RU2152219C1 - Peptides showing immunostimulating activity, method of their synthesis, drug based on thereof, splenopid and its using - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine, preparative biochemistry, pharmaceutical industry, biotechnology. SUBSTANCE: invention relates to peptides with immunostimulating activity, method of their synthesis, drug "Splenopid" developed on the base of these peptides and its using. Peptides of molecular mass from 400 to 50 000 Da are obtained from spleen tissue by mitogenic stimulation of spleen tissue cells in the process of its washing out, organ homogenization, dispersing in distilled water, disruption of cells by freezing-thawing out, ultrasonic oscillation, extract separation and its ultrafiltration through filters with pores size at interface value 50 000 Da. After addition of filling agent to isolated peptides the preparation is obtained in lyophilized form which is stable at storage for two years. Preparation can be used for treatment of patients with severe forms of suppurative-septic and autoimmune diseases. EFFECT: improved method of preparing, high effectiveness of preparation. 7 cl, 5 tbl

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к препаративной биохимии и фармацевтической промышленности и касается пептидов, обладающих иммуностимулирующей активностью, способа их получения, лекарственного препарата Спленопид, созданного на их основе, и его применения. The invention relates to medicine, namely to preparative biochemistry and the pharmaceutical industry, and relates to peptides having immunostimulating activity, a method for their preparation, a Splenopid drug based on them, and its use.

В настоящее время показана клиническая эффективность лечения инфекционных, гнойно-септических и онкогематологических заболеваний цитокинами, которые являются растворимыми факторами иммунокомпетентных клеток и представлены пептидами. Цитокины получают в чистом виде из природных источников сырья: тимуса и костного мозга млекопитающих, а также из клеток, стимулированных митогенами. В настоящее время широко известны цитокины, полученные химическим и рекомбинантным синтезом. Для повышения эффективности их применения проводятся попытки создания фармацевтических композиций, содержащие широкий набор синтетических цитокинов. Currently, clinical efficacy of treatment of infectious, purulent-septic and oncohematological diseases with cytokines, which are soluble factors of immunocompetent cells and are represented by peptides, has been shown. Cytokines are obtained in pure form from natural sources of raw materials: the thymus and bone marrow of mammals, as well as from cells stimulated by mitogens. Currently, cytokines obtained by chemical and recombinant synthesis are widely known. To increase the effectiveness of their use, attempts are being made to create pharmaceutical compositions containing a wide range of synthetic cytokines.

Что же касается селезенки млекопитающих, то известно, что перфузат селезенки свиньи обладает выраженной иммуностимулирующей активностью, обусловленной комплексом нативных цитокинов: интерлейкина-1, интерлейкина-2, интерферона-гамма, фактора некроза опухоли-альфа, гранулоцитарно-макрафагального колониестимулирующего фактора [1]. Однако попытки получения чистых биологически активных пептидов из селезенки довольно немногочисленны. Так, известен способ получения иммуностимулятора пептидной природы из селезенки млекопитающих [2]. Согласно этому способу селезенку свиньи или крупного рогатого скота промывают водой или ацетоном, измельчают, замораживают при -5^oC, экстрагируют 3%-ной уксусной кислотой при pH 3,0-4,0 в присутствии хлористого цинка, центрифугируют, перемешивают с ацетоном, получают осадок, который растворяют в воде в присутствии уксусной кислоты с последующей фильтрацией и лиофилизацией. Однако полученный препарат содержит комплекс пептидов с неопределенным молекулярным весом, не обладает высокой стимулирующей активностью, а также содержит большое количество посторонних примесей.As for the mammalian spleen, it is known that porcine spleen perfusate has a pronounced immunostimulating activity due to a complex of native cytokines: interleukin-1, interleukin-2, interferon-gamma, tumor necrosis factor-alpha, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor [1]. However, attempts to obtain pure biologically active peptides from the spleen are rather few. So, there is a method of obtaining an immunostimulant of peptide nature from the mammalian spleen [2]. According to this method, the spleen of a pig or cattle is washed with water or acetone, crushed, frozen at -5 ^o C, extracted with 3% acetic acid at pH 3.0-4.0 in the presence of zinc chloride, centrifuged, mixed with acetone, a precipitate is obtained which is dissolved in water in the presence of acetic acid, followed by filtration and lyophilization. However, the resulting preparation contains a complex of peptides with an indefinite molecular weight, does not have a high stimulating activity, and also contains a large number of impurities.

Известна пептидсодержащая фракция, выделенная из селезенки свиньи или крупного рогатого скота, с молекулярной массой от 10000 до 140000 дальтон [3] . Указанная пептидсодержащая фракция содержит не только чистые белки, но и около 20-25 аминокислот. Что же касается способа ее получения, то он является аналитическим, поскольку для выделения фракции с указанной молекулярной массой необходимо разделение пептидсодержащей смеси с помощью хроматографии высокого давления. Способ заключается в промывании селезенки, ее измельчении, замораживании, экстрагировании фосфатным буфером, отделении осадка центрифугированием, ультрафильтрации надосадочной жидкости, сорбции на гельфосфате кальция и выделении указанной фракции жидкостной хроматографией высокого давления, ее стерилизующей фильтрации и лиофилизации. Known peptide fraction isolated from pig spleen or cattle, with a molecular weight of from 10,000 to 140,000 daltons [3]. The specified peptide-containing fraction contains not only pure proteins, but also about 20-25 amino acids. As for the method for its preparation, it is analytical, since separation of a peptide-containing mixture by high pressure chromatography is necessary to isolate a fraction with the indicated molecular weight. The method consists in washing the spleen, grinding it, freezing it, extracting it with phosphate buffer, separating the precipitate by centrifugation, ultrafiltration of the supernatant, sorption on calcium gelphosphate and isolating this fraction with high pressure liquid chromatography, sterilizing filtration and lyophilization.

