RU2165455C1 - Recombinant plasmid dna pss5 encoding synthesis of recombinant human alpha-2b interferon, strain of escherichia coli ss5 as producer of recombinant human alpha-2b interferon and method of alpha-2b interferon preparing - Google Patents
Recombinant plasmid dna pss5 encoding synthesis of recombinant human alpha-2b interferon, strain of escherichia coli ss5 as producer of recombinant human alpha-2b interferon and method of alpha-2b interferon preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2165455C1 RU2165455C1 RU99124276/13A RU99124276A RU2165455C1 RU 2165455 C1 RU2165455 C1 RU 2165455C1 RU 99124276/13 A RU99124276/13 A RU 99124276/13A RU 99124276 A RU99124276 A RU 99124276A RU 2165455 C1 RU2165455 C1 RU 2165455C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interferon
- dna
- alpha
- strain
- plasmid
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения рекомбинантного лейкоцитарного интерферона альфа-2b человека медицинского назначения (далее ИНТ), а также к рекомбинантным штаммам Escherichia coli (E. Coli) и плазмидам для его получения. The invention relates to biotechnology, and in particular to methods for producing recombinant human leukocyte interferon alpha-2b for medical purposes (hereinafter, INT), as well as to recombinant Escherichia coli strains (E. Coli) and plasmids for its production.
Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами, двуцепочечными РНК и другими индукторами (авт. св. и пат. СССР N 297296, 1970; N 1366064, 1983, N 1713591, 1986 - кл. C 12 N 15/00; пат. РФ NN 1364343, 1984; 1709615, 1990; 2066188, 1993 - кл. C 12 N 15/00). Known methods for producing human leukocyte interferon from leukocytes of human donor blood induced by viruses, double-stranded RNA and other inducers (ed. St. and Pat. USSR
Недостатками этих способов являются, как правило, низкий выход продукта, невозможность масштабирования этого процесса, вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатита В и C, вируса иммунодефицита и др. Поэтому в настоящее время более перспективным признан способ получения ИНТ микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом химические подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию. The disadvantages of these methods are, as a rule, the low yield of the product, the inability to scale this process, the likelihood of contamination of the final product by human viruses, such as hepatitis B and C virus, immunodeficiency virus, etc. Therefore, the way to obtain INT microbiological synthesis is recognized as more promising. which provides the ability to obtain the target product with a significantly higher yield from a relatively inexpensive starting material. The chemical approaches used in this process allow creating variants of the structural gene that are optimal for bacterial expression, as well as regulatory elements that control its expression.
В настоящее время в качестве исходных микроорганизмов используют в основном различные искусственно сконструированные штаммы P. pastoris Ps. putida и Е. coli. Currently, various artificially constructed strains of P. pastoris Ps are mainly used as initial microorganisms. putida and E. coli.
Недостатком штамма P. Pastoris (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al.//High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada. , 12(3)., 152-155., 1995), является низкий уровень выхода целевого продукта на грамм биомассы, а штамма Ps. putida (Пат. СССР N 1640996, 1989, кл. C 12 N 15/00) - сложность выделения конечного продукта и, следовательно, трудоемкость и высокая себестоимость процесса с его участием. The disadvantage of the strain P. Pastoris (JN Garcia, JA Aguiar et. Al. // High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris.// Biotecnologia Aplicada., 12 (3)., 152-155., 1995), is low yield of the target product per gram of biomass, and strain Ps. putida (Pat. USSR N 1640996, 1989, class C 12 N 15/00) - the difficulty of isolating the final product and, therefore, the complexity and high cost of the process with its participation.
Известно значительное количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z- pBR322 (Pst1) HclF-11-206 или Z-pBR 322 (Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (пат. УР N13380, 1997, C 12 N 15/21) штамм Е. coli HB 101 с плазмидой pER 103 (пат. СССР N1417800, 1985, кл. C 12 N 15/00); штамм E.coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN (Кравченко В. В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т. 13, N 9, с. 1186-1193) и другие. A significant number of plasmids and strains of E. coli created on their basis are known: strains of E. coli ATCC 31633 and 31644 with plasmids Z-pBR322 (Pst1) HclF-11-206 or Z-pBR 322 (Pstl) / HclN SN 35-AHL6 ( US Pat. UR N13380, 1997, C 12 N 15/21) E. coli HB 101 strain with plasmid pER 103 (US Pat. USSR N1417800, 1985, class C 12 N 15/00); E. coli strain SG 20050 with plasmid p280 / 21FN (Kravchenko V.V. et al. Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, No. 9, pp. 1186-1193) and others.
Недостатком технологий, основанных на этих штаммах, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона. A disadvantage of technologies based on these strains is their instability, as well as the insufficient level of expression of interferon.
Прототипом заявляемых штамма и плазмиды является штамм E.coli sg 20050/ pIF16, депонированный под N ВКПМ в5809 и рекомбинантная плазмида pIF16, содержащая тандем двух синтетических генов альфа-интерферона, между которыми встроен синтетический цистрон orf 69 длиной 69 нуклеотидных остатков (пат. РФ N2054041, 1996, кл. C 12 N 15/21). The prototype of the claimed strain and plasmid is a strain of E. coli sg 20050 / pIF16, deposited under N VKPM b5809 and a recombinant plasmid pIF16 containing a tandem of two synthetic alpha-interferon genes, between which a synthetic cistron orf 69 with a length of 69 nucleotide residues is inserted (US Pat. RF N2054041 , 1996, CL C 12 N 15/21).
Экспрессия альфа-интерферона штаммом E.coli SG 20050 (plF16), содержащий эту плазмиду, контролируется тандемом двух мутантных конститутивных триптофановых промоторов и терминатором транскрипции фага 1. Плазмида содержит селективный маркер - ген устойчивости к ампициллину и репликон вектора pBR322. Уровень экспрессии ИНТ - 200-300 мг на л клеточной суспензии. The expression of alpha interferon by E. coli strain SG 20050 (plF16) containing this plasmid is controlled by the tandem of two mutant constitutive tryptophan promoters and the
Недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильных нерегулированных промоторов, что приводит к быстрой диссоциации плазмиды; а также использование гена бетта-лактомазы в качестве селективного маркера, т. к. она секретируется из бактериальной клетки и разрушает антибиотик, в результате чего в процессе ферментации происходит постоянное снижение селектирующего условия для плазмид-содержащих клеток штамма, накопление бесплазмидных клеток и в результате снижение выхода интерферона. The disadvantages of this plasmid and strain based on it are the use of strong unregulated promoters in the plasmid, which leads to rapid dissociation of the plasmid; as well as the use of the beta-lactomase gene as a selective marker, because it is secreted from the bacterial cell and destroys the antibiotic, as a result of which the selection condition for plasmid-containing cells of the strain is constantly reduced during fermentation, the accumulation of non-plasmid cells and, as a result, interferon output.
Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона. Along with the features of the strains used, the effectiveness of the process largely depends on the technology used for the isolation and purification of interferon.
Известен способ получения ИНТ, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушении биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию нафенилсилохроме C-80, pH-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте pH, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель- фильтрацию на Сефадексе G-100 (Авт. св. СССР N 1640996, 1995, кл. C 07 K 14/56). A known method of obtaining INT, including the cultivation of Ps cells. putida, biomass destruction, treatment with polyethyleneimine, ammonium sulfate fractionation, hydrophobic chromatography of naphenylsilochrome C-80, pH fractionation of the lysate, its concentration and diafiltration, DE-52 cellulose ion chromatography, pH elution, C-ion elution chromatography on eluent 52, concentration by passing through a filter cartridge and gel filtration on Sephadex G-100 (Aut. St. USSR N 1640996, 1995, class C 07 K 14/56).
Недостатком способа является его низкая продуктивность при использовании технологии на основе клеток Ps. Putida, а также многостадийность и большие потери конечного продукта. The disadvantage of this method is its low productivity when using technology based on Ps cells. Putida, as well as multi-stage and large losses of the final product.
Известен способ получения ИНТ, включающий в себя культивирование штамма E. coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах на качалке, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 6M раствором мочевины в буфере PBS, содержащем хлористый натрий, калий фосфат и Na2EDTA, растворяют в растворе гуанидинхлорида в буфере PBS и центрифугируют ((пат. РФ N 2054041, 1996, кл. C 12 N 15/21). A known method of producing INT, which includes culturing the E. coli strain SG 20050 / pIF16, in LB broth in flasks on a rocking chair, centrifuging the biomass, washing it with a buffer solution and sonication to destroy cells. The resulting lysate is centrifuged, washed with 6M urea in PBS buffer containing sodium chloride, potassium phosphate and Na2EDTA, dissolved in a solution of guanidine chloride in PBS buffer and centrifuged ((US Pat. RF N 2054041, 1996, class C 12 N 15/21).
Недостатками способа являются его относительно невысокая производительность, неустойчивость продуцента в процессе ферментации и, как следствие, нестабильность выхода интерферона. The disadvantages of the method are its relatively low productivity, instability of the producer during the fermentation process and, as a consequence, the instability of the yield of interferon.
Прототипом заявляемого способа получения ИНТ является способ получения лейкоцитарных интерферонов человека, (в частности ИНТ), заключающийся в культивировании штамма E.coli 294 ATCC 31446, трансформированного введением плазмид, замораживании полученных клеток, их разрушении механическими методами, суспендировании в буферном растворе и гомогенизировании. Для удалении ДНК и РНК к гомогенизату добавляют полиэтиленимин, после чего удаляют фильтрацией или центрифугированием твердые вещества. Верхний слой концентрируют ультрафильтрацией, а затем подвергают сначала аффинной хроматографии, регулированию pH, а затем подвергают ионообменной хроматографии на целлюлозе СМ52 или ее эквиваленте с использованием буферных растворов. (Пат. СССР N 1414319, 1981, кл. C 12 N 15/00). The prototype of the proposed method for producing INT is a method for producing human leukocyte interferons (in particular, INT), which consists in cultivating E. coli strain 294 ATCC 31446, transformed by the introduction of plasmids, freezing the obtained cells, destroying them by mechanical methods, suspending in buffer solution and homogenizing. To remove DNA and RNA, polyethyleneimine is added to the homogenizate, and then solids are removed by filtration or centrifugation. The top layer was concentrated by ultrafiltration, and then subjected to first affinity chromatography, pH adjustment, and then subjected to ion exchange chromatography on CM52 cellulose or its equivalent using buffer solutions. (Pat. USSR N 1414319, 1981, class C 12 N 15/00).
Недостатком способа является его многостадийность и низкая технологичность. The disadvantage of this method is its multi-stage and low adaptability.
Задачей, стоящей перед авторами, являлось создание более продуктивной плазмидной ДНК, штамма-продуцента и технологии получения ИНТ. The challenge facing the authors was to create a more productive plasmid DNA, producer strain and technology for obtaining INT.
Указанная задача решалась созданием рекомбинантной плазмидной ДНК pSS5 и штамма Escherichia coli SS5. This problem was solved by the creation of recombinant plasmid DNA pSS5 and Escherichia coli SS5 strain.
Плазмида pSS5 имеет 3604 пар оснований (п.о.) и характеризуется наличием следующих фрагментов:
DraI-HindIII фрагмента ДНК плазмиды pUC19 размером 1103 п.о., содержащий последовательность, ответственную за репликацию плазмиды, и последовательность лактозного промотора (Plac);
HindIII-XbaI фрагмента ДНК размером 226 п.о., содержащий последовательности двух промоторов - промотор фага T7 (PT7) и триптофановый промотор (Ptrp) - и последовательность Шайн Дальгарно, ответственную за инициацию трансляции;
XbaI-BamHI фрагмента ДНК размером 512 п.о., содержащий последовательность полусинтетического гена альфа-интерферона, полученного с помощью метода амплификации ДНК (ПЦР);
BamHI-SspI фрагмента ДНК плазмиды pKK233-3 размером 529 п.о., в котором HindIII сайт AAGCTT заменен на последовательность AAGCTAGCTT, содержащий последовательность rrnBT1T2, ответственную за терминацию транскрипции,
PstI-PstI фрагмент ДНК размером 1227 п.о. плазмиды pUC4K, в котором сайт HindIII AAGCTT заменен на последовательность AAACTT методом направленного мутагенеза с помощью метода ПЦР, кодирующий устойчивость к канамицину (kan).Plasmid pSS5 has 3604 base pairs (bp) and is characterized by the presence of the following fragments:
DraI-HindIII DNA fragment of plasmid pUC19 of 1103 bp containing the sequence responsible for the replication of the plasmid and the sequence of the lactose promoter (P lac );
A 226 bp HindIII-XbaI DNA fragment containing sequences of two promoters — a T7 phage promoter (P T7 ) and a tryptophan promoter (P trp ) —and a Shine Dalgarno sequence responsible for translation initiation;
An 512 bp XbaI-BamHI DNA fragment containing a sequence of the semi-synthetic alpha interferon gene obtained using DNA amplification method (PCR);
A 529 bp BamHI-SspI DNA fragment of plasmid pKK233-3 in which the AAGCTT HindIII site is replaced by the AAGCTAGCTT sequence containing the rrnBT 1 T 2 sequence responsible for transcription termination,
PstI-PstI 1227 bp DNA fragment plasmids pUC4K, in which the HindIII AAGCTT site is replaced with the AAACTT sequence by directional mutagenesis using the PCR method encoding kanamycin resistance (kan).
