RU2159776C2 - Reconstructed human antibodies specific for interleukin-8 - Google Patents

Reconstructed human antibodies specific for interleukin-8 Download PDF

Info

Publication number
RU2159776C2
RU2159776C2 RU97102034/13A RU97102034A RU2159776C2 RU 2159776 C2 RU2159776 C2 RU 2159776C2 RU 97102034/13 A RU97102034/13 A RU 97102034/13A RU 97102034 A RU97102034 A RU 97102034A RU 2159776 C2 RU2159776 C2 RU 2159776C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
human
chain
region
antibodies
dna
Prior art date
Application number
RU97102034/13A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU97102034A (en
Inventor
МАЦУСИМА Коудзи (JP)
Мацусима Коудзи
МАЦУМОТО Есихиро (JP)
Мацумото Есихиро
ЯМАДА Есики (JP)
Ямада Есики
САТО Кох (JP)
Сато Кох
ТСУТИЯ Масаюки (JP)
Тсутия Масаюки
ЯМАЗАКИ Тацуми (JP)
Ямазаки Тацуми
Original Assignee
Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Чугаи Сейяку Кабусики Кайся filed Critical Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Publication of RU97102034A publication Critical patent/RU97102034A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2159776C2 publication Critical patent/RU2159776C2/en

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

FIELD: immunology and biotechnology. SUBSTANCE: majority of reconstructed antibody comes from human antibody and CDR shows low antigenicity for human body. Reconstructed antibody is encoded by DNA sequence contained in expression vector. EFFECT: enabled use in therapy because of low antigenicity. 15 cl, 8 dwg, 5 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к определяющим комплементарность областям (CDR, гипервариабельным участкам) и вариабельным областям (V-участкам) мышиных моноклональных антител к человеческому интерлейкину-8 (ИЛ-8), к человеко/мышиным химерным антителам к человеческому ИЛ-8, а также к реконструированным человеческим антителам, причем области, определяющие комплементарность вариабельной области человеческой легкой цепи (L-цепи) и вариабельной области тяжелой цепи (H-цепи) человека замещены CDR мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8. Кроме того, данное изобретение представляет ДНК, которая кодирует вышеупомянутое антитело и его части. Данное изобретение также относится к вектору, который содержит вышеупомянутую ДНК, и более конкретно, экспрессии вектора и клетке-хозяину, трансформированной указанным вектором. Кроме того, данное изобретение представляет процесс получения реконструированного человеческого антитела к ИЛ-8, а также к процессу получения химерных антител к человеческому ИЛ-8. The invention relates to complementarity determining regions (CDRs, hypervariable regions) and variable regions (V regions) of murine monoclonal antibodies to human interleukin-8 (IL-8), to human / mouse chimeric antibodies to human IL-8, as well as to reconstructed human antibodies, the regions determining the complementarity of the variable region of the human light chain (L chain) and the variable region of the heavy chain (H chain) of a person are replaced by CDRs of murine monoclonal antibodies to human IL-8. In addition, the present invention provides DNA that encodes the aforementioned antibody and parts thereof. The present invention also relates to a vector that contains the aforementioned DNA, and more specifically, expression of a vector and a host cell transformed with said vector. In addition, this invention provides a process for producing a reconstructed human anti-IL-8 antibody, as well as a process for producing chimeric anti-human IL-8 antibodies.

Интерлейкин-8 (ИЛ-8) был открыт в культуре супернатанта моноцитов, стимулированных липополисахаридом (ЛПС), и является хемокином, известным так же как продуцируемый моноцитами фактор хемотаксиса нейтрофилов (ПМФХН) или активирующий нейтрофилы протеин-1 (АНП-1). ИЛ-8 продуцируется разными клетками, действует на нейтрофильные гранулоциты и лимфоциты и обладает активностью, которая вызывает хемотаксис по градиенту его концентрации. К тому же он не только индуцирует хемотаксис у нейтрофилов, но также активирует функции нейтрофилов, такие как дегрануляция, выделение пероксидов и усиление адгезии на эндотелиальных клетках. Interleukin-8 (IL-8) was discovered in the culture of supernatant of monocytes stimulated by lipopolysaccharide (LPS), and is a chemokine, also known as monocyte-produced neutrophil chemotaxis factor (PMPC) or neutrophil activating protein-1 (ANP-1). IL-8 is produced by different cells, acts on neutrophilic granulocytes and lymphocytes and has an activity that causes chemotaxis along the gradient of its concentration. In addition, it not only induces chemotaxis in neutrophils, but also activates the functions of neutrophils, such as degranulation, release of peroxides and increased adhesion to endothelial cells.

При воспалительных заболеваниях, и более конкретно, при респираторных заболеваниях, таких как легочный муковисцидоз, идиопатический легочный фиброз, респираторный дистресс-синдром взрослых, саркоидоз и эмпиема, а также при кожных заболеваниях, таких как псориаз, и при хроническом ревматоидном артрите, болезни Крона и язвенном колите, наблюдается патологическая инфильтрация лейкоцитов в месте воспаления при этих заболеваниях. Кроме того, ИЛ-8 обнаруживается в исследуемых пробах от пациентов с этими заболеваниями, что наводит на мысль о том, что ИЛ-8 может играть центральную роль в воспалении (McElvaney, N.G. et al., J. Clin. Invest., 90, 1296-1301, 1992; Lynch III, J. P. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 145, 1433-1439, 1992; Donnelly, S. C. et al., Lancet, 341, 643-647, 1993; Car, B.D. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Mеd., 149, 655-659, 1994; Antony, V.В. et al., J. Immunol. , 151, 7216-7223, 1993; Takematsu, H. et al., Arch. Denmatol., 129, 74-80, 1993; Brennan, F.M. et al., Eur. J. Immunol., 20, 2141- 2144, 1990; Izzo, R. S. et al., Scand. J. Gastroenterol., 28, 296-300, 1993; Izzo, R.S. et al., Am. J. Gastroenterol., 87, 1447-1452, 1992). In inflammatory diseases, and more specifically in respiratory diseases such as pulmonary cystic fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, adult respiratory distress syndrome, sarcoidosis and empyema, as well as skin diseases such as psoriasis, and chronic rheumatoid arthritis, Crohn’s disease and ulcerative colitis, there is a pathological leukocyte infiltration at the site of inflammation in these diseases. In addition, IL-8 is found in test samples from patients with these diseases, suggesting that IL-8 may play a central role in inflammation (McElvaney, NG et al., J. Clin. Invest., 90, 1296-1301, 1992; Lynch III, JP et al., Am. Rev. Respir. Dis., 145, 1433-1439, 1992; Donnelly, SC et al., Lancet, 341, 643-647, 1993; Car, BD et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 149, 655-659, 1994; Antony, V. B. et al., J. Immunol., 151, 7216-7223, 1993; Takematsu, H. et al., Arch. Denmatol., 129, 74-80, 1993; Brennan, FM et al., Eur. J. Immunol., 20, 2141-2144, 1990; Izzo, RS et al., Scand. J. Gastroenterol., 28, 296-300, 1993; Izzo, RS et al., Am. J. Gastroenterol., 87, 1447-1452, 1992).

Вслед за иммунизацией мышей человеческим ИЛ-8 в качестве антигена Ко Y-C., et al. получили мышиные моноклональные антитела WS-4, которые связываются с человеческим ИЛ-8 и подавляют связывание человеческого ИЛ-8 с нейтрофилами в результате этого связывания, и именно это нейтрализует биологическую активность, которой обладает ИЛ-8. Было четко показано, что изотопы мышиных моноклональных антител WS-4 состоят из к-типа L цепи и Cγ1-типа H цепи (J. Immunol. Methods, 149, 227-235, 1992). Following immunization of mice with human IL-8 as a Co antigen, Y-C., Et al. received mouse monoclonal antibodies WS-4, which bind to human IL-8 and inhibit the binding of human IL-8 to neutrophils as a result of this binding, and this neutralizes the biological activity that IL-8 possesses. It has been clearly shown that the isotopes of WS-4 murine monoclonal antibodies consist of a k-type L chain and a Cγ1-type H chain (J. Immunol. Methods, 149, 227-235, 1992).

Известные примеры антител к человеческому ИЛ-8, кроме WS-4, включают А. 5.12.14 (Boylan, A.M. et al., J. Clin. Invest., 89, 1257-1267, 1992), антитела анти-Рер-1 и антитела анти-Рер-3, раскрытые в международных патентных заявках N WO 92-04372 и DM/C7 (Mulligan, M.S. et al., J. Immunol., 150, 5585-5595, 1993). Well-known examples of antibodies to human IL-8, in addition to WS-4, include A. 5.12.14 (Boylan, AM et al., J. Clin. Invest., 89, 1257-1267, 1992), anti-Pep-1 antibodies and anti-Pep-3 antibodies disclosed in international patent applications N WO 92-04372 and DM / C7 (Mulligan, MS et al., J. Immunol., 150, 5585-5595, 1993).

Было также обнаружено с помощью введения мышиных моноклональных антител WS-4 на экспериментальной модели с использованием кроликов, что инфильтрация нейтрофилов подавляется при ишемическом и реперфузионном поражении легких (Sekido N., et al., Nature, 365, 654-657, 1993), индуцируемом ЛПС дерматите (Harada A. , et al., Internatl. Immunol., 5, 681-690, 1993) и индуцируемом ЛПС или интерлейкином-1 (ИЛ-1) артрите (Akahoshi Т., et al., Lymphokine Cytoline Res., 13, 113-116, 1994). It was also found by the administration of murine monoclonal antibodies WS-4 in an experimental rabbit model that neutrophil infiltration is suppressed by ischemic and reperfusion lung injury (Sekido N., et al., Nature, 365, 654-657, 1993), induced LPS dermatitis (Harada A., et al., Internatl. Immunol., 5, 681-690, 1993) and induced LPS or interleukin-1 (IL-1) arthritis (Akahoshi T., et al., Lymphokine Cytoline Res. 13, 113-116, 1994).

Гомолог человеческого ИЛ-8 существует у кроликов и называется кроличьим ИЛ-8. Так как было четко показано, что мышиные моноклональные антитела WS-4 перекрестно реагируют с кроличьим ИЛ-8, и что антитела подавляют связывание кроличьего ИЛ-8 с кроличьими нейтрофилами (Harada А., et al., Internatl. Immunol., 5, 681-690, 1993), эти данные наводят на мысль о том, что антитела к человеческому ИЛ-8 должны быть полезны в качестве терапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний у людей. A homologue of human IL-8 exists in rabbits and is called rabbit IL-8. Since it has been clearly shown that murine monoclonal antibodies WS-4 cross-react with rabbit IL-8, and that antibodies inhibit the binding of rabbit IL-8 to rabbit neutrophils (Harada A., et al., Internatl. Immunol., 5, 681 -690, 1993), these data suggest that antibodies to human IL-8 should be useful as a therapeutic agent for the treatment of inflammatory diseases in humans.

Моноклональные антитела, происходящие от других млекопитающих, а не от человека, проявляют высокую степень иммуногенности (также называемую антигенностью) у людей. По этой причине даже если мышиные антитела вводятся людям, в результате того, что они метаболизируются как чужеродное вещество, период полувыведения мышиных антител у людей относительно короток, что таким образом предотвращает соответствующее проявление нежелательных эффектов. Кроме того, человеческие антимышиные антитела, которые продуцируются в ответ на введенные мышиные антитела, вызывают иммунный ответ, который некомфортабелен и опасен для больного, примеры чего включают сывороточную болезнь и другие аллергические реакции. По этой причине мышиные антитела нельзя часто вводить людям. Monoclonal antibodies originating from other mammals, and not from humans, exhibit a high degree of immunogenicity (also called antigenicity) in humans. For this reason, even if murine antibodies are administered to humans, as a result of the fact that they are metabolized as a foreign substance, the half-life of murine antibodies in humans is relatively short, which thus prevents the corresponding manifestation of undesirable effects. In addition, human anti-mouse antibodies, which are produced in response to the introduced mouse antibodies, elicit an immune response that is uncomfortable and dangerous for the patient, examples of which include serum sickness and other allergic reactions. For this reason, murine antibodies cannot often be administered to humans.

Чтобы разрешить эти проблемы, был разработан процесс получения очеловеченного антитела. Мышиные антитела могут быть очеловечены двумя способами. Более простой способ включает продукцию химерных антител, у которых вариабельная область (V область) происходит из исходного мышиного моноклонального антитела, а константная область (С область) происходит из подходящего человеческого антитела. Так как получающиеся в результате химерные антитела содержат вариабельную область мышиного антитела в ее полной форме, они обладают специфичностью, идентичной специфичности исходных мышиных антител, и можно ожидать, что они будут связывать антиген. To solve these problems, a process has been developed to obtain humanized antibodies. Mouse antibodies can be humanized in two ways. A simpler method involves the production of chimeric antibodies in which the variable region (V region) originates from the original murine monoclonal antibody, and the constant region (C region) originates from a suitable human antibody. Since the resulting chimeric antibodies contain the variable region of the murine antibody in its full form, they have a specificity identical to that of the original murine antibodies, and it can be expected that they will bind the antigen.

Кроме того, так как пропорция протеиновых последовательностей, происходящих от другого животного, а не человека, в химерных антителах существенно снижена по сравнению с исходными мышиными антителами, предсказывается, что они обладают меньшей иммуногенностью по сравнению с исходными мышиными антителами. Хотя химерные антитела хорошо связываются с антигеном и обладают низкой иммуногенностью, однако все еще остается возможность появления иммунного ответа на мышиную вариабельную область (LoBuglio A.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989). In addition, since the proportion of protein sequences originating from another animal, rather than humans, in chimeric antibodies is significantly reduced compared to the original murine antibodies, it is predicted that they have less immunogenicity compared to the original murine antibodies. Although chimeric antibodies bind well to the antigen and have low immunogenicity, there is still the possibility of an immune response to the murine variable region (LoBuglio AF, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989) .

Хотя второй способ очеловечивания мышиных антител более сложен, латентная иммуногенность мышиных антител снижается значительно. При этом способе только гипервариабельная область (CDR) пересаживается из вариабельной области мышиных антител в человеческую вариабельную область для создания реконструированной человеческой вариабельной области. Однако, чтобы еще больше приблизить строение CDR реконструированной человеческой вариабельной области к строению исходного мышиного антитела, бывают обстоятельства, при которых может быть необходимо пересадить часть протеиновой последовательности структурной области (FR), несущей CDR из вариабельной области мышиного антитела, на человеческую вариабельную область. Although the second method of humanizing murine antibodies is more complex, the latent immunogenicity of murine antibodies is significantly reduced. In this method, only the hypervariable region (CDR) is transplanted from the variable region of murine antibodies to the human variable region to create a reconstructed human variable region. However, in order to further approximate the CDR structure of the reconstructed human variable region to the structure of the original murine antibody, there are circumstances in which it may be necessary to transfer a portion of the protein sequence of the structural region (FR) carrying the CDR from the variable region of the murine antibody to the human variable region.

Затем эти реконструированные человеческие вариабельные области связываются с человеческой константной областью. Эти части, происходящие из нечеловеческих протеиновых последовательностей, состоят в очеловеченном антителе только из CDR и очень незначительной части CO. CDR состоит из гипервариабельных протеиновых последовательностей, и они не проявляют видовой специфичности. По этой причине реконструированные человеческие антитела, которые содержат мышиные CDR, не должны обладать иммуногенностью, большей, чем иммуногенность природных человеческих антител, содержащих человеческие CDR. Then, these reconstructed human variable regions bind to the human constant region. These parts, originating from non-human protein sequences, consist in a humanized antibody of only CDR and a very small part of CO. CDR consists of hypervariable protein sequences and they do not exhibit species specificity. For this reason, reconstructed human antibodies that contain murine CDRs should not have an immunogenicity greater than the immunogenicity of natural human antibodies containing human CDRs.

Дополнительные детали, касающиеся реконструированных человеческих антител, можно найти, обратившись к Riechmann L., et al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeyen M., et al., 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, С.-A. et al. Protein Eng. , 4, 773-783, 1991; Maeda, H. et al., Hum. Antibodies Hybridomas, 2, 124-134, 1991; Gorman, S.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P.R. et al., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M.S. et al., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; and, Sato, К. et al., Cancer Res. , 53, 851-856, 1993. Additional details regarding reconstructed human antibodies can be found by contacting Riechmann L., et al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeyen M., et al., 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, S.-A. et al. Protein Eng. 4, 773-783, 1991; Maeda, H. et al., Hum. Antibodies Hybridomas, 2, 124-134, 1991; Gorman, S.D. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P.R. et al., Bio / Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M. S. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M.S. et al., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; and, Sato, K. et al., Cancer Res. 53, 851-856, 1993.

Как изложено выше, хотя реконструированные человеческие антитела, как предсказано, будут применимы в целях терапии, неизвестны реконструированные человеческие антитела к человеческому ИЛ-8. Кроме того, не существует стандартных процессов, которые могут универсально применяться в отношении произвольных антител для получения реконструированных человеческих антител. Таким образом, необходимы различные ухищрения для того, чтобы создать реконструированные человеческие антитела, которые проявляют достаточную связывающую активность и/или нейтрализующую активность в отношении конкретного антигена (например, Sato К., et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1933). Данное изобретение представляет антитела к человеческому ИЛ-8, обладающие низкой степенью иммуногенности. As described above, although reconstructed human antibodies are predicted to be applicable for therapeutic purposes, reconstructed human antibodies to human IL-8 are unknown. In addition, there are no standard processes that can be universally applied to arbitrary antibodies to produce reconstructed human antibodies. Thus, various tricks are needed in order to create reconstructed human antibodies that exhibit sufficient binding activity and / or neutralizing activity against a particular antigen (e.g., Sato K., et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1933). The present invention provides antibodies to human IL-8 with a low degree of immunogenicity.

Данное изобретение представляет реконструированные человеческие антитела к человеческому ИЛ-8. Данное изобретение также представляет человеческо/мышиные химерные антитела, которые применимы в процессе продукции указанных человеческих антител. Кроме того, данное изобретение также представляет фрагмент реконструированного человеческого антитела. Дополнительно данное изобретение представляет систему экспрессии для продукции химерных антител и реконструированных человеческих антител и их фрагментов. Кроме того, данное изобретение также представляет процесс получения химерных антител к человеческому ИЛ-8 и их фрагментов, а также процесс получения реконструированных человеческих антител к человеческому ИЛ-8 и их фрагментов. The present invention provides reconstructed human antibodies to human IL-8. The invention also provides human / mouse chimeric antibodies that are useful in the production process of said human antibodies. In addition, the present invention also provides a fragment of a reconstructed human antibody. Additionally, the present invention provides an expression system for the production of chimeric antibodies and reconstructed human antibodies and fragments thereof. In addition, this invention also provides a process for producing chimeric antibodies to human IL-8 and fragments thereof, as well as a process for producing reconstructed human antibodies to human IL-8 and fragments thereof.

Более конкретно, данное изобретение представляет:
1) V область L цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому ИЛ-8 и
2) V область H цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому ИЛ-8.More specifically, this invention provides:
1) V region L chain of mouse monoclonal antibodies to human IL-8 and
2) V region H chain of a murine monoclonal antibody to human IL-8.

Кроме того, данное изобретение представляет:
1) L цепь, содержащую С область человеческой L цепи и V область L цепи мышиного моноклонального антитела к ИЛ-8 и
2) H цепь, содержащую С область человеческой H цепи и V область H цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому ИЛ-8.In addition, this invention provides:
1) the L chain containing the C region of the human L chain and the V region of the L chain of the murine monoclonal antibody to IL-8 and
2) the H chain containing the C region of the human H chain and the V region H region of the mouse monoclonal antibody to human IL-8.

Кроме того, данное изобретение также представляет химерные антитела к человеческому ИЛ-8, состоящие из:
1) L цепей, причем каждая включает человеческую С область L цепи и V область L цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому ИЛ-8 и
2) H цепей, причем каждая содержит С область человеческой H цепи и V область H цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому ИЛ-8.In addition, this invention also provides chimeric antibodies to human IL-8, consisting of:
1) L chains, each comprising a human C region L chain and V region L chain of a murine monoclonal antibody to human IL-8, and
2) H chains, each containing the C region of the human H chain and the V region H region of the mouse monoclonal antibody to human IL-8.

Кроме того, данное изобретение представляет:
1) V область L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8 и
2) V область H цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8.In addition, this invention provides:
1) V region L chain of mouse monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8 and
2) V region H chain of mouse monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8.

Кроме того, данное изобретение также представляет:
1) L цепь, содержащую С область человеческой L цепи и V область L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8 и
2) H цепь, содержащую С область человеческой H цепи и V область H цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8.In addition, this invention also provides:
1) the L chain containing the C region of the human L chain and the V region of the L chain of mouse monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8 and
2) H chain containing the C region of the human H chain and the V region of the H chain of murine monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8.

Дополнительно данное изобретение представляет химерные антитела к человеческому ИЛ-8, состоящие из:
1) L цепей, причем каждая включает С область человеческой L цепи и V область L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8 и
2) H цепей, причем каждая включает С область человеческой H цепи и V область H цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8.Additionally, this invention provides chimeric antibodies to human IL-8, consisting of:
1) L chains, each of which includes the C region of the human L chain and the V region of the L chain of mouse monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8 and
2) H chains, each comprising the C region of the human H chain and the V region of the H chain of murine monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8.

Кроме того, данное изобретение представляет:
1) CDR V области L цепи моноклональных антител к человеческому ИЛ-8 и
2) CDR V области H цепи моноклональных антител к человеческому ИЛ-8.In addition, this invention provides:
1) CDR V region L of the chain of monoclonal antibodies to human IL-8 and
2) CDR V region H chain of monoclonal antibodies to human IL-8.

Кроме того, данное изобретение также представляет:
1) CDR V области L цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8 и
2) CDR V области H цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8.In addition, this invention also provides:
1) CDR V region L of the chain of murine monoclonal antibodies to human IL-8 and
2) CDR V region H of the chain of murine monoclonal antibodies to human IL-8.

Кроме того, данное изобретение также представляет реконструированную V область человеческой L цепи антитела к человеческому ИЛ-8, состоящую из:
1) структурных областей (FR) V области человеческой L цепи и
2) CDR V области L цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8;
а также как реконструированную V область H цепи антител к человеческому ИЛ-8, состоящую из:
1) FR V области H цепи и
2) CDR V области H цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8.In addition, this invention also provides a reconstructed V region of the human L chain of an anti-human IL-8 antibody, consisting of:
1) structural regions (FR) of the V region of the human L chain and
2) CDR V region L of the chain of murine monoclonal antibodies to human IL-8;
as well as a reconstructed V region H chain of antibodies to human IL-8, consisting of:
1) FR V region H chain and
2) CDR V region H of the chain of murine monoclonal antibodies to human IL-8.