Разработан способ получения и изучены некоторые свойства иммуномодулятора пептидной природы из селезенки свиньи с молекулярной массой пептидов от 700 до 15000 дальтон с последующей лиофилизацией продукта [4]. Полученный модулятор обладает высокой стимулирующей активностью, однако содержит также и примеси. Что же касается чистых пептидов, выделенных из селезенки, то известен пептид hil-2, выделенный из супернатанта клеток селезенки, стимулированных конконавалином А, который является разновидностью интерлейкина-2 и состоит из 140 аминокислот, обладая многими свойствами интерлейкина-2 [5], а также спленопептид, являющийся пентапептидом, с иммунологическими свойствами, подобными спленину [6]. Эти пептиды могут употребляться в нейтральной или солевой форме, могут включать небелковую часть, а также различные добавки, которые их делают пригодными для применения в виде инъекций, однако область их применения весьма ограничена. В то же самое время в литературе описано применение перфузатов ксеноселезенки для лечения больных с обширными гнойно-деструктивными заболеваниями легких и плевры с осложненным течением [7] , а также спленоперфузии для лечения таких аутоиммунных заболеваний, как системная красная волчанка, ревматоидный артрит и бронхиальная астма [8], при этом лечебный эффект обусловлен свойствами этого органа вырабатывать большое количество иммуномодулирующих веществ пептидной природы. A method was developed for the preparation and some properties of an immunomodulator of peptide nature from a pig spleen with a molecular weight of peptides from 700 to 15,000 daltons with subsequent lyophilization of the product [4]. The resulting modulator has a high stimulating activity, but also contains impurities. As for the pure peptides isolated from the spleen, the hil-2 peptide is known, isolated from the supernatant of spleen cells stimulated with conconavalin A, which is a type of interleukin-2 and consists of 140 amino acids, possessing many properties of interleukin-2 [5], and also a splenopeptide, which is a pentapeptide, with immunological properties similar to splenin [6]. These peptides can be used in neutral or salt form, can include non-protein part, as well as various additives that make them suitable for use in the form of injections, but their scope is very limited. At the same time, the literature describes the use of xenospleen perfusates for the treatment of patients with extensive purulent-destructive diseases of the lungs and pleura with a complicated course [7], as well as splenoperfusion for the treatment of autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis and bronchial asthma [ 8], while the therapeutic effect is due to the properties of this organ to produce a large number of immunomodulatory substances of peptide nature.

В связи с изложенным, задача изобретения заключается в поисках фракции пептидов, ответственных за активность, которой обладают перфузаты селезенки, выделении их в чистом виде с сохранением высокой иммуностимулирующей активности и низкой реактогенности, а также в создании препарата, представляющего фармацевтическую композицию, содержащую выделенные пептиды и фармакологически пригодный наполнитель, который позволяет получить препарат в лиофилизированной форме, пригодный к длительному хранению и парентеральному введению с минимальным аллергизирующим эффектом. Дополнительное применение препарата Спленопид показало высокую эффективность лечения тяжелых форм гнойно-септических и аутоиммунных заболеваний и позволило снизить количество применяемых глюкокортикостероидов. In connection with the foregoing, the objective of the invention is to search for the fraction of peptides responsible for the activity possessed by spleen perfusates, isolating them in pure form while maintaining high immunostimulatory activity and low reactogenicity, as well as in creating a drug representing a pharmaceutical composition containing the isolated peptides and pharmacologically suitable excipient, which allows you to get the drug in lyophilized form, suitable for long-term storage and parenteral administration with minimal m allergenic effect. The additional use of the drug Splenopid has shown high efficiency in the treatment of severe forms of purulent-septic and autoimmune diseases and has reduced the number of glucocorticosteroids used.

Сущность изобретения заключается в получении пептидов из клеток ткани селезенки с молекулярной массой 400-50000 дальтон, полученных стимуляцией митогеном в процессе отмывки ткани селезенки, разрушением клеток диспергированной в воде, предварительно гомогенизированной ткани и ультрафильтрацией отделенного экстракта через фильтры с размером пор с границей раздела 50000 дальтон. The essence of the invention is to obtain peptides from spleen tissue cells with a molecular weight of 400-50000 daltons, obtained by stimulation with mitogen during washing of spleen tissue, destruction of cells dispersed in water, pre-homogenized tissue and ultrafiltration of the separated extract through filters with pore sizes with an interface of 50,000 daltons .

Способ получения пептидов, обладающих иммуностимулирующей активностью, включает стимуляцию клеток ткани селезенки млекопитающих митогеном одновременно с отмывкой органа разрушением клеток замораживанием-размораживанием ткани, диспергированной в дистиллированной воде после предварительной гомогенизации органа с последующей ультразвуковой обработкой, отделение экстракта и его ультрафильтрацию через капиллярные фильтры с размером пор с границей раздела 50000 дальтон. A method for producing peptides having immunostimulating activity involves stimulating mammalian spleen tissue cells with mitogen while washing the organ with cell destruction by freezing-thawing the tissue dispersed in distilled water after preliminary homogenization of the organ, followed by ultrasonic treatment, separation of the extract and its ultrafiltration through capillary filters with pore size with a dividing 50,000 daltons.