На чертеже - последовательность нуклеотидов плазмиды pSS5. In the drawing, the nucleotide sequence of plasmid pSS5.
Штамм Escherichia coli SS5 получен трансформацией клеток Escherichia coli BL21 (DE 3) плазмидой pSS5 с использованием традиционной генно-инженерной технологии. The Escherichia coli SS5 strain was obtained by transforming Escherichia coli BL21 (DE 3) cells with the pSS5 plasmid using traditional genetic engineering technology.
Штамм E.coli SS5 характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки.The strain of E.coli SS5 is characterized by the following features:
Cultural and morphological characters.
Клетки мелкие, прямые, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. The cells are small, straight, thickened, rod-shaped, gram-negative, non-spore.
Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агару "Дифко" колонии круглые, гладкие, выпуклые, мутные, блестящие, серые, края ровные. При росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть. Cells grow well on simple nutrient media. When growing on Difco agar, the colonies are round, smooth, convex, cloudy, shiny, gray, the edges are even. When growing in liquid media (on a minimal medium with glucose or LB broth) they form an intense smooth turbidity.
Физико-биологические признаки
Аэроб. Температурный диапазон роста 4-42oC при оптимуме pH 6,5-7,5.Physico-biological characteristics
Aerobe. The temperature range of growth of 4-42 o C at the optimum pH of 6.5-7.5.
В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах, так и органические соединения в виде аминокислот, пептона, триптона, дрожжевого экстракта и т.д. Mineral salts in ammonium and nitrate forms, as well as organic compounds in the form of amino acids, peptone, tryptone, yeast extract, etc., are used as a nitrogen source.
В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы. Amino acids, glycerin, carbohydrates are used as a carbon source.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к канамицину (до 100 мкг/мл). Antibiotic resistance. Cells are resistant to kanamycin (up to 100 μg / ml).
Штамм Escherichia coli SS5 - продуцент альфа-интерферона
Способ, условия и состав среды для хранения штамма:
L-агар с добавлением 20 мкг/мл канамицина под маслом, L-бульон с 15% глицерином и антибиотиками при -20oC в ампулах, в лиофилизированном состоянии в ампулах при -70oC.Strain Escherichia coli SS5 - producer of alpha-interferon
The method, conditions and composition of the medium for storage of the strain:
L-agar with the addition of 20 μg / ml kanamycin under oil, L-broth with 15% glycerol and antibiotics at -20 o C in ampoules, in a lyophilized state in ampoules at -70 o C.
Штамм Escherichia coli SS5 идентифицирован по Определителю Берги (1974) как штамм вида Escherichia coli. The strain Escherichia coli SS5 was identified by the Bergi Identifier (1974) as a strain of the species Escherichia coli.
Особенностью заявляемого способа является разработка технологии, позволяющей выделять интерферон в виде нерастворимой формы (в виде телец включения (ТВ)), что позволяет существенно упростить технологическую схему процесса и повысить выход целевого продукта. A feature of the proposed method is the development of technology that allows you to allocate interferon in the form of an insoluble form (in the form of inclusion bodies (TV)), which can significantly simplify the process flow diagram and increase the yield of the target product.
Способ заключается в культивировании в питательной среде штамма Escherichia coli SS5, замораживании биомассы (БМ) при температуре не выше -70oC, размораживании БМ при повышении температуры до 4oC, разрушении клеток микроорганизма обработкой их лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой ТВ отмывкой детергентами, центрифугированием, растворением ТВ в растворе гуанидин гидрохлорида и последующей ренатурацией ИНТ, ренатурацию проводят путем разведения ИНТ буферным раствором, содержащим неионные детергенты. Полученный ИНТ подвергают очистке с помощью ионообменной хроматографии на целлюлозе СМ 52 целлюлоза.The method consists in cultivating a strain of Escherichia coli SS5 in a nutrient medium, freezing biomass (BM) at a temperature not higher than -70 ° C, thawing BM when the temperature rises to 4 ° C, destroying microorganism cells by treating them with lysozyme, removing DNA and RNA by introducing into a lysate DNA basics and purification of TB by washing with detergents, centrifugation, dissolution of TB in a solution of guanidine hydrochloride and subsequent renaturation of INT, renaturation is carried out by diluting INT with a buffer solution containing non-ionic detergents. The obtained INT is subjected to purification using ion exchange chromatography on cellulose CM 52 cellulose.
Оптимальными условиями проведения отдельных стадий получения интерферона являются следующие:
разрушение клеток осуществляют введением лизоцима в раствор в концентрации 0,1-0,2 мас.%;
удаление ДНК и РНК проводят инкубированием суспензии интерферона с избытком ДНК-азы при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа;
очищенный осадок ИНТ растворяют в 6M буферном растворе гуанидин гидрохлорида;
ренатурацию проводят путем разбавления раствора ИНТ буферным раствором, содержащим неионные детергенты.The optimal conditions for the individual stages of obtaining interferon are as follows:
cell destruction is carried out by introducing lysozyme into the solution at a concentration of 0.1-0.2 wt.%;
DNA and RNA removal is carried out by incubating a suspension of interferon with excess DNAase at room temperature for at least 1 hour;
the purified INT precipitate is dissolved in a 6M guanidine hydrochloride buffer;
renaturation is carried out by diluting the INT solution with a buffer solution containing non-ionic detergents.
Выход ИНТ в результате применения способа в оптимальном режиме составляет не менее 700 мг очищеннго ИНТ с 1 л культуральной среды, уровень экспрессии ИНТ - не менее 800 мг с 1 л культуральной среды. The yield of INT as a result of applying the method in the optimal mode is at least 700 mg of purified INT from 1 liter of culture medium, the expression level of INT is not less than 800 mg from 1 liter of culture medium.