Кроме того, данное изобретение представляет реконструированную человеческую L цепь антитела к человеческому ИЛ-8, состоящую из:
1) С области человеческой L цепи и
2) V области L цепи, состоящей из FR человеческой L цепи и CDR L цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8;
а также в виде реконструированной H цепи антитела к человеческому ИЛ-8, состоящей из:
1) C области человеческой H цепи и
2) V области H цепи, состоящей из FR человеческой H цепи и CDR H цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8.In addition, this invention provides a reconstructed human L chain of an anti-human IL-8 antibody, consisting of:
1) From the area of the human L chain and
2) V region of the L chain, consisting of FR human L chain and CDR L chain of murine monoclonal antibodies to human IL-8;
as well as in the form of a reconstructed H chain of antibodies to human IL-8, consisting of:
1) C region of the human H chain and
2) V region of the H chain, consisting of the FR of the human H chain and the CDR H chain of murine monoclonal antibodies to human IL-8.

Кроме того, данное изобретение также представляет реконструированное человеческое антитело к человеческому ИЛ-8, состоящее из:
(A) L цепей, причем каждая включает:
1) человеческую С область L цепи и
2) V область L цепи, содержащую FR человеческой L цепи и CDR L цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8;
а также
(Б) H цепей, причем каждая включает:
1) человеческую С область H цепи и
2) V область H цепи, содержащую FR человеческой H цепи и CDR H цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8.In addition, this invention also provides a reconstructed human anti-human IL-8 antibody, consisting of:
(A) L chains, each including:
1) human C region L chain and
2) the V region of the L chain containing the FR of the human L chain and CDR L chains of murine monoclonal antibodies to human IL-8;
and
(B) H chains, each of which includes:
1) human C region H chain and
2) V region H chain containing FR of the human H chain and CDR H chain of murine monoclonal antibodies to human IL-8.

Более конкретно, данное изобретение представляет:
1) CDR V области L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8, имеющие следующие последовательности или их часть:
CDR1: Arg Ala Ser Glu Ile Ile Туг Ser Туг Leu Ala
CDR2: Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
CDR3: Gin His His Phe Gly Phe Pro Arg Thr
а также
2) CDR V области H цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8, имеющие следующие последовательности или их часть:
CDR1: Asp Туг Туг Leu Ser
CDR2: Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly
CDR3: Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu Ala Tyr
Кроме того, данное изобретение представляет реконструированную V область L цепи антитела к человеческому ИЛ-8, включающую:
1) структурные участки (FR) V области L цепи и
2) CDR V области L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8;
а также реконструированную V область человеческой H цепи антител к человеческому ИЛ-8, состоящую из:
1) FR V области H цепи; и
2) CDR V области H цепи моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8.More specifically, this invention provides:
1) CDR V region L of the chain of mouse monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8, having the following sequences or part thereof:
CDR1: Arg Ala Ser Glu Ile Ile Tug Ser Tug Leu Ala
CDR2: Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
CDR3: Gin His His Phe Gly Phe Pro Arg Thr
and
2) CDR V region H of the chain of mouse monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8, having the following sequences or part of them:
CDR1: Asp Tug Tug Leu Ser
CDR2: Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly
CDR3: Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu Ala Tyr
In addition, this invention provides a reconstructed V region L chain of an anti-human IL-8 antibody, comprising:
1) structural sections (FR) of the V region of the L chain and
2) CDR V region L of the chain of murine monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8;
as well as the reconstructed V region of the human H chain of antibodies to human IL-8, consisting of:
1) FR V region H chain; and
2) CDR V region H chain of monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8.

Кроме того, данное изобретение представляет реконструированную человеческую L цепь антитела к человеческому ИЛ-8, состоящую из:
1) человеческой С области L цепи и
2) V области L цепи, состоящей из FR человеческой L цепи и CDR L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8;
а также реконструированную человеческую H цепь антитела к человеческому ИЛ-8, состоящую из:
1) человеческой С области H цепи и
2) V области H цепи, включающей FR человеческой H цепи и CDR H цепи моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8.In addition, this invention provides a reconstructed human L chain of an anti-human IL-8 antibody, consisting of:
1) human C region L chain and
2) V region of the L chain, consisting of the FR of the human L chain and CDR L of the mouse monoclonal antibody WS-4 to human IL-8;
as well as a reconstructed human H chain antibody to human IL-8, consisting of:
1) human C region H chain and
2) V region of the H chain, including FR of the human H chain and CDR H chain of monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8.

К тому же данное изобретение также представляет реконструированное человеческое антитело к человеческому ИЛ-8, состоящее из
(A) L цепей, причем каждая включает:
1) С область человеческой L цепи и
2) V область L цепи, состоящую из FR человеческой L цепи и CDR L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8, и
(Б) H цепей, причем каждая включает:
1) С область H цепи и
2) V область H цепи, состоящую из FR человеческой H цепи и CDR H цепи мышиного моноклонального антитела WS-4 к человеческому ИЛ-8.In addition, this invention also provides a reconstructed human anti-human IL-8 antibody, consisting of
(A) L chains, each including:
1) C region of the human L chain and
2) the V region of the L chain, consisting of the FR of the human L chain and CDR L of the mouse monoclonal antibody WS-4 to human IL-8, and
(B) H chains, each of which includes:
1) C region H chain and
2) V region of the H chain, consisting of the FR of the human H chain and the CDR H chain of the mouse monoclonal antibody WS-4 to human IL-8.

Примеры вышеупомянутых FR человеческой L цепи включают такие, которые имеют аминокислотные последовательности A или их часть, представленные в конце описания. Examples of the aforementioned human L chain FR include those that have amino acid sequences A or part thereof, presented at the end of the description.

Примеры вышеупомянутых FR человеческой H цепи включают те, которые имеют аминокислотные последовательности Б или их часть, представленные в конце описания. Examples of the aforementioned human H chain FR include those that have amino acid sequences B or part thereof, presented at the end of the description.

Дополнительно данное изобретение также касается ДНК, которая кодирует полипептид, включенный в вышеуказанные различные антитела, и ее фрагментов. Данное изобретение также относится к вектору, который содержит вышеупомянутую ДНК, примером которого является вектор экспрессии. Кроме того, данное изобретение представляет собой клетку-хозяина, которая трансформируется вышеупомянутым вектором. Additionally, this invention also relates to DNA that encodes a polypeptide included in the above various antibodies, and its fragments. This invention also relates to a vector that contains the aforementioned DNA, an example of which is an expression vector. In addition, this invention is a host cell that is transformed by the aforementioned vector.

Кроме того, данное изобретение также представляет процесс получения химерных антител к человеческому ИЛ-8 и его фрагментов, а также процесс получения реконструированных человеческих антител к человеческому ИЛ-8 и их фрагментов. In addition, this invention also provides a process for producing chimeric antibodies to human IL-8 and its fragments, as well as a process for producing reconstructed human antibodies to human IL-8 and their fragments.

Фиг. 1 показывает векторы экспрессии HEF-VL-gк и HEF-VH-gγ1, содержащие промотор/энхансер человеческого фактора элонгации 1α(HEF-1α), которые применимы для экспрессии L цепи и H цепи, соответственно, антител данного изобретения. FIG. 1 shows the expression vectors of HEF-VL-gk and HEF-VH-gγ1 containing the promoter / enhancer of the human elongation factor 1α (HEF-1α), which are applicable for the expression of the L chain and H chain, respectively, of the antibodies of the present invention.

Фиг. 2 является графиком, показывающим результаты ELISA по подтверждению способности связывания с человеческим ИЛ-8 химерного антитела WS-4 (chL/chH) данного изобретения, секретируемого в культуральную среду клетками COS. FIG. 2 is a graph showing ELISA results for confirming the binding ability of human chimeric antibody WS-4 (chL / chH) of the present invention secreted into the culture medium by COS cells to human IL-8.

Фиг. 3 является диаграммой конструирования ДНК, которая кодирует аминокислотные последовательности каждого из первой версии "a" (RVHa) V области H цепи реконструированного человеческого антитела WS-4 данного изобретения (А) и первой версии "a" (RVLa) V области L цепи реконструированного человеческого антитела WS-4 (В). FIG. 3 is a DNA construction diagram that encodes the amino acid sequences of each of the first version “a” (RVHa) V of region H of the reconstructed human antibody WS-4 of the present invention (A) and the first version of “a” (RVLa) V of region L of the reconstructed human antibodies WS-4 (B).

Фиг. 4 является графиком, показывающим результаты ELISA по сравнению способности связывания с человеческим ИЛ-8 V области L цепи (RVLa) и V области H цепи (RVHa) реконструированных человеческих антител WS-4 данного изобретения в комбинации с, соответственно, V областью H цепи химерных антител WS-4 (chH) и V областью L цепи химерных антител WS-4 (chL), экспрессируемых в клетках COS, со способностью связывания химерных антител WS-4 (chL/chH) данного изобретения, секретируемых в культуральную среду клеток COS. FIG. 4 is a graph showing ELISA results comparing the ability of binding to human IL-8 of V region L chain (RVLa) and V region H chain (RVHa) of the reconstituted human WS-4 antibodies of the present invention in combination with chimeric V region H chain WS-4 antibodies (chH) and V region L of the chain of WS-4 chimeric antibodies (chL) expressed in COS cells with the ability of the invention to bind the WS-4 chimeric antibodies (chL / chH) secreted into the culture medium of COS cells.

Фиг. 5 является графиком, показывающим результаты ELISA по сравнению способности связывания с человеческим ИЛ-8 8 типов реконструированных человеческих антител WS-4, содержащих RVLa данного изобретения (RVLa/RVHa, RVLa/RVHb, RVLa/RVHc, RVLa/RVHd, RVLa/RVHe, RVLa/RVHf, RVLa/RVHg и RVLa/RVHh), секретируемых в культуральную среду клеток COS. FIG. 5 is a graph showing ELISA results comparing the binding ability of human IL-8 to 8 types of reconstituted human WS-4 antibodies containing RVLa of the present invention (RVLa / RVHa, RVLa / RVHb, RVLa / RVHc, RVLa / RVHd, RVLa / RVHe, RVLa / RVHf, RVLa / RVHg and RVLa / RVHh) secreted into the culture medium of COS cells.

Фиг. 6 является графиком, показывающим результаты ELISA по сравнению способности связывания с человеческим ИЛ-8 8 типов реконструированных человеческих антител WS-4, содержащих вторую версию RVLb данного изобретения (RVLb/RVHa, RVLb/RVHb, RVLb/RVRc, RVLb/RVHe, RVLb/RVHf, RVLb/RVHg и RVLb/RVHh), продуцируемых в культуральный супернатант клеток COS, со способностью связывания химерных антител WS-4 (chL/chH) данного изобретения, секретируемых в культуральную среду клеток COS. FIG. 6 is a graph showing ELISA results comparing the binding ability of human IL-8 to 8 types of reconstituted human WS-4 antibodies containing the second version of the RVLb of the present invention (RVLb / RVHa, RVLb / RVHb, RVLb / RVRc, RVLb / RVHe, RVLb / RVHf, RVLb / RVHg and RVLb / RVHh) produced in the culture supernatant of COS cells with the ability to bind the chimeric antibodies WS-4 (chL / chH) of the present invention secreted into the culture medium of COS cells.

Фиг. 7 является графиком, показывающим результаты ELISA по сравнению способности связывания с человеческим ИЛ-8 очищенных реконструированных человеческих антител WS-4 RVLa/RVHg и RVLb/RVHg данного изобретения и очищенных химерных антител WS-4 (chL/chH) данного изобретения. FIG. 7 is a graph showing ELISA results comparing human IL-8 binding ability of purified reconstituted human antibodies WS-4 RVLa / RVHg and RVLb / RVHg of the present invention and purified chimeric antibodies of WS-4 (chL / chH) of the present invention.

Фиг. 8 является графиком, показывающим результаты исследований подавления связывания лигандных рецепторов по сравнению способности подавлять связывание ИЛ-8 с рецепторами к ИЛ-8 очищенных реконструированных человеческих антител RVLa/RVHg и RVLb/RVHg данного изобретения со способностью подавления связывания мышиных антител WS-4 и химерных антител WS-4 (chL/chH) данного изобретения. FIG. 8 is a graph showing the results of ligand receptor binding suppression studies compared to the ability to inhibit the binding of IL-8 to IL-8 receptors of the purified reconstituted human RVLa / RVHg and RVLb / RVHg antibodies of the present invention with the ability to inhibit the binding of mouse antibodies WS-4 and chimeric antibodies WS-4 (chL / chH) of the present invention.

Клонирование ДНК, кодирующей мышиную V область
Чтобы клонировать ген, который кодирует V область мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8, необходимо получить гибридому, которая продуцирует мышиные моноклональные антитела к человеческому ИЛ-8, для получения такого гена. После извлечения мРНК из гибридомы мРНК превращали в однонитевую кДНК известными методами с последующей амплификацией целевой ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) для получения гена. Примером источника этого гена является гибридома WS-4, которая продуцирует мышиные моноклональные антитела к человеческому ИЛ-8, полученному Ко Y.C., et al. Процесс получения этой гибридомы описан в J. Immunol. Methods, 149, 227-235, 1992, и далее описан в качестве справочного примера 1.Cloning of DNA encoding a murine V region
In order to clone a gene that encodes the V region of murine monoclonal antibodies to human IL-8, it is necessary to obtain a hybridoma that produces murine monoclonal antibodies to human IL-8 to obtain such a gene. After extracting the mRNA from the hybridoma, the mRNA was converted into single-stranded cDNA by known methods, followed by amplification of the target DNA using polymerase chain reaction (PCR) to obtain the gene. An example of the source of this gene is the WS-4 hybridoma, which produces murine monoclonal antibodies to human IL-8, obtained by Co YC, et al. The process for producing this hybridoma is described in J. Immunol. Methods, 149, 227-235, 1992, and further described as reference example 1.

1) Извлечение всей ДНК
Для клонирования целевой ДНК, которая кодирует V область мышиных моноклональных антител к ИЛ-8, всю РНК можно получить путем разрушения клеток гибридомы с помощью обработки тиоцианатом гуанидина и проведения центрифугирования в градиенте плотности на основе хлорида цезия (Chirgwin J.M., et al. , Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979). Кроме того, можно также использовать другие методы, которые применяются при клонировании генов, такие как те, при которых производятся обработка детергентом и обработка фенолом в присутствии ингибитора рибонуклеазы (РНКазы), такого, как ванадиевый комплекс (Berger S. L., et al., Biochemistry, 18, 5143-5149, 1979).1) Extraction of all DNA
To clone a target DNA that encodes the V region of murine monoclonal anti-IL-8 antibodies, all RNA can be obtained by disrupting hybridoma cells by treatment with guanidine thiocyanate and density gradient centrifugation based on cesium chloride (Chirgwin JM, et al., Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979). In addition, you can also use other methods that are used in the cloning of genes, such as those that are treated with detergent and phenol in the presence of a ribonuclease inhibitor (RNase), such as a vanadium complex (Berger SL, et al., Biochemistry, 18, 5143-5149, 1979).

2) Синтез кДНК
Затем можно получить однонитевую кДНК, комплементарную мРНК путем обработки всей РНК обратной транскриптазой с использованием олиго(dТ), олигонуклеотида, комплементарного поли(А)-хвосту, расположенному на 3' конце мРНК, в качестве праймера и мРНК, содержащейся во всей РНК, полученной вышеописанным способом, в качестве матрицы (Larrick J. W., et al., Bio/Technology, 7, 934-938, 1989). Дополнительно можно также в то же время использовать случайный праймер. Кроме того, в случае, когда желательно сначала выделить мРНК, это может быть сделано путем нанесения всей РНК на колонку олиго(dТ)-целлюлозы, с которой связан поли(А)-хвост мРНК.2) Synthesis of cDNA
Then, single-stranded cDNA complementary to mRNA can be obtained by treating all RNA with reverse transcriptase using an oligo (dT) oligonucleotide complementary to the poly (A) tail located at the 3 'end of mRNA as a primer and mRNA contained in all RNA obtained as described above, as a matrix (Larrick JW, et al., Bio / Technology, 7, 934-938, 1989). Additionally, a random primer can also be used at the same time. In addition, in the case where it is desirable to first isolate mRNA, this can be done by depositing all of the RNA onto a column of oligo (dT) cellulose to which the poly (A) tail of the mRNA is linked.

3) Амплификация ДНК, кодирующей V область, с помощью полимеразной цепной реакции. 3) Amplification of DNA encoding the V region using polymerase chain reaction.

Затем кДНК, которая кодирует вышеназванную область, специфично амплифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для амплификации V области L цепи (к) типа мышиных моноклональных антител используются 11 типов олигонуклеотидных праймеров, показанных в ПОСЛ ИД NN 1-11 (мышиная каппа вариабельная; МКВ) и олигонуклеотидный праймер, показанный в ПОСЛ ИД N 12 (мышиный каппа константный; МКК) в качестве 5' концевого праймера и 3' концевого праймера, соответственно. Вышеупомянутые праймеры МКВ гибридизуются с последовательностью ДНК, которая кодирует мышиную лидерную последовательность L цепи каппа-типа. Then, the cDNA that encodes the above region is specifically amplified by polymerase chain reaction (PCR). For amplification of the V region of the L chain (k) type of mouse monoclonal antibodies, 11 types of oligonucleotide primers shown in SEQ ID NN 1-11 (mouse variable kappa; MKP) and the oligonucleotide primer shown in SEQ ID N 12 (mouse constant kappa; MKK) are used ) as the 5 'end primer and 3' end primer, respectively. The aforementioned MKV primers hybridize to a DNA sequence that encodes a kappa-type murine L chain leader.

Для амплификации V области H цепи мышиных моноклональных антител используются 12 типов олигнуклеотидных праймеров, показанные в ПОСЛ ИД NN 13-24 (мышиные тяжелые вариабельные; МТВ) и олигонуклеотидный праймер, показанный в ПОСЛ ИД N 25 (мышиная тяжелая константная; МТК), в качестве 5' концевого праймера и 3' концевого праймера, соответственно. Вышеупомянутые МТB праймеры гибридизуются с последовательностью ДНК, которая кодирует мышиную С область H цепи. For amplification of the V region H chain of murine monoclonal antibodies, 12 types of oligonucleotide primers are used, shown in SEQ ID NN 13-24 (mouse heavy variable; MTB) and the oligonucleotide primer shown in SEQ ID N 25 (mouse heavy constant; MTK) 5 'end primer and 3' end primer, respectively. The above MTB primers hybridize to a DNA sequence that encodes a murine C region H chain.

Кроме того, все 5' концевые праймеры (МКВ и МТВ) содержат последовательность GTCGAC, которая создает сайт расщепления рестрикционным ферментом SalI около 3' конца, тогда как оба 3' концевых праймера (МКК и МТК) содержат нуклеотидную последовательность CCCGGG, которая создает сайт расщепления рестрикционным ферментом XmaI вблизи 5' конца. Эти сайты расщепления рестрикционным ферментом используются для субклонирования целевых фрагментов ДНК, которые кодируют обе V области, в соответствующие векторы клонирования. В случае, когда эти сайты расщепления рестрикционными ферментами присутствуют также в целевой последовательности ДНК, которая кодирует обе V области, должны использоваться другие сайты расщепления рестрикционными ферментами для субклонирования в соответствующие клонирующие векторы. In addition, all 5 'end primers (MKB and MTB) contain the GTCGAC sequence, which creates a SalI restriction enzyme cleavage site near the 3' end, while both 3 'end primers (MKK and MTK) contain the CCCGGG nucleotide sequence that creates the cleavage site restriction enzyme XmaI near the 5 'end. These restriction enzyme cleavage sites are used to subclone target DNA fragments that encode both V regions into the corresponding cloning vectors. In the case where these restriction enzyme cleavage sites are also present in the target DNA sequence that encodes both V regions, other restriction enzyme cleavage sites should be used for subcloning into the corresponding cloning vectors.

4) Выделение ДНК, кодирующей V область
Затем, чтобы получить фрагмент ДНК, который кодирует целевую V область мышиного моноклонального антитела, продукты амплификации ПЦР разделяют и очищают в агарозном геле с низкой температурой плавления или на колонке [набор для очистки продуктов ПЦР (QIAGEN PCR Purification Spin Kit: QIAGEN); набор для очистки ДНК (GENECLEAN II, BIO 101). Фрагмент ДНК, который кодирует целевую V область мышиных моноклональных антител, получают путем ферментативной обработки очищенного продукта амплификации рестрикционными ферментами SalI и XmaI.4) Isolation of DNA encoding the V region
Then, to obtain a DNA fragment that encodes a target V region of a murine monoclonal antibody, PCR amplification products are separated and purified on a low melting point agarose gel or on a column [QIAGEN PCR Purification Spin Kit: QIAGEN); DNA purification kit (GENECLEAN II, BIO 101). A DNA fragment that encodes a target V region of murine monoclonal antibodies is obtained by enzymatically treating the purified amplification product with restriction enzymes SalI and XmaI.

Далее с помощью расщепления подходящего клонирующего вектора, такого как плазмида pUC19 теми же самыми рестрикционными ферментами, SalI и XmaI, и ферментативного связывания вышеупомянутого фрагмента ДНК с этой pUC19 получают плазмиду, которая содержит фрагмент ДНК, который кодирует целевую V область мышиных моноклональных антител. Определение последовательности клонированной ДНК может быть выполнено обычным методом, примером чего является использование автоматического секвенатора ДНК (Applied Biosystems). Клонирование и определение последовательности целевой ДНК описаны детально в примерах 1 и 2. Then, by digesting a suitable cloning vector such as plasmid pUC19 with the same restriction enzymes, SalI and XmaI, and enzymatically linking the aforementioned DNA fragment to this pUC19, a plasmid is obtained that contains a DNA fragment that encodes the target V region of murine monoclonal antibodies. Sequencing of the cloned DNA can be performed by a conventional method, an example of which is the use of an automatic DNA sequencer (Applied Biosystems). Cloning and sequence determination of the target DNA are described in detail in examples 1 and 2.

Гипервариабельные участки (CDR)
Данное изобретение также представляет гипервариабельный участок или определяющую комплементарность область (CDR) вариабельной области мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8. V области как L цепи, так и H цепи этих антител образуют связывающий антиген сайт. Эти области на L цепи и H цепи имеют сходную основную структуру. V области обоих цепей содержат четыре структурные области, у которых последовательность является относительно консервативной, и эти четыре структурные области связаны с помощью трех гипервариабельных участков или CDR (Kabat Е.А. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1991).Hypervariable Sites (CDR)
The present invention also provides a hypervariable region or complementarity determining region (CDR) of the variable region of murine monoclonal antibodies to human IL-8. V regions of both the L chain and the H chain of these antibodies form an antigen binding site. These regions on the L chain and H chain have a similar basic structure. The V regions of both chains contain four structural regions in which the sequence is relatively conserved, and these four structural regions are linked using three hypervariable regions or CDRs (Kabat, E.A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept Health and Human Services, 1991).

