RU2157843C1 - Bacterial strain bacillus cereus b 3b for oxidation of petroleum hydrocarbons and derivatives - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnological methods for oil pollution removal. SUBSTANCE: bacterial strain isolated from soil polluted by petroleum derivatives is cultured for 72 h in liquid nutrient medium containing mineral salts, soya been flour, and molasses at 28 C under aerobic conditions. Deep culture of microorganism (10%) is placed into sterile peat with mineral additives and additionally grown for 120 h at 3 C. Destructive activity of preparation containing thus grown strain with regard to petroleum hydrocarbons and derivatives at working concentration of bacteria 0.1% ranges between 91.5 and 94% within a wide pH range: from 3.0 to 8.5. EFFECT: enhanced oil destructive activity. 2 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов, и может быть использовано для получения биопрепаратов для очистки почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, а также для ликвидации аварийных разливов нефти. The invention relates to biotechnology, in particular to the cleaning of environmental objects from pollution by oil and oil products using microorganisms, and can be used to obtain biological products for cleaning soils and surface water from oil pollution, as well as to eliminate accidental oil spills.

Известны нефтеокисляющие штаммы бактерий Acenitobacter, см. патент РФ N 2053204 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г., и Mycobacterium, см. патент РФ N 2053206 по кл. С 02 F 3/34 от 29.09.94 г., применяемые для биодеструкции углеводородов нефтепродуктов в окружающей среде. Known oil-oxidizing strains of bacteria Acenitobacter, see RF patent N 2053204 for class. With 02 F 3/34 dated 04/12/94, and Mycobacterium, see RF patent N 2053206 for class. C 02 F 3/34 dated 09/29/94, used for biodegradation of hydrocarbons of petroleum products in the environment.

Однако эти штаммы недостаточно эффективны. However, these strains are not effective enough.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) являются штаммы Pseudomonas putida ПИК₀-1, Pseudomonas fluorescens П-896 и Micrococcus ПИК_y-1, которые используются в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий для создания биопрепарата для очистки от нефти и нефтепродуктов. Штаммы имеют достаточную активность при pH от 4,5 до 8,5, см. патент РФ N 2122980 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г.The closest technical solution (prototype) are strains of Pseudomonas putida PIK ₀ -1, Pseudomonas fluorescens P-896 and Micrococcus PIK _y -1, which are used as aerobic oil-oxidizing bacteria to create a biological product for cleaning from oil and oil products. The strains have sufficient activity at a pH of from 4.5 to 8.5, see RF patent N 2122980 for class. C 02 F 3/34 dated 04/12/94

Недостатком данных штаммов является относительно низкая нефтеокисляющая активность при низких значениях pH среды. The disadvantage of these strains is the relatively low oil oxidizing activity at low pH values.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий, обладающих высокой нефтеокисляющей активностью при низких значениях pH среды. The objective of the present invention is to obtain a strain of bacteria with high oil-oxidizing activity at low pH values.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Bacillus cereus В 3б, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов при pH от 3,0 до 8,5. To solve this problem, a bacterial strain Bacillus cereus B 3b is proposed, which has a high destructive activity against hydrocarbons of oil and oil products at pH from 3.0 to 8.5.

Штамм бактерий Bacillus cereus В 3б депонирован в Государственной Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ГКМ ВИЗР) по номером 98 от 12.03.99 г. Идентификация штамма проведена по "Определителю микроорганизмов" Берги (1980г.). The bacterial strain Bacillus cereus B 3b was deposited in the State Collection of microorganisms of the All-Russian Scientific Research Institute of Plant Protection (GKM VIZR) under the number 98 dated 03/12/99. The strain was identified by the Identifier of Microorganisms by Bergi (1980).

Штамм бактерий Bacillus cereus В 3б выделен из загрязненной нефтепродуктами почвы в поселке Кишкенай (Литовская республика) на территории Клайпедского филиала АО "ТОГ". Штамм выделен на селективной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника питания углеводороды нефтепродуктов. The bacterial strain Bacillus cereus B 3b was isolated from oil-contaminated soil in the village of Kishkenai (Republic of Lithuania) on the territory of the Klaipeda branch of TOG JSC. The strain is isolated on a selective nutrient medium containing hydrocarbons of petroleum products as the sole source of nutrition.