Существенными отличиями заявляемого способа от прототипа являются использование более продуктивного нового штамма, что позволяет изменить технологический процесс и сделать более целесообразным ферментативное разрушение вместо механического и получение нерастворимой формы интерферона, использование для удаления ДНК и РНК обработку ДНК-зой, перевод ИНТ в растворимую форму и ренатурацию, замена трехстадийной очистки ИНТ на одностадийную. Significant differences of the proposed method from the prototype are the use of a more productive new strain, which makes it possible to change the technological process and make enzymatic destruction more appropriate instead of the mechanical one and obtain an insoluble form of interferon, use DNA processing to remove DNA and RNA, translate INT into a soluble form and renature , replacement of three-stage purification of INT with one-stage.
Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируется следующими примерами. The essence and advantages of the claimed group of inventions is illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение рекомбинантной плазмиды. Example 1. Obtaining a recombinant plasmid.
Технология получения плазмиды pSS5 включает следующие этапы:
получение полусинтетического гена альфа-интерферона,
конструирование векторной плазмиды pSSI,
конструирование рекомбинантной плазмиды pSS5.The technology for plasmid pSS5 includes the following steps:
obtaining a semi-synthetic alpha interferon gene,
construction of the vector plasmid pSSI,
construction of the recombinant plasmid pSS5.
Получение полусинтетического гена альфа-интерферона. Obtaining a semi-synthetic alpha interferon gene.
Для клонирования гена альфа-интерферона был использован метод прямой полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации фрагмента ДНК из тотальной геномной ДНК человека, кодирующий альфа-интерферон (S.L. Emanuel, S. Pestka. //Human interferon-aA, -a2, and a2 (Arg) genes in genomic DNA/The J.of Biol. Chem., V. 268., No 17., 12565- 12569, 1993). For cloning the alpha interferon gene, the direct polymerase chain reaction (PCR) method was used to amplify a DNA fragment from total human genomic DNA encoding alpha interferon (SL Emanuel, S. Pestka. // Human interferon-aA, -a2, and a2 (Arg) genes in genomic DNA / The J.of Biol. Chem., V. 268., No.17, 12565-12569, 1993).
Для амплификации использовались два праймера: 1 и 2, нуклеотидная последовательность которых была составлена на основе известной первичной структуры гена альфа-2в интерферона человека. For amplification, two primers were used: 1 and 2, the nucleotide sequence of which was based on the known primary structure of the human interferon alpha-2b gene.
S1-5'-CTAGTCTAGATGTGTGATCTGCCTCAAA-3' и S2-5'-CGCGGATCCTCATTCCTTACTTCTTAAACТТТC-3'. S1-5'-CTAGTCTAGATGTGTGATCTGCCTCAAA-3 'and S2-5'-CGCGGATCCTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC-3'.
Данную и последующие ПЦР реакции проводили в следующих условиях: 10 mM Tis-HCl, pH 8.3, 50 mM KCI, 3 mM MgCl2, 0.2 mM каждого dNTP, 1.25 ед. Taq-полимеразы, 100 нг ДНК.This and subsequent PCR reactions were carried out under the following conditions: 10 mM Tis-HCl, pH 8.3, 50 mM KCI, 3 mM MgCl 2 , 0.2 mM each dNTP, 1.25 units. Taq polymerase, 100 ng DNA.
Процесс амплификации состоял из следующих стадий: прогревание при 94oC 3 мин, 35 циклов ПЦР (30 с 94oC, 30 с 56oC, 30 с 72oC) и инкубация при 2 мин 72oC. Полученный фрагмент ДНК размером 539 п.о. обрабатывали рестриктазами XbaI, BamHI, клонировали в вектор pUC19 по этим же сайтам рестрикции, структуру клонированого фрагмента подтверждали определением нуклеотидной последовательности. В результате была получена плазмида pUCAl размером 3225 п. о. , в которой ДНК гена альфа-интерферона фланкирована сайтами рестрикции XbaI и BamHI.The amplification process consisted of the following stages: heating at 94 o C for 3 min, 35 cycles of PCR (30 s 94 o C, 30 s 56 o C, 30 s 72 o C) and incubation at 2 min 72 o C. The resulting DNA fragment of size 539 bp treated with restriction enzymes XbaI, BamHI, cloned into pUC19 vector at the same restriction sites, the structure of the cloned fragment was confirmed by determination of the nucleotide sequence. As a result, the 32UC bp pUCAl plasmid was obtained. in which the DNA of the alpha interferon gene is flanked by the XbaI and BamHI restriction sites.
Мутагенез гена альфа-интерферона заключался в замене редко встречающихся триплетов в Е. coli, кодирующих соответствующие аминокислоты на часто встречающиеся триплеты в Е. coli, кодирующие эти же аминокислоты. Мутагенез ДНК гена альфа-интерферона проводится методом ПЦР. Для амплификации ДНК использовали праймеры:
S3-5'-CTAGTCTAGATGTGTGATCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTA GCCGTCGTACCCTGATGCTCCTGGCACAGATGCGTCGTATCTCTCTGTTCTCC-3' и
S4-5' -CGCGGATCCTCATTCCTTGGAACGCAGGGATTCCTGCAGGTT GGTGGACAGAGAAAAAGAACGCATGAТТТCTGCACGAACAACCTC-3'
В реакции ПЦР ДНК плазмиды pUCAl использовали в качестве матрицы. Полученный фрагмент ДНК размером 539 п. о. обрабатывали рестриктазами XbaI, BamHI, клонировали в вектор pUC19 по этим же сайтам рестрикции, структуру клонированного фрагмента подтверждали определением нуклеотидной последовательности. В результате была получена плазмида pUCA2 размером 3225 п.о., в которой ДНК полусинтетического гена альфа-интерферона фланкирована сайтами рестрикции XbaI и BamHI.Mutagenesis of the alpha-interferon gene was the replacement of rarely occurring triplets in E. coli encoding the corresponding amino acids by frequently occurring triplets in E. coli encoding the same amino acids. Mutagenesis of the alpha interferon gene DNA is carried out by PCR. For amplification of the DNA used primers:
S3-5'-CTAGTCTAGATGTGTGATCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTA GCCGTCGTACCCTGATGCTCCTGGCACAGATGCGTCGTATCTCTCTGTTCTCC-3 'and
S4-5 '-CGCGGATCCTCATTCCTTGGAACGCAGGGATTCCTGCAGGTT GGTGGACAGAGAAAAAGAACGCATGATTTCTGCACGAACAACCTC-3'
In the PCR reaction, pUCAl plasmid DNA was used as a template. The resulting DNA fragment size of 539 p. treated with restriction enzymes XbaI, BamHI, cloned into the pUC19 vector at the same restriction sites, the structure of the cloned fragment was confirmed by determination of the nucleotide sequence. As a result, a 3225 bp pUCA2 plasmid was obtained in which the DNA of the semisynthetic alpha-interferon gene is flanked by the XbaI and BamHI restriction sites.
