин "парентеральное введение" означает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или интраперитонеальное введение. Особенно предпочтительными формами парентерального введения является подкожное и внутримышечное введение. Antibodies (or fragments thereof) of the present invention can be administered orally, parenterally, by inhalation, or by topical administration. As used herein, the term “parenteral administration” means intravenous, intramuscular, subcutaneous, rectal, vaginal or intraperitoneal administration. Particularly preferred forms of parenteral administration are subcutaneous and intramuscular administration.
Для профилактическое или терапевтического индуцирования иммуносупрессии, или для терапевтического лечения канцерогенных опухолей суточная доза для парентерального или перорального введения составляет, в основном, от около 0,05 до 100, а предпочтительно около 0,5-10 миллиграммов на килограмм веса тела в день. For the prophylactic or therapeutic induction of immunosuppression, or for the therapeutic treatment of carcinogenic tumors, the daily dose for parenteral or oral administration is generally from about 0.05 to 100, and preferably about 0.5-10 milligrams per kilogram of body weight per day.
Антитело настоящего изобретения может быть также введено путем ингаляции. Под термином "ингаляция" подразумевается интраназальное или пероральное введение путем ингаляции. Подходящие лекарственные формы для такого введения, такие как аэрозольные композиции или ингаляторы с дозируемым количеством активного ингредиента, могут быть получены стандартными способами. Предпочтительная доза используемого соединения настоящего изобретения, в основном, составляет от около 10 до 100 миллиграммов. The antibody of the present invention may also be administered by inhalation. By the term “inhalation” is meant intranasal or oral administration by inhalation. Suitable dosage forms for such administration, such as aerosol formulations or inhalers with a metered amount of the active ingredient, can be prepared by standard methods. A preferred dose of the compound of the present invention used is generally from about 10 to 100 milligrams.
Антитело настоящего изобретения может быть также использовано для местного применения. Под термином "местное введение" подразумевается несистемное введение, а в частности, нанесение антитела (или его фрагмента) настоящего изобретения на внешнюю поверхность эпидермиса или на щечные карманы, и закапывание такого препарата антитела в уши, глаза и нос, при котором не происходит попадания значительного количества этого антитела в кровоток. Термин "системное введение" означает пероральное, внутривенное, внутримышечное и внутрибрюшинное введение. Разумеется, что количество антитела, необходимое для получения желаемого терапевтического или профилактического эффекта, будет зависеть от выбранного антитела, природы и тяжести заболевания, подвергаемого лечению, и от самого пациента, и в конечном счете это количество может быть установлено лечащим врачом. Подходящая доза для местного применения антитела настоящего изобретения может, в основном, составлять от около 1 до 100 миллиграммов на килограмм веса тела в день. The antibody of the present invention can also be used for topical application. The term "local administration" means non-systemic administration, and in particular, the application of an antibody (or fragment thereof) of the present invention to the outer surface of the epidermis or on the buccal pockets, and instillation of such an antibody preparation into the ears, eyes and nose, in which there is no significant amounts of this antibody into the bloodstream. The term "systemic administration" means oral, intravenous, intramuscular and intraperitoneal administration. Of course, the amount of antibody required to obtain the desired therapeutic or prophylactic effect will depend on the chosen antibody, the nature and severity of the disease being treated, and on the patient himself, and ultimately this amount can be determined by the attending physician. A suitable dose for topical application of the antibody of the present invention can generally be from about 1 to 100 milligrams per kilogram of body weight per day.
Композиции
Хотя антитело настоящего изобретения или его фрагменты могут быть введены отдельно, однако, предпочтительно вводить эти антитела в виде фармацевтической композиции. Для местного применения активный ингредиент может составлять от 0,001% до 10% мас., например от 1% до 2% мас. по массе всей композиции, и хотя он может составлять от 10% мас., однако, предпочтительно, чтобы его количество не превышало 5% мас., а более предпочтительно, чтобы это количество составляло от 0,1% до 1% по массе композиции.Songs
Although the antibody of the present invention or fragments thereof may be administered separately, however, it is preferable to administer these antibodies in the form of a pharmaceutical composition. For topical use, the active ingredient may be from 0.001% to 10% wt., For example from 1% to 2% wt. by weight of the entire composition, and although it may be from 10% wt., however, it is preferable that its amount does not exceed 5% wt., and more preferably, this amount is from 0.1% to 1% by weight of the composition.
