RU2159251C1 - Способ получения рецепторов лактогенных гормонов - Google Patents
Способ получения рецепторов лактогенных гормонов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2159251C1 RU2159251C1 RU99109621A RU99109621A RU2159251C1 RU 2159251 C1 RU2159251 C1 RU 2159251C1 RU 99109621 A RU99109621 A RU 99109621A RU 99109621 A RU99109621 A RU 99109621A RU 2159251 C1 RU2159251 C1 RU 2159251C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- receptors
- sorbent
- buffer
- triton
- prolactin
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биологии, к способам выделения рецепторов гормонов. Из молока животных выделяют и промывают жировые глобулы. Обрабатывают их детергентом тритоном Х-100. Полученный солюбилизат мембран жировых глобул молока очищают. С помощью аффинной хроматографии выделяют рецепторы. В качестве активированного сорбента используют пролактин, иммобилизованный на эпоксиактивированном TSK-геле. Сорбент получают в результате инкубации при рН буфера 7,4-9,0. Изобретение позволяет получить рецепторы лактогенных гормонов в чистом виде и повысить эффективность их производства. 4 ил. ^
Description
Изобретение относится к области биологии, к исследованию материалов путем разделения на компоненты с использованием хроматографии, в частности к способам выделения рецепторов гормонов с помощью обычной жидкостной и аффинной хроматографии высокого давления из компонентов молочных продуктов.
Известны способы выделения рецепторов лактогенных гормонов из органов животных, основанные на экстракции белковых фракций, в частности, из амниотической жидкости и из гипофиза животных. Однако эти способы требуют большого количества исходного материала, трудоемкой препаративной очистки, сложного процесса экстрагирования.
Наиболее близким к заявленному решению является способ определения концентрации рецепторов лактогенных гормонов (авторское свидетельство N 1751665 от 30.07.92 г. авторов Лариной М.М. и Федосимова В.А.).
Суть способа - прототипа заключается в следующем: мембраны жировых шариков, содержащие рецепторы лактогенных гормонов, выделяют из молока коров и подвергают рецепторному анализу путем инкубации этих мембран с меченым I125 пролактином и нативным пролактином в инкубационном буфере.
Затем мембраны отделяют от буфера путем центрифугирования и определяют количество связанного с рецепторами меченого пролактина по радиоактивности проб.
Константу диссоциации и концентрацию рецепторов лактогенных гормонов определяют по графику Скэтчарда методом регрессионного анализа (с помощью программы "Дельта", разработанной в МГУ для двухцентровой модели связывания).
Недостатком прототипа является то, что выделенные рецепторы лактогенных гормонов связаны с мембранами жировых глобул молока, что не обеспечивает чистоту полученных рецепторов гормонов. Это обстоятельство, в свою очередь, позволяет проводить с рецепторами только количественный анализ и не позволяет исследовать их физико-химические и биологические свойства.
Кроме того, известный способ включает применение рецепторного анализа - трудоемкого, дорогостоящего и связанного с радиоактивными препаратами.
Целью заявленного решения является повышение эффективности способа.
Указанная цель достигается тем, что в известном способе для иммобилизации пролактина используют активированный сорбент - эпоксиактивированный TSK-гель, а инкубацию проводят в течение 2-х часов при температуре 25oC и pH буфера от 7.4 до 9.0.
Заявленный способ позволяет получать рецепторы лактогенных гормонов в чистом виде и использовать их в научных и медико-биологических исследованиях физиологии и биохимии лактогенной функции организма.
Сущность заявленного способа заключается в следующем: из молока различных видов животных выделяют жировые глобулы и тщательно их промывают. Мембраны жировых глобул солюбилизируют с помощью детергента Тритона X-100. Из полученного солюбилизата с помощью аффинной хроматографии выделяют лактогенные рецепторы в чистом виде. Раствор рецепторов концентрируется, затем проводится исследование физико-химических и биологических свойств рецепторов для данного вида и данной особи с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЖХВД) (фиг. 1).
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Выделение и обработка жировых глобул молока.