Конструирование векторной плазмиды pSS1. Construction of the vector plasmid pSS1.
Векторная плазмида pSS1 представляет собой вектор pUC19, в котором ген amp заменяется на ген kan, с удаленным HindIII сайтом, и по сайтам рестрикции BamHI- SspI клонирован фрагмент ДНК, содержащий терминатор транскрипции из плазмиды рKK223-3, в котором также был удален HindIII сайт. The pSS1 vector plasmid is the pUC19 vector in which the amp gene is replaced with the kan gene with the HindIII site removed, and a DNA fragment containing the transcription terminator from plasmid pKK223-3 is cloned at the BamHI-SspI restriction sites, in which the HindIII site has also been deleted.
Конструирование векторной плазмиды pSS1 проводят в четыре стадии:
- удаление сайта HindIII в плазмиде рKK223-3,
- получение плазмиды pUC19T,
- мутагенез гена kan (удаление HindIII сайта в ген kan),
- получение векторной плазмиды pSS1
ДНК плазмиды рKK223-3 обрабатывают последовательно ферментом рестрикции HindIII, ферментом фрагмент Кленова и далее ферментом лигаза фага T4.The construction of the vector plasmid pSS1 is carried out in four stages:
- removal of the HindIII site in plasmid pKK223-3,
- obtaining plasmids pUC19T,
- kan gene mutagenesis (removal of the HindIII site in the kan gene),
- obtaining the vector plasmid pSS1
The plasmid pKK223-3 DNA is sequentially treated with the HindIII restriction enzyme, the Klenov fragment enzyme, and then the phage T4 ligase enzyme.
Лигированную ДНК трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина. После инкубирования в течение 12 час при 37oC клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. В результате была получена плазмида pKK223-3H размером 4588 п.о.The ligated DNA is transformed into cells of the E. coli strain DH5 and plated on LB medium containing 100 μg / ml ampicillin. After incubation for 12 hours at 37 ° C., the clones are plated, plasmid DNA is isolated and restriction analysis is performed. As a result, the plasmid pKK223-3H of 4588 bp was obtained.
Переклонирование фрагмента ДНК BamHI-Ssp1 размером 520 п.о., кодирующего терминатор транскрипции rrn BT1T2, из плазмиды рKK223-3H в плазмиду pUC19 по этим же сайтам осуществляется обработкой этих плазмид ферментами рестрикции BamHI и Ssp1, а затем лигированием лигазой фага T4. Лигированную ДНК трансформировали в клетки штамма E.coli DH5, высевали на среду LB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали 12 час при 37oC. Клоны отсевали, выделяли плазмидную ДНК и осуществляли рестрикционный анализ. В результате была получена плазмида pUC19T размером 2600 п.о. На третьей стадии проводили удаление HindIII сайта из гена kan и замещение гена amp на ген kan с удаленным HindIII сайтом в плазмиде pUC19T. Для этого проводили три раунда амплификации ДНК методом ПЦР.Cloning of a 520 bp BamHI-Ssp1 DNA fragment encoding the rrn BT 1 T 2 transcription terminator from pKK223-3H plasmid to pUC19 plasmid at the same sites is carried out by treating these plasmids with BamHI and Ssp1 restriction enzymes, and then ligating with phage T4 ligase . The ligated DNA was transformed into cells of the E. coli strain DH5, plated on LB medium containing 100 μg / ml ampicillin and incubated for 12 hours at 37 ° C. Clones were weeded out, plasmid DNA was isolated and restriction analysis was performed. As a result, a plasmid pUC19T of 2600 bp was obtained. In the third stage, the HindIII site was removed from the kan gene and the amp gene was replaced by the kan gene with the deleted HindIII site in plasmid pUC19T. For this, three rounds of DNA amplification by PCR were performed.
В ходе первого раунда, используя ДНК плазмиды pUC4K в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 757 п.о., кодирующего N-конец гена kan, с помощью праймеров:
S5-5'-AGAATGGCAAAAGТТТATGCAТТТ-3'
24-mer rev Sequencing primer - 5'-AGCGGATAACAAТТТCACACAGGA-3'
В ходе второго раунда, используя ДНК плазмиды pUC4K в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 642 п.о., кодирующего C-конец гена kan, с помощью праймеров:
S6-5'-AAATGCATAAACТТТTGCCATTCT-3'
24-mer Sequencing primer - 5'-CGCCAGGGТТТTCCCAGTCACGA-3'
В ходе третьего раунда, используя ДНК фрагментов из предыдущих двух реакций ПЦР (раунда 1 и раунда 2) в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 1376 п.о., кодирующего полный ген kan с удаленным HindIII сайтом, используя праймеры:
24-mer rev Sequencing primer - 5'-AGCGGATAACAAТТТCACACAGG A-3'
24-mer Sequencing primer - 5'-CGCCAGGGТТТTCCCAGTCACGA-3'.During the first round, using pUC4K plasmid DNA as a template, the 757 bp DNA fragment encoding the N-terminus of the kan gene is amplified using primers:
S5-5'-AGAATGGCAAAAGTTTATGCAATTT-3 '
24-mer rev Sequencing primer - 5'-AGCGGATAACAAТТТCACACAGGA-3 '
During the second round, using the DNA of plasmid pUC4K as a template, the 642 bp DNA fragment encoding the C-terminus of the kan gene is amplified using primers:
S6-5'-AAATGCATAAACTTTTGCCATTCT-3 '
24-mer Sequencing primer - 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3 '
During the third round, using DNA fragments from the previous two PCR reactions (
24-mer rev Sequencing primer - 5'-AGCGGATAACAAТТТCACACAGG A-3 '
24-mer Sequencing primer - 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3 '.
Далее получают векторную плазмиду pSS1. Для этого ДНК фрагмента размером 1376 п.о., полученного в 3 раунде амплификации, обрабатывают последовательно ферментом рестрикции PstI и ферментом фрагмент Кленова, а ДНК полученной плазмиды pUC19T ферментами рестрикции SspI и DraI. Далее, обработанные таким образом фрагмент ДНК, кодирующий ген kan и ДНК плазмиды pUC19T лигируют ферментом лигаза фага Т4. Лигированную ДНК трансформируют в клетки штамма E. coli DH5 и высевают на среду LB, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После культивирования в течение 12 ч. при 37oC клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ. В результате получают векторную плазмиду pSS1 размером 2920 п.о.Next, get the vector plasmid pSS1. For this, a 1376 bp DNA fragment obtained in round 3 of amplification was sequentially treated with the PstI restriction enzyme and the Klenov fragment enzyme, and the DNA of the obtained plasmid pUC19T with SspI and DraI restriction enzymes. Further, the thus processed DNA fragment encoding the kan gene and the plasmid pUC19T DNA is ligated with the T4 phage ligase enzyme. The ligated DNA was transformed into cells of E. coli strain DH5 and plated on LB medium containing 20 μg / ml kanamycin. After culturing for 12 hours at 37 ° C, the clones are screened, plasmid DNA is isolated, and restriction analysis is performed. The result is a vector plasmid pSS1 size of 2920 p.