Композиции настоящего изобретения для местного применения включают в себя активный ингредиент в сочетании с одним или несколькими приемлемыми носителями и необязательно другой (другие) терапевтический(кие) ингредиент(ы). Этот носитель или носители должны быть "приемлемыми" в отношении их совместимости с другими ингредиентами композиции и не оказывать неблагоприятного воздействия на реципиента. Compositions of the present invention for topical application include the active ingredient in combination with one or more acceptable carriers and optionally the other (s) therapeutic ingredient (s). This carrier or carriers should be “acceptable” with respect to their compatibility with other ingredients of the composition and not adversely affect the recipient.
Композиции, подходящие для местного применения, представляют собой жидкие или полужидкие препараты, которые могут проникать через кожу в места организма, требующие лечения, и примерами которых могут служить линименты, лосьоны, кремы, мази или пасты, а также капли, подходящие для закапывания в глаза, уши или нос. Compositions suitable for topical application are liquid or semi-liquid preparations that can penetrate through the skin to places of the body that require treatment, and examples are liniments, lotions, creams, ointments or pastes, as well as drops suitable for instillation into the eyes , ears or nose.
В соответствии с настоящим изобретением препараты в виде капель могут содержать стерильные водные или масляные растворы или суспензии, которые могут быть получены путем растворения активного ингредиента в соответствующем водном растворе бактерицидного, и/или фунгицидного агента, и/или любого другого подходящего консерванта, и предпочтительно включающего поверхностно-активного вещества. Полученный раствор может быть затем очищен путем фильтрации и перенесен в соответствующую емкость, которую затем герметично закрывают и стерилизуют путем автоклавирования или выдерживания в течение получаса при температуре 90-100oC. Альтернативно этот раствор может быть стерилизован путем фильтрации и перенесен в соответствующие емкости с помощью стандартной техники асептики. Примерами бактериальных и фунгицидных агентов, подходящих для введения в препараты в виде капель, являются нитрат или ацетат фенилртути (0,002%), бензалконийхлорид (0,01%) и ацетат хлоргексидина (0,01%). Подходящими растворителями для получения масляного раствора являются глицерин, разбавленный спирт и пропиленгликоль.In accordance with the present invention, the droplet formulations may contain sterile aqueous or oily solutions or suspensions that can be prepared by dissolving the active ingredient in an appropriate aqueous solution of a bactericidal and / or fungicidal agent, and / or any other suitable preservative, and preferably including surfactant. The resulting solution can then be purified by filtration and transferred to an appropriate container, which is then hermetically sealed and sterilized by autoclaving or incubation for half an hour at a temperature of 90-100 o C. Alternatively, this solution can be sterilized by filtration and transferred to appropriate containers using standard aseptic technique. Examples of bacterial and fungicidal agents suitable for administration in the form of drops are phenylmercury nitrate or acetate (0.002%), benzalkonium chloride (0.01%) and chlorhexidine acetate (0.01%). Suitable solvents for the preparation of an oily solution are glycerol, dilute alcohol and propylene glycol.
Лосьоны настоящего изобретения представляют собой препараты, подходящие для нанесения на кожу или глаза. Глазные лосьоны могут включать в себя стерильный водный раствор, необязательно содержащий бактерицид, и могут быть изготовлены способами, аналогичными способам изготовления капель. Лосьоны или линименты для нанесения на кожу могут также содержать агент, ускоряющий осушку или охлаждение кожи, например, такой как спирт или ацетон, и/или увлажняющий агент, такой как глицерин или масло, например касторовое или арахисовое масло. Lotions of the present invention are preparations suitable for application to the skin or eyes. Ophthalmic lotions may include a sterile aqueous solution, optionally containing a bactericide, and may be prepared by methods similar to those used to make the drops. Lotions or linings for application to the skin may also contain an agent that accelerates the drying or cooling of the skin, for example, such as alcohol or acetone, and / or a moisturizing agent, such as glycerin or oil, for example castor or peanut oil.