Свежее молоко фильтруют через ватные фильтры. Из фильтрованного молока выделяют жировые глобулы путем центрифугирования в течение 40 мин при 10oC при 3000 об/мин. Выделенные жировые глобулы промывают теплой водой, дозируют по порциям и помещают на хранение в холодильник при -40oC.
2. Солюбилизация мембран жировых глобул молока (МЖГМ).
Солюбилизацию МЖГМ выполняют с помощью детергента Тритона X-100: в замороженные жировые глобулы добавляют необходимое количество 1%-ного Тритона X-100 в 0.04 М фосфатном буфере с pH 7.4.
Эмульсионную смесь жировых глобул инкубируют в растворе детергента при постоянном помешивании в течение 3 часов при 30oC.
После инкубации солюбилизат, содержащий остатки мембран и выделившийся жир, центрифугируют 1 час при 0oC при 3000 об/мин. Затем плотный слой жира удаляют из центрифужных стаканов, а солюбилизат фильтруют через обычные фильтры для удаления оставшихся кусочков жира, далее - через микрофильтры - для очистки от крупных мицелл казеина и остатков мембран жировых глобул.
3. Освобождение солюбилизата от Тритона X-100.
Известно, что детергент Тритон X-100 вызывает комплексообразование основного лактогенного гормона - пролактина.
Для очистки солюбилизата от Тритона X-100 авторы предлагают использовать очень простую ячейку, заполненную сорбентом TSK HW-40 (фиг. 2). Ячейка предварительно промывается буфером (0.04 М фосфатный буфер с pH 7.4, содержащим 0.1% альбумина). Буфер удаляется полностью из ячеек центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин.
После удаления буфера в ячейки вносят порции солюбилизата и снова центрифугируют при тех же условиях. Каждая ячейка способна полностью очистить от 1%-ного Тритона X-100 30 мл солюбилизата. Одновременно применение 4 ячеек в центрифуге K-70 позволяет очистить от детергента 120 мл солюбилизата.
Исследование адсорбции Тритона X-100 показало, что при соотношении солюбилизата, содержащего 1% Тритона X-100, и геля TSK HW-40 1:3 по объему прохождения Тритона X-100 через ячейки ничтожно мало и составляет 1.4% и менее от исходного количества.
Очищенный солюбилизат из МЖГМ помещают на хранение в морозильник при -20oC.
4. Очистка рецепторов лактогенных гормонов.
Очистку рецепторов лактогенных гормонов, выделенных из МЖГМ, от различных компонентов мембран белковой и небелковой природы проводят с помощью аффинной хроматографии. Для ее осуществления авторы предлагают использовать реакционноспособный сорбент, содержащий в качестве активных групп эпоксидные циклы и полученный путем привитой сополимеризации TSK HW-65 геля с глицидилметакрилатом.
Привитая сополимеризация геля осуществляется в окислительно-восстановительной среде в присутствии солей церийаммонийнитрата - Ce(NH4)2(NO3)6, которые инициируют привитую сополимеризацию.
5. Иммобилизация пролактина на активированном сорбенте - эпоксиактивированном TSK-геле.
Известно, что во время присоединения лигандов к активированному сорбенту эпоксидные группы реагируют с аминогруппами лигандов, образуя ковалентные связи. Степень присоединения определяется первичными аминогруппами лиганда и зависит от pH, состава буфера, температуры и времени инкубации.
Кроме того, присоединение определенного белка зависит в какой-то степени и от свойств этого белка.
В процессе исследований авторами установлены оптимальные значения этих параметров: pH, состава буфера, температуры и времени инкубации для адсорбции пролактина с активированным сорбентом.
В заявленном способе авторы предлагают использовать говяжий пролактин (производство фирмы "Гормон", Москва) с активностью 20 МЕ. В качестве инкубационного буфера предлагается 0.5 М Na2CO3. Инкубацию сорбента с пролактином проводят при перемешивании при 25oC. Оптимальные условия связывания пролактина обеспечиваются в буфере с pH 9.0 при 25oC в течение 2-х часов инкубации. Данные опытов приведены на фиг. 3.