Большинство частей вышеупомянутых четырех структурных областей (FR) имеют β-пластинчатую структуру, и три CDR образуют петли. CDR могут в некоторых случаях образовывать часть β-пластинчатую структуру. Три CDR поддерживаются трехмерно в чрезвычайно близких положениях с помощью FR и принимают участие в образовании связывающего антиген сайта вместе с тремя спаренными CDR. Данное изобретение представляет CDR, которые применимы в качестве компонентов очеловеченных антител, а также ДНК, которая кодирует их. Эти CDR можно определить по экспериментальным правилам Kabat Е.А. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", путем сравнения последовательностей V области с известными аминокислотными последовательностями V области, детальное объяснение чего представлено в осуществлении 3. Most parts of the above four structural regions (FR) have a β-plate structure, and three CDRs form loops. CDRs may in some cases form part of a β-plate structure. Three CDRs are supported three-dimensionally in extremely close positions by FR and are involved in the formation of an antigen binding site together with three paired CDRs. The present invention provides CDRs that are useful as components of humanized antibodies, as well as DNA that encodes them. These CDRs can be determined by the experimental rules of Kabat E.A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", by comparing the sequences of the V region with the known amino acid sequences of the V region, a detailed explanation of which is presented in exercise 3.

Получение химерных антител
Перед созданием реконструированной человеческой V области антитела к человеческому ИЛ-8 необходимо подтвердить, образуют ли действительно используемые CDR связывающую антиген область. С этой целью были получены химерные антитела. Чтобы получить химерные антитела, необходимо сконструировать ДНК, которая кодирует L цепь и H цепь химерного антитела. Основной метод конструирования обеих ДНК включает связывание соответствующих последовательностей ДНК мышиной лидерной последовательности, присутствующей в ПЦР-клонированной ДНК, и последовательности мышиной V области с последовательностью ДНК, которая кодирует человеческую С область, уже присутствующей в векторе экспрессии для клетки млекопитающего.Obtaining chimeric antibodies
Before creating the reconstructed human V region, antibodies to human IL-8 must confirm whether the really used CDRs form an antigen binding region. To this end, chimeric antibodies were obtained. To obtain chimeric antibodies, it is necessary to construct DNA that encodes the L chain and H chain of the chimeric antibody. A basic method for constructing both DNAs involves linking the corresponding DNA sequences of the mouse leader sequence present in the PCR cloned DNA and the sequence of the mouse V region to the DNA sequence that encodes the human C region already present in the expression vector for the mammalian cell.

Вышеупомянутые С области человеческого антитела могут быть любыми С областями L цепи и любыми С областями H цепи, и что касается L цепи, примеры включают Cк или Сλ человеческой L цепи, тогда как, что касается H цепи, если это IgG, примеры включают Cγ1, Cγ2, Cγ3 или Cγ4 (Ellison J. et al., DNA, 1, 11-18 (1981), Takahashi N. Et al., Cell, 29, 671-679 (1982), Krawinkel U. Et al., EMBO J., 1, 403-407 (1982)) или другие изотипы. The aforementioned C regions of a human antibody can be any C regions of the L chain and any C regions of the H chain, and for the L chain, examples include Ck or Cλ of the human L chain, whereas for the H chain, if it is IgG, examples include Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4 (Ellison J. et al., DNA, 1, 11-18 (1981), Takahashi N. Et al., Cell, 29, 671-679 (1982), Krawinkel U. Et al., EMBO J., 1, 403-407 (1982)) or other isotypes.

Получены два типа векторов экспрессии для продукции химерных антител, а именно вектор экспрессии, который содержит ДНК, кодирующую V область мышиной L цепи и С область человеческой L цепи под контролем энхансерно/промоторной области регуляции экспрессии, и вектор экспрессии, который содержит ДНК, которая кодирует V область мышиной H цепи и С область человеческой H цепи под контролем области управления экспрессией энхансерно/промоторного типа. Затем клетки-хозяева, такие как клетки млекопитающих, одновременно трансформировали обоими этими экспрессирующими векторами, и трансформированные клетки культивировали или in vitro, или in vivo для продукции химерного антигена (например, WO91-16928). Two types of expression vectors were obtained for the production of chimeric antibodies, namely, an expression vector that contains DNA encoding the V region of the mouse L chain and the C region of the human L chain under the control of the enhancer / promoter region of expression regulation, and an expression vector that contains DNA that encodes V region of the mouse H chain and C region of the human H chain under the control of the expression control region of the enhancer / promoter type. Then, host cells, such as mammalian cells, were simultaneously transformed with both of these expression vectors, and the transformed cells were cultured either in vitro or in vivo to produce a chimeric antigen (e.g., WO91-16928).

Или же, ДНК, которая кодирует V область L цепи мыши и С область L цепи человека, и ДНК, кодирующую V область мышиной H цепи и С область человеческой H цепи, могут вводиться в единственный вектор экспрессии, клетки-хозяева трансформируются с применением этого вектора и затем культивируются или in vitro, или in vivo для продукции химерных антител. Alternatively, DNA that encodes the V region L of the mouse chain and C region L of the human chain, and DNA encoding the V region of mouse H chain and the C region of human H chain, can be introduced into a single expression vector, host cells are transformed using this vector and then cultivated either in vitro or in vivo to produce chimeric antibodies.

Получение химерных антител из моноклональных антител WS-4 описано в осуществлении 4. Obtaining chimeric antibodies from monoclonal antibodies WS-4 is described in exercise 4.

кДНК, которая кодирует лидерную последовательность цепи к-типа мышиных WS-4 и V область, клонируется с использованием ПЦР и соединяется с вектором экспрессии, который содержит ДНК человеческого генома, которая кодирует Cк область человеческой L цепи. Подобным же образом кДНК, которая кодирует лидерную последовательность H цепи и V область мышиного антитела WS-4, клонируется с использованием ПЦР и связывается с вектором экспрессии, который содержит ДНК человеческого генома, которая кодирует человеческую Сγ1, область. The cDNA, which encodes the leader sequence of the k-type chain of the murine WS-4 and V region, is cloned using PCR and linked to an expression vector that contains the human genome DNA that encodes the C region of the human L chain. Similarly, cDNA that encodes the leader sequence of the H chain and V region of the WS-4 mouse antibody is cloned using PCR and binds to an expression vector that contains the DNA of the human genome that encodes the human Cγ1 region.

Более конкретно, подходящие нуклеотидные последовательности вводятся на 5' и 3' концах кДНК, которая кодирует V областей мышиных антител WS-4 с использованием специально сконструированных праймеров ПЦР, так что (1) их можно легко вставить в вектор экспрессии и (2) они соответствующим образом функционируют в указанном векторе экспрессии (например, эффективность транскрипции улучшается с помощью введения последовательности Козака в данное изобретение). More specifically, suitable nucleotide sequences are introduced at the 5 'and 3' ends of the cDNA that encodes the V regions of mouse WS-4 antibodies using specially designed PCR primers so that (1) they can be easily inserted into the expression vector and (2) they are appropriate function in the specified expression vector (for example, transcription efficiency is improved by introducing the Kozak sequence into the present invention).

Затем ДНК, которая кодирует V область мышиного антитела WS-4, полученная путем амплификации с помощью ПЦР с использованием этих праймеров, вводится в вектор экспрессии HEF (см. фиг. 1), который уже содержит желаемую человеческую C область. Эти векторы пригодны для временной или постоянной экспрессии генетически сконструированного антитела в разных системах клеток млекопитающих. Then, the DNA that encodes the V region of the WS-4 mouse antibody obtained by PCR amplification using these primers is introduced into the HEF expression vector (see FIG. 1), which already contains the desired human C region. These vectors are suitable for the temporary or permanent expression of a genetically engineered antibody in different mammalian cell systems.

При испытании на активность по связыванию с антигеном химерных антител WS-4, полученных таким образом, была продемонстрирована активность антител WS-4 в отношении связывания с человеческим ИЛ-8 (см. фиг. 2). Таким образом, было сделано заключение, что была клонирована верная мышиная V область и определена правильная последовательность. When tested for antigen binding activity of WS-4 chimeric antibodies thus obtained, the activity of WS-4 antibodies with respect to binding to human IL-8 was demonstrated (see FIG. 2). Thus, it was concluded that the correct murine V region was cloned and the correct sequence was determined.

Создание реконструированных человеческих антител WS-4
Чтобы получить реконструированные человеческие антитела, в которых CDR мышиных моноклональных антител пересажены в человеческие антитела, желательно, чтобы была высокая степень гомологии между аминокислотными последовательностями FR мышиных моноклональных антител, имеющих CDR, подлежащие пересадке, и аминокислотными последовательностями FR человеческих моноклональных антител, в которые должны быть пересажены эти CDR.The creation of reconstructed human antibodies WS-4
In order to obtain reconstructed human antibodies in which the CDRs of mouse monoclonal antibodies are transplanted into human antibodies, it is desirable that there is a high degree of homology between the amino acid sequences FR of mouse monoclonal antibodies having CDRs to be transplanted and the amino acid sequences FR of human monoclonal antibodies into which these CDRs are transplanted.

С этой целью человеческие V области для того, чтобы служить основой для конструирования V областей реконструированных человеческих антител WS-4, можно выбирать путем сравнения аминокислотных последовательностей FR мышиных моноклональных антител с аминокислотной последовательностью FR человеческих антител. Более конкретно, V области L и H цепей мышиных антител WS-4 сравнили со всеми известными человеческими V областями, найденными в базе данных Национального фонда биомедицинских исследований (National Biomedical Research Foundation, NBRF) с использованием генетического аналитического программного обеспечения, GENETEX (Software Development Co., Ltd.). To this end, human V regions, in order to serve as the basis for constructing the V regions of the reconstituted human antibodies WS-4, can be selected by comparing the amino acid sequences FR of murine monoclonal antibodies with the amino acid sequence FR of human antibodies. More specifically, the V regions of the L and H chains of mouse WS-4 antibodies were compared with all known human V regions found in the National Biomedical Research Foundation (NBRF) database using genetic analysis software, GENETEX (Software Development Co ., Ltd.).

При сравнении с известными V областями человеческих L цепей было обнаружено, что V область L цепи мышиных антител WS-4 наиболее близко похожа на область человеческих антител HAU (Watanabe S. еt al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. , 351, 1291-1295, 1970), имеющих гомологию, равную 69,2%. С другой стороны при сравнении с известными V областями H цепи человеческих антител было обнаружено, что V область H цепи антител WS-4 наиболее близко похожа на V область человеческих антител VDH26 (Buluwela L. еt al., EMBO J., 7, 2003-2010, 1988), имеющую гомологию, равную 71,4%. When compared with the known V regions of human L chains, it was found that the V region of the L chain of mouse WS-4 antibodies is most closely related to the region of human HAU antibodies (Watanabe S. et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 351, 1291-1295, 1970) having a homology of 69.2%. On the other hand, when compared with the known V regions of the H chain of human antibodies, it was found that the V region of the H chain of antibodies WS-4 is most closely related to the V region of human antibodies of VDH26 (Buluwela L. et al., EMBO J., 7, 2003- 2010, 1988) having a homology of 71.4%.

В основном гомология аминокислотных последовательностей мышиных V областей с аминокислотными последовательностями человеческих V областей меньше, чем гомология с аминокислотными последовательностями мышиных V областей. Это показывает, что V область мышиных антител WS-4 не полностью сходна с человеческой V областью, и в то же время указывает на то, что очеловечивание V области мышиных WS-4 является наилучшим путем решения проблемы иммуногенности у больных людей. In general, the homology of the amino acid sequences of murine V regions with the amino acid sequences of human V regions is less than the homology with the amino acid sequences of murine V regions. This shows that the V region of mouse WS-4 antibodies is not completely similar to the human V region, and at the same time, indicates that humanization of the V region of mouse WS-4 is the best way to solve the problem of immunogenicity in sick people.

V область мышиных антител WS-4, кроме того, сравнили с консенсусной последовательностью подгруппы человеческой V области по Kabat Е.А., et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health Services, U.S. Government Printing Office, чтобы сравнить FR V области. Эти результаты показаны в таблице 1. The V region of WS-4 murine antibodies was further compared with the consensus sequence of a subgroup of the human V region according to Kabat E.A., et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health Services, U.S. Government Printing Office to compare the FR V area. These results are shown in table 1.

FR V области L цепи мышиных антител WS-4 наиболее близко похожи на консенсусную последовательность FR V области человеческой L цепи подгруппы I (HSGI), имеющую гомологию, равную 64,4%. С другой стороны FR V области H цепи мышиных антител WS-4 наиболее близко похожи на консенсусную последовательность V области человеческой H цепи подгруппы III (HSGIII), имеющую гомологию, равную 62,3%. The FR V regions of the L chain of murine antibodies of WS-4 are most closely related to the consensus sequence of the FR V regions of the human L chain of subgroup I (HSGI) having a homology of 64.4%. On the other hand, the FR V region of the H chain of murine antibodies of WS-4 is most closely related to the consensus sequence of the V region of the human H chain of subgroup III (HSGIII) having a homology of 62.3%.

Эти результаты подтверждают результаты, полученные из сравнения с известными человеческими антителами, V областью L цепи человеческих антител HAU, принадлежащей к подгруппе I V областей человеческой L цепи, и V областью H цепи человеческих антител VDH26, принадлежащей к подгруппе III V областей H цепи. Чтобы создать V область L цепи реконструированных человеческих антител WS-4, возможно лучше всего использовать V область человеческой L цепи, принадлежащую к подгруппе I (HSGI), тогда как, чтобы создать V область H цепи реконструированных человеческих антител WS-4, возможно, лучше всего использовать V область H цепи человеческих антител, принадлежащих к подгруппе III (HSGIII). These results confirm the results obtained from a comparison with known human antibodies, the V region L chain of human antibodies HAU belonging to the subgroup I V regions of the human L chain, and the V region H chain human antibodies VDH26 belonging to the subgroup III V regions of the H chain. To create the V region L chain of the remodeled human antibodies WS-4, it is probably best to use the V region of the human L chain belonging to subgroup I (HSGI), while to create the V region H region of the reconstructed human antibodies WS-4, it is probably better all use the V region H chain of human antibodies belonging to subgroup III (HSGIII).

При сравнении с V областью L цепи известных человеческих антител V область L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 наиболее близко похожа на V область L цепи человеческих антител REI, представителя подгруппы 1 V областей L цепи. Таким образом, использовались FR из REI при создании V области L цепи реконструированных человеческих антител WS-4. В этих человеческих FR на основе REI существуют различия в пяти аминокислотах (в положениях 39, 71, 104, 105 и 107; см. таблицу 2) по сравнению с последовательностью человеческих REI, документально показанной в специальной литературе (Palm W. et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 356, 167-191, 1975; и Epp О. et al., Biochemistry, 14, 4943-4952, 1975). When compared with the V region L chain of known human antibodies, the V region L chain of mouse monoclonal antibodies WS-4 is most similar to the V region L chain of human antibodies REI, a representative of subgroup 1 V regions of the L chain. Thus, FR from REI was used to create the V region L chain of the reconstructed human antibodies WS-4. In these human REI-based FRs, there are differences in the five amino acids (at positions 39, 71, 104, 105 and 107; see Table 2) compared to the human REI sequence documented in the literature (Palm W. et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 356, 167-191, 1975; and Epp, O. et al., Biochemistry, 14, 4943-4952, 1975).

Номера аминокислот, показанные в таблице, приведены на основе опыта Kabat Е. А. et al. (1991). Изменения двух аминокислот в положениях 39 и 71 были теми изменениями, которые вызваны аминокислотами, присутствующими в FRV области L цепи крысиных антител CAMPATH-IH (Riechmann et al., 1988). По Kabat et al. (1991) изменение других трех аминокислот в FR4 (положения 104, 105 и 107) основаны на J области из других человеческих kL цепей и не отличаются от человеческих. The amino acid numbers shown in the table are based on the experience of Kabat E.A. et al. (1991). The changes in the two amino acids at positions 39 and 71 were those changes that are caused by the amino acids present in the FRV region L of the CAMPATH-IH rat antibody chain (Riechmann et al., 1988). According to Kabat et al. (1991) a change in the other three amino acids in FR4 (positions 104, 105 and 107) are based on the J region from other human kL chains and are not different from human ones.

Было создано два варианта V области L цепи реконструированных человеческих антител WS-4. В первом варианте RVLa FR были идентичными FR на основе REI, присутствующих в реконструированных человеческих антителах CAMPATH-IH (Riechmann et al., 1988), тогда как CDR были идентичны CDR V области L цепи мышиных антител WS-4. Второй вариант, RVLb, основан на RVLa, и отличается только по одной аминокислоте в положении 71 в человеческой FR3. Как определено Clothia С. et al., J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987, остаток 71 является частью канонической структуры CDRI V области L цепи. Two variants of the V region L chain of the reconstructed human antibodies WS-4 were created. In the first embodiment, the RVLa FRs were identical to the REI based FRs present in the reconstructed human CAMPATH-IH antibodies (Riechmann et al., 1988), while the CDRs were identical to the CDR V region L of the mouse chain of WS-4 antibodies. The second option, RVLb, is based on RVLa, and differs only in one amino acid at position 71 in human FR3. As defined by Clothia, C. et al., J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987, residue 71 is part of the canonical structure of the CDRI V region of the L chain.

Предсказано, что аминокислота в этом положении непосредственно влияет на структуру петли CDRI V области L цепи, и по этой причине считается, что она имеет значительное воздействие на связывание с антигеном. В V области L цепи RVLb реконструированных человеческих антител WS-4 фенилаланин в положении 71 заменен на тирозин. В таблице 2 показаны соответствующие аминокислотные последовательности V области L цепи мышиных антител WS-4, FR модифицированных REI для использования в реконструированных человеческих антителах CAMPATH-1H (Riechmann, et al., 1988) и два варианта V области L цепи реконструированных человеческих антител WS-4. The amino acid at this position is predicted to directly affect the structure of the CDRI V loop of region L of the chain, and for this reason it is believed to have a significant effect on antigen binding. In the V region L of the RVLb chain of the reconstructed human WS-4 antibody, phenylalanine at position 71 is replaced by tyrosine. Table 2 shows the corresponding amino acid sequences of V region L chain of mouse antibodies WS-4, FR modified by REI for use in reconstructed human antibodies CAMPATH-1H (Riechmann, et al., 1988) and two variants of V region L chain of reconstructed human antibodies WS- 4.

FR V области H цепи мышиных антител WS-4 наиболее близко похожи на V область человеческой H цепи, принадлежащей к подгруппе Ill (таблица 1). The FR V regions of the H chain of murine antibodies WS-4 are most closely related to the V region of the human H chain belonging to the Ill subgroup (Table 1).

При сравнении с известными V областями человеческих H цепей и V областью H цепи мышиных антител WS-4 наиболее близко похожи на V область H цепи человеческих антител VDH26, представителя подгруппы III V областей человеческих H цепей, от FR1 до FR3 (Buluwela L. et al., EMBO J., 7, 2003-2010, 1988). В отношении FR4, так как о последовательности FR4 из VDH26 не сообщалось, было решено использовать аминокислотную последовательность FR4 человеческих антител 4B4, относящихся к подгруппе III (Sanz I., et al., J. Immunol. , 142, 883-887, 1989). Эти V области человеческой H цепи использовали в качестве основы для создания V области H цепи реконструированных антител WS-4. When compared with the known V regions of human H chains and V region H chains of mouse antibodies, WS-4 is most closely related to the V region H chain of human antibodies VDH26, a representative of subgroup III V regions of human H chains, FR1 to FR3 (Buluwela L. et al ., EMBO J., 7, 2003-2010, 1988). With respect to FR4, since the FR4 sequence of VDH26 was not reported, it was decided to use the amino acid sequence FR4 of human antibodies 4B4 belonging to subgroup III (Sanz I., et al., J. Immunol., 142, 883-887, 1989) . These V regions of the human H chain were used as the basis for creating the V region of the H chain of the reconstituted WS-4 antibodies.

Было создано восемь вариантов V области H цепи реконструированных человеческих антител WS-4. Во всех восьми вариантах человеческие FR1, FR2 и FR3 основаны на FR1, FR2 и FR3 человеческих антител VDH26, тогда как FR4 основаны на FR4 человеческих антител 4B4. Мышиные CDR были идентичны CDR V области H цепи мышиных антител WS-4. Eight variants of the V region H chain of the reconstructed human WS-4 antibodies were created. In all eight embodiments, human FR1, FR2, and FR3 are based on FR1, FR2, and FR3 of human VDH26 antibodies, while FR4 are based on FR4 of human 4B4 antibodies. Mouse CDRs were identical to CDRs of the V region of the H chain of mouse WS-4 antibodies.

В таблицах 3 и 4 показаны соответствующие аминокислотные последовательности V области H цепи мышиных антител WS-4, матрица от FR1 по FR3 человеческих антител VDH26, FR4 человеческих антител 4B4 и 8 вариантов V области H цепи реконструированных человеческих антител WS-4. Tables 3 and 4 show the corresponding amino acid sequences of the V region H chain of mouse antibodies WS-4, the matrix FR1 to FR3 of human antibodies VDH26, FR4 of human antibodies 4B4 and 8 variants of the V region H chain of reconstructed human antibodies WS-4.

Аминокислоты обозначены с использованием однобуквенного кода. Номера аминокислот находятся в соответствии с определением Kabat et al. Amino acids are designated using a single letter code. Amino acid numbers are as defined by Kabat et al.

Получение ДНК, кодирующей V область реконструированных человеческих антител WS-4
Получение V области реконструированных человеческих антител WS-4 описано детально в примере 5.Obtaining DNA encoding the V region of the reconstructed human antibodies WS-4
Obtaining the V region of reconstructed human antibodies WS-4 is described in detail in example 5.

Была синтезирована ДНК, которая кодирует соответствующие первые варианты V областей L цепи и H цепи реконструированных человеческих антител WS-4. Затем было подтверждено, что вся последовательность ДНК варианта "а" V областей L цепи и H цепи реконструированных человеческих антител WS-4 кодирует правильную аминокислотную последовательность путем определения последовательности. Последовательность варианта "а" V области L цепи реконструированных человеческих антител WS-4 показана в ПОСЛ ИД N 62, а последовательность варианта "а" V области H цепи реконструированных человеческих антител WS-4 показана в ПОСЛ ИД N 38. DNA was synthesized that encodes the corresponding first variants of V regions of the L chain and H chain of the reconstructed human antibodies WS-4. It was then confirmed that the entire DNA sequence of variant "a" of the V regions of the L chain and H chain of the reconstituted human antibodies WS-4 encodes the correct amino acid sequence by determining the sequence. The sequence of variant “a” of V region L of the chain of reconstructed human antibodies WS-4 is shown in SEQ ID NO: 62, and the sequence of variant “a” of V region H of the chain of reconstructed human antibodies WS-4 is shown in SEQ ID NO 38.