Лекарственный препарат Спленопид, обладающий иммуностимулирующей активностью, представляет собой пептиды из клеток ткани селезенки с молекулярной массой 400-50000 дальтон, полученных стимуляцией митогеном в процессе отмывки ткани селезенки, разрушением клеток предварительно гомогенизированной ткани, диспергированной в дистиллированной воде, и ультрафильтрацией отдельного экстракта через фильтры с размером пор с границей раздела 50000 дальтон, взятые в количестве 10-15 мг белка в дозе, и физиологически пригодный наполнитель, в качестве которого может быть использован желатиноль с гентамицином. Препарат получают в лиофилизированной форме посредством лиофильного высушивания пептидов с наполнителем, включающего замораживание лиофилизата при -35^oC и высушивания в течение 48 часов в сублимационной камере при -30^o и вакууме 0,1 Тор.The drug Splenopid, which has immunostimulating activity, is a peptide from spleen tissue cells with a molecular weight of 400-50000 daltons, obtained by mitogen stimulation during washing of spleen tissue, destruction of cells of pre-homogenized tissue dispersed in distilled water, and ultrafiltration of an individual extract through filters with pore size with an interface of 50,000 daltons, taken in an amount of 10-15 mg of protein per dose, and a physiologically acceptable excipient, as CSOs can be used zhelatinol with gentamicin. The drug is obtained in lyophilized form by freeze drying the peptides with an excipient, including freezing the lyophilisate at -35 ^o C and drying for 48 hours in a freeze-drying chamber at -30 ^o and a vacuum of 0.1 Torr.

Способ лечения гнойно-септических заболеваний включает на фоне комплексной терапии дополнительное внутримышечное введение больному лекарственного препарата Спленопид ежедневно, однократно в течение суток в количестве 5-20 мг белка в течение 3-10 дней. A method for the treatment of purulent-septic diseases includes, against the background of complex therapy, additional intramuscular injection of the drug Splenopid to the patient daily, once a day, in the amount of 5-20 mg of protein for 3-10 days.

Способ лечения аутоиммунных заболеваний включает дополнительное внутримышечное введение больному лекарственного препарата Спленопид ежедневно, однократно в течение суток в количестве 5-20 мг белка в течение 3-10 дней. A method for the treatment of autoimmune diseases includes additional intramuscular administration of the drug Splenopid to the patient daily, once a day, in the amount of 5-20 mg of protein for 3-10 days.

Изобретение реализуется следующим образом. The invention is implemented as follows.

Стерильно забранную селезенку свиньи или крупного рогатого скота отмывают физиологическим раствором, содержащим митогенный стимулятор фитогемагглютинин или конконавалин А для митогенной стимуляции спленоцитов. Селезенку помещают в транспортный контейнер при температуре 4-6^oC и доставляют в стерильный бокс, селезенку измельчают ножницами, а затем в гомогенизаторе, к гомогенату добавляют дистиллированную воду и разрушение клеток осуществляют повторным замораживанием-размораживанием с последующей обработкой ультразвуком. Затем массу центрифугируют или фильтруют через грубый фильтр и полученный таким образом экстракт подвергают ультрафильтрации через капиллярные фильтры с границей раздела 50000 дальтон. Ультрафильтрат представляет собой фракцию, содержащую пептиды, полипептиды и низкомолекулярные белки с молекулярной массой от 400 до 50000 дальтон. Для получения стабильного при хранении препарата Спленопид, обладающего иммуностимулирующей активностью, к ультрафильтрату добавляют официнальный желатиноль и раствор гентамицина, разливают во флаконы по 5 мл и подвергают лиофильному высушиванию при температуре замораживания -35^oC, при этом температура в сублимационной камере составляет -30^oC, уровень вакуума -0,1 Тор, время сублимации - 48 часов. Высушенный препарат герметично закрывают резиновой крышкой, завальцовывают алюминиевым колпачком и маркируют. Для проверки биологической активности содержимое флакона растворяют в дистиллированной воде и проверяют пролиферативную активность лимфоцитов, а также влияние препарата на течение аутоиммунного процесса у экспериментальных животных и на индуцированный экспериментальный сепсис и экспериментальную миелодепрессию. Далее проводят испытание препарата Спленопид в клинике при лечении тяжелых форм аутоиммунных (системная красная волчанка, ревматоидный артрит и т.д.) и гнойно-септических заболеваний.The sterilely taken spleen of a pig or cattle is washed with physiological saline containing a mitogenic stimulant phytohemagglutinin or conconavalin A to mitogenously stimulate splenocytes. The spleen is placed in a transport container at a temperature of 4-6 ^o C and delivered to a sterile box, the spleen is crushed with scissors, and then in the homogenizer, distilled water is added to the homogenate and the cells are destroyed by repeated freezing-thawing, followed by ultrasound treatment. The mass is then centrifuged or filtered through a coarse filter, and the extract thus obtained is subjected to ultrafiltration through capillary filters with an interface of 50,000 daltons. Ultrafiltrate is a fraction containing peptides, polypeptides and low molecular weight proteins with a molecular weight of from 400 to 50,000 daltons. To obtain a storage-stable preparation of Splenopid, which has immunostimulating activity, officinal gelatinol and a gentamicin solution are added to the ultrafiltrate, poured into 5 ml vials and freeze-dried at a freezing temperature of -35 ^o C, while the temperature in the sublimation chamber is -30 ^o C vacuum level -0.1 Torr, sublimation time - 48 hours. The dried preparation is sealed with a rubber lid, rolled with an aluminum cap and marked. To check the biological activity, the contents of the vial are dissolved in distilled water and the proliferative activity of lymphocytes is checked, as well as the effect of the drug on the course of the autoimmune process in experimental animals and on induced experimental sepsis and experimental myelo-depression. Next, they test the drug Splenopid in the clinic for the treatment of severe autoimmune forms (systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, etc.) and purulent-septic diseases.