При этих условиях связывается с гелем 51% содержащегося в инкубационном буфере пролактина.
При увеличении времени инкубации до 4 часов при 25oC количество связанного пролактина увеличивается до 58%.
Поскольку некоторое количество активированных групп в сорбенте остаются свободными и после присоединения лигандов, эти группы обычно блокируют избытком первичного амина - этоколамина, глицина, глюкозамина и др. Авторы предлагают использовать для этой цели 10%-ный раствор трис-OH в 0.5 М Na2CO3, pH 9.00. Инкубацию трис-OH буфера с сорбентом проводят при 25oC в течение 3 часов при постоянном помешивании. Затем сорбент промывают.
Промытый сорбент с иммобилизированным пролактином используют для опытов или помещают на хранение в холодильник при 4oC в 0.5 М растворе NaCl.
Для связывания рецепторов ЛГ с иммобилизированным на эпоксиактивированном TSK-геле пролактином сорбент инкубируют с солюбилизатом из МЖГМ в течение 18 часов при 25oC в 0.04 М фосфатном буфере с pH 7.4. Затем сорбент переносят в стеклянные фильтры Шотта и тщательно промывают водой, буфером и окончательно еще раз водой.
Десорбцию рецепторов с комплексом ПРЛ-рецептор выполняют с помощью 0.05 М раствора ацетата аммония (NH4CH3COO), pH 4.2, содержащего 0.1% Тритона X-100.
Сорбент с иммобилизированным на его поверхности комплексом ПРЛ-рецептор инкубируют в растворе ацетата аммония в течение 1 часа при 25oC. Затем смесь сорбента с раствором переносят в специальные ячейки (фиг. 2) с TSK HW-40 гелем и центрифугируют. При этой операции раствор с десорбированными с комплекса рецепторами ЛГ освобождается от Тритона X-100.
Очищенные с помощью аффинной хроматографии рецепторы ЛГ имеют в растворе очень низкую концентрацию, которая находится за пределами чувствительности УФ-детектора. Авторы предлагают концентрировать растворы, в содержащие рецепторы ЛГ, с помощью эмирсионных фильтров CX-10 (Millipore). Один фильтр CX-10 способен отфильтровать 20 мл жидкости за 6-7 часов. Авторами выполнено концентрирование раствора рецепторов в 20 раз.
На фиг. 4 представлена хроматограмма очищенных и сконцентрированных рецепторов ЛГ из МЖГМ. На хроматограмме четко видны три пика. Первый пик проходит в свободном объеме гельфильтрующей колонки (TSK SW 4000) и имеет молекулярный вес не менее 2000 КД. Очевидно, этот пик представляет собой рецепторные кластеры, солюбилизированные с МЖГМ.
Второй пик на хроматограмме имеет кажущейся молекулярный вес 56 КД и представляет собой мономерную форму рецептора ЛГ.
Третий пик на хроматограмме представляет собой продукты распада рецепторов ЛГ с молекулярным весом менее 10 КД.
Таким образом, осуществляется контроль качества полученных рецепторов.
Список использованной литературы
1. Описание изобретения к А.С. N 1751665 авторов: Лариной М.М. и Федосимова В.А. на "Способ определения концентрации лактогенных рецепторов".
1. Описание изобретения к А.С. N 1751665 авторов: Лариной М.М. и Федосимова В.А. на "Способ определения концентрации лактогенных рецепторов".
2. Biol Chem. Hoppe - Seyler, vol. 374, pp. 271-279, 1993. Johrke, B. Kruger, T.Viengutz, The Celycolylation as Source of the Variability in prolactin Patterns of Jnolividl al Human Amniotic Fluids.