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSS5
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSS5 проводят в две стадии:
конструирование фрагмента ДНК фланкирующего сайтами рестрикции HindIII- XbaI, кодирующего одновременно промотор фага T7, промотор триптофанового оперона и SD последовательность (Шайн-Дельгарно);
конструирование рекомбинантной плазмиды pSS5.Construction of the recombinant plasmid pSS5
The construction of recombinant plasmids pSS5 is carried out in two stages:
constructing a DNA fragment flanking the HindIII-XbaI restriction sites, encoding simultaneously the T7 phage promoter, tryptophan operon promoter and SD sequence (Schein-Delgarno);
construction of the recombinant plasmid pSS5.
Первая стадия осуществляется путем амплификации фрагмента ДНК размером 230 п. о. с помощью реакции ПЦР, в которой используются в качестве матрицы ДНК Е. coli и следующие праймеры:
S7 (в котором имеются последовательность сайта рестрикции для фермента Hindlll, последовательность, кодирующая T7 промотор, и последовательность, кодирующая
5'-конец триптофонового промотора):
5'-CCCAAGCTtaatacgactcactatagggagacccTATGGCTGTGCAGGTCGTA и
S8 (в котором имеются последовательность сайта рестрикции для фермента XbaI, SD последовательность и последовательность, кодирующая 3'-конец триптофанового промотора):
5'-TGCTCTAGATTATCTCCTTGAATTCCТТТTTACGTGAACTTGCGTA-3'.The first stage is carried out by amplification of a 230 bp DNA fragment. using the PCR reaction, in which E. coli DNA and the following primers are used as template
S7 (in which there is a restriction site sequence for the Hindlll enzyme, a sequence encoding a T7 promoter, and a sequence encoding
5'-end tryptophone promoter):
5'-CCCAAGCTtaatacgactcactatagggagacccTATGGCTGTGCAGGTCGTA and
S8 (in which there is a restriction site sequence for the XbaI enzyme, an SD sequence and a sequence encoding the 3'-end of the tryptophan promoter):
5'-TGCTCTAGATTATCTCCTTGAATTCCTTTTTACGTGAACTTGCGTA-3 '.
На второй стадии амплифицированный фрагмент ДНК с праймеров S7-S8 обрабатывали ферментами рестрикции HindIII-XbaI, ДНК плазмиды pUCA обрабатывали ферментами рестрикции XbaI-BamHI, а ДНК плазмиды pSSI обрабатывали ферментами рестрикции HindIII- BamHI и далее полученные фрагменты ДНК лигировали. In the second stage, the amplified DNA fragment from S7-S8 primers was treated with HindIII-XbaI restriction enzymes, pUCA plasmid DNA was treated with XbaI-BamHI restriction enzymes, and pSSI plasmid DNA was treated with HindIII-BamHI restriction enzymes and the resulting DNA fragments were ligated.
Лигированную ДНК трансформировали в клетки штамма E.coli DH5, высевали на среду LB, содержащую 20 мкг/мл канамицина и инкубировали 12 ч при 37oC. Клоны отсевали, выделяли плазмидную ДНК, проводили рестрикционный анализ и определяли нуклеотидную последовательность.The ligated DNA was transformed into cells of the E. coli strain DH5, plated on LB medium containing 20 μg / ml kanamycin and incubated for 12 hours at 37 ° C. Clones were weeded out, plasmid DNA was isolated, restriction analysis was performed, and the nucleotide sequence was determined.
В результате была получена рекомбинантная плазмида pSS5 размером 3604 п. о. As a result, a recombinant plasmid pSS5 of 3604 bp was obtained.
Пример 2. Получение штамма Е.coli SS5 - продуцента интерферона
Штамм-продуцент альфа-интерферона Е. coli SS5 получали путем трансформации клеток штамма Е. coli BL21 рекомбинантной плазмидой pSS5 с последующим отбором рекомбинантных клонов на среде с канамицином при 37oC и с определением активности альфа-интерферона и определением количества альфа-интерферона в экстрактах клеток, выращенных до оптической плотности 15.0-16.0 о. е. в среде M9, содержащей 1% кислотного гидролизата казеина (Difco), 1% глюкозы, 20 мкг/мл канамицина, при температуре 38-39oC.Example 2. Obtaining a strain of E. coli SS5 - producer of interferon
The E. coli SS5 alpha interferon producing strain was obtained by transforming E. coli BL21 strain cells with the recombinant plasmid pSS5, followed by selection of recombinant clones on a medium with kanamycin at 37 ° C and determining the alpha interferon activity and determining the amount of alpha interferon in the extracts cells grown to an optical density of 15.0-16.0 about. e. in M9 medium containing 1% casein acid hydrolyzate (Difco), 1% glucose, 20 μg / ml kanamycin, at a temperature of 38-39 o C.
Активность альфа-интерферона определяли методом ингибирования цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на диплоидные фибробласты человека и иммуноферментным методом. Alpha interferon activity was determined by the inhibition of the cytopathic effect of the vesicular stomatitis virus on human diploid fibroblasts and by an enzyme immunoassay.
Содержание альфа-интерферона в 15-20 г биомассы клеток, получаемых с 1 л культуры, составляло в зависимости от серии 700- 800 мг альфа-интерферона с суммарной активностью 1-2 х 10 ME. The content of alpha-interferon in 15-20 g of biomass of cells obtained from 1 liter of culture, depending on the series, was 700-800 mg of alpha-interferon with a total activity of 1-2
Пример 3. Получение ИНТ из штамма Е. соli SS5. Example 3. Obtaining INT from strain E. coli SS5.