При лечении тяжелых форм гнойно-септических и аутоиммунных заболеваний больному на фоне традиционного лечения вводят внутримышечно препарат Спленопид в количестве 5-20 мг белка в дозе ежедневно, однократно в течение суток 3-10 дней. In the treatment of severe forms of purulent-septic and autoimmune diseases, the patient is administered intramuscularly with Splenopid in the amount of 5-20 mg of protein in a dose daily, once a day for 3-10 days, against the background of traditional treatment.

Примеры осуществления способа. Examples of the method.

Пример 1. В цехе биопрепаратов мясокомбината осуществляют стерильный забор селезенок от годовалых свиней. Вес трех селезенок составляет 995 г. Каждую селезенку отмывают 1 л 0,9%-ного раствора хлористого натрия с добавлением 30-40 мг фитогемагглютинина. Селезенку в стерильном полиэтиленовом пакете помещают и транспортный контейнер (температура +4-6^oC), доставляют в стерильный бокс лаборатории. Препарат получают путем грубого измельчения ткани селезенки ножницами с последующим более тонким измельчением гомогенизатором, добавляют 1600 мл дистиллированной воды. Последующее разрушение клеточной массы осуществляют 3-кратным замораживанием-размораживанием с последующей ультразвуковой деструкцией (22 кГц по 60 сек). Далее массу центрифугируют при температуре +4-6^oC в течение 30 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость собирают в емкости для последующей фильтрации с помощью капиллярных полисульфоновых фильтров с границей раздела 50000 дальтон. На выходе получают 1 л ультрафильтрата с молекулярной массой 400-50000 дальтон. В качестве наполнителя и стабилизатора перед сублимацией на 1000 мл ультрафильтрата добавляют 166±3,0 мл официнального желатиноля и 1,2±0,1 мл 4%-ного официнального раствора гентамицина. Смесь разливают во флаконы емкостью 10 мл (из нейтрального стекла) по 5 мл. В 5 мл содержится 8-10 мл общего белка (определение по Лоури). Далее проводят сублимационное высушивание ультрафильтрата на аппарате LZ-45 (Чехия). Режим лиофилизации имеет следующие параметры: температура замораживания ультрафильтрата - 35^oC, температура в сублимационной камере - 30^oC, уровень вакуума в сублимационной камере - 0,1 Тор. Время сублимации 48 часов. Высушенный препарат герметично закрывают крышкой и завальцовывают алюминиевым колпачком и маркируют. Препарат представляет пористую массу светло-желтого цвета, хорошо растворимую в воде и в 0,9%-ном растворе хлористого натрия. Влажность препарата 5%, количество белка 8-10 мг. При посеве 2-х флаконов препарат стерилен, нетоксичен, апирогенен, стабилен при хранении при +4-6^oC в течение 2-х лет, pH препарата при растворении в воде составляет 7,0-8,5.Example 1. In the shop of biological products of a meat factory, a sterile sampling of spleens from one-year-old pigs is carried out. The weight of three spleens is 995 g. Each spleen is washed with 1 l of a 0.9% sodium chloride solution with the addition of 30-40 mg of phytohemagglutinin. The spleen is placed in a sterile plastic bag and the transport container (temperature + 4-6 ^o C), delivered to a sterile laboratory box. The preparation is obtained by coarse grinding of spleen tissue with scissors, followed by finer grinding by a homogenizer, 1600 ml of distilled water are added. Subsequent destruction of the cell mass is carried out by 3-fold freezing-thawing, followed by ultrasonic destruction (22 kHz for 60 sec). Next, the mass is centrifuged at a temperature of + 4-6 ^o C for 30 minutes at 3000 rpm The supernatant is collected in a tank for subsequent filtration using capillary polysulfone filters with an interface of 50,000 daltons. The output is 1 l of ultrafiltrate with a molecular weight of 400-50000 daltons. As a filler and stabilizer, before the sublimation per 1000 ml of ultrafiltrate, 166 ± 3.0 ml of official gelatinol and 1.2 ± 0.1 ml of a 4% official gentamicin solution are added. The mixture is poured into 10 ml vials (from neutral glass) of 5 ml. 5 ml contains 8-10 ml of total protein (as determined by Lowry). Next, freeze-drying of the ultrafiltrate is carried out on an apparatus LZ-45 (Czech Republic). The lyophilization mode has the following parameters: the temperature of ultrafiltrate freezing is 35 ^o C, the temperature in the sublimation chamber is 30 ^o C, the vacuum level in the sublimation chamber is 0.1 Torr. Sublimation time 48 hours. The dried preparation is hermetically sealed with a lid and rolled with an aluminum cap and marked. The drug is a porous mass of light yellow color, readily soluble in water and in a 0.9% solution of sodium chloride. The moisture content of the drug is 5%, the amount of protein is 8-10 mg. When sowing 2 vials, the drug is sterile, non-toxic, pyrogen-free, stable when stored at + 4-6 ^o C for 2 years, the pH of the drug when dissolved in water is 7.0-8.5.

