RU2160778C1 - Штамм бактерий bacillus сereus-продуцент нитрилгидратазы - Google Patents
Штамм бактерий bacillus сereus-продуцент нитрилгидратазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2160778C1 RU2160778C1 RU99123771/13A RU99123771A RU2160778C1 RU 2160778 C1 RU2160778 C1 RU 2160778C1 RU 99123771/13 A RU99123771/13 A RU 99123771/13A RU 99123771 A RU99123771 A RU 99123771A RU 2160778 C1 RU2160778 C1 RU 2160778C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- bacillus cereus
- activity
- nitrile hydratase
- nitrilehydratase
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для синтеза акриламида из акрилонитрила. Штамм бактерий Bacillus cereus B5 продуцирует нитрилгидратазу на простой органоминеральной среде. Активность нитрилгидратазы в отношении ацетонитрила 220 ед, акрилонитрила - 200 ед. Нитрилгидратаза штамма В cereus B5 термостабильна, применяется для биотехнологического синтеза акриламида гидратаций акрилонитрила в водных растворах. Штамм обладает более высокой активностью, удовлетворительной термостабильностью и гомогенностью культуры. 5 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается получения нового штамма бактерий, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью, которая может быть использована для получения важных продуктов, в частности, акриламида из акрилонитрила. Нитрилгидратаза - фермент, катализирующий процесс гидролиза нитрилов карбоновых кислот до соответствующих амидов.
Известны микроорганизмы, продуцирующие фермент нитрилгидратазу и относящиеся к родам Pseudomonas, Rhodococcus, Brevibacterium, Agrobacterium. В том числе известны штаммы, способные к трансформации акрилонитрила в акриламид: Rhodococcus rhodochrous J-1 [1], Rhodococcus sp. N771 [2], Rhodococcus sp. N774 [3], Pseudomonas chlororophis B23 [4], Brevibacterium R312 [5], Agrobacterium radiobacter SC-C15-1 [7].
Наиболее близким аналогом к предлагаемому изобретению является штамм Rhodococcus rhodochrous М8 [6], который используется для синтеза концентрированных водных растворов акриламида из акрилонитрила [8,9].
Недостатком бактерий Rhodococcus является относительно медленный рост и связанные с этим трудности культивирования и поддержания гомогенности культуры в процессе промышленного производства указанного штамма, а также невысокая активность.
Задачей изобретения является быстрорастущий, легко культивируемый штамм с высокой активностью и удовлетворительной термостабильностью нитрилгидратазы. Для решения этой задачи предлагается штамм бактерий Bacillus cereus В5 - продуцент нитрилгидратазы.
Заявляемый бактериальный штамм на основании таксономического изучения отнесен к виду Bacillus cereus. Это первый известный штамм вида Bacillus cereus, обладающий способностью преобразовывать нитрилы в амиды. Данный штамм обладает индуцибельной нитрилгидратазой, осуществляющей гидролиз алифатических нитрилов в амиды. Индукция нитрилгидратазы достигается при выращивании клеток Bacillus cereus В 5 на минеральной среде с ионами кобальта, содержащей в качестве индуктора нитрилы и амиды органических кислот, например, ацетонитрил или ацетамид, а в качестве источника углерода - глюкозу. Все компоненты среды являются коммерчески доступными соединениями, что особенно важно в случае промышленного использования штамма. Важным технологическим преимуществом использования штамма является высокая скорость роста и температурная стабильность фермента. Максимальная активность фермента наблюдается при 55oC.
Данный микроорганизм отличается быстрым ростом на простой органоминеральной среде при высокой активности нитрилгидратазы и простотой поддержания гомогенности культуры.
Штамм Bacillus cereus В5 может быть использован в биотехнологическом процессе получения амидов, в частности, акриламида.
Штамм характеризуется следующими культуральными, морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Культуральные свойства: при росте на мясопептонном агаре штамм проявляет грибовидный рост, образует бесцветные плоские колонии с ризойдным краем, поверхность матовая. При росте на мясопептонном бульоне образует пленку и осадок.