Штамм отселектирован и стабилизирован по признаку углеводородокисляющей активности в отношении нефти и нефтепродуктов. The strain is selected and stabilized on the basis of hydrocarbon-oxidizing activity in relation to oil and oil products.

Культурально-морфологические признаки штамма:
Палочки размером 1,5 х (3,0 - 7,0) мкм, одиночные и в цепочках, образуют споры через 24 - 48 часов на МПА; споры овальные, спорангий не раздувается, расположены субтерминально. На МПА культура образует непрозрачные белые или светло-кремовые колонии с ровным краем, блестящие, слизистые, легко снимающиеся с поверхности агара. Штамм растет в диапазоне температур от (2 - 5)^oC до (45 - 50)^oC, оптимальная температура роста - (25-35)^oC; pH среды от 2,7 до 8,8, оптимальный - 3,4 - 7,5. Штамм хранят на косяках МПА при (2 - 5)^oC или в лиофилизированном виде в ампулах.Cultural and morphological characteristics of the strain:
Rods measuring 1.5 x (3.0 - 7.0) microns, single and in chains, form spores after 24 - 48 hours on MPA; disputes are oval, sporangium does not swell, are located subterminally. On MPA, the culture forms opaque white or light cream colonies with a smooth edge, shiny, mucous, easily removed from the surface of the agar. The strain grows in the temperature range from (2 - 5) ^o C to (45 - 50) ^o C, the optimum growth temperature is (25-35) ^o C; pH of the medium is from 2.7 to 8.8, the optimal is 3.4 - 7.5. The strain is stored on the jambs of the MPA at (2 - 5) ^o C or in lyophilized form in ampoules.

Физиолого-биохимические признаки штамма:
Грамположителен (по щелочи), факультативный анаэроб, растет анаэробно, не образует пигменты. Оксидазный тест положительный, каталазный тест положительный. Растет при 7%NaCI, при +55^oC рост отсутствует. Тест Фогес-Проскауэра положительный, pH среды теста Фогес-Проскауэра - 5,7. Образует ацетилметилкарбинол, потребляет цитрат, утилизирует пропионат. Обладает нитратредуцирующей способностью. Гидролизует желатин, казеин, крахмал; образует кислоту из глюкозы. Способен к восстановлению лакмуса, пептонизации и образованию творожистого осадка сычужного типа в тесте с лакмусовым молоком. Утилизирует многие источники азотного и углеродного питания: нитраты, соли аммония, пептон, аминокислоты, кукурузную и соевую муку, растительные экстракты и лизаты, глюкозу, сахарозу, крахмал.Physiological and biochemical characteristics of the strain:
Gram-positive (alkali), facultative anaerobic, grows anaerobically, does not form pigments. The oxidase test is positive, the catalase test is positive. It grows at 7% NaCI, at +55 ^o C there is no growth. The Voges-Proskauer test is positive, the pH of the Voges-Proskauer test is 5.7. Forms acetylmethylcarbinol, consumes citrate, utilizes propionate. It has nitrate-reducing ability. Hydrolyzes gelatin, casein, starch; forms acid from glucose. It is capable of restoring litmus, peptonization and the formation of a curdled sediment of the rennet type in the test with litmus milk. It utilizes many sources of nitrogen and carbon nutrition: nitrates, ammonium salts, peptone, amino acids, corn and soy flour, plant extracts and lysates, glucose, sucrose, starch.