Препарат оказывал специфическое иммуностимулирущее действие, выявленное по усилению пролиферативной активности лимфоцитов. The drug had a specific immunostimulating effect, identified by increasing the proliferative activity of lymphocytes.

Специфические и неспецифические примеси. Осуществляют контроль на отсутствие пептидов с молекулярной массой более 50000 дальтон. Для этого содержимое одного флакона растворяют в 5 мл 10%-ного раствора муравьиной кислоты в воде и 0,4 мл раствора вводят в стеклянную хроматографическую колонку 1х60, заполненную сефадексом G-50 (Fine Pharmacia, Швеция). Образец хроматографируют при скорости потока 0,15 мл/мин. Регистрацию производят по УФ-поглощению при длине волны 280 нм. Предварительно определяют на хроматографе область выхода свободного объема колонки. Для этого колонку калибруют, нанося на нее смесь 0,2 мл 0,05%-ного раствора голубого декстрана и 0,2 мл 0,01%-ного раствора цианкобаламина в 10%-ной муравьиной кислоте. Область выхода на хроматограмме голубого декстрана соответствует свободному объему колонки. Specific and non-specific impurities. Examine for the absence of peptides with a molecular weight of more than 50,000 daltons. For this, the contents of one bottle are dissolved in 5 ml of a 10% solution of formic acid in water and 0.4 ml of the solution is introduced into a 1x60 glass chromatographic column filled with Sephadex G-50 (Fine Pharmacia, Sweden). The sample is chromatographed at a flow rate of 0.15 ml / min. Registration is performed by UV absorption at a wavelength of 280 nm. Preliminarily determine on the chromatograph the output region of the free volume of the column. To do this, the column is calibrated by applying a mixture of 0.2 ml of a 0.05% solution of blue dextran and 0.2 ml of a 0.01% solution of cyancobalamin in 10% formic acid. The output region in the chromatogram of blue dextran corresponds to the free volume of the column.

На хроматограмме образца препарата не должно быть пиков УФ-поглощающего материала в области выхода свободного объема. On the chromatogram of a sample of the preparation there should not be peaks of UV absorbing material in the area of free volume exit.

Пример 2. Аналогичным способом выделяют биологически активную фракцию пептидов из ткани селезенки крупного рогатого скота, за исключением того, что отмывание ткани осуществляют с добавлением конкавалина А, а неразрушенные и полуразрушенные клетки удаляются фильтрацией через грубые матерчатые фильтры. И на 1 кг селезенки получают 1 л ультрафильтрата. Example 2. In a similar way, a biologically active fraction of peptides is isolated from cattle spleen tissue, except that tissue washing is carried out with the addition of concavalin A, and non-destroyed and dilapidated cells are removed by filtration through coarse cloth filters. And per 1 kg of spleen get 1 liter of ultrafiltrate.

Определение пролиферативной активности лимфоцитов. Получение лимфоцитарной суспензии: кровь, взятую из локтевой вены, переносят в стерильные пробирки с 2,7%-ным р-ром Na-ЭДТА (pH 7,4) из расчета 1 мл на 10 мл крови. Тщательно перемешивают с антикоагулянтом для предотвращения свертывания. Determination of proliferative activity of lymphocytes. Obtaining a lymphocytic suspension: blood taken from the cubital vein is transferred into sterile tubes with 2.7% Na-EDTA solution (pH 7.4) at the rate of 1 ml per 10 ml of blood. Mix thoroughly with an anticoagulant to prevent clotting.

- Полученную кровь разводят HEPES-буфером (без ионов Ca и Mg) в соотношении 1:3. - The resulting blood is diluted with HEPES-buffer (without Ca and Mg ions) in a ratio of 1: 3.

- В центрифужную пробирку наливают 3 мл р-ра фикол-верографина (плотность - 1,077 г/см). С помощью пастеровской пипетки 8 мл разведенной крови осторожно наслаивают по стенке пробирки на раствор фикол-верографина, закрывают стерильной резиновой пробкой и центрифугируют в горизонтальном роторе при 400 G в течение 30 минут. - In a centrifuge tube, 3 ml of ficol-verographin solution is poured (density - 1.077 g / cm). Using a Pasteur pipette, 8 ml of diluted blood is carefully layered over the wall of the tube onto a solution of ficol-verographin, closed with a sterile rubber stopper and centrifuged in a horizontal rotor at 400 G for 30 minutes.

- После центрифугирования из белесоватого кольца, образовавшегося на границе смеси фикол-верографина и разведенной крови, пастеровской пипеткой отбирают взвесь мононуклеарных клеток (лимфоциты и моноциты) и подсчитывают их число (P) по формуле:

где K - количество разделяемой крови, M - количество лейкоцитов в 1 мл крови, F - доля лимфоцитов, V - объем взвеси лимфоцитов после разделения крови в мл, N - концентрация лимфоцитов в 1 мл взвеси.- After centrifugation from a whitish ring formed at the border of a mixture of ficol-verographin and diluted blood, a suspension of mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) is taken with a Pasteur pipette and their number (P) is calculated by the formula:

where K is the amount of shared blood, M is the number of leukocytes in 1 ml of blood, F is the proportion of lymphocytes, V is the volume of suspension of lymphocytes after separation of blood in ml, N is the concentration of lymphocytes in 1 ml of suspension.