Морфологические признаки. Клетки грамположительные, подвижные, факультативно анаэробные, палочковидные, размеры 0,9-1,2 х 2,0-5,0 мкм, образуют термоустойчивые эндоспоры.
Физиологические свойства: штамм редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакция Фогес- Проскауэра положительная. Штамм оксидазокаталазоположительный, уреазоотрицательный. Растет при pH 6-9, оптимальное значение pH 7,2, при температуре 0-45oC, оптимальное значение температуры 34oC. Штамм дает кислую реакцию при росте на глюкозе, фруктозе, не образует кислоты из арабинозы и маннита. Гидролизует крахмал и казеин. В качестве источников азота использует соединения аммония и нитраты.
Чувствительность к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к хлорафениколу, бензилпенициллину, ампициллину, канамицину, мономицину, тетрациклину.
Патогенность: штамм не патогенный.
Изобретение описывает данный микроорганизм для использования в процессе гидратации различных нитрилосоединений и получения соответствующих амидосоединений, включая любой его мутант.
Культура используемого в данном изобретении штамма бактерий может быть получена на различных видах сред, включающие различные источники углерода и азота, органические и неорганические соли, которые широко используются для получения культуры обычных бактерий.
Ферментативную активность определяли с использованием в качестве субстратов нитрилов карбоновых кислот. За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество нитрилгидратазы, содержащейся в 1 мг сухого веса клеток, катализирующей образование 1 мкмоль амида в минуту (мкМ амид/мг сух.вес.•мин). Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Выделение штамма Bacillus cereus В5.
Заявляемый штамм был выделен из почвы. 1,0 г почвы вносили в 100 мл среды следующего состава (табл. 1).
Культивировали 3 суток при температуре 30oC и аэрации. 2 мл полученной суспензии вносили в 100 мл той же среды.
Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высевали на агаризированную среду (1,5% агар-агара) с теми же компонентами. После инкубации в течение 24-48 ч при 28-30oC, отбирали отдельные колонии и изучали их способность к трансформации акрилонитрила в акриламид. В результате был выделен штамм Bacillus cereus В5, обладающий нитрилгидратазной активностью.
Пример 2. Использование штамма Bacillus cereus В 5 для трансформации ацетонитрила в ацетамид.
Клетки культивировали в среде следующего состава, pH 7,2 (табл. 2).
Из реакционной среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности. Концентрацию клеток определяли фотометрически при длине волны 540 нм.
Активность нитрилгидратазы оценивали следующим образом.
1 мл культуральной жидкости центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, pH 7,2. Клетки ресуспендировали в том же буфере до значения оптической плотности 0,2-0,5 (А 540 нм). К 2 мл клеточной суспензии добавляли ацетонитрил в количестве 25 мкл. Реакцию проводили при 20oC в течение 10 мин, а затем останавливали добавлением 0,1 мл 1 н HCl. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию акриламида в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии.
Активность нитрилгидратазы в отношении ацетонитрила достигала 220 ед.
Пример 3. Использование штамма Bacillus cereus В5 для трансформации акрилонитрила в акриламид.
Штамм Bacillus cereus В5 подготавливали к процессу трансформации по примеру 2. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата добавляли акрилонитрил в количестве 25 мкл.
Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила достигала 200 ед.
Измерение активности в зависимости от времени роста клеток представлено в таблице 3. Очевидно, что штамм Bacillus cereus В 5 обладает более высокой скоростью роста и активностью, чем прототип.
Пример 4. Очистка культуры Bacillus cereus В5 от контаминации.
Полученный штамм Bacillus cereus В 5 культивировали в колбах Эрленмейера объемом 500 мл, содержащих по 150 мл среды состава, представленного в табл. 4.
При ОП540 суспензии 0,1 стерильность среды преднамеренно нарушали внесением 0,5 г почвы. Культивировали в течение 24 ч на ротационной качалке (120 об/мин) при 30oC. Затем колбу с культурой прогревали при 80oC в течение 15 мин. После этого продолжали культивирование при тех же условиях в течение 24 ч.