ДНК, которые кодируют другие варианты V области реконструированных человеческих антител WS-4, были получены с использованием незначительного изменения открыто описанного метода индукции ПЦР-мутации (Kamman М. et al., Nucleic Acids Res., 17, 5404, 1989) с первым вариантом "а" в качестве матрицы. Как ранее описано в отношении создания V области реконструированных человеческих антител WS-4, были получены ДНК, которая кодирует один дополнительный вариант V области L цепи реконструированных человеческих антител WS-4 (вариант "b"), а также ДНК, которая кодирует семь дополнительных вариантов V области H цепи реконструированных человеческих антител WS-4 (варианты "b", "с", "d", "e", "f", "g" и "h"). DNA that encodes other variants of the V region of the reconstructed human WS-4 antibodies was obtained using a slight modification of the openly described method for inducing PCR mutation (Kamman M. et al., Nucleic Acids Res., 17, 5404, 1989) with the first variant "a" as a matrix. As previously described with respect to the creation of the V region of the reconstructed human antibodies WS-4, DNA was obtained that encodes one additional variant of the V region L of the chain of reconstructed human antibodies WS-4 (variant "b"), as well as the DNA that encodes seven additional variants V region H chain of the reconstituted human antibodies WS-4 (variants "b", "c", "d", "e", "f", "g" and "h").

Эти дополнительные варианты содержали легкие изменения в серии аминокислотных последовательностей из первого варианта, и эти изменения в аминокислотных последовательностях были достигнуты с помощью осуществления незначительных изменений в последовательности ДНК при применении индукции мутации с помощью ПЦР. Был создан праймер ПЦР, который вызывает необходимое изменение в последовательности ДНК. После серии ПЦР реакций продукт ПЦР клонировали с последующим определением последовательности для подтверждения того, что произошли изменения последовательности ДНК, которые предполагались. Последовательность варианта "b" V области L цепи реконструированных человеческих антител WS-4 показана в ПОСЛ ИД N 65, а последовательность вариантов "b", "с", "d", "e", "f", "g" и "h" V области H цепи реконструированных человеческих антител WS-4 показаны в ПОСЛ ИД NN 41, 44, 45, 48, 51, 54 и 55, соответственно. These additional variants contained slight changes in the series of amino acid sequences from the first embodiment, and these changes in amino acid sequences were achieved by making minor changes in the DNA sequence when applying mutation induction by PCR. A PCR primer was created that causes the necessary change in the DNA sequence. After a series of PCR reactions, the PCR product was cloned, followed by sequencing to confirm that the DNA sequence changes that were expected to occur. The sequence of variant b of region V of the L chain of the reconstructed human antibodies WS-4 is shown in SEQ ID N 65, and the sequence of variants b, c, d, e, f, g and The h "V region H chains of the reconstituted human WS-4 antibodies are shown in SEQ ID NOS 41, 44, 45, 48, 51, 54 and 55, respectively.

После подтверждения последовательностей ДНК различных вариантов V области реконструированных человеческих антител WS-4 путем определения последовательности ДНК, которая кодирует V область реконструированных человеческих антител WS-4, субклонировали в векторы экспрессии для клеток млекопитающих, которые уже содержали ДНК, которая кодирует человеческую С область. А именно ДНК, которая кодирует V область L цепи реконструированных человеческих антител WS-4, связывали с последовательностью ДНК, которая кодирует С область L цепи, а ДНК, которая кодирует V область H цепи реконструированных человеческих антител WS-4, связывали с последовательностью ДНК, которая кодирует человеческую Cγ1 область. After confirming the DNA sequences of various variants of the V region of the reconstituted human antibodies WS-4 by determining the DNA sequence that encodes the V region of the reconstructed human antibodies WS-4, subcloned into expression vectors for mammalian cells that already contained DNA that encodes the human C region. Namely, the DNA that encodes the V region L chain of the remodeled human antibodies WS-4, was associated with a DNA sequence that encodes the C region L of the chain, and the DNA that encodes the V region H chain of the reconstructed human antibodies WS-4, was linked to a DNA sequence, which encodes the human Cγ1 region.

Затем все комбинации варианта "а" или "b" V области L цепи реконструированных человеческих антител и вариантов с "а" по "h" V области H цепи были испытаны на связывание с человеческим ИЛ-8. В результате, как показано на фиг. 7, оба реконструированных антитела, содержащих вариант "а" или "b" и вариант "g" H цепи (RVLa/RVHg и RVLb/RVHg) продемонстрировали способность связываться с человеческим ИЛ-8 в такой же степени, как и химерное антитело WS-4. Then, all combinations of variant “a” or “b” of the V region L chain of the reconstructed human antibodies and variants “a” to “h” of the V region of the H chain were tested for binding to human IL-8. As a result, as shown in FIG. 7, both reconstructed antibodies containing variant “a” or “b” and variant “g” H chains (RVLa / RVHg and RVLb / RVHg) demonstrated the ability to bind to human IL-8 to the same extent as the chimeric antibody WS- 4.

Любая система экспрессии, включая эукариотические клетки, такие как клетки животных или определенные клетки млекопитающих, клетки грибов, клетки дрожжей и прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки (например, Escherichia coli), можно использовать для продукции химерных антител или реконструированных человеческих антител к человеческому ИЛ-8 данного изобретения. Предпочтительно, однако, чтобы химерные антитела или реконструированные антитела данного изобретения экспрессировались в клетках млекопитающих, таких как клетки COS или клетки CHO. В этих случаях для экспрессии в клетках млекопитающих можно использовать пригодный обычно используемый промотор. Например, предпочтительно использовать немедленно-ранний промотор человеческого цитомегаловируса (HCMV). Примеры векторов экспрессии, которые содержат промотор HCMV включают HCMV-VH-HCγ1 и HCMV-VL-НСк, а также сюда включаются те, которые производятся от pSV2neo (International Patent Application Publication No. WO92-19759). Any expression system, including eukaryotic cells, such as animal cells or certain mammalian cells, fungal cells, yeast cells, and prokaryotic cells, such as bacterial cells (e.g. Escherichia coli), can be used to produce chimeric antibodies or reconstructed human antibodies to human IL -8 of the present invention. Preferably, however, the chimeric antibodies or reconstituted antibodies of the invention are expressed in mammalian cells, such as COS cells or CHO cells. In these cases, a suitable commonly used promoter can be used for expression in mammalian cells. For example, it is preferable to use the immediate early promoter of human cytomegalovirus (HCMV). Examples of expression vectors that contain the HCMV promoter include HCMV-VH-HCγ1 and HCMV-VL-HCK, as well as those derived from pSV2neo (International Patent Application Publication No. WO92-19759).

Кроме того, примеры других промоторов генетической экспрессии в клетках млекопитающих, которые могут использоваться в данном изобретении, которые нужно использовать, включают промоторы вирусов, таких как ретровирусы, вирус полиомы, аденовирусы и обезьяний вирус 40 (SV40), a также промоторы, происходящие из клеток млекопитающих, таких как человеческий фактор-1 α элонгации полипептидной цепи (HEF-1α). Например, в случае использования промотора SV40 экспрессия может производиться следующим методом Mulligan R.C. et al. (Nature, 277, 108-114, 1979), или в случае использования промотора HEF-1α, экспрессия может производиться по следующему методу Mizushima S. et al. (Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990). In addition, examples of other promoters of genetic expression in mammalian cells that can be used in this invention to be used include promoters of viruses such as retroviruses, polyoma virus, adenoviruses and monkey virus 40 (SV40), as well as promoters derived from cells mammals, such as human factor-1 α polypeptide chain elongation (HEF-1α). For example, in the case of using the SV40 promoter, expression can be performed by the following Mulligan R.C. method. et al. (Nature, 277, 108-114, 1979), or in the case of using the HEF-1α promoter, expression can be performed according to the following method of Mizushima S. et al. (Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990).

Другим конкретным примером промотора, пригодного для данного изобретения, является промотор HEF-1α. HEF-VH-gγ1 и HEF-VL-gк (фиг. 1) содержатся в векторе экспрессии, включающем этот промотор. Последовательности ДНК, происходящие из вируса полиомы, аденовируса, SV40 или бычьего папилломного вируса (BPV) и т.д., могут использоваться в качестве репликаторных точек. Кроме того, чтобы амплифицировать ряд генетических копий в клетках-хозяевах, можно использовать аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, нео-резистентный ген, ген тимидинкиназы (ТК), ген ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (XGPRT) или дигидрофолатредуктазу (dhfr) в качестве селективных маркеров. Another specific example of a promoter suitable for the present invention is the HEF-1α promoter. HEF-VH-gγ1 and HEF-VL-gк (Fig. 1) are contained in an expression vector including this promoter. DNA sequences derived from polyoma virus, adenovirus, SV40 or bovine papillomavirus (BPV), etc., can be used as replicator points. In addition, to amplify a number of genetic copies in host cells, one can use aminoglycoside-3'-phosphotransferase, a non-resistant gene, a thymidine kinase (TK) gene, xanthine-guanine phosphorybosyltransferase (XGPRT) gene, or dihydrofolate reductase (d).

В заключение данное изобретение, во первых, представляет V область L цепи и V область H цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8, а также ДНК, которая кодирует указанную V область L цепи, и ДНК, которая кодирует указанную V область H цепи. Они применимы при получении человеческо/мышиных химерных антител и реконструированных человеческих антител к человеческому ИЛ-8. Примером моноклонального антитела является WS-4. V область L цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную, например, в ПОСЛ ИД N 26, а V область H цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную, например, в ПОСЛ ИД N 27. Эти аминокислотные последовательности кодируются нуклеотидными последовательностями, показанными, например, в ПОСЛ ИД NN 26 и 27, соответственно. In conclusion, this invention, firstly, represents the V region L chain and V region H chain of murine monoclonal antibodies to human IL-8, as well as DNA that encodes the specified V region L chain, and DNA that encodes the specified V region H chain. They are applicable to the production of human / mouse chimeric antibodies and reconstructed human antibodies to human IL-8. An example of a monoclonal antibody is WS-4. V region L chain has the amino acid sequence shown, for example, in SEQ ID N 26, and V region H chain has the amino acid sequence shown, for example, SEQ ID N 27. These amino acid sequences are encoded by the nucleotide sequences shown, for example, in SEQ ID NN 26 and 27, respectively.

Химерные антитела к человеческому ИЛ-8 данного изобретения состоят из:
1) С области человеческой L цепи и V области мышиной L цепи; и
2) С области человеческой L цепи и V области мышиной H цепи.Chimeric antibodies to human IL-8 of the present invention consist of:
1) C region of the human L chain and V region of the mouse L chain; and
2) C region of the human L chain and V region of the mouse H chain.

V область мышиной L цепи, V область мышиной H цепи и ДНК, которая кодирует эти области, описаны ранее. Вышеупомянутая С область человеческой L цепи может быть любой человеческой С областью L цепи, примеры которых включают человеческие Cк и Сλ области. Вышеупомянутая С область H цепи может быть любой человеческой С областью H цепи может быть любая человеческая С область H цепи, примеры которой включают человеческую Cγ1, Cγ2, Cγ3 или Cγ4 область (Ellison J. , еt al., DNA, 1, 11-18 (1981), Takahashi N., еt al., Cell, 29, 671-679 (1982) и Krawinkel U., еt al., EMBO J., 1, 403-407 (1982)). The V region of the murine L chain, the V region of the murine H chain, and the DNA that encodes these regions have been described previously. The above C region of the human L chain can be any human C region of the L chain, examples of which include human Ck and Cλ regions. The above C region H chain can be any human C region H chain can be any human C region H chain, examples of which include the human Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4 region (Ellison J., et al., DNA, 1, 11-18-18 (1981), Takahashi N., et al., Cell, 29, 671-679 (1982) and Krawinkel U., et al., EMBO J., 1, 403-407 (1982)).

Для продукции химерных антител получены два типа векторов экспрессии. А именно вектор экспрессии, который содержит ДНК, которая кодирует V область мышиной L цепи и человеческую С область L цепи под контролем области управления экспрессией энхансерно/промоторного типа, и вектор экспрессии, который содержит ДНК, которая кодирует мышиную V область H цепи и человеческую С область H цепи под контролем области управления экспрессией энхансерно/промоторного типа. Затем клетки-хозяева, как клетки млекопитающих, одновременно трансформируются этими векторами экспрессии, и трансформированные клетки культивируются или in vitro или in vivo с получением химерных антител. Two types of expression vectors were obtained for the production of chimeric antibodies. Namely, an expression vector that contains DNA that encodes a murine L chain V region and a human L chain C region under the control of an enhancer / promoter type expression control region, and an expression vector that contains DNA that encodes a murine V chain H region and human C H chain region under the control of the expression control region of the enhancer / promoter type. Then the host cells, like mammalian cells, are simultaneously transformed by these expression vectors, and the transformed cells are cultured either in vitro or in vivo to produce chimeric antibodies.

Или же ДНК, которая кодирует мышиную V область L цепи и человеческую С область L цепи, и ДНК, которая кодирует мышиную V область H цепи и человеческую С область H цепи, может быть введена в единственный вектор экспрессии, клетки-хозяева трансформируются с использованием указанного вектора, и эти трансформированные клетки затем культивируются или in vitro или in vivo для получения химерных антител. Or, DNA that encodes a mouse V region L chain and human C region L chain, and DNA that encodes a mouse V region H chain and human C region H chain can be introduced into a single expression vector, the host cells are transformed using the specified vectors, and these transformed cells are then cultured either in vitro or in vivo to produce chimeric antibodies.

Реконструированное человеческое антитело WS-4 данного изобретения состоит из:
А) L цепей, причем каждая состоит из:
1) человеческой С области L цепи и
2) V области L цепи, состоящей из FR человеческой L цепи и CDR L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8, а также
В) H цепей, причем каждая состоит из:
1) человеческой С области H цепи и
2) V области H цепи, состоящей из FR человеческой H цепи и CDR H цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8.Reconstructed human antibody WS-4 of the present invention consists of:
A) L chains, each consisting of:
1) human C region L chain and
2) V region of the L chain, consisting of FR human L chain and CDR L chain of mouse monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8, and
C) H chains, each of which consists of:
1) human C region H chain and
2) V region of the H chain, consisting of the FR of the human H chain and the CDR H chain of mouse monoclonal antibodies WS-4 to human IL-8.

При предпочтительном способе осуществления данного изобретения вышеупомянутые CDR L цепи находятся в аминокислотной последовательности, показанной в ПОСЛ ИД N 26, причем пределы указанной аминокислотной последовательности определены в таблице 5; вышеупомянутые CDR H цепи находятся в аминокислотной последовательности, показанной в ПОСЛ ИД N 27, причем пределы указанной аминокислотной последовательности определены в таблице 5; вышеупомянутые FR человеческой L цепи происходят из REI; вышеупомянутые FR1, FR2 и FR3 человеческой H цепи получены из VDH26, и FR4 получены из 4B4; вышеупомянутая С область L цепи является человеческой Cк областью; вышеупомянутая человеческая С область H цепи является человеческой Cγ1 областью. К тому же вышеупомянутая человеческая С область H цепи может быть человеческой Cγ4 областью или радиоизотоп может быть связан вместо вышеупомянутой человеческой С области L цепи и/или человеческой С области H цепи. In a preferred embodiment of the invention, the aforementioned CDR L chains are in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, the limits of the specified amino acid sequence are defined in Table 5; the aforementioned CDR H chains are in the amino acid sequence shown in SEQ ID N 27, the limits of the specified amino acid sequence are defined in table 5; the above-mentioned FR human L chains are derived from REI; the aforementioned human H chain FR1, FR2, and FR3 are derived from VDH26, and FR4 are derived from 4B4; the aforementioned C region L chain is a human C region; the aforementioned human C region H chain is a human Cγ1 region. In addition, the aforementioned human C region H chain may be a human Cγ4 region or a radioisotope may be linked in place of the aforementioned human C region L chain and / or human C region H chain.

Предпочтительно заменить часть аминокислотной последовательности вышеупомянутой человеческой FR для получения реконструированных человеческих антител, которые обладают достаточной активностью в отношении специфичного антигена. It is preferable to replace a portion of the amino acid sequence of the aforementioned human FR to obtain reconstructed human antibodies that have sufficient activity against a specific antigen.

При предпочтительном способе данного изобретения V область L цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную как RVLa или RVLb в таблице 2, а V область H цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную как RVHa, RVHb, RVHc, RVHd, RVHe, RVHf, RVHg или RVHh в таблицах 3 и 4. Кроме того, аминокислота в положении 41 в FR V области H цепи должна быть пролином, аминокислота в указанном положении 47 должна быть триптофаном и/или аминокислота в положении 67 указанной FR3 должна быть фенилаланином, и эти антитела, имеющие аминокислотные последовательности, показанные как RVHb, RVHd, RVHe, RVHf, RVHg или RVHh, более предпочтительны. Те, в которых присутствует RVHg в качестве V области H цепи, наиболее предпочтительны. In a preferred method of the invention, the V region L chain has the amino acid sequence shown as RVLa or RVLb in Table 2, and the V region H chain has the amino acid sequence shown as RVHa, RVHb, RVHc, RVHd, RVHe, RVHf, RVHg or RVHh in the tables 3 and 4. In addition, the amino acid at position 41 in the FR V region of the H chain must be proline, the amino acid at the indicated position 47 must be tryptophan and / or the amino acid at position 67 of the specified FR3 must be phenylalanine, and these antibodies having amino acid sequences, shown s like RVHb, RVHd, RVHe, RVHf, RVHg or RVHh, are more preferred. Those in which RVHg is present as the V region of the H chain are most preferred.

Для продукции реконструированных антител получены два типа векторов экспрессии. А именно получены вектор экспрессии, который содержит ДНК, которая кодирует ранее описанную реконструированную человеческую L цепь под контролем области управления экспрессией энхансерно/промоторного типа, а также другой вектор экспрессии, который содержит ДНК, которая кодирует ранее описанную реконструированную человеческую H цепь под контролем области управления экспрессией энхансерно/промоторного типа. Затем клетки-хозяева, такие как клетки млекопитающих, одновременно трансформируются этими векторами экспрессии, и трансформированные клетки культивируются или in vitro, или in vivo для получения реконструированных человеческих антител. Two types of expression vectors were obtained for the production of reconstructed antibodies. Namely, an expression vector is obtained that contains DNA that encodes a previously described reconstructed human L chain under the control of an expression enhancer / promoter type control region, as well as another expression vector that contains DNA that encodes a previously described reconstructed human H chain under control of a control region expression enhancer / promoter type. Then, host cells, such as mammalian cells, are simultaneously transformed with these expression vectors, and the transformed cells are cultured either in vitro or in vivo to produce reconstructed human antibodies.

Или же ДНК, которая кодирует реконструированную человеческую L цепь, и ДНК, которая кодирует реконструированную человеческую H цепь, вводятся в единственный вектор экспрессии, клетки-хозяева трансформируются с использованием указанного вектора, и эти трансформированные клетки затем культивируют или in vitro, или in vivo для получения целевых реконструированных антител. Or, the DNA that encodes the reconstructed human L chain and the DNA that encodes the reconstructed human H chain are introduced into a single expression vector, the host cells are transformed using the specified vector, and these transformed cells are then cultured either in vitro or in vivo for obtaining targeted reconstructed antibodies.

Химерные антитела или реконструированные человеческие антитела, полученные таким образом, могут быть выделены и очищены обычными методами, такими как аффинная хроматография с протеином А, ионообменная хроматография или гельфильтрация. Chimeric antibodies or reconstructed human antibodies thus obtained can be isolated and purified by conventional methods, such as protein A affinity chromatography, ion exchange chromatography or gel filtration.

Химерную L цепь или реконструированную человеческую L цепь данного изобретения можно использовать для получения полных антител путем соединения с H цепью. Подобным же образом химерную H цепь или реконструированную человеческую H цепь данного изобретения можно использовать для получения полных антител путем соединения с L цепью. The chimeric L chain or reconstructed human L chain of the present invention can be used to obtain complete antibodies by connecting to the H chain. Similarly, the chimeric H chain or the reconstructed human H chain of the present invention can be used to produce complete antibodies by connecting to the L chain.

Мышиная V область L цепи, реконструированная человеческая V область L цепи, мышиная V область H цепи и реконструированная человеческая V область H цепи являются по своей природе областями, которые связывают антиген в виде человеческого ИЛ-8. Полагают, что они будут применяться в качестве фармацевтических препаратов, диагностических средств и т.д. сами по себе или в форме слитого белка с другими протеинами. The murine V region of the L chain, the reconstructed human V region of the L chain, the mouse V region of the H chain and the reconstructed human V region of the H chain are inherently regions that bind the antigen in the form of human IL-8. They are believed to be used as pharmaceuticals, diagnostics, etc. alone or in the form of a fusion protein with other proteins.

Кроме того, CDR V области L цепи и CDR V области H цепи данного изобретения являются также по своей природе частями, которые связывают антиген в виде человеческого ИЛ-8. Считают, что они будут применяться в качестве фармацевтических препаратов, диагностических средств и т.д. сами по себе или в форме слитого белка с другими протеинами. In addition, the CDR V region of the L chain and CDR V region H of the chain of the present invention are also in nature parts that bind the antigen in the form of human IL-8. It is believed that they will be used as pharmaceuticals, diagnostics, etc. alone or in the form of a fusion protein with other proteins.

ДНК, которая кодирует мышиную V область L цепи данного изобретения, применима для получения ДНК, которая кодирует химерную L цепь, или ДНК, которая кодирует реконструированную человеческую L цепь. Подобным же образом, ДНК, которая кодирует V область мышиной H цепи применима для получения ДНК, которая кодирует химерную H цепь, или ДНК, которая кодирует реконструированную человеческую H цепь. К тому же ДНК, которая кодирует CDR V области L цепи данного изобретения, применима для получения ДНК, которая кодирует реконструированную человеческую V область L цепи, или ДНК, которая кодирует реконструированную человеческую L цепь. DNA that encodes a murine V region L chain of the present invention is useful for producing DNA that encodes a chimeric L chain, or DNA that encodes a reconstructed human L chain. Similarly, DNA that encodes the V region of a murine H chain is useful for producing DNA that encodes a chimeric H chain, or DNA that encodes a reconstructed human H chain. In addition, DNA that encodes a CDR V region L region of the chain of the present invention is useful for producing DNA that encodes a reconstructed human V region L chain, or DNA that encodes a reconstructed human L chain.

Подобным же образом, ДНК, которая кодирует CDR V области H цепи данного изобретения, применима для получения ДНК, которая кодирует реконструированную человеческую V область H цепи, и ДНК, которая кодирует реконструированную человеческую H цепь. Кроме того, реконструированные человеческие антитела F(ab')2, Fab или Fv, или одиночную цепь, Fv, которая связывается как с Fv H цепи, так и L цепи, могут продуцироваться подходящими клетками-хозяевами и использоваться для целей, описанных выше (см., например. Bird R.E. et al., TIBTECH, 9, 132-137, 1991).Similarly, DNA that encodes a CDR V region H region of the chain of the present invention is useful for producing DNA that encodes a reconstructed human V region H chain and DNA that encodes a reconstructed human H chain. In addition, reconstructed human antibodies F (ab ') 2 , Fab or Fv, or a single chain, Fv, which binds to both the Fv H chain and the L chain, can be produced by suitable host cells and used for the purposes described above ( see, for example, Bird RE et al., TIBTECH, 9, 132-137, 1991).