Выход лимфоцитов, составляющий не менее 70 - 90%, считается удовлетворительным. - Концентрацию выделенных лимфоцитов в стерильных условиях доводят до 5•10 в 6 степени клеток/мл среды RPMJ 1640, содержащей 10% (человеческой) сыворотки IV(AB) группы или телячьей; 12 мМ HEPES, 300 мкг/мл глутамина, по 100 мкг/мл каждого антибиотика и препарат Спленопид в концентрациях от 0,00012 до 0,12 мг белка/мл и закрывают стерильными пробками. The output of lymphocytes, comprising at least 70 - 90%, is considered satisfactory. - The concentration of isolated lymphocytes under sterile conditions is adjusted to 5 • 10 to 6 degree cells / ml of RPMJ 1640 medium containing 10% (human) serum IV (AB) group or calf; 12 mM HEPES, 300 μg / ml glutamine, 100 μg / ml each antibiotic and Splenopid in concentrations from 0.00012 to 0.12 mg protein / ml and closed with sterile plugs.

- Автоматическими пипетками клеточную суспензию разливают по 20 мкл в лунки 96-луночного планшета для иммунологических реакций. В лунки контрольных культур для оценки спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов добавляют по 20 мкл среды RPMI 1640, в лунки контрольных культур для оценки индуцированной митогенами пролиферативной активности лимфоцитов помимо 20 мкл среды RPMI 1640 вносят 20 мкл раствора митогена (фитогемагглютинина). В опытные лунки к 20 мкл среды RPVJ 1640 добавляют по 20 мкл разных концентраций препарата. Каждый вариант культуры занимает по 3 лунки. - With automatic pipettes, the cell suspension is dispensed in 20 μl into the wells of a 96-well plate for immunological reactions. 20 μl of RPMI 1640 medium is added to the wells of control cultures to assess the spontaneous proliferative activity of lymphocytes; 20 μl of mitogen (phytohemagglutinin) solution is added to 20 μl of RPMI 1640 medium in addition to 20 μl of control cultures to evaluate mitogen-induced proliferative activity of lymphocytes. In experimental wells, 20 μl of different concentrations of the preparation are added to 20 μl of RPVJ 1640 medium. Each culture option occupies 3 holes.

- Культуры на 72 часа помещают в термостат при 37^oC во влажную атмосферу, содержащую 5% CO. За 4 часа до конца культивирования в каждую лунку вносят 20 мкл р-ра H-тимидина с уд. активностью 10 мкKu/мл без стерильности.- The culture for 72 hours is placed in a thermostat at 37 ^o C in a humid atmosphere containing 5% CO. 4 hours before the end of cultivation, 20 μl of H-thymidine solution with beats was added to each well. activity of 10 µKu / ml without sterility.

- После окончания культивирования каждую среду автоматической пипеткой (лучше с помощью автоматического сборника клеток Harvester) тщательно ресуспендируют и переносят на стекловолоконные фильтры, высушивают и каждый участок фильтра с пробой из отдельной лунки переносят во флакон с 2 мл сцинтилляционной жидкости (1 кг толуола, 4 PPO и 061 г - POPOP). - After cultivation, each medium is automatically resuspended using an automatic pipette (preferably using an automatic Harvester cell collector) and transferred to fiberglass filters, dried, and each section of the sample filter from a separate well is transferred to a vial with 2 ml of scintillation fluid (1 kg of toluene, 4 PPO and 061 g - POPOP).

- Подсчет включения H-тимидина производят на сцинтилляционном счетчике (импульсы за минуту), вычисляется средняя величина включения в 3 контрольных - без митогена (спонтанная пролиферация - СП) и в 3-х с митогеном (индуцированная пролиферация - ИП), а также пролиферация при воздействии разных концентраций препарата культур лимфоцитов; Пролиферативная активность выражается "индексом стимуляции" - ИС, вычисляемом по формуле:

В норме ИС - 50-60%.- The inclusion of H-thymidine is counted on a scintillation counter (pulses per minute), the average value of the inclusion in 3 controls is calculated - without mitogen (spontaneous proliferation - SP) and 3 with mitogen (induced proliferation - PI), as well as proliferation with exposure to different concentrations of the drug cultures of lymphocytes; Proliferative activity is expressed by the "stimulation index" - IP, calculated by the formula:

The norm of IP is 50-60%.

В низких дозах препарат должен стимулировать пролиферативную активность лимфоцитов, в высоких дозах - угнетать ее. In low doses, the drug should stimulate the proliferative activity of lymphocytes, in high doses - inhibit it.

Пример 3. Влияния препарата Спленопид на течение аутоиммунного процесса. Example 3. The effect of the drug Splenopid on the course of the autoimmune process.