Согласно настоящему изобретению кремы, мази или пасты представляют собой полутвердые препараты активного соединения, предназначенные для наружного применения. Они могут быть приготовлены путем смешивания активного ингредиента в тонкоизмельченной или порошковой форме отдельно или в растворе или суспензии в водной или безводной жидкости, с жирной или нежирной основой, используя соответствующее устройство. Эта основа может содержать углеводороды, такие как твердый, мягкий или жидкий парафин; глицерин; пчелиный воск; металлосодержащие мыла; слизи; масла натурального происхождения, такие как миндальное, кукурузное, арахисовое, касторовое или оливковое масло; ланолин или его производные, или жирные кислоты, такие как стеариновая или олеиновая кислота, в сочетании со спиртом, таким как пропиленгликоль или полигликоли. Эта композиция может содержать любое подходящее поверхностно-активное вещество, такое как катионогенное или неионогенное ПАВ, например сложные сорбитанэфиры или их полиоксиэтиленовые производные. В такую композицию могут быть включены суспендирующие агенты, такие как натуральные камеди, производные целлюлозы, или неорганические материалы, такие как кремноземы, а также другие ингредиенты, такие как ланолин. According to the present invention, creams, ointments or pastes are semi-solid preparations of the active compound for external use. They can be prepared by mixing the active ingredient in finely divided or powder form separately or in a solution or suspension in an aqueous or anhydrous liquid, with a greasy or non-greasy base, using an appropriate device. This base may contain hydrocarbons, such as hard, soft or liquid paraffin; glycerol; beeswax; metal-containing soaps; mucus; naturally occurring oils such as almond, corn, peanut, castor or olive oil; lanolin or its derivatives, or fatty acids, such as stearic or oleic acid, in combination with an alcohol, such as propylene glycol or polyglycols. This composition may contain any suitable surfactant, such as a cationic or nonionic surfactant, for example sorbitan esters or their polyoxyethylene derivatives. Suspending agents such as natural gums, cellulose derivatives, or inorganic materials such as silicas, as well as other ingredients such as lanolin, may be included in such a composition.
При этом, следует отметить, что количество и интервал приема индивидуальных доз антитела (или его фрагментов) настоящего изобретения зависят от природы и тяжести заболевания, подвергаемого лечению, формы, способа и места введения лекарственного средства, а также от каждого конкретного реципиента и могут быть определены традиционными способами. Следует также отметить, что оптимальный курс лечения, то есть число доз антитела настоящего изобретения или его фрагментов, принимаемых в день, и число дней приема этих доз могут быть определены специалистом с помощью стандартных тестов, обычно используемых для установления режима лечения. Moreover, it should be noted that the number and interval of administration of individual doses of the antibody (or fragments thereof) of the present invention depend on the nature and severity of the disease being treated, the form, method and place of administration of the drug, as well as on each specific recipient and can be determined in traditional ways. It should also be noted that the optimal course of treatment, that is, the number of doses of the antibodies of the present invention or fragments thereof, taken per day, and the number of days of taking these doses can be determined by a specialist using standard tests commonly used to establish a treatment regimen.
Однако, следуя вышеприведенному описанию, каждый специалист может без излишнего и трудоемкого экспериментирования в полной мере использовать настоящее изобретение. Для более наглядной иллюстрации настоящего изобретения ниже приводятся примеры, которые, однако, не должны рассматриваться как некое ограничение объема настоящего изобретения. However, following the above description, each specialist can, without undue and laborious experimentation, make full use of the present invention. To more clearly illustrate the present invention, examples are provided below, which, however, should not be construed as limiting the scope of the present invention.
Композиция в виде капсулы. Capsule composition.
Композиции настоящего изобретения в виде капсул получали путем наполнения жесткой желатиновой капсулы, состоящей из двух частей, 50 миллиграммами антитела настоящего изобретения или его фрагментом в виде порошка, 100 миллиграммами лактозы, 32 миллиграммами талька и 8 миллиграммами стеарата магния. Capsule compositions of the present invention were prepared by filling in a two-part hard gelatin capsule with 50 milligrams of the antibody of the present invention or a fragment thereof in powder form, 100 milligrams of lactose, 32 milligrams of talc and 8 milligrams of magnesium stearate.