Одинарная цепь Fv образуется путем связывания V области H цепи и V области L цепи реконструированного человеческого антитела к человеческому ИЛ-8. В этой одинарной цепи Fv V область H цепи и V область L цепи связаны с помощью линкера, и предпочтительно, с помощью пептидного линкера (Huston J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988). A single Fv chain is formed by linking the V region of the H chain and the V region of the L chain of the reconstructed human anti-human IL-8 antibody. In this single Fv chain, the V region of the H chain and the V region of the L chain are linked by a linker, and preferably by a peptide linker (Huston JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988 )

V область H цепи и V область L цепи этой одиночной цепи Fv может быть одной из вышеупомянутых V областей H цепи и L цепи реконструированных человеческих антител. Конкретные примеры этого включают V области H цепи, образованные аминокислотными последовательностями, описанными в ПОСЛ ИД NN 38, 41, 44, 45, 48, 51 и 54, и одинарную цепь Fv, содержащую V область L цепи, образованную аминокислотными последовательностями, описанными в ПОСЛ ИД NN 62 или 65 (см. WO88-01649). The V region H chain and V region L chain of this single Fv chain may be one of the aforementioned V regions H chain and L chain of reconstructed human antibodies. Specific examples of this include V region H chains formed by the amino acid sequences described in SEQ ID NOS 38, 41, 44, 45, 48, 51 and 54, and a single Fv chain containing the V region L chain formed by the amino acid sequences described in SEQ ID NN 62 or 65 (see WO88-01649).

Эти V области, предпочтительно, связаны пептидным линкером. Примеры пептидных линкеров, которые для этого используются, включают любой произвольный с единственной цепью пептид, образованный, например, остатками 12-19 (см. WO88-09344). These V regions are preferably linked by a peptide linker. Examples of peptide linkers that are used for this include any single-chain peptide formed, for example, by residues 12-19 (see WO88-09344).

ДНК, которая кодирует одинарную цепь Fv, получена путем использования ДНК, которая кодирует H цепь или V область H цепи, и ДНК, которая кодирует L цепь или V область L цепи вышеупомянутых реконструированных человеческих антител, в качестве матрицы, амплификации части ДНК, которая кодирует те аминокислотные последовательности, которые желательны, используя праймерную пару, которая определяет оба конца, с помощью ПЦР, и амплификации путем соединения праймерной пары, которая определяет ДНК, которая кодирует полипептидный линкер вместе с обоими этими концами, так чтобы соответственно связать H и L цепи. DNA that encodes a single Fv strand is obtained by using DNA that encodes an H chain or V region H chain, and DNA that encodes an L chain or V region L chain of the aforementioned reconstructed human antibodies, as a matrix, amplification of the part of DNA that encodes those amino acid sequences that are desired using a primer pair that defines both ends using PCR and amplification by connecting a primer pair that defines DNA that encodes a polypeptide linker together with both at the ends, so that respectively connect the H and L chains.

К тому же, если получены ДНК, которые кодируют одинарную цепь Fv, вектор экспрессии, который их содержит, вместе с клеткой-хозяином, которая трансформирована указанным вектором экспрессии, могут быть получены обычными методами. Кроме того, одинарная цепь Fv может быть получена обычными методами с использованием этой клетки-хозяина. In addition, if DNA is obtained that encodes a single Fv strand, the expression vector that contains them, together with the host cell, which is transformed with the specified expression vector, can be obtained by conventional methods. In addition, a single Fv chain can be obtained by conventional methods using this host cell.

По сравнению с молекулами антител одинарные цепи Fv проявляют лучшее проникновение в ткань, и предполагается, что они будут использоваться при визуализации с помощью радиоизотопной метки и в качестве терапевтического средства, имеющего функции, сходные с реконструированными человеческими антителами. Compared to antibody molecules, single Fv chains exhibit better penetration into tissue, and it is expected that they will be used for imaging using a radioisotope tag and as a therapeutic agent that has functions similar to reconstructed human antibodies.

Для подтверждения связывающего действия химерных антител, реконструированных человеческих антител и их F(ab')2, Fab, Fv или одинарной цепи Fv в отношении ИЛ-8 данного изобретения можно использовать ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), EIA (иммуноферментный анализ-ИФА), RIA (радиоиммуноанализ - РИА) или методику с флуоресцентными антителами. Например, в случае применения иммуноферментного анализа с химерными антителами и реконструированными человеческими антителами, человеческий ИЛ-8 добавляют в плату, покрытую поликлональными антителами к человеческому ИЛ-8, добавляют супернатант культуры или очищенный образец клеток, которые продуцируют химерные антитела или реконструированные человеческие антитела к человеческому ИЛ-8, и добавляют подходящие вторые антитела, которые помечены ферментом, таким как щелочная фосфатаза. После инкубации и промывания платы добавляют субстрат фермента, такой как п-нитрофенилфосфат, с последующим измерением поглощения для оценки активности по связыванию антигена.To confirm the binding effect of chimeric antibodies, reconstructed human antibodies and their F (ab ') 2 , Fab, Fv or a single Fv chain with respect to IL-8 of the present invention, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), EIA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), RIA (radioimmunoassay - RIA) or a technique with fluorescent antibodies. For example, in the case of an enzyme-linked immunosorbent assay with chimeric antibodies and reconstituted human antibodies, human IL-8 is added to a plate coated with polyclonal antibodies to human IL-8, a culture supernatant or a purified sample of cells that produce chimeric antibodies or reconstructed human antibodies to human is added IL-8, and suitable second antibodies are added that are labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase. After incubation and washing of the plate, an enzyme substrate, such as p-nitrophenyl phosphate, is added, followed by absorption measurement to evaluate antigen binding activity.

Активность по подавлению связывания с рецепторами ИЛ-8 химерных антител, реконструированных человеческих антител и их F(ab')2, Fab, Fv или одинарной цепи Fv к человеческому ИЛ-8, оценивают путем обычного определения подавления связывания с лигандными рецепторами. Например, чтобы исследовать подавление связывания ИЛ-8 с рецепторами ИЛ-8 на нейтрофилах, после отделения нейтрофилов, полученных из гепаринизированной крови путем центрифугирования или другими способами, получают суспензию клеток, имеющую соответствующее число клеток, которые можно использовать в вышеназванном исследовании.The activity of inhibiting binding to IL-8 receptors of chimeric antibodies, reconstructed human antibodies and their F (ab ') 2 , Fab, Fv or single chain Fv to human IL-8 is evaluated by the usual determination of ligand receptor binding suppression. For example, in order to investigate the inhibition of IL-8 binding to IL-8 receptors on neutrophils, after separation of neutrophils obtained from heparinized blood by centrifugation or other methods, a cell suspension is obtained having the appropriate number of cells that can be used in the above study.

Раствор, содержащий ИЛ-8, соответственно меченый 125I и тому подобным, и немеченый ИЛ-8 смешивают с раствором, содержащим антитела данного изобретения или их фрагменты, приготовленным в соответствующей концентрации, с последующим добавлением этой смеси к вышеупомянутой суспензии нейтрофилов. После определенного периода времени нейтрофилы отделяются, и определяется активность метки на нейтрофилах.A solution containing IL-8, respectively labeled 125 I and the like, and unlabeled IL-8 are mixed with a solution containing the antibodies of the present invention or fragments thereof, prepared in an appropriate concentration, followed by addition of this mixture to the aforementioned neutrophil suspension. After a certain period of time, the neutrophils separate and the label activity on the neutrophils is determined.

Для оценки подавления хемотаксиса нейтрофилов антителами или их фрагментами данного изобретения можно использовать обычные известные методы, такие как метод, описанный у Grob P.M. et al., J. Biol. Chem., 265, 8311-8316, 1990. To assess the suppression of neutrophil chemotaxis by antibodies or fragments of the present invention, conventional known methods can be used, such as the method described by Grob P.M. et al., J. Biol. Chem., 265, 8311-8316, 1990.

В случае использования коммерчески доступной камеры для хемотаксиса после разведения антител или их фрагментов данного изобретения в подходящей среде культивирования в камеру добавляют ИЛ-8 с последующим добавлением разведения антител или фрагментов. Затем в камеру добавляют приготовленную суспензию нейтрофилов и оставляют стоять в течение определенного периода времени. Так как мигрирующие нейтрофилы удерживаются на фильтре, помещенном в камере, число таких нейтрофилов может быть определено обычными методами, такими как окрашивание или методы с флуоресцентными антителами. Кроме того, количественное определение может быть выполнено с помощью оценки под микроскопом или с помощью автоматического измерения с использованием какого- либо аппарата. If a commercially available chemotaxis chamber is used after diluting the antibodies or fragments of the present invention in a suitable culture medium, IL-8 is added to the chamber, followed by dilution of the antibodies or fragments. Then, the prepared neutrophil suspension is added to the chamber and left to stand for a certain period of time. Since migrating neutrophils are retained on a filter placed in the chamber, the number of such neutrophils can be determined by conventional methods such as staining or fluorescence antibody methods. In addition, quantitative determination can be carried out using an evaluation under a microscope or using automatic measurement using any apparatus.

После стерилизации путем фильтрования с использованием мембранного фильтра химерные антитела, реконструированные человеческие антитела и их фрагменты F(ab')2, Fab, Fv или Fv с одинарной цепью к человеческому ИЛ-8 данного изобретения можно вводить в виде фармацевтического терапевтического препарата, предпочтительно парентерально, путем, например, внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции или подкожной инъекции, или интратрахеально, с помощью, например, ингалятора. Хотя и изменяясь в зависимости от возраста и симптоматики пациента, нормальная дозировка у людей составляет 1-1000 мг/организм, для чего может быть выбрано разделение на дозы, равные 1-10 мг/кг/неделю.After sterilization by filtration using a membrane filter, chimeric antibodies, reconstituted human antibodies and their F (ab ′) 2 , Fab, Fv or Fv single chain human fragments IL-8 of the present invention can be administered as a pharmaceutical therapeutic agent, preferably parenterally, by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection or subcutaneous injection, or intratracheally, using, for example, an inhaler. Although changing depending on the age and symptoms of the patient, the normal dosage in humans is 1-1000 mg / body, for which a division into doses of 1-10 mg / kg / week can be chosen.

После оценки их очищающей связывающей активности химерные антитела, реконструированные человеческие антитела к человеческому ИЛ-8 и их фрагменты F(ab')2, Fab, Fv или Fv с одинарной цепью можно изготовить в виде фармацевтического терапевтического препарата с помощью методов, обычно используемых для производства препаратов физиологически активных белков. Например, препарат для инъекций состоит из очищенных химерных антител, реконструированных человеческих антител к человеческому ИЛ-8 или их фрагментов F(ab')2, Fab, FV или FV с одинарной цепью, растворенных в растворителе, таком как физиологический раствор или буфер, с добавлением антиадсорбционного средства, такого как твин 80, желатин или человеческий сывороточный альбумин (ЧСА). Или же этот препарат может быть также лиофилизированным для растворения и приготовления перед использованием. Примеры носителей, которые могут использоваться для лиофилизации, включают сахара-спирты или сахара, такие как маннит и глюкоза.After evaluating their cleansing binding activity, chimeric antibodies, reconstituted human antibodies to human IL-8 and their single chain F (ab ') 2 , Fab, Fv or Fv fragments can be formulated as pharmaceutical therapeutic agents using methods commonly used in the manufacture of preparations of physiologically active proteins. For example, an injection preparation consists of purified chimeric antibodies, reconstructed human antibodies to human IL-8, or fragments thereof F (ab ′) 2 , Fab, FV or FV single chain, dissolved in a solvent such as saline or buffer, with adding an anti-adsorption agent such as tween 80, gelatin or human serum albumin (HSA). Alternatively, this preparation may also be lyophilized for dissolution and preparation before use. Examples of carriers that can be used for lyophilization include sugar alcohols or sugars such as mannitol and glucose.

Хотя последующее представляет собой детальное объяснение данного изобретения через его осуществления, описанные ниже, объем данного изобретения не ограничивается этими примерами. Although the following is a detailed explanation of the present invention through its implementation, described below, the scope of the present invention is not limited to these examples.

Пример 1: Клонирование ДНК, кодирующей V область мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8
ДНК, которая кодирует вариабельную область мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8, клонировали способом, описанным ниже.Example 1: Cloning of DNA encoding the V region of murine monoclonal antibodies to human IL-8
DNA that encodes the variable region of murine monoclonal antibodies to human IL-8 was cloned by the method described below.

1. Получение всей PHK
Всю PHK получали из гибридомы WS-4 с помощью модификации метода центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия Chirgwin J.M., et al., описанному в Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979.1. Getting the whole PHK
All PHK was obtained from the WS-4 hybridoma using a modification of the density gradient centrifugation method of cesium chloride Chirgwin JM, et al. Described in Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979.

А именно 1 • 107 клеток гибридомы WS-4 полностью гомогенизировали в 25 мл 4 b гуанидина тиоцианата (Fluka). Гомогенат наслаивали на 5,7 М раствор хлорида цезия в центрифужной пробирке с последующим осаждением PHK путем центрифугирования в течение 14 часов при 20oC при 31000 об/мин в роторе Beckman SW40.Namely, 1 • 10 7 cells of the WS-4 hybridoma were fully homogenized in 25 ml of 4 b guanidine thiocyanate (Fluka). The homogenate was layered on a 5.7 M solution of cesium chloride in a centrifuge tube, followed by precipitation of PHK by centrifugation for 14 hours at 20 ° C at 31,000 rpm in a Beckman SW40 rotor.

Осадок PHK промывали 80% этанолом и затем растворяли в 200 мкл 20 мМ раствора Трис-HCl (pH 7,5), содержащего 10 мМ ЭДТА и 0,5% N-лаурилсаркозината натрия. После добавления протеиназы (Boeringer) до концентрации, равной 0,5 мг/мл, полученную в результате смесь инкубировали в водяной бане при 37oC в течение 30 минут. Смесь экстрагировали фенолом и хлороформом, и PHK осаждали этанолом. Затем осадок PHK растворяли в 200 мкл 10 мМ раствора Трис-HCl (pH 7,5), содержащего 1 мМ ЭДТА.The PHK precipitate was washed with 80% ethanol and then dissolved in 200 μl of a 20 mM Tris-HCl solution (pH 7.5) containing 10 mM EDTA and 0.5% sodium N-lauryl sarcosinate. After the addition of proteinase (Boeringer) to a concentration of 0.5 mg / ml, the resulting mixture was incubated in a water bath at 37 ° C. for 30 minutes. The mixture was extracted with phenol and chloroform, and PHK was precipitated with ethanol. The PHK pellet was then dissolved in 200 μl of a 10 mM Tris-HCl solution (pH 7.5) containing 1 mM EDTA.

2. Экстракция матричной РНК (мРНК)
Чтобы экстрагировать мРНК, кодирующую H цепь мышиных моноклональных антител WS-4, поли-(А)-положительную мРНК экстрагировали из всей РНК, полученной на стадии 1, выше, используя набор для выделения мРНК Fast Track, вариант 3,2 (Invitrogen) и следуя процедуре, описанной в инструкциях производителя.2. Extraction of messenger RNA (mRNA)
To extract mRNA encoding the H chain of mouse WS-4 monoclonal antibodies, a poly- (A) -positive mRNA was extracted from all RNA obtained in step 1 above using the Fast Track mRNA isolation kit option 3.2 (Invitrogen) and following the procedure described in the manufacturer's instructions.

3. Синтез однонитевой кДНК. 3. Synthesis of single-stranded cDNA.

Однонитевую кДНК синтезировали из примерно 40 нг мРНК, полученной на стадии 2, выше, используя набор с DNA Cycle (Invitrogen) и следуя процедуре, описанной в инструкциях. Полученный продукт затем использовали для амплификации кДНК, которая кодирует мышиную V область H цепи. Кроме того, чтобы амплифицировать кДНК, которая кодирует мышиную V область L цепи, была синтезирована однонитевая кДНК из примерно 10 мкг вышеназванной всей РНК. Single-stranded cDNA was synthesized from about 40 ng of mRNA obtained in step 2 above using the DNA Cycle kit (Invitrogen) and following the procedure described in the instructions. The resulting product was then used to amplify a cDNA that encodes a murine V region H chain. In addition, in order to amplify a cDNA that encodes a murine V region L chain, a single-stranded cDNA was synthesized from about 10 μg of the above total RNA.

4. Амплификация гена, кодирующего вариабельную область антитела, с помощью ПЦР
1) Амплификация кДНК, кодирующей мышиную V область H цепи
Праймеры MHv (мышиной тяжелой вариабельной) с 1 по 12, показанные в ПОСЛ ИД NN: с 13 по 24 и праймер MHC (мышиной тяжелой константной), показанный в ПОСЛ ИД N: 25 (Jones S.Т., et al., Bio/Tichnology, 9, 88-89, 1991), использовали для праймеров ПЦР. 100 мкл раствора ПЦР, содержащих 10 мМ Трис-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 0,1 мМ дНТФ (дАТФ, дГТФ, ДЦТФ, дТТФ), 1,5 мМ MgCl2, 0,001% (вес/объем) желатин, 5 единиц ДНК-полимеразы AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus), 0,25 мМ одного из MHv праймеров, показанных в ПОСЛ ИД NN: с 13 по 24, 75 мкМ MCH праймера, показанного в ПОСЛ ИД N: 25, и 1,5 мкл раствора однонитевой кДНК, полученной на стадии 3, выше. Растворы ПЦР готовили для каждого из праймеров MHV 1-12. После покрытия каждого раствора 50 мкл минерального масла его нагревали в течение по порядку 3 минуты при первоначальной температуре, равной 94oC, с последующим циклом из 1 минуты при 94oC, 1 минуты при 55oC и 1 минуты при 72oC. После повторения этого цикла нагревания 30 раз реакционную смесь далее инкубировали в течение 10 минут при 72oC.4. Amplification of a gene encoding the variable region of an antibody using PCR
1) Amplification of cDNA encoding murine V region H chain
Primers MH v (mouse heavy variable) from 1 to 12 shown in SEQ ID NN: 13 to 24 and the primer MHC (mouse heavy constant) shown in SEQ ID N: 25 (Jones S.T., et al., Bio / Tichnology, 9, 88-89, 1991), used for PCR primers. 100 μl of PCR solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 0.1 mM dNTP (dATP, dGTP, DCTF, dTTP), 1.5 mM MgCl 2 , 0.001% (weight / volume ) gelatin, 5 units of AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Elmer Cetus), 0.25 mM of one of the MH v primers shown in SEQ ID NN: 13 to 24, 75 μM MCH primer shown in SEQ ID N: 25, and 1.5 μl of a single-stranded cDNA solution obtained in step 3 above. PCR solutions were prepared for each of the primers MH V 1-12. After each solution was coated with 50 μl of mineral oil, it was heated for 3 minutes at an initial temperature of 94 ° C, followed by a cycle of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C. After repeating this heating cycle 30 times, the reaction mixture was further incubated for 10 minutes at 72 o C.

2) Амплификация кДНК, кодирующей мышиную V область L цепи
Праймеры MKv (мышиной каппа вариабельной) с 1 по 11, показанные в ПОСЛ ИД NN: 1 по 11 и праймер MKC (мышиной каппа константной), показанный в ПОСЛ ИД N: 12 (Jones S.T. et al., Bio/Technology, 9, 88-89, 1991) как праймеры в ПЦР.2) Amplification of cDNA encoding a murine V region L chain
Primers MK v (mouse variable kappa) 1 to 11 shown in SEQ ID NN: 1 to 11 and MKC primer (mouse kappa constant) shown in SEQ ID N: 12 (Jones ST et al., Bio / Technology, 9 , 88-89, 1991) as primers in PCR.

Амплификацию кДНК производили из 2 мкл однонитевой кДНК, полученной на стадии 3 выше, с использованием того же метода, который описан для амплификации гена V области H цепи на стадии 4, часть (1), выше, за исключением того, что амплификацию выполняли, используя 0,25 мкМ каждой из смесей праймеров MKv и 3,0 мкМ праймера МСК. Amplification of cDNA was performed from 2 μl of single-stranded cDNA obtained in step 3 above using the same method as described for amplification of the V region H chain gene in step 4, part (1), above, except that amplification was performed using 0.25 μM of each of the mixtures of MKv primers and 3.0 μM of MSC primer.

5. Очистка и фрагментация продукта ПЦР
Соответствующие фрагменты ДНК V области H цепи и V области L цепи, амплифицированные с помощью ПЦР, как описано выше, разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием 1,5% агарозы (Sigma) с низкой температурой плавления. Куски агарозы, содержащие фрагмент ДНК H цепи длиной примерно 450 по и фрагмент ДНК L цепи длиной примерно в 400 по вырезали отдельно и расплавляли в течение 5 минут при 65oC с последующим добавлением равного объема 20 мМ Трис-HCl (pH 7,5), содержащего 2 мМ ЭДТУ и 300 мМ NaCl.5. Purification and fragmentation of the PCR product
The corresponding DNA fragments of V region H chain and V region L chain amplified by PCR as described above were separated by agarose gel electrophoresis using 1.5% low melting point agarose (Sigma). Pieces of agarose containing an H chain DNA fragment of about 450 po and an L chain DNA fragment of about 400 po were cut separately and melted for 5 minutes at 65 ° C followed by the addition of an equal volume of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 2 mm EDTU and 300 mm NaCl.

Эту смесь экстрагировали фенолом и хлороформом, фрагменты ДНК выделяли путем осаждения этанолом и растворяли в 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5), содержащем 1 мМ ЭДТУ. Затем фрагменты расщепляли в течение 3 часов при 37oC с применением 5 единиц рестрикционного фермента Xmal (New England BioLabs) в 10 мМ Трис-HCl (pH 7,9), содержащем 10 мМ MgCL2 и 1 мМ дитиотреитола. Затем фрагменты ДНК расщепляли в течение 2 часов при 37oC с помощью 40 единиц рестрикционного фермента SalI (Takara Shuzo), и полученные фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле с применением 1,5% агарозы (Sigma) с низкой температурой плавления.This mixture was extracted with phenol and chloroform, DNA fragments were isolated by ethanol precipitation and dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 1 mM EDTA. The fragments were then cleaved for 3 hours at 37 ° C. using 5 Xmal restriction enzyme units (New England BioLabs) in 10 mM Tris-HCl (pH 7.9) containing 10 mM MgCL 2 and 1 mM dithiothreitol. The DNA fragments were then digested for 2 hours at 37 ° C. using 40 SalI restriction enzyme units (Takara Shuzo), and the obtained DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis using 1.5% agarose (Sigma) with a low melting point.

Куски агарозы, содержащие фрагменты ДНК, вырезали и расплавляли в течение 5 минут при 65o с последующим добавлением равного объема 20 мМ Трис-HCl (pH 7,5), содержащего 2 мМ ЭДТА и 300 мМ NaCl. Эту смесь затем экстрагировали фенолом и хлороформом, фрагменты ДНК выделяли осаждением этанолом и растворяли в 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5), содержащем ЭДТУ.Pieces of agarose containing DNA fragments were excised and melted for 5 minutes at 65 ° , followed by the addition of an equal volume of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 2 mM EDTA and 300 mM NaCl. This mixture was then extracted with phenol and chloroform, DNA fragments were isolated by ethanol precipitation and dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing EDTA.