Получение альфа-интерферона проводили в 4 этапа:
1 этап. Культивирование штамма Е. coli SS5
2 этап. Выделение и очистка нерастворимой формы альфа-интерферона
3 этап. Растворение и ренатурация альфа-интерферона
4 этап. Хроматографическая очистка альфа-интерферона
Культивирование штамма К. coli SS5.Obtaining alpha interferon was carried out in 4 stages:
2 stage. Isolation and purification of an insoluble form of alpha interferon
3 stage. Dissolution and renaturation of alpha interferon
4th stage. Chromatographic purification of alpha interferon
Cultivation of the strain K. coli SS5.
Выращенный посевной материал штамма Е. coli SS5 в 750 мл богатой среды LB в течение 12 ч при 26oC асептически вносили в лабораторный ферментер, содержащий 8.0 л стерильной среды, содержащей 1 х M9, 1% кислотного гидролизата казеина, 1% глюкозы, 1 мМ MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 20 мг/мл канамицина. Выращивание в ферментере проводили при температуре 38-39oC, поддерживая pH 7±0,15 путем автоматической подтитровки 40%-ным раствором гидроокиси натрия. Концентрацию растворенного кислорода в диапазоне (40±10)% от насыщения поддерживали путем изменения скорости оборотов мешалки от 100 до 400 об/мин и подачи воздуха от 0.2 до 1.5 объема воздуха/мин.The grown seed of E. coli SS5 strain in 750 ml of rich LB medium for 12 h at 26 ° C was aseptically introduced into a laboratory fermenter containing 8.0 l of sterile medium containing 1 x M9, 1% casein acid hydrolyzate, 1% glucose, 1 mM MgCl 2 , 0.1 mM CaCl 2 , 20 mg / ml kanamycin. Cultivation in the fermenter was carried out at a temperature of 38-39 o C, maintaining a pH of 7 ± 0.15 by automatic subtitling with a 40% sodium hydroxide solution. The concentration of dissolved oxygen in the range (40 ± 10)% of saturation was maintained by changing the speed of the mixer from 100 to 400 rpm and air supply from 0.2 to 1.5 air volumes / min.
Накопление альфа-интерферона в виде нерастворимой формы - "телец включений" контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии. Ферментацию заканчивали по достижении максимальной оптической плотности (15-16) о.е. и появлению зрелых "телец включений". По окончании культивирования биомассу отделяли от среды центрифугированием при скорости вращения 5000-10000 об/мин. Биомассу фасовали в полиэтиленовые пакеты и замораживали при температуре минус 70oC.The accumulation of alpha-interferon in the form of an insoluble form - “inclusion bodies” was monitored by phase contrast microscopy. Fermentation was completed upon reaching the maximum optical density (15-16) p.u. and the emergence of mature “inclusion bodies”. At the end of cultivation, the biomass was separated from the medium by centrifugation at a rotation speed of 5000-10000 rpm. Biomass was packaged in plastic bags and frozen at a temperature of minus 70 o C.
Выделение и очистка нерастворимой формы альфа-интерферона. Isolation and purification of an insoluble form of alpha interferon.
20 г замороженной биомассы штамма Е. coli SS5 суспендировали в 200 мл буфера 1 (10 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 10 мМ ЭДТА, 0.1% Triton Х100), добавляли 30 мг лизоцима и инкубировали с перемешиванием при температуре 4oC в течение 30 мин. Обработанную лизоцимом суспензию замораживали при минус 20oC в течение 3 час, а затем повышали температуру до комнатной. К суспензии добавляли 5 мг ДНКазы и 5 мМ MgCl2, инкубировали в течение 1 час при комнатной температуре, а затем добавляли равный объем буфера 2 (10 мМ Tris- HCl pH 8.0, 1 мМ ЭДТА, 0.1% Triton Х100), интенсивно перемешивали и центрифугировали 20 мин на центрифуге Бэкман J2-21 при скорости 9000 об/мин на роторе JA-10. Полученный осадок промывали последовательно еще один раз буфером 2, буфером 3 (10 мМ Tris-HCl pH 8.0, 1 мМ ЭДТА, неионный детергент). При этом время инкубации в этом буфере составляло не менее 12 час при 4oC. Дальнейшую промывку вели буфером 2 с 3 М мочевиной, буфером 2 без детергента Triton X100, раствором 40% изопропанола и в заключение - водой.20 g of frozen E. coli SS5 strain biomass was suspended in 200 ml of buffer 1 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X100), 30 mg lysozyme was added and incubated with stirring at 4 ° C for 30 minutes. The lysozyme-treated suspension was frozen at
Растворение и ренатурация альфа-интерферона
Полученный на предыдущем этапе осадок растворяли в 5-10 мл раствора 6 М гуанидин гидрохлорида, содержащего 100 мМ ДТТ, 20 мМ Tris-HCl и выдерживали при pH 8.0 и комнатной температуре в течение 2 ч. Нерастворившийся материал удаляли центрифугированием при 18 000 об/мин на центрифуге Бэкман J2-21 в роторе JA-10.Dissolution and renaturation of alpha interferon
The precipitate obtained in the previous step was dissolved in 5-10 ml of a solution of 6 M guanidine hydrochloride containing 100 mM DTT, 20 mM Tris-HCl and kept at pH 8.0 and room temperature for 2 hours. Insoluble material was removed by centrifugation at 18,000 rpm on a Beckman J2-21 centrifuge in a JA-10 rotor.
Ренатурацию альфа-интерферона проводили путем медленного разбавления полученного раствора в 250-500 мл буфера 4 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 70 мМ NaCl, смесь неионных детергентов) при температуре 4oC. После чего инкубировали раствор с постоянным перемешиванием в течение 24 час. Далее агрегированный материал удаляли центрифугированием при 9 000 об/мин в роторе JA-10 на центрифуге Бэкман J2-21.Renaturation of alpha-interferon was carried out by slowly diluting the resulting solution in 250-500 ml of buffer 4 (20 mm Tris-HCl pH 8.0, 70 mm NaCl, a mixture of nonionic detergents) at a temperature of 4 o C. Then the solution was incubated with constant stirring for 24 hour. Next, the aggregated material was removed by centrifugation at 9,000 rpm in a JA-10 rotor on a Beckman J2-21 centrifuge.
Хроматографическая очистка альфа-интерферона. Chromatographic purification of alpha interferon.