Инъецируемая парентеральная композиция
Фармацевтическую композицию настоящего изобретения в форме, подходящей для введения путем инъекции, получали путем размешивания 1,5% мас. антитела настоящего изобретения или его фрагмента в 10% по объему пропиленгликоля и воде. Полученный раствор стерилизовали путем фильтрации.Injectable parenteral composition
The pharmaceutical composition of the present invention in a form suitable for administration by injection was obtained by stirring 1.5% wt. antibodies of the present invention or its fragment in 10% by volume of propylene glycol and water. The resulting solution was sterilized by filtration.
Композиции в виде мази
Антитело настоящего изобретения или его фрагмент - 1,0 г
Медицинское парафиновое масло - До 100,0 г
Антитело настоящего изобретения или его фрагмент диспергировали в небольшом объеме носителя, в результате чего получали в высокой степени гомогенный продукт. Затем этой дисперсией заполняли гибкие металлические тюбики.Ointment Compositions
The antibody of the present invention or its fragment is 1.0 g
Medical Paraffin Oil - Up to 100.0 g
The antibody of the present invention or a fragment thereof was dispersed in a small volume of the carrier, resulting in a highly homogeneous product. Then, flexible metal tubes were filled with this dispersion.
Композиция в виде крема для наружного применения
Антитело настоящего изобретения или его фрагмент - 1,0 г
Polawax GP 200 - 20,0 г
Безводный ланолин - 2,0 г
Белый воск - 2,5 г
Метилгидроксибензоат - 0,1 г
Дистиллированная вода - 100,0 г
Polawax, пчелиный воск и ланолин нагревали вместе при 60oC. Затем добавляли метилгидроксибензоат, и полученную смесь гомогенизировали с помощью высокоскоростного смешивания. После этого температуру снижали до 50oC. К смеси добавляли антитело настоящего изобретения или его фрагмент и диспергировали это антитело в смеси, после чего полученную композицию оставляли для охлаждения, медленно размешивая при этом.Cream composition for external use
The antibody of the present invention or its fragment is 1.0 g
Polawax GP 200 - 20.0 g
Anhydrous lanolin - 2.0 g
White wax - 2.5 g
Methylhydroxybenzoate - 0.1 g
Distilled water - 100.0 g
Polawax, beeswax and lanolin were heated together at 60 ° C. Methylhydroxybenzoate was then added, and the resulting mixture was homogenized by high speed mixing. After that, the temperature was reduced to 50 o C. To the mixture was added the antibody of the present invention or its fragment and the antibody was dispersed in the mixture, after which the resulting composition was left to cool, while slowly stirring.
Композиция в виде лосьона для местного применения
Антитело настоящего изобретения или его фрагмент - 1,0 г
Сорбитанмонолаурат - 0,6 г
Полисорбат 20 - 0,6 г
Цетостеариловый спирт - 1,2 г
Глицерин - 0,6 г
Метилгидроксибензоат - 0,2 г
Очищенная вода B.P. - До 100,00 мл B.P. - Британская фармакопея
Метилгидроксибензоат и глицерин растворяли в 70 мл воды при 75oC. Сорбитанмонолаурат, полисорбат 20 и цетостеариловый спирт расплавляли вместе при 75oC и добавляли к водному раствору. Полученную эмульсию гомогенизировали, оставляли охлаждаться, продолжая размешивать, и добавляли антитело настоящего изобретения или его фрагмент в виде суспензии в оставшейся воде. После этого, всю полученную суспензию продолжали размешивать до тех пор, пока она не будет однородной.Topical lotion composition
The antibody of the present invention or its fragment is 1.0 g
Sorbitan monolaurate - 0.6 g
Polysorbate 20 - 0.6 g