Таким образом, соответственно получили фрагмент ДНК, содержащий ген, который кодирует мышиную V область L цепи к-типа, и фрагмент ДНК, содержащий ген, который кодирует мышиную V область H цепи. Вышеназванные фрагменты ДНК, оба имеют сайт присоединения SalI на их 5' конце и сайт присоединения XmaI на их 3' конце. Thus, a DNA fragment containing a gene that encodes a murine V region of the k-type chain L and a DNA fragment containing a gene that encodes a murine V region of the H chain are respectively obtained. The above DNA fragments, both have a SalI attachment site at their 5 'end and an XmaI attachment site at their 3' end.

6. Сцепление и трансформация
Примерно 0,3 мкг фрагмента ДНК SalI-XmaI, содержащего ген, который кодирует мышиную V область L цепи каппа-типа, полученные способом, описанным выше, смешивали с примерно 0,1 мкг вектора pUC19 (Takara Shuzo), подготовленного путем расщепления с помощью SalI, XmaI и щелочной фосфатазы Escherichia coli (ВАР; Takara Shuzo) в течение 4 часов при 16oC в буферной реакционной смеси, содержащей 1 единицу ДНК-лигазы T4 (Gibco BRL), и добавляли прилагаемый буфер для связывания.6. Grip and transformation
Approximately 0.3 μg of the SalI-XmaI DNA fragment containing the gene that encodes the Kappa type L murine V region L obtained by the method described above was mixed with approximately 0.1 μg of the pUC19 vector (Takara Shuzo) prepared by digestion with SalI, XmaI, and Escherichia coli alkaline phosphatase (BAP; Takara Shuzo) for 4 hours at 16 ° C in a buffer reaction mixture containing 1 unit of T4 DNA ligase (Gibco BRL), and the attached binding buffer was added.

Затем вышеупомянутую смесь для связывания добавляли к 50 мкл компетентных клеток Е. Coli DH5 α (GIBCO BRL), после чего клетки оставляли стоять в течение 30 минут на льду, в течение 1 минуты при 42oC и опять на льду в течение 1 минуты. Затем добавляли 400 мкл 2 х YT среды (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). После инкубации в течение 1 часа при 37oC Е. Coli распределяли на 2 х агаризованной среды YT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей 50 мкг/мл ампициллина (Meiji Seika), с последующей инкубацией в течение ночи при 37oC для получения трансформанта Е. Coli.Then, the above binding mixture was added to 50 μl of competent E. Coli DH5α cells (GIBCO BRL), after which the cells were left to stand for 30 minutes on ice, for 1 minute at 42 ° C. and again on ice for 1 minute. Then 400 μl of 2 x YT medium was added (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). After incubation for 1 hour at 37 ° C, E. Coli was dispensed onto 2 x YT agar medium (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) containing 50 μg / ml ampicillin ( Meiji Seika), followed by overnight incubation at 37 ° C. to obtain E. Coli transformant.

Затем в это время применяли X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозид, Takara Shuzo) в качестве маркера селекции. Then, X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside, Takara Shuzo) was used as a selection marker at this time.

Этот трансформант инкубировали в течение ночи при 37oC в 10 мл 2 х среды YT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, и из этой культуры получали плазмидную ДНК с использованием набора QIAGEN Plasmid Mini Kit (QIAGEN) и следуя процедуре, описанной в инструкциях.This transformant was incubated overnight at 37 ° C in 10 ml of 2 x YT medium containing 50 μg / ml ampicillin, and plasmid DNA was obtained from this culture using the QIAGEN Plasmid Mini Kit (QIAGEN) and following the procedure described in the instructions.

Плазмиду, содержащую ген, который кодирует мышиную V область L цепи к-типа, происходящую из гибридомы WS-4, полученную таким образом, назвали pUC-WS4-VL. A plasmid containing a gene that encodes a murine V region of the L type k-chain, derived from a WS-4 hybridoma, thus obtained, was called pUC-WS4-VL.

Плазмиду, содержащую ген, который кодирует мышиную V область H цепи, происходящую из гибридомы WS-4, получали из фрагментов ДНК SalI-XmaI, следуя тому же методу, который описан выше, за исключением использования JM109 для компетентных клеток Е. coli. Полученную плазмиду назвали pUC-WS4-VH. A plasmid containing a gene that encodes a murine V region H chain derived from a WS-4 hybridoma was obtained from SalI-XmaI DNA fragments following the same method as described above, except for the use of JM109 for competent E. coli cells. The resulting plasmid was named pUC-WS4-VH.

Пример 2: Определение нуклеотидной последовательности ДНК
Нуклеотидную последовательность кодирующей области кДНК в вышеназванных плазмидах определяли, используя M13 праймер RV и M13 праймер M4 (оба Takara Shuzo) в качестве праймеров последовательности, автоматический секвенатор ДНК (Applied Biosystems Inc.) и набор Taq Dye Deoxy Tertinator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Inc.) и следуя протоколу, описанному производителями. Нуклеотидная последовательность гена, который кодирует V область L цепи мышиных моноклональных антител WS-4, содержащаяся в плазмиде pUC-WS4-VL, показана в ПОСЛ ИД N: 26. Кроме того, нуклеотидная последовательность гена, который кодирует V области H цепи мышиных моноклональных антител, содержащаяся в плазмиде pUC-WS4-VH, показана в ПОСЛ ИД N: 27.Example 2: Determination of the nucleotide sequence of DNA
The nucleotide sequence of the cDNA coding region in the above plasmids was determined using M13 RV primer and M13 M4 primer (both Takara Shuzo) as sequence primers, automatic DNA sequencer (Applied Biosystems Inc.) and Taq Dye Deoxy Tertinator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem .) and following the protocol described by the manufacturers. The nucleotide sequence of the gene that encodes the V region L of the WS-4 mouse monoclonal antibody chain contained in the plasmid pUC-WS4-VL is shown in SEQ ID N: 26. In addition, the nucleotide sequence of the gene that encodes the V region H of the mouse monoclonal antibody chain contained in the plasmid pUC-WS4-VH shown in SEQ ID N: 27.

Пример 3: Определение CDR
Основная структура V областей L и H цепей имеет взаимные сходства, причем каждая имеет четыре каркасные области, связанные с помощью трех гипервариабельных областей, областей, определяющих комплементарность (CDR). Хотя аминокислотная последовательность каркасной области относительно хорошо сохраняется, изменчивость аминокислотной последовательности областей CDR чрезвычайно высока (Kabat Е.А. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Of Health and Human Services, 1991).Example 3: Definition of CDR
The basic structure of the V regions of the L and H chains has mutual similarities, each of which has four frame regions linked by three hypervariable regions, complementarity determining regions (CDRs). Although the amino acid sequence of the framework region is relatively well preserved, the variability of the amino acid sequence of CDR regions is extremely high (Kabat, E.A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Of Health and Human Services, 1991).

На основании этого факта были определены CDR, которые показаны в таблице 5, путем исследования их гомологии при попытках подобрать аминокислотную последовательность вариабельной области мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8 с помощью базы данных аминокислотных последовательностей антител, полученных Kabat et al. Based on this fact, the CDRs shown in Table 5 were determined by examining their homology when trying to select the amino acid sequence of the variable region of murine monoclonal antibodies to human IL-8 using the database of amino acid sequences of antibodies obtained by Kabat et al.

Пример 4: Подтверждение экспрессии клонированной кДНК (получение химерных WS-4 антител)
Получение вектора экспрессии
Чтобы получить вектор, который экспрессирует химерные WS-4 антитела, клоны кДНК pUC-WS4-VL и pUC-WS4-VH, которые кодируют V области L цепи и H цепи мышиных WS-4, соответственно, были модифицированы с помощью ПЦР. Затем они были введены в вектор экспрессии HEF (см. ранее описанный, WО92-19759 и фиг. 1)
Обратный праймер (ПОСЛ ИД N: 28) для V области L цепи и обратный праймер (ПОСЛ ИД N: 29) для V области H цепи были соответственно гибридизованы с ДНК, которая кодирует стартовую из лидерной последовательности V области, и конструировали так, чтобы имелась консенсусная последовательность Козака (Kozak М. et al. , J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) и сайт рестрикции HindIII. Прямой праймер (ПОСЛ ИД N: 30) для V области L цепи и прямой праймер (ПОСЛ ИД N: 31) для V области H цепи гибридизовали с последовательностью ДНК, которая кодирует терминальную J цепь, и конструировали так, чтобы добавить сплайсинговую донорную последовательность и сайт рестрикции BamHI.Example 4: Confirmation of the expression of cloned cDNA (obtaining chimeric WS-4 antibodies)
The expression vector
To obtain a vector that expresses chimeric WS-4 antibodies, pUC-WS4-VL and pUC-WS4-VH cDNA clones that encode murine WS-4 region V chain L and H chains, respectively, were modified by PCR. They were then introduced into the HEF expression vector (see previously described, WO92-19759 and FIG. 1)
The reverse primer (SEQ ID N: 28) for the V region of the L chain and the reverse primer (SEQ ID N: 29) for the V region of the H chain were respectively hybridized with DNA that encodes a start from the leader sequence of the V region, and designed to have Kozak consensus sequence (Kozak M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) and the HindIII restriction site. The forward primer (PEFC ID N: 30) for the V region L chain and the forward primer (PEFC ID N: 31) for the V region H chain were hybridized with a DNA sequence that encodes a terminal J chain and designed to add a spliced donor sequence and BamHI restriction site.

100 мкл реакционной смеси ПЦР, содержащей 20 мМ Трис-HCl (pH 8,2), 10 мМ KCl, 6 мМ (NH4)2SO4, 1% Тритон X-100, 100 мкМ дНТФ, 1,5 мМ MgCl2, 100 пмолей каждого праймера, 100 нг матричной ДНК (pUC-VL или pUC-VH) и 2,5 Ед фермента AmpliTaq, покрывали 50 мкл минерального масла. После первоначальной денатурации в течение 3 минут при 94oC цикл нагревания, состоящий из 1 минуты при 94oC, 1 минуты при 55oC и 1 минуты при 72oC, повторяли 30 раз с последующей конечной инкубацией в течение 10 минут при 72oC.100 μl PCR reaction mixture containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.2), 10 mM KCl, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 1% Triton X-100, 100 μM dNTP, 1.5 mM MgCl 2 , 100 pmoles of each primer, 100 ng of template DNA (pUC-VL or pUC-VH) and 2.5 U of AmpliTaq enzyme were coated with 50 μl of mineral oil. After an initial denaturation of 3 minutes at 94 ° C, a heating cycle consisting of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C was repeated 30 times, followed by final incubation for 10 minutes at 72 o C.

Продукт ПЦР очищали, используя 1,5% агарозной гель с низкой температурой плавления с последующим расщеплением с помощью HindIII и BamHI. Ген V области L цепи клонировали в вектор экспрессии HEF, HEF-VL-gк, тогда как ген V области H цепи клонировали в HEF вектор экспрессии HEF-VH-gγ1. После определения последовательностей ДНК плазмиды, содержащие фрагмент ДНК, имеющий правильную последовательность ДНК, были названы HEF-chW4L-gк и HEF-chW4H-gγ1, соответственно. The PCR product was purified using a 1.5% low melting point agarose gel followed by digestion with HindIII and BamHI. The V chain L region V gene was cloned into an HEF expression vector, HEF-VL-gk, while the H chain V region gene was cloned into an HEF expression vector of HEF-VH-gγ1. After determining the DNA sequences of the plasmid containing the DNA fragment having the correct DNA sequence, HEF-chW4L-gk and HEF-chW4H-gγ1, respectively, were named.

Трансфекция в клетки COS
Чтобы увидеть временную экспрессию химерных антител WS-4, вышеназванные векторы экспрессии испытывали в клетках COS. HEF-chWS4L-gк и HEF-chW4H-gγ1 одновременно трансфицировали в клетки COS путем электропорации, используя систему Gene Pulser (Biorad). Каждую ДНК (10 мкг) добавляли к 0,8 мл образца, содержащего 1•107 клеток/мл в фосфатно-буферном физрастворе (ФБФР) и затем подвергали пульсации при 1,5 кВ с емкостью 25 мкФ.Transfection into COS Cells
To see the transient expression of WS-4 chimeric antibodies, the above expression vectors were tested in COS cells. HEF-chWS4L-gk and HEF-chW4H-gγ1 were simultaneously transfected into COS cells by electroporation using the Gene Pulser system (Biorad). Each DNA (10 μg) was added to 0.8 ml of a sample containing 1 • 10 7 cells / ml in phosphate buffered saline (PBS) and then subjected to pulsation at 1.5 kV with a capacity of 25 μF.

После того, как их оставляли стоять в течение периода времени, равного 10 минутам, при комнатной температуре, электропорированные клетки суспендировали в 15 мл среды культивирования DMEM (GIBCO), содержащей 5% бычьей плодной сыворотки, освобожденной от γ-глобулина, помещенных в чашку для тканевой культуры. После инкубации в течение 96 часов культуральную среду собирали, остатки клеток удаляли путем центрифугирования и супернатант затем отфильтровывали с помощью дискового фильтра, имеющего диаметр пор, равный 0,45 мкм (Gelman Science). After they were left to stand for 10 minutes at room temperature, electroporated cells were suspended in 15 ml of DMEM cultivation medium (GIBCO) containing 5% bovine fetal serum freed from γ-globulin placed in a cup tissue culture. After incubation for 96 hours, the culture medium was collected, the remaining cells were removed by centrifugation, and the supernatant was then filtered using a disk filter having a pore diameter of 0.45 μm (Gelman Science).

ELISA
Платы для ELISA для количественного определения связывания антигена и концентрации антител готовили, как описано ниже. Платы для ELISA для определения активности связывания антигена были подготовлены следующим образом. После образования твердого слоя в каждую ячейку 96-ячеечной платы (Nunc) со 100 мкл козьих поликлональных антител к человеческому ИЛ-8 (R & D Systems), растворенных в твердом слое буфера при концентрации, равной 2 мкг/мл (0,1 М бикарбонат натрия, 0,02% азид натрия) и блокирования с помощью 200 мкл буфера для разведений (50 мМ Трис-HCl (pH 7,2), 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ MgCl2, 0,15 М NaCl, 0,05% Твин 20 и 0,02% азид натрия) добавляли 100 мкл рекомбинантного человеческого ИЛ-8 (Amersham) (5 нг/мл).ELISA
ELISA plates for quantifying antigen binding and antibody concentration were prepared as described below. ELISA boards for determining antigen binding activity were prepared as follows. After the formation of a solid layer in each cell of a 96-cell plate (Nunc) with 100 μl of goat polyclonal antibodies to human IL-8 (R & D Systems), dissolved in a solid layer of buffer at a concentration of 2 μg / ml (0.1 M sodium bicarbonate, 0.02% sodium azide) and blocking with 200 μl dilution buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.2), 1% bovine serum albumin (BSA), 1 mM MgCl 2 , 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20 and 0.02% Sodium Azide) was added 100 μl of recombinant human IL-8 (Amersham) (5 ng / ml).

Очищенный образец химерных антител или супернатант культуры клеток COS, которые экспрессировали их, разводили серийно и добавляли в каждую ячейку. Затем добавляли 100 мкл меченных щелочной фосфатазой козьих к человеческому IgG антител (TAGO) (1 мкг/мл). После инкубации и промывания добавляли раствор субстрата (1 мг/мл п-нитрофенилфосфата) с последующим измерением поглощения при 405 нм. A purified sample of chimeric antibodies or the supernatant of the COS cell culture that expressed them was serially diluted and added to each well. Then, 100 μl alkaline phosphatase-labeled goats were added to human IgG antibodies (TAGO) (1 μg / ml). After incubation and washing, a substrate solution (1 mg / ml p-nitrophenyl phosphate) was added, followed by measuring absorbance at 405 nm.

Для измерения концентрации антител после образования твердого слоя в ячейках 96-ячеечной платы с помощью 100 мкл козьих к человеческому IgG антител (TAGO) с концентрацией 1 мкг/мл и блокирования, очищенный образец химерных антител или культуральной среды клеток COS, которые экспрессировали их, разводили серийно и добавляли в каждую ячейку. Затем добавляли 100 мкл меченных щелочной фосфатазой козьих к человеческому IgG антител (TAGO) (1 мкг/мл). После инкубации и промывания добавляли раствор субстрата (1 мг/мл п-нитрофенилфосфата) и измеряли поглощение при 405 нм. To measure the concentration of antibodies after solidification in cells of a 96-cell plate using 100 μl of goat anti-human IgG antibodies (TAGO) with a concentration of 1 μg / ml and blocking, a purified sample of chimeric antibodies or culture medium of COS cells that expressed them was diluted serially and added to each well. Then, 100 μl alkaline phosphatase-labeled goats were added to human IgG antibodies (TAGO) (1 μg / ml). After incubation and washing, a substrate solution (1 mg / ml p-nitrophenyl phosphate) was added and the absorbance was measured at 405 nm.

В результате, так как химерные антитела WS-4 продемонстрировали специфическое связывание с ИЛ-8, считали, что эти химерные антитела имеют правильное строение V области мышиных моноклональных антител WS-4 (см. фиг. 2). As a result, since the WS-4 chimeric antibodies showed specific binding to IL-8, it was believed that these chimeric antibodies had the correct structure of the V region of the WS-4 murine monoclonal antibody (see FIG. 2).

Кроме того, Escherichia coli, имеющую вышеупомянутую плазмиду HEF-chWS4L-gк, поместили на хранение как Escherichia coli DH5 α (HEF-chWS4L-gк), a Escherichia coli, имеющую вышеупомянутую плазмиду HEF-chWS4H-gγ1, поместили на хранение как Escherichia coli JM109 (HEF-chWS4H-gγ1) в Индустриальный технологический научно-исследовательский институт биоинженерии Агентства индустриальной науки и технологии (Bioengineering Industrial Technology Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, lbaraki, Japan)) 12 июля 1994 под соответствующими названиями FERM ВР-4739 и FERM ВР-4740 в соответствии с положениями Будапештской Конвенции. In addition, Escherichia coli having the aforementioned HEF-chWS4L-gk plasmid was stored as Escherichia coli DH5 α (HEF-chWS4L-gk), and Escherichia coli having the aforementioned HEF-chWS4H-gγ1 plasmid was stored as Escherichia JM109 (HEF-chWS4H-gγ1) at the Bioengineering Industrial Technology Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, lbaraki, Japan) July 12, 1994 under the corresponding names FERM BP-4739 and FERM BP-4740 in accordance with the provisions of the Budapest Convention.

Пример 5: Получение реконструированных человеческих антител WS-4
Получение V области H цепи реконструированных человеческих антител WS-4
ДНК, которая кодирует V область H цепи реконструированных человеческих антител WS-4, была сконструирована способом, описанным ниже. Полная ДНК, которая кодирует V область H цепи реконструированных человеческих антител, была сконструирована так, что известные последовательности ДНК, которые соответственно кодируют с FR1 по FR3 человеческих антител VDH26 и FR4 человеческих антител 4B4, связаны с последовательностью ДНК, которая кодирует CDR V области H цепи мышиных антител WS-4.Example 5: Obtaining reconstructed human antibodies WS-4
Obtaining V region H chain of reconstructed human antibodies WS-4
DNA that encodes the V region H chain of the reconstituted human WS-4 antibodies was constructed by the method described below. The complete DNA, which encodes the V region H chain of the reconstructed human antibodies, was constructed so that known DNA sequences which respectively encode FR1 through FR3 of the human antibodies VDH26 and FR4 of the human antibodies 4B4 are linked to a DNA sequence that encodes a CDR of the V region H chain mouse antibodies WS-4.

Затем соответственно добавляли сайт распознавания HindIII/консенсусную последовательность Козака и сайт распознавания BamHI/сплайсинговую донорную последовательность на 5' и 3' концы этой последовательности ДНК с последующим введением в вектор экспрессии HEF. Последовательность ДНК, сконструированную таким образом, затем разделяли на четыре примерно равные олигонуклеотида, после чего вторичную структуру этих нуклеотидов, для которых существовала возможность помехи сборки этих олигонуклеотидов, была определена с помощью компьютера. Четыре олигонуклеотидные последовательности показаны в ПОСЛ ИД NN: 32-35. Эти олигонуклеотиды имеют длину, равную 113-143 основаниям, и примыкающие олигонуклеотиды имеют область перекрывания, обычно состоящую из 20 оснований. HF1 (ПОСЛ ИД NN: 32) и HF3 (ПОСЛ ИД NN: 34) из этих четырех олигонуклеотидов имеют смысловую последовательность ДНК, тогда как другие HF2 (ПОСЛ ИД N: 33) и HF4 (ПОСЛ ИД N: 35) имеют антисмысловую последовательность ДНК. Эти олигонуклеотиды были синтезированы с помощью автоматического синтезатора ДНК (Applied Biosystem). Then, respectively, the HindIII recognition site / Kozak consensus sequence and the BamHI recognition site / splice donor sequence at the 5 'and 3' ends of this DNA sequence were added, followed by the introduction of an HEF expression vector. The DNA sequence constructed in this way was then divided into four approximately equal oligonucleotides, after which the secondary structure of these nucleotides, for which there was the possibility of interference with the assembly of these oligonucleotides, was determined using a computer. Four oligonucleotide sequences are shown in SEQ ID NN: 32-35. These oligonucleotides have a length of 113-143 bases, and adjacent oligonucleotides have an overlap region, usually consisting of 20 bases. HF1 (AFTER ID NN: 32) and HF3 (AFTER ID NN: 34) of these four oligonucleotides have a sense DNA sequence, while other HF2 (AFTER ID N: 33) and HF4 (AFTER ID N: 35) have an antisense DNA sequence . These oligonucleotides were synthesized using an automated DNA synthesizer (Applied Biosystem).

Кроме того, метод сборки этих четырех нуклеотидов с помощью ПЦР проиллюстрирован на фиг. 3. Примерно 100 нг каждого HF1 и HF2, а также HF3 и HF4 объединяли и добавляли к реакционной смеси ПЦР, имеющей конечный объем, равный 98 мкл и содержащей 2,5 Ед Pfu ДНК-полимеразы. После первоначальной денатурации в течение 3 минут при 94oC растворы инкубировали в течение 2 циклов, причем каждый цикл состоял из инкубации в течение 2 минут при 94oC, 2 минут при 55oC и 2 минут при 72oC.In addition, a method for assembling these four nucleotides by PCR is illustrated in FIG. 3. Approximately 100 ng of each HF1 and HF2, as well as HF3 and HF4, were combined and added to the PCR reaction mixture having a final volume of 98 μl and containing 2.5 U Pfu DNA polymerase. After initial denaturation for 3 minutes at 94 ° C, the solutions were incubated for 2 cycles, each cycle consisting of incubation for 2 minutes at 94 ° C, 2 minutes at 55 ° C and 2 minutes at 72 ° C.