Для выращивания штамма и получения биопрепарата использовали посевную и ферментационную питательные среду следующего состава:
KH₂PO₄ - 2 г/л
Na₂HPO₄ - 3 г/л
MgSO₄ • 7Н₂O - 0,5 г/л
FeCl₂ • 6H₂O - 0,05 г/л
CaCl₂ • 2H₂O - 0,01 г/л
(NH₄)₂SO₄ - 2 г/л
Соевая мука - 5 г/л
Меласса - 20 г/л
Вода - до 1 л
Посевной материал выращивали в колбах, а процесс культивирования проводили в ферментерах V = 100 л при Т = 28^oC, pH 6,8 - 7,2 в течение 72 часов в аэробных условиях. В качестве индуктора использовали 0,01% сырую нефть. Затем глубинную культуру микроорганизма (10%) вносили в стерильный торф одновременно с минеральными добавками и проводили доращивание при Т = 3^oC в течение 120 часов.To grow the strain and obtain a biological product used inoculum and fermentation nutrient medium of the following composition:
KH ₂ PO ₄ - 2 g / l
Na ₂ HPO ₄ - 3 g / l
MgSO ₄ • 7H ₂ O - 0.5 g / l
FeCl ₂ • 6H ₂ O - 0.05 g / l
CaCl ₂ • 2H ₂ O - 0.01 g / l
(NH ₄ ) ₂ SO ₄ - 2 g / l
Soya flour - 5 g / l
Molasses - 20 g / l
Water - up to 1 l
The seed was grown in flasks, and the cultivation process was carried out in fermenters V = 100 l at T = 28 ^o C, pH 6.8 - 7.2 for 72 hours under aerobic conditions. 0.01% crude oil was used as an inductor. Then a deep culture of the microorganism (10%) was introduced into sterile peat simultaneously with mineral additives and was grown at T = 3 ^o C for 120 hours.

В качестве минеральных добавок использовали:
карбамид - 0,6 мас.%;
двойной суперфосфат - 0,3 мас.%;
сульфат калия - 1,5 мас.%
Титр полученного биопрепарата - 1 • 10¹² КОЕ/г.As mineral additives used:
carbamide - 0.6 wt.%;
double superphosphate - 0.3 wt.%;
potassium sulfate - 1.5 wt.%
The titer of the obtained biological product is 1 • 10 ¹² CFU / g.

Нефтеокисляющую активность штамма оценивали ИК-спектрометрически с использованием прибора АН-2 по снижению концентрации углеводородов нефтепродуктов в образцах почвы. The oil-oxidizing activity of the strain was evaluated by IR spectrometry using the AN-2 instrument to reduce the concentration of hydrocarbons in oil products in soil samples.

Пример 1
Биопрепарат на основе штамма бактерий Bacillus cereus В 3б вносили в керамические сосуды, наполненные грунтом с pH от 3,0 до 8,5 и содержанием мазута 36,6 до 39,2 г/кг. Количество внесенного биопрепарата - 1 г на 1 кг почвы. Сосуды выдерживали в термостатах в диапазоне температуры от 3 до 45^oC в течение 90 суток. Содержание мазута в почве контролировали 1 раз в 30 дней. Опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 1.Example 1
A biological product based on the Bacillus cereus B 3b strain of bacteria was introduced into ceramic vessels filled with soil with a pH from 3.0 to 8.5 and a fuel oil content of 36.6 to 39.2 g / kg. The amount of biological product introduced is 1 g per 1 kg of soil. The vessels were kept in thermostats in the temperature range from 3 to 45 ^o C for 90 days. The fuel oil content in the soil was monitored once every 30 days. The experiment was carried out in triplicate. The results are presented in table 1.

Пример 2
Во втором примере биопрепарат на основе штамма бактерий Bacillus cereus В 3б был внесен в стеклянные сосуды, наполненные почвой с содержанием сырой нефти 48,0 - 51,4 г/кг; pH колебалось от 3,0 до 8,5.Example 2
In the second example, a biological product based on the bacterial strain Bacillus cereus B 3b was introduced into glass vessels filled with soil with a crude oil content of 48.0 - 51.4 g / kg; pH ranged from 3.0 to 8.5.

Опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 2. The experiment was carried out in triplicate. The results are presented in table 2.

В результате проведенных опытов можно констатировать весьма высокую деструктивную активность препарата на основе заявленного штамма (до 94%), в том числе и при низком pH (до 92,5% при pH 3,0). При этом штамм эффективен в широком диапазоне температур (Т = 3 - 45^oC).As a result of the experiments, it is possible to state a very high destructive activity of the drug based on the claimed strain (up to 94%), including at low pH (up to 92.5% at pH 3.0). Moreover, the strain is effective in a wide temperature range (T = 3 - 45 ^o C).

Штамм бактерий Bacillus cereus В 3б может быть выращен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых материалов. The bacterial strain Bacillus cereus B 3b can be grown industrially using standard biotechnological equipment using available raw materials.

Claims (1)

Штамм бактерий Bacillus cereus В 3б ГКМ ВИЗР 98 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов. The bacterial strain Bacillus cereus B 3b GKM VIZR 98 for the oxidation of hydrocarbons and petroleum products.

Images