Cetostearyl alcohol - 1.2 g
Glycerin - 0.6 g
Methylhydroxybenzoate - 0.2 g
BP Purified Water - Up to 100.00 ml BP - British Pharmacopoeia
Methylhydroxybenzoate and glycerol were dissolved in 70 ml of water at 75 ° C. Sorbitan monolaurate,
Композиция в виде глазных капель
Антитело настоящего изобретения или его фрагмент - 0,5 г
Метилгидроксибензоат - 0,01 г
Пропилгидроксибензоат - 0,04 г
Очищенная вода B.P. - 100,0 г
Метил- и пропилгидроксибензоаты растворяли в 70 мл очищенной воды при 75oC, и полученный раствор оставляли для охлаждения. Затем добавляли антитело настоящего изобретения или его фрагмент, и раствор стерилизовали путем фильтрации через мембранный фильтр (размер пор 0,022 мкм), после чего этот раствор заливали в соответствующие стерильные емкости, используя технику асептики.Eye Drop Composition
The antibody of the present invention or its fragment is 0.5 g
Methylhydroxybenzoate - 0.01 g
Propylhydroxybenzoate - 0.04 g
BP purified water - 100.0 g
Methyl and propylhydroxybenzoates were dissolved in 70 ml of purified water at 75 ° C, and the resulting solution was allowed to cool. Then, the antibody of the present invention or a fragment thereof was added, and the solution was sterilized by filtration through a membrane filter (pore size 0.022 μm), after which this solution was poured into appropriate sterile containers using aseptic technique.
Композиции для введения путем ингаляции
Приготавливали смесь 10 мг антитела настоящего изобретения или его фрагмента и 0,2-0,5% замасливающего агента, такого как полисорбат 85 или олеиновая кислота, и эту смесь диспергировали в пропелленте, таком как фреон, а предпочтительно в комбинации с 1,2-дихлоротетрафторэтаном и дифторохлорометаном, после чего смесь вводили в соответствующий аэрозольный контейнер, имеющий емкость 15-20 мл, и адаптированный либо для интраназального, либо для перорального введения путем ингаляции.Compositions for administration by inhalation
A mixture of 10 mg of the antibody of the present invention or a fragment thereof and 0.2-0.5% of a sizing agent such as Polysorbate 85 or oleic acid was prepared, and this mixture was dispersed in a propellant such as Freon, and preferably in combination with 1,2- dichlorotetrafluoroethane and difluorochloro methane, after which the mixture was injected into an appropriate aerosol container having a capacity of 15-20 ml and adapted for either intranasal or oral administration by inhalation.
Композиция для введения путем ингаляции
Для введения в аэрозольный контейнер емкостью 15-20 мл 10 мг антитела настоящего изобретения или его фрагмента растворяли в этаноле (6-8 мл), добавляли 0,1-0,2% замасливающего агента, такого как полисорбат 85 или олеиновая кислота, и диспергировали в пропелленте, таком как фреон, предпочтительно в комбинации 1,2-дихлоротетрафторэтаном и дифторохлорометаном, после чего эту смесь вводили в соответствующий аэрозольный контейнер либо для интраназального, либо для перорального введения путем ингаляции.Composition for administration by inhalation
For administration to a 15-20 ml aerosol container, 10 mg of the antibody of the present invention or a fragment thereof was dissolved in ethanol (6-8 ml), 0.1-0.2% of a sizing agent such as Polysorbate 85 or oleic acid was added, and dispersed in a propellant such as freon, preferably in a combination of 1,2-dichlorotetrafluoroethane and difluorochloro methane, after which this mixture was injected into an appropriate aerosol container for either intranasal or oral administration by inhalation.