Влияние препарата Спленопид изучают на инбредных мышах-самках NZB 10-месячного возраста с активной экспериментальной красной волчанкой, сопровождающейся тяжелым люпус-нефритом. Опытным мышам вводят внутривенно препарат в дозе 0,2 мг на животное. Препарат вводят 2 раза в неделю в течение 2-х месяцев, начиная с 10-месячного возраста (всего 16 инъекций). Контрольным животным вводят физиологичекий раствор в том же объеме. Кровь для исследования анти-ДНК-антител и ЦИК берут из ретробульбарного сплетения до начала введения препарата, в возрасте 11 месяцев (8 инъекций) и в 13 месяцев (через 1 месяц после завершения курса введения препарата). Содержание антител к нативной ДНК определяют с помощью радиоизотопной техники и стандартных наборов Kit фирмы "Amersham" (Великобритания). ЦИК выявляют методом 3%-ной ПЭГ-преципитации на лазерном нефелометре фирмы "Haechat-Bechring" (Германия) и распечатывают на компьютере "Hewlett-Packard-85" (США). Отложения иммунных комплексов в почках исследуют в гистологических срезах флюоресцирующей сыворотки против иммуноглобулинов мышей, меченной изотиоцианатом флоюресцеина (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН). Площадь, занимаемую отложениями иммунных комплексов (ИК) в сосудистом клубочке почки оценивают по 5-балльной системе. Проводят контроль выживаемости мышей и определяют содержание белка в суточных порциях мочи по Лоури. Достоверность результатов оценивают по критерию t-Стьюдента. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1. The effect of Splenopid is studied on 10-month-old NZB inbred female mice with active experimental lupus erythematosus accompanied by severe lupus nephritis. Experimental mice are injected intravenously with a dose of 0.2 mg per animal. The drug is administered 2 times a week for 2 months, starting at 10 months of age (a total of 16 injections). Control animals were injected with physiological saline in the same volume. Blood for the study of anti-DNA antibodies and CEC is taken from the retrobulbar plexus before the administration of the drug, at the age of 11 months (8 injections) and at 13 months (1 month after completion of the drug administration). The content of antibodies to native DNA is determined using the radioisotope technique and standard Kit kits from Amersham (UK). CECs are detected by 3% PEG precipitation using a Haechat-Bechring laser nephelometer (Germany) and printed on a Hewlett-Packard-85 computer (USA). Deposits of immune complexes in the kidneys are examined in histological sections of fluorescent serum against mouse immunoglobulins labeled with fluorescein isothiocyanate (N.F. Gamalei Research Institute of Epidemiology and Microbiology RAMS). The area occupied by deposits of immune complexes (IR) in the vascular glomerulus of the kidney is estimated by a 5-point system. Control the survival of mice and determine the protein content in daily portions of urine according to Lowry. The reliability of the results is evaluated by the t-student criterion. The results of the studies are presented in table 1.

Из этой таблицы видно, что под влиянием препарата происходит достоверное снижение анти-ДНК антител и ЦИК в сыворотке крови, снижалось содержание иммунных комплексов в клубочках почек, а также концентрация белка в суточных порциях мочи. Установлено также, что средняя продолжительность жизни мышей и количество выживших животных к 13-месячному возрасту было более чем в 3 раза выше в опытной группе. From this table it can be seen that under the influence of the drug there is a significant decrease in anti-DNA antibodies and CEC in the blood serum, the content of immune complexes in the glomeruli of the kidneys, as well as the concentration of protein in daily portions of urine, decreased. It was also established that the average life expectancy of mice and the number of surviving animals by 13 months of age were more than 3 times higher in the experimental group.

Таким образом, введение препарата Спленопид мышам NZB с ярко выраженным волчаночным процессом способно снизить активность аутоиммунного процесса. Thus, the introduction of the drug Splenopid to NZB mice with a pronounced lupus process can reduce the activity of the autoimmune process.

Пример 4. Влияние препарата на течение экспериментального сепсиса. Воздействие на септический процесс препарата из ткани селезенки изучают в экспериментах на белых беспородных мышах. Экспериментальный сепсис вызывают внутривенным введением животным однодневной живой культуры Staph. aureus штамм "Wood-46" в дозе 0,2 мл с концентрацией 1 млрд. клеток в 1 мл. Сепсис развивался на 3 сутки с ЛД-50. После заражения животных разделяли на 2 группы (по 30 животных в каждой). В I группе на 3, 4, 5 сутки после заражения внутривенно вводят по 0,2 мл физиологического раствора. Во II группе в те же сроки вводили по 0,2 мл препарата Спленопид. Example 4. The effect of the drug on the course of experimental sepsis. The effect on the septic process of the drug from spleen tissue is studied in experiments on outbred white mice. Experimental sepsis is caused by the intravenous administration of Staph live culture to animals. aureus strain "Wood-46" at a dose of 0.2 ml with a concentration of 1 billion cells in 1 ml Sepsis developed on day 3 with LD-50. After infection, the animals were divided into 2 groups (30 animals each). In group I, on 3, 4, 5 days after infection, 0.2 ml of physiological saline is administered intravenously. In group II, 0.2 ml of Splenopid was administered at the same time.

Результаты исследования показали, что введение препарата в указанной дозе приводило к выживанию 71% зараженных мышей, в то время как в контроле выживаемость мышей составила 38%. The results of the study showed that administration of the drug at the indicated dose resulted in the survival of 71% of the infected mice, while in the control the survival rate of the mice was 38%.