После взаимной замены половины объема реакционных растворов ПЦР инкубацию продолжали в течение дополнительных двух циклов. После добавления 100 пмолей каждого из праймера RVH5' (ПОСЛ ИД N: 36) и праймера RVH3' (ПОСЛ ИД N: 37) в качестве внешних праймеров, реакционные растворы ПЦР покрывали 50 мкл минерального масла. После первоначальной денатурации в течение 3 минут при 94oC реакционные растворы инкубировали в течение 45 циклов из 1 минуты при 94oC, 1 минуты при 55oC и 1 минуты при 72oC с последующей инкубацией в течение 10 минут при 72oC.After mutual replacement of half the volume of the PCR reaction solutions, the incubation was continued for an additional two cycles. After adding 100 pmoles of each of the RVH5 ′ primer (SEQ ID N: 36) and the RVH3 primer (SEQ ID N: 37) as external primers, the PCR reaction solutions were coated with 50 μl of mineral oil. After initial denaturation for 3 minutes at 94 ° C, the reaction solutions were incubated for 45 cycles of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C, followed by incubation for 10 minutes at 72 ° C .

Фрагмент ДНК, содержащий примерно 450 пар оснований, очищали в 1,5% агарозном геле с низкой температурой плавления, расщепляли с помощью HindIII и BamHI и клонировали в HEF вектор экспрессии HEF-VH-gγ1 (фиг. 1). После определения последовательности ДНК с использованием праймера EF-1 (ПОСЛ ИД N: 66) и праймера HIP (ПОСЛ ИД NN: 67) плазмиду, которая содержала фрагмент ДНК, который кодирует правильную аминокислотную последовательность V области H цепи, назвали HEF-RVHa-gγ1. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность V области H цепи, заключенные в этой плазмиде HEF-RVHa-gγ1, показаны в ПОСЛ ИД N: 38.A DNA fragment containing about 450 base pairs was purified on a 1.5% low melting point agarose gel, digested with HindIII and BamHI, and the HEF-VH-gγ1 expression vector was cloned into HEF (Fig. 1). After determining the DNA sequence using primer E F -1 (PEFC ID N: 66) and HIP primer (PEFC ID NN: 67), a plasmid that contained a DNA fragment that encodes the correct amino acid sequence of the V region of the H chain was named HEF-RVHa- gγ1. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the V region of the H chain enclosed in this plasmid HEF-RVHa-gγ1 are shown in SEQ ID N: 38.

Каждый из вариантов "b", "с", "d", "e", "f", "g" и "h" V области H цепи реконструированных человеческих антител WS-4 получали способом, описанным ниже. Each of the variants “b”, “c”, “d”, “e”, “f”, “g” and “h” of the V region H region of the reconstituted human antibody WS-4 was obtained by the method described below.

Вариант "b" (RVHb) амплифицировали с помощью ПЦР, используя мутагенные праймеры LTWl (ПОСЛ ИД N: 39) и LTW2 (ПОСЛ ИД N: 40), сконструированные так, что лейцин в положении 47 заменялся триптофаном, RVH5' (ПОСЛ ИД N: 36) и RVH3' (ПОСЛ ИД N: 37) в качестве праймеров, которые определяют оба конца, и плазмиды HEF-RVHa-gγ1 в качестве матричной ДНК для получения плазмиды HEF-RVHb-gγ1. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность V области H цепи, заключенные в этой плазмиде HEF-RVHb gγ1, показаны в ПОСЛ ИД N: 41. Option "b" (RVHb) was amplified by PCR using mutagenic primers LTWl (PEFC ID N: 39) and LTW2 (PEFC ID N: 40), designed so that the leucine at position 47 was replaced by tryptophan, RVH5 '(PEFC ID N : 36) and RVH3 '(PEFC ID N: 37) as primers that define both ends, and plasmids HEF-RVHa-gγ1 as template DNA to obtain the plasmid HEF-RVHb-gγ1. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the V region of the H chain contained in this plasmid HEF-RVHb gγ1 are shown in SEQ ID N: 41.

Вариант "с" амплифицировали с помощью ПЦР, используя мутагенные праймеры QTP1 (ПОСЛ ИД N: 42) и QTP2 (ПОСЛ ИД N: 43), сконструированные так, что глютаминовая кислота в положении 41 заменялась пролином, и плазмиду HEF-RVHa-gγ1 в качестве матричной ДНК для получения плазмиды HEF-RVHc-gγ1. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность V области H цепи, заключенные в этой плазмиде HEF-RVHc-gγ1, показаны в ПОСЛ ИД N: 44. Option c was amplified by PCR using the mutagenic primers QTP1 (SEQ ID N: 42) and QTP2 (SEQ ID N: 43), designed so that glutamic acid at position 41 was replaced by proline, and the plasmid HEF-RVHa-gγ1 in as template DNA to obtain the plasmid HEF-RVHc-gγ1. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the V region of the H chain enclosed in this plasmid HEF-RVHc-gγ1 are shown in SEQ ID N: 44.

Вариант "d" амплифицировали с помощью ПЦР, используя мутагенные праймеры QTP1 и QTP2 и плазмиду HEF-RVHb-gγ1 в качестве матричной ДНК для получения плазмиды HEF-RVHd-gγ1. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность V области H цепи, заключенные в этой плазмиде HEF-RVHd-gγ1, показаны в ПОСЛ ИД N: 45. Option "d" was amplified by PCR using mutagenic primers QTP1 and QTP2 and plasmid HEF-RVHb-gγ1 as template DNA to obtain the plasmid HEF-RVHd-gγ1. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the V region of the H chain enclosed in this plasmid HEF-RVHd-gγ1 are shown in SEQ ID N: 45.

Вариант "e" амплифицировали путем использования мутагенных праймеров АТР1 (ПОСЛ ИД N: 46) и АТР2 (ПОСЛ ИД N: 47), сконструированные так, что аланин в положении 40 заменялся на пролин, и плазмиды HEF-RVHd-gγ1 в качестве матричной ДНК для получения плазмиды HEF-RVHe-gγ1. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность V области H цепи, заключенные в этой плазмиде HEF-RVHe-gγ1, показаны в ПОСЛ ИД N: 48. Option "e" was amplified by using the mutagenic primers ATP1 (PEFC ID N: 46) and ATP2 (PEFC ID N: 47), designed so that the alanine at position 40 was replaced by proline, and the plasmids HEF-RVHd-gγ1 as template DNA to obtain the plasmid HEF-RVHe-gγ1. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the V region of the H chain enclosed in this plasmid HEF-RVHe-gγ1 are shown in SEQ ID N: 48.

Вариант "f" амплифицировали, используя мутагенные праймеры GTA1 (ПОСЛ ИД N: 49) и GTA2 (ПОСЛ ИД N: 50), сконструированные так, что глицин в положении 44 заменялся аланином, и плазмиду HEF-RVHd-gγ1 в качестве матричной ДНК для получения плазмиды HEF-RVHf-gγ1. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность V области H цепи, заключенные в этой плазмиде HEF-RVHf-gγ1, показаны в ПОСЛ ИД N: 51. Option "f" was amplified using mutagenic primers GTA1 (POSID ID N: 49) and GTA2 (POSID ID N: 50), designed so that glycine at position 44 was replaced by alanine, and the plasmid HEF-RVHd-gγ1 as template DNA for of obtaining the plasmid HEF-RVHf-gγ1. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the V region of the H chain enclosed in this plasmid HEF-RVHf-gγ1 are shown in SEQ ID N: 51.

Вариант "g" амплифицировали, используя мутагенные праймеры LTF1 (ПОСЛ ИД N: 52) и LTF2 (ПОСЛ ИД N: 53), сконструированные так, что лейцин в положении 67 заменялся фенилаланином, и плазмиду HEF-RVHd-gγ1 в качестве матричной ДНК для получения плазмиды HEF-RVHg-gγ1. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность V области H цепи, заключенные в этой плазмиде HEF-RVHg-gγ1, показаны в ПОСЛ ИД N: 54. Option g was amplified using the mutagenic primers LTF1 (PEFC ID N: 52) and LTF2 (PEFC ID N: 53), designed so that the leucine at position 67 was replaced by phenylalanine, and the plasmid HEF-RVHd-gγ1 as the template DNA for of obtaining the plasmid HEF-RVHg-gγ1. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the V region of the H chain contained in this plasmid HEF-RVHg-gγ1 are shown in SEQ ID N: 54.

Вариант "h" амплифицировали, используя мутагенные праймеры LTF1 и LTF2 и плазмиду HEF-RVHb-gγ1 в качестве матричной ДНК для получения плазмиды HEF-RVHh-gγ1. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность V области H цепи, заключенные в этой плазмиде HEF-RVHh-gγ1, показаны в ПОСЛ ИД N: 55. Option “h” was amplified using the mutagenic primers LTF1 and LTF2 and the plasmid HEF-RVHb-gγ1 as template DNA to obtain the plasmid HEF-RVHh-gγ1. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the V region of the H chain enclosed in this plasmid HEF-RVHh-gγ1 are shown in SEQ ID N: 55.

Получение V области L цепи реконструированных человеческих антител WS-4
ДНК, которая кодирует V область L цепи реконструированных человеческих антител WS-4, была создана способом, описанным ниже. Полная ДНК, которая кодирует V область L цепи реконструированных человеческих антител WS-4, была создана так, что последовательность ДНК, которая кодирует FR человеческих антител REI, связывается с последовательностью ДНК, которая кодирует CDR V области L цепи мышиных антител WS-4.Obtaining V region L chain of reconstructed human antibodies WS-4
DNA, which encodes the V region L chain of the reconstructed human antibodies WS-4, was created by the method described below. The complete DNA, which encodes the V region L chain of the reconstructed human antibodies WS-4, was created so that the DNA sequence that encodes the FR of human antibodies REI binds to the DNA sequence that encodes the CDR V region L of the mouse chain of WS-4 antibodies.

Затем сайт распознавания HindIII/консенсусную последовательность Козака и сайт распознавания BamHI/сплайсинговую донорную последовательность добавляли, соответственно на 5' и 3' концы этой последовательности ДНК, так чтобы сделать возможным ее введение в вектор экспрессии HEF. Последовательность ДНК, созданная таким образом, затем делится на четыре примерно равные нуклеотида, после чего вторичную структуру этих нуклеотидов, для которых существует возможность помех сборки этих нуклеотидов, анализировали с помощью компьютера. Then the HindIII recognition site / Kozak consensus sequence and the BamHI recognition site / splice donor sequence were added at the 5 'and 3' ends of this DNA sequence, respectively, to enable its introduction into the HEF expression vector. The DNA sequence created in this way is then divided into four approximately equal nucleotides, after which the secondary structure of these nucleotides, for which there is the possibility of interference in the assembly of these nucleotides, was analyzed using a computer.

Четыре олигонуклеотидные последовательности показаны в ПОСЛ ИД N: 56-59. Эти олигонуклеотиды имеют длину, равную 106-124 основаниям, примыкающие олигонуклеотиды имеют область перекрывания, обычно состоящую из 19-23 оснований. LF1 (ПОСЛ ИД N: 56) и LF3 (ПОСЛ ИД N: 58) из этих четырех олигонуклеотидов имеют смысловую последовательность ДНК, тогда как другие LF2 (ПОСЛ ИД N: 57) и LF4 (ПОСЛ ИД N: 59) имеют антисмысловую последовательность. Эти олигонуклеотиды были синтезированы тем же методом, что и примененный в отношении вышеназванных HF1-HF4. Four oligonucleotide sequences are shown in SEQ ID N: 56-59. These oligonucleotides have a length of 106-124 bases, adjacent oligonucleotides have an overlap region, usually consisting of 19-23 bases. LF1 (LAST ID N: 56) and LF3 (LAST ID N: 58) of these four oligonucleotides have a DNA sense sequence, while the other LF2 (LAST ID N: 57) and LF4 (LAST ID N: 59) have an antisense sequence. These oligonucleotides were synthesized by the same method as used for the above HF1-HF4.

Для сборки, после первоначальной денатурации 98 мкл смеси ПЦР, содержащей 100 нг каждого из четырех типов нуклеотидов и 5 Ед Ampli Taq, в течение 3 минут при 94oC, смесь инкубировали в течение 2 циклов, причем каждый цикл состоял из инкубации в течение 2 минут при 94oC, 2 минут при 55oC и 2 минут при 72oC. После добавления 100 мкл каждого из: праймера RVL5' (ПОСЛ ИД N: 60) и праймера RVL3' (ПОСЛ ИД N: 61) в качестве внешних праймеров, реакционную смесь ПЦР покрывали 50 мкл минерального масла. После первоначальной денатурации в течение 3 минут при 94oC, реакционный раствор инкубировали в течение 30 циклов из 1 минуты при 94oC, 1 минуты при 55oC и 1 минуты при 72oC, с последующей инкубацией в конце в течение 10 минут при 72oC (см. фиг. 3).For assembly, after an initial denaturation of 98 μl of a PCR mixture containing 100 ng of each of the four types of nucleotides and 5 U of Ampli Taq, for 3 minutes at 94 ° C, the mixture was incubated for 2 cycles, each cycle consisting of incubation for 2 minutes at 94 ° C, 2 minutes at 55 ° C and 2 minutes at 72 ° C. After adding 100 μl of each of: RVL5 ′ primer (PEFC ID N: 60) and RVL3 'primer (PEFC ID N: 61) as external primers, the PCR reaction mixture was covered with 50 μl of mineral oil. After initial denaturation for 3 minutes at 94 ° C, the reaction solution was incubated for 30 cycles of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C, followed by incubation at the end for 10 minutes at 72 o C (see Fig. 3).

Фрагмент ДНК, состоящий примерно из 400 пар оснований, очищали, используя 1,5% агарозный гель с низкой температурой плавления, расщепляли HindIII и BamHI и клонировали в HEF вектор экспрессии HEF-VL-gк (фиг. 1). После определения последовательности ДНК с применением праймера EF-1
(ПОСЛ ИД N: 66) и праймера KIP (ПОСЛ ИД N: 68), плазмида, которая содержала фрагмент ДНК, который кодирует правильную аминокислотную последовательность V области L цепи, была названа HEF-RVLa-gк. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность для V области L цепи, заключенные в этой плазмиде HEF-RVLa-gк, показаны в ПОСЛ ИД N: 62.A DNA fragment of approximately 400 base pairs was purified using a 1.5% low melting point agarose gel, digested with HindIII and BamHI, and the HEF-VL-gk expression vector was cloned into HEF (Fig. 1). After determining the DNA sequence using primer EF-1
(PEFC ID N: 66) and KIP primer (POST ID N: 68), a plasmid that contained a DNA fragment that encodes the correct amino acid sequence of region V of the L chain was named HEF-RVLa-gc. The amino acid sequence and the nucleotide sequence for the V region of the L chain, enclosed in this plasmid HEF-RVLa-gk, are shown in SEQ ID N: 62.

Вариант "b" амплифицировали с помощью ПЦР, используя мутагенные праймеры FTY1 (ПОСЛ ИД N: 63) и FTY2 (ПОСЛ ИД N: 64), сконструированные так, что фенилаланин в положении 71 заменялся тирозином, RVL5' (ПОСЛ ИД N: 60) и RVL3' (ПОСЛ ИД N: 61) в качестве праймеров, которые определяют оба конца, и плазмиды HEF-RVLa-gк в качестве матричной ДНК для получения плазмиды HEF-RVLb-gк. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность V области L цепи, заключенные в этой плазмиде HEF-RVHb-gк, показаны в ПОСЛ ИД N: 65. Option "b" was amplified by PCR using the mutagenic primers FTY1 (PEFC ID N: 63) and FTY2 (PEFC ID N: 64), designed so that the phenylalanine at position 71 was replaced by tyrosine, RVL5 '(PEFC ID N: 60) and RVL3 '(PEFC ID N: 61) as primers that define both ends, and plasmids HEF-RVLa-gk as template DNA to obtain the plasmid HEF-RVLb-gk. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the V region of the L chain, enclosed in this plasmid HEF-RVHb-gk, are shown in SEQ ID N: 65.

Чтобы оценить активность по связыванию антигена каждой цепи реконструированных человеческих антител WS-4, клетки COS сначала одновременно трансфицировали способом, описанным ранее в отношении вектора экспрессии HEF-RVLa-gк для варианта "а" L цепи реконструированных человеческих антител WS-4 и вектора экспрессии HEF-chWS4H-gγ1 для H цепи химерных антител WS-4. После отбора культуральной среды, как описано выше, определяли количество произведенных антител и активность по связыванию антигена для антител, продуцируемых с применением метода, описанного в разделе по ELISA в вышеприведенном примере 4. Эти результаты показаны на фиг. 4. Как показано на фиг. 4, это подтверждало то, что не существовало различия в активности по связыванию антигена между химерными антителами (chL/chH), использованными в качестве положительного контроля, и антителами, состоящими из реконструированной L цепи и химерной H цепи (RVLa/chH). In order to evaluate the antigen binding activity of each strand of the reconstituted human antibodies WS-4, COS cells were first simultaneously transfected with the method previously described for the HEF-RVLa-gк expression vector for variant “a” L of the reconstituted human antibody WS-4 and the HEF expression vector -chWS4H-gγ1 for the H chain of chimeric antibodies WS-4. After selection of the culture medium, as described above, the amount of produced antibodies and antigen binding activity were determined for antibodies produced using the method described in the ELISA section in Example 4 above. These results are shown in FIG. 4. As shown in FIG. 4, this confirmed that there was no difference in antigen binding activity between chimeric antibodies (chL / chH) used as a positive control and antibodies consisting of a reconstructed L chain and a chimeric H chain (RVLa / chH).

В то же время, чтобы оценить комбинацию вектора экспрессии HEF-chWS4L-gк для L цепи химерных антител WS-4 и варианта "а" H цепи реконструированных человеческих антител WS-4, оба были одновременно сотрансфицированы в клетки COS, и для полученных антител определяли количество произведенных антител и активность по связыванию антигена, используя метод, описанный в разделе "ELISA" в вышеприведенном примере 4. Активность по связыванию антигена не проявлялась у этих антител (chL/RVHa) (см. фиг. 4). At the same time, in order to evaluate the combination of the expression vector HEF-chWS4L-gк for the L chain of chimeric antibodies WS-4 and variant “a” of the H chain of reconstituted human antibodies WS-4, both were simultaneously transfected into COS cells, and the antibodies obtained were determined the amount of antibody produced and antigen binding activity using the method described in the ELISA section in Example 4 above. Antigen binding activity was not manifested in these antibodies (chL / RVHa) (see FIG. 4).

Как описано ранее, так как вариант "а" L цепи реконструированных человеческих антител WS-4 проявлял активность по связыванию антигена, равную активности L цепи химерных антител WS-4, оценку каждого варианта всех реконструированных H цепей выполняли путем одновременного трансфицирования клеток COS каждым вариантом реконструированной H цепи и вариантом "а" L цепи реконструированных человеческих антител WS-4 (RVLa). As described previously, since variant A of the L chain of reconstructed human antibodies WS-4 showed antigen binding activity equal to the activity of the L chain of chimeric antibodies WS-4, each variant of all reconstructed H chains was evaluated by simultaneously transfecting COS cells with each variant of the reconstructed H chain and variant “a” L chain of reconstructed human antibodies WS-4 (RVLa).

Результат был таким, что эти антитела, имеющие варианты "b", "d", "e", "f", "g" и "h" реконструированной H цепи, проявляли активность по связыванию антигена, сравнимую с активностью химерных антител WS-4 (chL/chH), используемых в качестве положительного контроля, показывая таким образом, что эта комбинация формирует функциональный сайт связывания антигена у человеческих антител. Однако, что касается количества продуцируемых антител, все варианты продуцировались в меньшем количестве, чем химерные антитела WS-4 (chL/chH), за исключением варианта "g" (RVHg). Кроме того, активность по связыванию антигена не наблюдалась у антител, имеющих вариант "с" H цепи (см. фиг. 5). The result was such that these antibodies, having variants b, d, e, f, g and h of the reconstructed H chain, showed antigen binding activity comparable to that of WS- chimeric antibodies 4 (chL / chH) used as a positive control, thus showing that this combination forms a functional antigen binding site in human antibodies. However, with regard to the amount of antibody produced, all variants were produced in lesser amounts than the chimeric antibodies WS-4 (chL / chH), with the exception of variant "g" (RVHg). In addition, antigen binding activity was not observed in antibodies having the “c” H chain variant (see FIG. 5).

На основании этих данных было сделано заключение, что антитела, имеющие вариант "a" L цепи реконструированных человеческих антител WS-4 (RVLa) и вариант "g" H цепи реконструированных человеческих антител WS-4, снова образуют функциональный сайт связывания антигена, который проявляет благоприятную активность по связыванию антигена, и что количество продуцируемых антител сравнимо с количеством химерных антител WS-4 (chL/chH) после одновременной трансфекции в клетки COS. Based on these data, it was concluded that antibodies having the “a” L variant of the WS-4 reconstructed human antibody chain (RVLa) and the “g” H variant of the WS-4 reconstructed human antibody chain again form a functional antigen binding site that exhibits favorable antigen binding activity, and that the amount of antibody produced is comparable to the amount of WS-4 chimeric antibodies (chL / chH) after simultaneous transfection into COS cells.

Затем оценка варианта "b" L цепи реконструированных человеческих антител (RVLb) производилась путем одновременного трансфицирования клеток COS каждым вариантом H цепи с вариантом "b" L цепи реконструированных человеческих антител WS-4 (RVLb). Результат показал, что только антитела, имеющие "g" вариант H цепи реконструированных человеческих антител (RVLb/RVHg), проявляли активность по связыванию антигена, сравнимую с активностью химерных антител WS-4 (chL/chH), использованных в качестве положительного контроля, и было сделано заключение, что это сочетание образует функциональный сайт связывания антигена в человеческих антителах. Кроме того, что касается количества продуцируемых антител, все варианты продуцировались в меньшей степени, чем химерные антитела WS-4 (chL/chH), за исключением варианта "g" (RVHg) (см. фиг. 6). Then, the variant “b” L chain of reconstructed human antibodies (RVLb) was evaluated by simultaneously transfecting COS cells with each variant H chain with the variant “b” L chain of reconstructed human antibodies WS-4 (RVLb). The result showed that only antibodies having the “g” version of the H chain of reconstructed human antibodies (RVLb / RVHg) showed antigen binding activity comparable to that of WS-4 chimeric antibodies (chL / chH) used as a positive control, and it was concluded that this combination forms a functional antigen binding site in human antibodies. In addition, with regard to the number of antibodies produced, all variants were produced to a lesser extent than the chimeric antibodies WS-4 (chL / chH), with the exception of variant "g" (RVHg) (see Fig. 6).