Образцы полученной таким образом культуры рассевали до отдельных колоний на агаризованную среду аналогичного состава и на мясопептонный агар. Во всех вариантах культура была гомогенной.
Пример 5. Влияние температуры на активность нитрилгидратазы штамма Bacillus cereus В5.
Бактерии Bacillus cereus В5 выращивали в течение 24 ч и подготавливали к трансформации по примеру 2. Образцы с реакционной смесью, содержащие 25 мкл акрилонитрила и 0,04 мг клеток по сухому весу в 2 мл 0,025 М фосфатного буфера, pH 7,6, инкубировали в течение 5 мин при различных температурах. Концентрацию образовавшегося в реакционной смеси акриламида определяли с помощью газожидкостной хроматографии. Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от температуры проведения реакции трансформации для заявляемого штамма представлено в табл. 5.
Таким образом, нитрилгидратаза из заявляемого штамма обладает удовлетворительной термостабильностью.
Заявляемый штамм может применяться для биотехнологического синтеза акриламида гидратацией акрилонитрила в водных растворах.
Список литературы
1. Brennan, B.A., Alms, G., Nelson, M.J., Dumey, L.T. and Scarrow, R.C. (1996b) Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J1 contains a non-corrin cobalt ion with two sulfur ligands. J. Am. Chem. Soc. 118, 9194-9195.
1. Brennan, B.A., Alms, G., Nelson, M.J., Dumey, L.T. and Scarrow, R.C. (1996b) Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J1 contains a non-corrin cobalt ion with two sulfur ligands. J. Am. Chem. Soc. 118, 9194-9195.
2. Nagamune, Т., Honda, J., Cho, W.D., Kamiya, N., Teratani, Y., Hirata, A., Sasabe, H. and Endo, I. (1991) Cristallization of a photosensitive nitrile hydratase from Rhodococcus sp. N-771. J. Mol. Biol. 220, 221-222.
3. Korf, M. -A., Honda, J., Teratani, Y., Kobayashi. Y., Nagamune, T., Sasabe, H., Hirata, A., Ambe, F. and Endo, I. (1992) Light- induced oxidation of iron atoms in a photosensitive nitrile hydratase. FEBS Lett. 301, 177- 180.
4. Nagasava, T. , Nanba, H., Ryuno, K. and Yamada, H. (1987) Nitrile hydratase of Pseudomonas chlororaphis B23. Purification and characterization. Eur. J. Biochem. 162, 691-698
5. Bonnet, D., Artaud, I., Petre, D. and Mansuy, D. (1996) Key role of alkanoic acids on the spectral properties, activity, and active-site stability of iron-containing nitrile hydratase from Brevibacterium R312. Eur. J. Biochem. 240, 239-244.
5. Bonnet, D., Artaud, I., Petre, D. and Mansuy, D. (1996) Key role of alkanoic acids on the spectral properties, activity, and active-site stability of iron-containing nitrile hydratase from Brevibacterium R312. Eur. J. Biochem. 240, 239-244.
6. Патент N 1731814 SU.
7. Патент N 05395758 US.
8. Патент N 1811698 SU.
9. Патент N 2112804 RU.