Антитела и фармацевтические композиции настоящего изобретения особенно предпочтительно использовать для парентерального введения, то есть подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. Композиции для парентерального введения могут быть изготовлены в виде раствора антитела настоящего изобретения или его фрагмента, либо коктейля этого антитела, растворенного в приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе. Для этой цели могут быть использованы водные носители, такие как вода, забуференная вода, 0,4%-ный солевой раствор, 0,3%-ный глицин и т.п. Указанные растворы являются стерильными и, в основном, не содержат макрочастиц. Эти растворы стерилизуют с использованием стандартной техники стерилизации. Композиции настоящего изобретения могут содержать фармацевтически приемлемые добавки, необходимые для приближения указанных композиций к физиологическим условиям, например агенты, корректирующие pH, буферные агенты и т.п. Концентрация антитела настоящего изобретения или его фрагмента в указанной композиции может широко варьироваться, например, примерно, от менее чем 0,5%, а в основном, около или, по крайней мере, около 1%, и вплоть до 15 или 20% мас., и может быть, в первую очередь, определена исходя из объема жидкости, ее вязкости и т.п., а также исходя из выбранного способа введения. The antibodies and pharmaceutical compositions of the present invention are particularly preferably used for parenteral administration, i.e., subcutaneous, intramuscular or intravenous administration. Compositions for parenteral administration can be prepared in the form of a solution of an antibody of the present invention or a fragment thereof, or a cocktail of this antibody, dissolved in an acceptable carrier, preferably in an aqueous carrier. Aqueous carriers such as water, buffered water, 0.4% saline, 0.3% glycine, and the like can be used for this purpose. These solutions are sterile and generally do not contain particulate matter. These solutions are sterilized using standard sterilization techniques. The compositions of the present invention may contain pharmaceutically acceptable additives necessary to bring these compositions closer to physiological conditions, for example, pH adjusting agents, buffering agents, and the like. The concentration of the antibodies of the present invention or its fragment in the specified composition can vary widely, for example, from about less than 0.5%, but mainly about or at least about 1%, and up to 15 or 20% wt. , and can be, first of all, determined on the basis of the volume of liquid, its viscosity, etc., as well as on the basis of the chosen method of administration.
Так, например, фармацевтическая композиция для внутримышечного введения может содержать 1 мл стерильной забуферной воды и 50 мл антитела настоящего изобретения или его фрагмента. Аналогично фармацевтическая композиция для внутривенного вливания может содержать 250 мл стерильного раствора Рингера и 150 мг антитела настоящего изобретения или его фрагмента. Практические методы получения парентеральных композиций хорошо известны специалистам и более подробно описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15-е изд. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (водится в настоящее описание посредством ссылки). Thus, for example, a pharmaceutical composition for intramuscular administration may contain 1 ml of sterile buffered water and 50 ml of an antibody of the present invention or a fragment thereof. Similarly, a pharmaceutical composition for intravenous infusion may contain 250 ml of sterile Ringer's solution and 150 mg of the antibody of the present invention or a fragment thereof. Practical methods for preparing parenteral compositions are well known in the art and are described in more detail, for example, in Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (referenced herein).
Антитела (или их фрагменты) настоящего изобретения могут быть лиофилизованы для хранения с последующим его разведением в соответствующем носителе непосредственно перед использованием. Было показано, что эта техника является эффективной при использовании стандартных иммуноглобулинов, и поэтому могут быть использованы стандартные способы лиофилизации и восстановления композиций настоящего изобретения. Antibodies (or fragments thereof) of the present invention can be lyophilized for storage, followed by dilution in an appropriate carrier immediately before use. It has been shown that this technique is effective using standard immunoglobulins, and therefore standard methods of lyophilization and reconstitution of the compositions of the present invention can be used.
В зависимости от желаемого результата фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть введены в профилактических и/или терапевтических целях. При терапевтическом введении композиции водят пациенту, уже страдающему определенным заболеванием, в количестве, достаточном для лечения заболевания или, по крайней мере, для задержки его развития, либо развития возможных осложнений. При профилактическом применении композиции, содержащие антитела настоящего изобретения, или коктейль, содержащий указанные антитела, вводят пациенту, еще не страдающему данным заболеванием, в целях усиления резистентности этого пациента к данному заболеванию. Depending on the desired result, the pharmaceutical compositions of the present invention can be introduced for prophylactic and / or therapeutic purposes. With therapeutic administration, the compositions are administered to a patient already suffering from a certain disease in an amount sufficient to treat the disease or at least to delay its development or the development of possible complications. For prophylactic use, compositions containing the antibodies of the present invention or a cocktail containing these antibodies are administered to a patient not yet suffering from the disease in order to increase the patient's resistance to the disease.