Хроматографическую очистку альфа-интерферона проводили на катионите CM-52 (Watm). К раствору ренатурированного альфа-интерферона добавляли 1M раствор NH4(CH3COO) при pH 4.5 до концентрации 25 мМ и наносили на смолу CM-52, предварительно уравновешенную буфером 5 (25 мМ NH4(CH3COO), pH 4.5). Далее смолу промывали буфером 6 (50 мМ NH4(CH3COO) при pH 4.5), буфером 7 (50 мМ NH4(CH3COO) при pH 5.0).Chromatographic purification of alpha interferon was performed on CM-52 cation exchanger (Watm). To a solution of renatured alpha-interferon was added a 1M solution of NH 4 (CH 3 COO) at a pH of 4.5 to a concentration of 25 mM and was applied to a CM-52 resin, previously equilibrated with buffer 5 (25 mM NH 4 (CH 3 COO), pH 4.5). Next, the resin was washed with buffer 6 (50 mm NH 4 (CH 3 COO) at pH 4.5), buffer 7 (50 mm NH 4 (CH 3 COO) at pH 5.0).
ИНТ элюировали буфером 7, содержащим 0,15 мМ NaCl. Выход интерферона альфа-2b составлял не менее 800 мг из 20 г биомассы, полученной с 1 л культуральной среды с удельной активностью не менее 2·108 МЕ/мг.INT was eluted with buffer 7 containing 0.15 mM NaCl. The yield of interferon alpha-2b was not less than 800 mg from 20 g of biomass obtained from 1 l of culture medium with a specific activity of at least 2 · 10 8 IU / mg.
Как следует из приведенных примеров, заявляемая группа изобретений позволяет получать интерферон альфа-2b с высоким выходом при относительно простой и надежной технологии. As follows from the above examples, the claimed group of inventions allows to obtain interferon alpha-2b in high yield with a relatively simple and reliable technology.
Claims (7)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU99124276/13A RU2165455C1 (en) | 1999-11-23 | 1999-11-23 | Recombinant plasmid dna pss5 encoding synthesis of recombinant human alpha-2b interferon, strain of escherichia coli ss5 as producer of recombinant human alpha-2b interferon and method of alpha-2b interferon preparing |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU99124276/13A RU2165455C1 (en) | 1999-11-23 | 1999-11-23 | Recombinant plasmid dna pss5 encoding synthesis of recombinant human alpha-2b interferon, strain of escherichia coli ss5 as producer of recombinant human alpha-2b interferon and method of alpha-2b interferon preparing |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2165455C1 true RU2165455C1 (en) | 2001-04-20 |
Family
ID=20227112
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU99124276/13A RU2165455C1 (en) | 1999-11-23 | 1999-11-23 | Recombinant plasmid dna pss5 encoding synthesis of recombinant human alpha-2b interferon, strain of escherichia coli ss5 as producer of recombinant human alpha-2b interferon and method of alpha-2b interferon preparing |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2165455C1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2610173C1 (en) * | 2016-03-30 | 2017-02-08 | Илья Александрович Марков | Recombinant plasmid pfm-ifn-17 providing expression of interferon alpha-2b of human, recombinant plasmid pfm-ap, providing expression of enzyme methionine-aminopeptidase e coli, biplasmid strain escherichia coli fm-ifn-ap (pfm-ifn-17, pfm-ap) - producer (met-) of recombinant interferon alpha -2b of human |
-
1999
- 1999-11-23 RU RU99124276/13A patent/RU2165455C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2610173C1 (en) * | 2016-03-30 | 2017-02-08 | Илья Александрович Марков | Recombinant plasmid pfm-ifn-17 providing expression of interferon alpha-2b of human, recombinant plasmid pfm-ap, providing expression of enzyme methionine-aminopeptidase e coli, biplasmid strain escherichia coli fm-ifn-ap (pfm-ifn-17, pfm-ap) - producer (met-) of recombinant interferon alpha -2b of human |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0946711B1 (en) | Improved expression vectors | |
JPH0665305B2 (en) | Method for stabilizing host cell containing recombinant DNA | |
CA2038706A1 (en) | Bacterial vectors | |
AU2001284914A1 (en) | Phage-dependent Superproduction of Biologically Active Protein and Peptides | |
WO2002014468A2 (en) | Phage-dependent superproduction of biologically active protein and peptides | |
AU753879B2 (en) | Industrial method for producing heterologous proteins in E.coli and strains useful for said method | |
HU194316B (en) | Process for preparing alpha-l human leukocyte interferone | |
RU2165455C1 (en) | Recombinant plasmid dna pss5 encoding synthesis of recombinant human alpha-2b interferon, strain of escherichia coli ss5 as producer of recombinant human alpha-2b interferon and method of alpha-2b interferon preparing | |
US11639515B2 (en) | Genetically engineered strain for producing porcine myoglobin and food-grade fermentation and purification thereof | |
FI103132B (en) | Method for the preparation of recombinant IgA protease | |
EP0076037B1 (en) | Amplified expression of dna sequences | |
RU2697375C2 (en) | Plasmid vector prh15a for producing methionine-free interferon alpha-2b, bacterial strain escherichia coli bl21 de3 - producer of methionine-free interferon alpha-2b and method for producing methionine-free interferon alpha-2b | |
CA2015046C (en) | Recombinant dna and expression vector | |
KR910001811B1 (en) | Method for control of foreign gene expression by glucose | |
RU2242516C1 (en) | Method for preparing recombinant human alpha-2b-interferon, recombinant plasmid and strain-producer for its realization | |
SU1703690A1 (en) | Recombinant plasmid dna pvn22, encoding human interferon @@@-i1 synthesis, and the strain of bacterium pseudomonas sp - a producer of human interferon @@@-i1 | |
CN112391364B (en) | High-activity glutamine transaminase mutant and preparation method thereof | |
CN107641630A (en) | It is mutated degradation of microcystins GFP and its application | |
RU2326168C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pIF TREN CODING HUMAN POLYPEPTIDE OF ALFA-2b INTERFERON AND POLYPEPTIDE OF Escherichia BACTERIA RACE coli-PRODUCER OF HUMAN ALFA-2b INTERFERON | |
Jiang et al. | The expression of proUK in Escherichia coli: the vgb promoter replaces IPTG and coexpression of argU compensates for rare codons in a hypoxic induction model | |
US20060286631A1 (en) | Method for preparating t-20 peptide by high cell density cultivation of recombinant e. coli containing t-20 peptide coding gene | |
Saito et al. | Overproduction of thermostable β-galactosidase in Escherichia coli, its purification and molecular structure | |
JP3357405B2 (en) | Method for producing flavin nucleotides | |
CN1145701C (en) | Recombinant glucokinase as thrombolytic medicine | |
RU2097428C1 (en) | Recombinant plasmid dna pttg km2 encoding synthesis of recombinant human immune interferon, strain escherichia coli t3g - a producer of recombinant human immune interferon and a method of preparing recombinant human immune interferon |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20051124 |