Claims (1)
- Способ получения рецепторов лактогенных гормонов, включающий выделение жировых глобул молока центрифугированием, отличающийся тем, что жировые глобулы молока обрабатывают детергентом Тритоном Х-100, полученный солюбилизат мембран жировых глобул молока очищают, рецепторы выделяют с помощью аффинной хроматографии на активированном сорбенте, в качестве которого используют пролактин, иммобилизованный на эпоксиактивированном TSK-геле, полученный в результате инкубации при рН буфера от 7,4 до 9,0.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU99109621A RU2159251C1 (ru) | 1999-04-29 | 1999-04-29 | Способ получения рецепторов лактогенных гормонов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU99109621A RU2159251C1 (ru) | 1999-04-29 | 1999-04-29 | Способ получения рецепторов лактогенных гормонов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2159251C1 true RU2159251C1 (ru) | 2000-11-20 |
Family
ID=20219545
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU99109621A RU2159251C1 (ru) | 1999-04-29 | 1999-04-29 | Способ получения рецепторов лактогенных гормонов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2159251C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2456996C1 (ru) * | 2011-06-07 | 2012-07-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере зищиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Способ получения очищенной в-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма vibrio cholerae |
-
1999
- 1999-04-29 RU RU99109621A patent/RU2159251C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
WATERS M.I. Prolactin receptor content of rabbit milk, Endocrinolody, 1980, v.107, N 3, p.816-821. KARMER G.W. et al. I of Endocrinolody, 1986, N 109, p.175-180. JOHRKE, et al. The celycolylation as Source of the variability in prolactin patterns of jnolividl al human amniotic fluids, Biol. Chem, Hoppe-Seyler, v.374, p.271-279, 1993. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2456996C1 (ru) * | 2011-06-07 | 2012-07-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере зищиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Способ получения очищенной в-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма vibrio cholerae |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA1188612A (en) | Recovery | |
US20080319163A1 (en) | Method for Isolating and Purifying Immuno-Modulating Polypeptide from Cow Placenta | |
US4512763A (en) | Method and apparatus for selective removal of constituents of blood | |
EP3897696A1 (en) | Extracorporeal devices for methods for treating diseases associated with anti-neutrophil cytoplasmic antibodies | |
Noda et al. | Mode of action of staphylococcal leukocidin: relationship between binding of 125I-labeled S and F components of leukocidin to rabbit polymorphonuclear leukocytes and leukocidin activity | |
CN106140099A (zh) | 一种分离纯化乳铁蛋白的免疫亲和柱及其制备方法和用途 | |
NO169577B (no) | Fyllmateriale for vaeske-kromatograf | |
RU2159251C1 (ru) | Способ получения рецепторов лактогенных гормонов | |
RU2643365C2 (ru) | Способ очистки дарбэпоетина альфа | |
EP3612548B1 (en) | Methods for removing bacterial toxins from a biological fluid | |
CN111087443A (zh) | 一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法 | |
Bertrand et al. | Expanded bed chromatography for one-step purification of mannose binding lectin from tulip bulbs using mannose immobilized on DEAE Streamline | |
Eveleigh | Techniques and instrumentation for preparative immunosorbent separations | |
JP6259245B2 (ja) | 免疫グロブリンGに対する親和性を有するペプチド及びそれを用いたIgG型抗体吸着材 | |
WO1989012390A1 (en) | Biocompatible, substance-specific reagents for treating physiological fluids | |
JPH0245064A (ja) | インターロイキン2レセプターの除去装置およびそれを備えた血液体外循環装置 | |
Horenstein et al. | Purification of clinical-grade monoclonal antibodies by chromatographic methods | |
Yamamoto et al. | Selective Removal of Anti‐Acetylcholine Receptor Antibodies and IgG In Vitro with an Immunoadsorbent Containing Immobilized Sulfathiazole | |
JP6236278B2 (ja) | 体液浄化デバイス用IgG型抗体吸着材 | |
RU2389022C2 (ru) | Сорбент для удаления иммуноглобулинов | |
JPS6251589B2 (ru) | ||
RU2325172C2 (ru) | Сорбент для удаления иммуноглобулинов | |
Srour et al. | Histidine based adsorbents for selective removal of monoclonal immunoglobulin IgM antibodies from Waldenstrom's macroglobulinemia patient sera: A preliminary study | |
CN1463985A (zh) | 自雁形目鸟类卵中选择性分离IgY抗体的方法及由此获得的IgY抗体 | |
Josić et al. | High-performance liquid affinity chromatography of liver plasma membrane proteins |