При вышеуказанной оценке два типа реконструированных человеческих антител (RVLa/RVHg и RVLb/RVHg), которые проявляли активность по связыванию с человеческим ИЛ-8, и степень продукции, сравнимые с активностью и продукцией химерных антител (chL/chH), соответственно очищали с помощью колонки с протеином А, после чего оценивали активность по связыванию, точно применяя метод, описанный в разделе по ELISA в примере 4. Результат показал, что химерные антитела (chL/chH), антитела RVLa/RVHg и антитела RVLb/RVHg, все проявляли ту же самую степень активности по связыванию (см. фиг. 7). In the above assessment, two types of reconstructed human antibodies (RVLa / RVHg and RVLb / RVHg), which showed binding activity to human IL-8, and the degree of production comparable to the activity and production of chimeric antibodies (chL / chH), respectively, were purified using columns with protein A, after which binding activity was evaluated using the exact method described in the ELISA section in Example 4. The result showed that chimeric antibodies (chL / chH), RVLa / RVHg antibodies and RVLb / RVHg antibodies all showed that the same degree of binding activity (see FIG. 7).

На основании этих данных было сделано заключение, что антитела, имеющие или вариант "a" (RVLa), или вариант "b" (RVLb) L цепи реконструированных человеческих антител WS-4, и вариант "g" (RVHg) H цепи реконструированных человеческих антител WS-4 снова образуют функциональный сайт связывания антигена, чей уровень активности по связыванию антигена и чей уровень продукции антител сравнимы с активностью и уровнем продукции, которые проявляют химерные антитела WS-4 (chL/chH), после одновременной трансфекции в клетки COS. Based on these data, it was concluded that antibodies having either variant “a” (RVLa) or variant “b” (RVLb) L of the WS-4 reconstructed human antibody chain and variant “g” (RVHg) H of the reconstructed human antibody chain WS-4 antibodies again form a functional antigen binding site, whose level of antigen binding activity and whose level of antibody production is comparable to the activity and production level that chimeric WS-4 antibodies (chL / chH) exhibit after simultaneous transfection into COS cells.

Ингибиторную активность в отношении связывания ИЛ-8 с ИЛ-8 рецепторами у реконструированных человеческих антител, состоящих из варианта "а" (RVLa) H цепи и варианта "g" (RVHg) H цепи реконструированных человеческих антител WS-4, или варианта "b" (RVLb) указанной L цепи и варианта "g" (RVHg) указанной H цепи, оценивали с помощью исследования по подавлению связывания с лигандным рецептором. Inhibitory activity with respect to the binding of IL-8 to IL-8 receptors in reconstructed human antibodies, consisting of variant “a” (RVLa) H chain and variant “g” (RVHg) H chain of reconstructed human antibodies WS-4, or variant “b "(RVLb) of the indicated L chain and variant" g "(RVHg) of the indicated H chain were evaluated using a ligand receptor binding suppression assay.

Примерно 100 мл образца гепаринизированной крови от нормальных субъектов наслаивали в виде 35 мл образцов на 15 мл моно-поли-разделяющего раствора (ICN Biomedicals), и слой человеческих нейтрофилов выделяли путем центрифугирования по предоставляемым инструкциям. После отмывания этих клеток средой RPMI-1640, содержащей 1% БСА, загрязняющие эритроциты удаляли с помощью 150 мМ раствора хлорида аммония. После центрифугирования клетки промывали средой RPMI-1640, содержащей 1% БСА, и ресуспендировали до концентрации 2 • 107 клеток/мл. Было обнаружено, что содержание нейтрофилов в этой клеточной суспензии составило 95% или более, по результатам количественного определения после окрашивания мазков образцов, полученных с использованием Cytospin (Shandon) с красителем Diff-Quik (Green Cross).About 100 ml of a sample of heparinized blood from normal subjects was layered as 35 ml of samples in 15 ml of mono-poly separation solution (ICN Biomedicals), and the layer of human neutrophils was isolated by centrifugation according to the instructions. After washing these cells with RPMI-1640 medium containing 1% BSA, the contaminating red blood cells were removed using a 150 mM ammonium chloride solution. After centrifugation, the cells were washed with RPMI-1640 medium containing 1% BSA and resuspended to a concentration of 2 × 10 7 cells / ml. It was found that the neutrophil content in this cell suspension was 95% or more, according to the results of quantitative determination after staining of smears of samples obtained using Cytospin (Shandon) with Diff-Quik dye (Green Cross).

Вышеуказанную суспензию нейтрофилов центрифугировали и ресуспендировали до концентрации 2 • 107 клеток/мл с буфером для связывания (Д-ФБФР, содержащий 1% БСА и 0,1% азида натрия). В это время добавляли химерные антитела SK2, имеющие Fc часть, идентичную такой части человеческих антител данного изобретения (см. Международную патентную заявку N PCT/JP 94/00859) и антиген к нему, человеческий ИЛ-6, до концентраций, равных примерно 50 мкг/мл и примерно 40 нг/мл, соответственно, и инкубировали в течение 30 минут на ледяной бане с целью предварительного насыщения Fc рецепторов на нейтрофилах.The above neutrophil suspension was centrifuged and resuspended to a concentration of 2 x 10 7 cells / ml with binding buffer (D-PBSF containing 1% BSA and 0.1% sodium azide). At this time, SK2 chimeric antibodies were added having an Fc portion identical to that portion of the human antibodies of the present invention (see International Patent Application No. PCT / JP 94/00859) and its antigen, human IL-6, to concentrations of about 50 μg / ml and about 40 ng / ml, respectively, and incubated for 30 minutes in an ice bath in order to pre-saturate Fc receptors on neutrophils.

ИЛ-8, меченный радиоактивной меткой 125I (74 СБк/ммоль, Amersham) и немеченный ИЛ-8 (Amersham) готовили путем смешивания с буфером для связывания в концентрациях 4 нг/мл, каждый. Химерные антитела WS-4 (chL/chH), реконструированные человеческие антитела (RVLa/RVHg и RVLb/RVHg), человеческие антитела отрицательного контроля (PAESEL + LOREI) или мышиные антитела WS-4 положительного контроля соответственно разводили буфером для связывания до концентраций от 2000 нг/мл до примерно 8 нг/мл, серийно 2-кратными разведениями. 50 мкл раствора ИЛ-8 и 50 мкл раствора каждого антитела инкубировали в течение 30 минут на ледяной бане. Затем добавляли 100 мкл вышеуказанной суспензии нейтрофилов и инкубацию продолжали дополнительно в течение 1 часа при перемешивании каждые 15 минут. После инкубации суспензию клеток наслаивали на 200 мкл 20% раствора сахарозы с последующим центрифугированием и замораживанием. Чтобы количественно определить ИЛ-8, связанный с клетками, клеточный осадок отрезали и радиоактивность измеряли с помощью гамма-счетчика (Aroka). Эти результаты показаны на фиг. 8.IL-8 labeled with a radioactive label 125 I (74 SBq / mmol, Amersham) and unlabeled IL-8 (Amersham) were prepared by mixing with binding buffer at concentrations of 4 ng / ml, each. WS-4 chimeric antibodies (chL / chH), reconstructed human antibodies (RVLa / RVHg and RVLb / RVHg), negative control human antibodies (PAESEL + LOREI) or positive control mouse antibodies WS-4 were diluted with binding buffer, respectively, to concentrations from 2000 ng / ml to about 8 ng / ml, serially 2-fold dilutions. 50 μl of a solution of IL-8 and 50 μl of a solution of each antibody were incubated for 30 minutes in an ice bath. Then, 100 μl of the above neutrophil suspension was added and incubation was continued for an additional 1 hour with stirring every 15 minutes. After incubation, the cell suspension was layered on 200 μl of a 20% sucrose solution, followed by centrifugation and freezing. To quantify IL-8 bound to cells, the cell pellet was cut off and radioactivity was measured using a gamma counter (Aroka). These results are shown in FIG. 8.

Четко показано, что антитела, имеющие вариант "a" L цепи (RVLa) и вариант "g" H цепи (RVHg) реконструированных человеческих антител WS-4, или вариант "b" указанной L цепи и вариант "g" указанной H цепи, обладают ингибирующей связывание активностью, сравнимой с активностью химерных антител (chL/chH) в отношении связывания ИЛ-8 с ИЛ-8 рецепторами. It is clearly shown that antibodies having variant “a” L chain (RVLa) and variant “g” H chain (RVHg) of the reconstructed human antibodies WS-4, or variant “b” of said L chain and variant “g” of said H chain, possess binding inhibitory activity comparable to the activity of chimeric antibodies (chL / chH) with respect to the binding of IL-8 to IL-8 receptors.

Кроме того, Escherichia coli, имеющая вышеуказанную плазмиду HEF-RVLa-gк, была помещена на хранение как Escherichia coli DH5α (HEF-RVLa-gк), и Escherichia coli, содержащая плазмиду HEF-RVHg-gγ1 была помещена на хранение, как Escherichia coli JM109 (HEF-RVHg-gγ1) в Научно-исследовательский институт индустриальной технологии биоинженерии Агентства индустриальной науки и технологии (Bioengeneering Industrial Technology Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, lbaraki Japan) 12 июля 1994 г. под соответствующими названиями FERM ВР-4738 и FERM ВР-4741 на основании положений Будапештской конвенции. In addition, Escherichia coli having the above plasmid HEF-RVLa-gk was stored as Escherichia coli DH5α (HEF-RVLa-gk), and Escherichia coli containing the plasmid HEF-RVHg-gγ1 was stored as Escherichia coli JM109 (HEF-RVHg-gγ1) at the Bioengeneering Industrial Technology Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, lbaraki Japan) July 12, 1994 under the corresponding names FERM BP-4738 and FERM BP-4741 on the basis of the provisions of the Budapest Convention.

Справочный пример 1: Получение гибридомы WS-4
Гибридому, которая продуцирует моноклональные антитела к человеческому ИЛ-8, получали путем слияния клеток селезенки мышей BALB/c, иммунизированных человеческим ИЛ-8, и клеток мышиной миеломы P3 х 63 -Ag8.653 по обычным методикам с использованием полиэтиленгликоля. Отбор производили, используя активность по связыванию с человеческим ИЛ-8 в качестве критерия для подтверждения гибридомы WS-4 (Ко Y.C., et al., J. Immunol. Methods, 149, 227-235, 1992).Reference Example 1: Preparation of a WS-4 Hybridoma
A hybridoma that produces monoclonal antibodies to human IL-8 was obtained by fusion of the spleen cells of BALB / c mice immunized with human IL-8 and mouse P3 x 63 -Ag8.653 mouse myeloma cells by conventional methods using polyethylene glycol. Selection was performed using human IL-8 binding activity as a criterion for confirming WS-4 hybridoma (Co. YC, et al., J. Immunol. Methods, 149, 227-235, 1992).

Данное изобретение представляет реконструированные человеческие антитела к человеческому ИЛ-8, и в этих антителах, CDR V области человеческих антител замещается CDR мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8. Так как большая часть этого реконструированного человеческого антитела имеет человеческое происхождение, а CDR по своей природе обладает низкой антигенностью, реконструированные человеческие антитела данного изобретения имеют низкую антигенность для людей, и по этой причине можно ожидать, что они будут применимы в медицине для лечения. The present invention provides reconstructed human antibodies to human IL-8, and in these antibodies, the CDR V region of human antibodies is replaced by the CDRs of murine monoclonal antibodies to human IL-8. Since most of this reconstructed human antibody is of human origin, and the CDR is inherently low antigenic, reconstructed human antibodies of the present invention have low antigenicity for humans, and for this reason they can be expected to be useful in medicine for treatment.

Перечень микроорганизмов, помещенных на хранение по положениям статьи 13 бис Договора о патентной кооперации Международного сообщества хранилищ:
Название: Национальный институт биологических наук и Агентство по технологии, касающейся человека индустриальной науки и технологии National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial science and Technology
Адрес: 1-3 Higashi 1-chome, Taukuba, lbaruki, Japan
Регистрационные номера хранилища и даты поступления на хранение:
1) Escherichia coli DH5α (HEF-RVLa-gк)
Номер хранения: FERM ВР-4738
Дата поступления: 12 июля 1994 г.The list of microorganisms deposited under the provisions of Article 13 bis of the Patent Cooperation Treaty of the International Storage Community:
Title: National Institute of Biological Sciences and Agency for Technology Related to Man of Industrial Science and Technology National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial science and Technology
Address: 1-3 Higashi 1-chome, Taukuba, lbaruki, Japan
Warehouse registration numbers and dates of storage:
1) Escherichia coli DH5α (HEF-RVLa-gc)
Storage Number: FERM BP-4738
Date Received: July 12, 1994

2) Escherichia coli DH5α (HEF-chWS4L-gк)
Номер хранения: FERM BP-4739
Дата поступления: 12 июля 1994 г.2) Escherichia coli DH5α (HEF-chWS4L-gk)
Storage Number: FERM BP-4739
Date Received: July 12, 1994

3) Escherichia coli JM109 (HEF-chWS4H-gγ1)
Номер хранения: FERM ВР-4740
Дата поступления: 12 июля 1994 г.3) Escherichia coli JM109 (HEF-chWS4H-gγ1)
Storage Number: FERM BP-4740
Date Received: July 12, 1994

4) Escherichia coli JM109 (HEF-RVHg-gγ1)
Номер хранения: FERM BP-4741
Дата поступления: 12 июля 1994 г.4) Escherichia coli JM109 (HEF-RVHg-gγ1)
Storage Number: FERM BP-4741
Date Received: July 12, 1994

Claims (15)

1. Реконструированная человеческая V область L цепи антитела RVLa или RVLb к человеческому ИЛ-8, состоящая из последовательно чередующихся каркасной области (FR) человеческой V области L цепи и CDR V области L цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 и содержащая аминокислотную последовательность, представленную в табл.2. 1. Reconstructed human V region L chain of the RVLa or RVLb antibody to human IL-8, consisting of a successively alternating frame region (FR) of the human V region L chain and CDR V region L chain of murine monoclonal antibodies to human IL-8: FR1-CDR1 -FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 and containing the amino acid sequence shown in table.2. 2. Реконструированная человеческая V область L цепи по п.1, причем указанная FR происходит из человеческих антител REI. 2. The reconstructed human V region L chain according to claim 1, wherein said FR originates from human REI antibodies. 3. Реконструированная человеческая V область H цепи антитела RVLa, RVLb, RVLc, RVLd, RVLe, RVLf, RVLg или RVLh к человеческому ИЛ-8, состоящая из последовательно чередующихся каркасной области (FR) человеческой V области H цепи и CDR V области H цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 и содержащая аминокислотную последовательность, представленную в табл.3 и 4. 3. Reconstructed human V region H chain of the antibody RVLa, RVLb, RVLc, RVLd, RVLe, RVLf, RVLg or RVLh to human IL-8, consisting of a successively alternating frame region (FR) of the human V region H chain and CDR V region H chain mouse monoclonal antibodies to human IL-8: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 and containing the amino acid sequence shown in tables 3 and 4. 4. Реконструированная человеческая V область H цепи по п.3, причем указанные FR1, FR2 и FR3 происходят из человеческих антител VDH26 и указанная FR4 происходит из человеческих антител 4B4. 4. The reconstructed human V region H chain according to claim 3, wherein said FR1, FR2 and FR3 are derived from human antibodies VDH26 and said FR4 is derived from human antibodies 4B4. 5. L цепь реконструированного человеческого антитела к человеческому ИЛ-8, состоящая из: 1) человеческой C области L цепи, представляющая собой человеческую Cк область, и 2) V области L цепи по п.1.5. The L chain of the reconstructed human antibody to human IL-8, consisting of: 1) the human C region of the L chain, which is human C to the region, and 2) the V region of the L chain according to claim 1. 6. H цепь реконструированного человеческого антитела к человеческому ИЛ-8, состоящая из: 1) человеческой C области H цепи, представляющая собой человеческую Cγ1 или Cγ4 область, и 2) V области H цепи по п.3.6. The H chain of the reconstructed human anti-human IL-8 antibody, consisting of: 1) the human C region of the H chain, which is the human Cγ 1 or Cγ 4 region, and 2) the V region of the H chain according to claim 3. 7. Реконструированное человеческое антитело к человеческому ИЛ-8, состоящее из: 1) L цепи по п.5 и 2) H цепи по п.6. 7. Reconstructed human antibody to human IL-8, consisting of: 1) L chain according to claim 5 and 2) H chain according to claim 6. 8. ДНК, кодирующая реконструированную человеческую V область L цепи антитела к человеческому ИЛ-8 по п.1 и содержащая нуклеотидную последовательность или ее часть, представленную в ПОСЛ ИД N 62 или N 65. 8. DNA encoding the reconstructed human V region L chain of the anti-human IL-8 antibody according to claim 1 and containing the nucleotide sequence or part thereof presented in SEQ ID N 62 or N 65. 9. ДНК, кодирующая реконструированную человеческую V область H цепи антитела к человеческому ИЛ-8 по п.3 и содержащая нуклеотидную последовательность или ее часть, представленную в ПОСЛ ИД NN 38, 41, 44, 45, 48, 51, 54 или 55. 9. DNA encoding the reconstructed human V region H chain of the anti-human IL-8 antibody according to claim 3 and containing the nucleotide sequence or part thereof presented in SEQ ID NO 38, 41, 44, 45, 48, 51, 54 or 55. 10. ДНК, кодирующая реконструированную человеческую L цепь антитела к человеческому ИЛ-8 по п.5 и содержащая нуклеотидную последовательность или ее часть, представленную в ПОСЛ ИД N 62 или N 65. 10. DNA encoding a reconstructed human L chain of an anti-human IL-8 antibody according to claim 5 and containing the nucleotide sequence or part thereof presented in SEQ ID N 62 or N 65. 11. ДНК, кодирующая реконструированную человеческую H цепь антитела к человеческому ИЛ-8 по п.6 и содержащая нуклеотидную последовательность или ее часть, представленную в ПОСЛ ИД NN 38, 41, 44, 45, 48, 51, 54 или 55. 11. DNA encoding the reconstructed human H chain of an anti-human IL-8 antibody according to claim 6 and containing the nucleotide sequence or a part thereof presented in SEQ ID NO 38, 41, 44, 45, 48, 51, 54 or 55. 12. Вектор, содержащий ДНК, по п.10. 12. The vector containing the DNA of claim 10. 13. Вектор, содержащий ДНК, по п.11. 13. The vector containing DNA, according to claim 11. 14. Способ производства реконструированных человеческих антител к человеческому ИЛ-8, включающий стадии культивирования клеток-хозяев, трансформированных одновременно вектором экспрессии, содержащим ДНК, которая представлена в п.10, и вектором экспрессии, содержащим ДНК, которая представлена в п.11, и выделения целевых антител. 14. A method for the production of reconstructed human antibodies to human IL-8, comprising the steps of culturing host cells transformed simultaneously with an expression vector containing DNA, which is presented in claim 10, and an expression vector containing DNA, which is presented in claim 11, and allocation of target antibodies. 15. Способ производства реконструированных человеческих антител к человеческому ИЛ-8, включающий стадии культивирования клеток-хозяев, трансформированных вектором экспрессии, содержащим ДНК, которая представлена в п.10, или ДНК, которая представлена в п.11, и выделения целевых антител. 15. A method for producing reconstructed human antibodies to human IL-8, comprising the steps of culturing host cells transformed with an expression vector containing the DNA that is presented in claim 10, or the DNA that is presented in claim 11, and the selection of the target antibodies.
RU97102034/13A 1994-07-13 1995-07-12 Reconstructed human antibodies specific for interleukin-8 RU2159776C2 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP16148194 1994-07-13
JP6-161481 1994-07-13
JP6-289951 1994-11-24
JP6-310785 1994-12-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU97102034A RU97102034A (en) 1999-03-20
RU2159776C2 true RU2159776C2 (en) 2000-11-27

Family

ID=15735911

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU97102034/13A RU2159776C2 (en) 1994-07-13 1995-07-12 Reconstructed human antibodies specific for interleukin-8

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2159776C2 (en)
TW (1) TW416960B (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2766112C2 (en) * 2016-08-05 2022-02-08 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Composition for prevention or treatment of il-8-related diseases

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007114319A1 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for control of blood kinetics of antibody
RU2510400C9 (en) 2007-09-26 2014-07-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Modification method of isoelectric point of antibody by means of amino-acid replacements in cdr
CN102056946A (en) 2008-04-11 2011-05-11 中外制药株式会社 Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
KR102568454B1 (en) 2010-11-30 2023-08-18 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
JP6774164B2 (en) 2012-08-24 2020-10-21 中外製薬株式会社 Mouse FcγRII specific Fc antibody
TW202340236A (en) 2012-08-24 2023-10-16 日商中外製藥股份有限公司 Fcγriib-specific fc region variant
AU2014250434B2 (en) 2013-04-02 2019-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
TWI779010B (en) 2014-12-19 2022-10-01 日商中外製藥股份有限公司 ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES, POLYPEPTIDES CONTAINING VARIANT Fc REGIONs, AND METHODS OF USE
MX2017008978A (en) 2015-02-05 2017-10-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof.
AR105634A1 (en) * 2015-09-18 2017-10-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTIBODIES THAT JOIN IL 8 AND ITS USES
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
CN112119090B (en) 2018-03-15 2023-01-13 中外制药株式会社 Anti-dengue virus antibodies cross-reactive to Zika virus and methods of use

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2766112C2 (en) * 2016-08-05 2022-02-08 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Composition for prevention or treatment of il-8-related diseases

Also Published As

Publication number Publication date
TW416960B (en) 2001-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6245894B1 (en) Reshaped human antibody to human interleukin-8
US6024956A (en) Method to treat inflammation with humanized anti-IL-8-antibodies
EP1163271B1 (en) Recombinant il-18 antibodies and their use
JP3176598B2 (en) Chimeric antibody against human interleukin-6 receptor
JP3865418B2 (en) Reconstituted human antibody against human interleukin-8
RU2159776C2 (en) Reconstructed human antibodies specific for interleukin-8
US20090017020A1 (en) Recombinant il-5 antagonists useful in treatment of il-5 mediated disorders
US20030170817A1 (en) Anti-Fas antibodies
US5693323A (en) Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
HU230197B1 (en) Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases
EP0800536B1 (en) Recombinant il-5 antagonists useful in treatment of il-5 mediated disorders
US20030108546A1 (en) Apoptosis-inducing single-chain Fv
US5783184A (en) Method for treatment and diagnosis of IL-5 mediated disorders
CA2283540A1 (en) Anti-fas antibodies
JP3614183B2 (en) Reconstituted human antibody against human interleukin-6
AU734758B2 (en) Anti-fas antibodies
US6433148B1 (en) Monoclonal anti-idiotypic antibodies (AB2) and their uses
CN113164601B (en) Isolated antigen binding proteins and uses thereof
CN117586402A (en) NKp80 antibody and application thereof
CN117545504A (en) Antigen binding proteins against human serum albumin
JPH11171900A (en) Anti-fas antibody
JP2000169393A (en) MEDICAMENT INCLUDING ANTI-Fas ANTIBODY
MXPA98002536A (en) Antibodies anti-
JP2000166574A (en) HUMANIZED ANTI-Fas ANTIBODY
JP2000166573A (en) HUMANIZED ANTI-Fas ANTIBODY

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20030713