Однократное или многократные введения фармацевтических композиций могут быть осуществлены с использованием доз и режима их введения в соответствии с назначением врача. В любом случае, фармацевтическая композиция настоящего изобретения обеспечивает определенное количество модифицированных антител или его фрагментов настоящего изобретения, достаточное для эффективного лечения пациента. Single or multiple administrations of the pharmaceutical compositions can be carried out using the doses and the regimen for their administration as prescribed by the doctor. In any case, the pharmaceutical composition of the present invention provides a certain amount of modified antibodies or fragments of the present invention, sufficient for effective treatment of the patient.
Следует отметить, что антитела настоящего изобретения могут быть использованы для конструирования и синтеза либо пептидных, либо непептидных соединений (псевдопептидных), которые, в свою очередь, могут быть использованы в той же самой терапии, что и исходное антитело. См., например, Saragovi и др., Science 253, 782-795 (1991). It should be noted that the antibodies of the present invention can be used to construct and synthesize either peptide or non-peptide compounds (pseudopeptide), which, in turn, can be used in the same therapy as the original antibody. See, for example, Saragovi et al., Science 253, 782-795 (1991).
Депозит
Штамм был депонирован в ATCC с номером допуска N. Дата депонирования: 9 июля 1992 г.Deposit
The strain was deposited at ATCC with a permit number N. Date of deposit: July 9, 1992.
Заявители и их правоприемники признают свою обязанность заменять те культуры, которые должны погибнуть до конца срока выдачи патента, в течение 5 лет после последнего запроса на культуру, либо в течение 30 лет, независимо от каких-либо сроков; заявители также признают свою обязанность известить депозитарий о выдаче указанного патента, с момента которой этот депозит должен быть окончательно доступен для пользования. До сего времени указанный депозит является доступным лишь Комиссару по патентам, согласно условиям ст. 37 Свода федеральных правил, часть 1-14, и разделу 35 Кодекса законов США. Applicants and their legal successors acknowledge their obligation to replace those crops that must die before the end of the patent grant period, within 5 years after the last request for culture, or within 30 years, regardless of any terms; Applicants also acknowledge their obligation to notify the depositary of the grant of the said patent, from the moment of which this deposit must be finally available for use. Until now, the specified deposit is available only to the Commissioner for Patents, in accordance with the conditions of Art. 37 Code of Federal Regulations, Part 1-14, and Section 35 of the United States Code.
Другие варианты осуществления настоящего изобретения приводятся в формуле изобретения. Other embodiments of the present invention are provided in the claims.
Claims (6)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US73506491A | 1991-07-25 | 1991-07-25 | |
| US1.07/735,064 | 1991-07-25 | ||
| US07/735,064 | 1991-07-25 | ||
| US2.07/856,281 | 1992-03-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94038045A RU94038045A (en) | 1995-11-27 |
| RU2170256C2 true RU2170256C2 (en) | 2001-07-10 |
Family
ID=24954212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94038045/13A RU2170256C2 (en) | 1991-07-25 | 1992-07-24 | Recombinant antibody with specificity to cd4, method of its preparing and pharmaceutical composition for treatment of patients with psoriasis |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2170256C2 (en) |
| SG (1) | SG67924A1 (en) |
| ZA (1) | ZA925615B (en) |
-
1992
- 1992-07-24 SG SG1996007774A patent/SG67924A1/en unknown
- 1992-07-24 RU RU94038045/13A patent/RU2170256C2/en not_active IP Right Cessation
- 1992-07-27 ZA ZA925615A patent/ZA925615B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA925615B (en) | 1993-04-28 |
| SG67924A1 (en) | 1999-10-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3048640B2 (en) | Recombinant antibodies for human therapy | |
| US5658570A (en) | Recombinant antibodies for human therapy | |
| US5756096A (en) | Recombinant antibodies for human therapy | |
| JP3619866B2 (en) | Recombinant anti-CD4 antibody for human therapy | |
| IE84118B1 (en) | Recombinant antibodies for human therapy | |
| JP2006526414A (en) | Deimmunized anti-CD3 antibody | |
| RU2170256C2 (en) | Recombinant antibody with specificity to cd4, method of its preparing and pharmaceutical composition for treatment of patients with psoriasis | |
| WO2024097652A2 (en) | Anti-kras t cell receptors and engineered cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100725 |