Claims (1)
- Штамм бактерий Bacillus cereus - продуцент нитрилгидратазы.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU99123771/13A RU2160778C1 (ru) | 1999-11-10 | 1999-11-10 | Штамм бактерий bacillus сereus-продуцент нитрилгидратазы |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU99123771/13A RU2160778C1 (ru) | 1999-11-10 | 1999-11-10 | Штамм бактерий bacillus сereus-продуцент нитрилгидратазы |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2160778C1 true RU2160778C1 (ru) | 2000-12-20 |
Family
ID=20226853
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU99123771/13A RU2160778C1 (ru) | 1999-11-10 | 1999-11-10 | Штамм бактерий bacillus сereus-продуцент нитрилгидратазы |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2160778C1 (ru) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2771828C2 (ru) * | 2014-09-17 | 2022-05-12 | Споуджен Байотек Инк. | Слитые белки, рекомбинантные бактерии и способы применения рекомбинантных бактерий |
US11882829B2 (en) | 2013-03-15 | 2024-01-30 | Spogen Biotech Inc. | Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants, and immobilizing bacillus spores on plants |
US11905315B2 (en) | 2014-09-17 | 2024-02-20 | Spogen Biotech Inc. | Fusion proteins, recombinant bacteria, and methods for using recombinant bacteria |
US12031164B2 (en) | 2017-09-20 | 2024-07-09 | Spogen Biotech Inc. | Fusion proteins, recombinant bacteria, and exosporium fragments for plant health |
-
1999
- 1999-11-10 RU RU99123771/13A patent/RU2160778C1/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11882829B2 (en) | 2013-03-15 | 2024-01-30 | Spogen Biotech Inc. | Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants, and immobilizing bacillus spores on plants |
RU2771828C2 (ru) * | 2014-09-17 | 2022-05-12 | Споуджен Байотек Инк. | Слитые белки, рекомбинантные бактерии и способы применения рекомбинантных бактерий |
US11905315B2 (en) | 2014-09-17 | 2024-02-20 | Spogen Biotech Inc. | Fusion proteins, recombinant bacteria, and methods for using recombinant bacteria |
US12031164B2 (en) | 2017-09-20 | 2024-07-09 | Spogen Biotech Inc. | Fusion proteins, recombinant bacteria, and exosporium fragments for plant health |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR0134094B1 (ko) | 아미드의 생물학적 제조방법 | |
O'Brien et al. | A rapid test for chitinase activity that uses 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-beta-D-glucosaminide | |
SU1512488A3 (ru) | Способ получени амида | |
Blakey et al. | Regio-and stereo-specific nitrile hydrolysis by the nitrile hydratase from Rhodococcus AJ270 | |
Nawaz et al. | Degradation of acetonitrile by Pseudomonas putida | |
RU2053300C1 (ru) | Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы | |
Willenbacher et al. | Foam-free production of Surfactin via anaerobic fermentation of Bacillus subtilis DSM 10 T | |
Singh et al. | Screening and characterization of microorganisms capable of producing antineoplastic drug, L-asparaginase | |
Azab et al. | Studies on uricase induction in certain bacteria | |
Babu et al. | Nitrile-metabolizing potential of Amycolatopsis sp. IITR215 | |
Pogorelova et al. | Cobalt-dependent transcription of the nitrile hydratase gene in Rhodococcus rhodochrous M8 | |
RU2160778C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus сereus-продуцент нитрилгидратазы | |
Nawaz et al. | Degradation of organic cyanides by Pseudomonas aeruginosa | |
NZ292559A (en) | Preparation of racemic alpha-substituted 4-methylthiobutyric acids by enzymatic hydrolysis | |
RU2196822C1 (ru) | Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы | |
JPH04304892A (ja) | グリシンの生物学的製造法 | |
JPH04365491A (ja) | 4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造法 | |
HU214125B (en) | Biotechnological process for preparing s-(+)-2,2-dimethyl cyclopropane-carboxamide | |
RU2223316C2 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ | |
RU2177034C1 (ru) | Штамм бактерий alcaligenes denitrificans-продуцент нитрилазы | |
Rahim et al. | A novel and quick plate assay for acetamidase producers and process optimization for its production by Aspergillus candidus | |
KR100355496B1 (ko) | 내열성 티로신 페놀리아제와 트립토파나아제를 생산하는신규한 고온성 공생 미생물 심비오박테리움 퇴비 sc-1및 그의 유사 미생물의 탐색방법 | |
KR20080099348A (ko) | 아미드의 미생물학적 제조 방법 | |
Shaini et al. | Optimization of Staphylococcus saprophyticus lipase isolated from windrow compost | |
JPH03277292A (ja) | 光学活性な2―ヒドロキシカルボン酸の製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20071111 |