Для изучения механизмов повышения резистентности мышей к септическому процессу было изучено изменение физиологических характеристик лейкоцитов (фагоцитоз, люминол-зависимая хемилюминесценция, NST-тест) под влиянием препарата селезенки. Установлено, что под влиянием препарата увеличиваются абсолютный фагоцитарный показатель лейкоцитов приблизительно на 100% (опыт - 90692±5231; контроль - 45920±2145, p<0,05); захват микробов лейкоцитами (число Райта) на 92% (контроль 8,5±0,05, опыт - 16,3±1,2, p<0,05) и процент переваривания микробов на 55%. To study the mechanisms of increasing the resistance of mice to the septic process, we studied the physiological characteristics of leukocytes (phagocytosis, luminol-dependent chemiluminescence, NST test) under the influence of the spleen preparation. It was found that under the influence of the drug, the absolute phagocytic leukocyte count increases by approximately 100% (experiment - 90692 ± 5231; control - 45920 ± 2145, p <0.05); leukocyte capture of microbes (Wright number) by 92% (control 8.5 ± 0.05, experience 16.3 ± 1.2, p <0.05) and the percentage of microbial digestion by 55%.

Под влиянием препарата селезенки хемилюминесценция лейкоцитов in vitro увеличивалась в 2,5 раза (опыт 3722253+856712; контроль 1507456+242052, а NST-реакция лейкоцитов в 2 раза (опыт 386+11,2; контроль 194+9,5). Таким образом введение препарата повышает противоинфекционную защиту у животных с экспериментальным сепсисом. Under the influence of the spleen preparation, the in vitro chemiluminescence of leukocytes increased 2.5 times (experiment 3722253 + 856712; control 1507456 + 242052, and the NST reaction of leukocytes 2 times (experiment 386 + 11.2; control 194 + 9.5). Thus, the introduction of the drug increases anti-infection protection in animals with experimental sepsis.

Пример 5. Влияние препарата Спленопид на экспериментальную миэлодепрессию. Example 5. The effect of the drug Splenopid on experimental myelodepression.

Исследование проведено на 2-х группах белых беспородных крысах-самцах с циклофосфановой миэлодепрессией:
1 группа - контроль с введением циклофосфана;
2 группа - опыт с введением циклофосфана и препарата Спленопид. Миэлодепрессию вызывают внутрибрюшинным введением циклофосфана в дозе 50 мг/кг веса один раз в день в течение 2 суток. Количество лейкоцитов падало более чем в 5 раз, лимфоцитов примерно в 6 раз, нейтрофилов на 1/3 от исходного уровня (таблица 2). Препарат селезенки вводят внутрибрюшинно в дозе 1,6 мг белка/кг один раз в сутки в течение 3 дней. Кровь для исследования берут из хвостовой вены. Число лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов определяют стандартными методами. У опытных крыс после введения препарата (таблица 2) происходило увеличение лейкоцитов с 1,8+0,6 в контроле до 4,4+0,4 на 10/л. Палочкоядерных лейкоцитов с 0,86+0,03 в контроле до 1,29+0,04 на 10/л, лимфоцитов с 1,2+0,04 в контроле до 3,1+0,03 на 10/л и моноцитов с 0,03+0,001 в контроле до 0,11+0,001 на 10/л. К 5-ым суткам благоприятное влияние препарата на изучаемые показатели было еще более выраженным; к 14 суткам - в опытной группе не отличались от исхода, в то время как в контрольной группе они были все еще ниже нормы (таблица 2).The study was conducted on 2 groups of white outbred male rats with cyclophosphamide myelodepression:
Group 1 - control with the introduction of cyclophosphamide;
Group 2 - experience with the introduction of cyclophosphamide and the drug Splenopid. Myelodepression is caused by intraperitoneal administration of cyclophosphamide at a dose of 50 mg / kg of weight once a day for 2 days. The number of leukocytes fell by more than 5 times, lymphocytes by about 6 times, neutrophils by 1/3 of the initial level (table 2). The spleen preparation is administered intraperitoneally at a dose of 1.6 mg protein / kg once a day for 3 days. Blood for examination is taken from the tail vein. The number of white blood cells, red blood cells and platelets is determined by standard methods. In experimental rats after administration of the drug (table 2), there was an increase in leukocytes from 1.8 + 0.6 in the control to 4.4 + 0.4 per 10 / L. Leukocyte leukocytes from 0.86 + 0.03 in the control to 1.29 + 0.04 per 10 / L, lymphocytes from 1.2 + 0.04 in the control to 3.1 + 0.03 per 10 / L and monocytes from 0.03 + 0.001 in the control to 0.11 + 0.001 per 10 / l. By the 5th day, the beneficial effect of the drug on the studied parameters was even more pronounced; by 14 days - in the experimental group did not differ from the outcome, while in the control group they were still below normal (table 2).

Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что препарат Спленопид обладает выраженным иммунокоррегирующим действием при различных патологиях, связанных с нарушением функций иммунной системы. Установлено, что препарат Спленопид, полученный по разработанной нами технологии, стимулирует метаболическую и функциональную активность лейкоцитов периферической крови, способствует выведению аутоиммунных комплексов из организма, при системной красной волчанке что, очевидно, связано с повышением активности фагоцитирующих клеток. Вероятно, эти механизмы играют важную роль и в реализации лечебного действия препарата при экспериментально вызванных патологических состояниях - сепсисе, системной красной волчанке и фармакологической миелодепрессии. Thus, the conducted experiments indicate that the preparation Splenopid has a pronounced immunocorrection effect in various pathologies associated with impaired functions of the immune system. It was established that the Splenopid preparation, obtained by the technology developed by us, stimulates the metabolic and functional activity of peripheral blood leukocytes, promotes the elimination of autoimmune complexes from the body, with systemic lupus erythematosus, which is obviously associated with an increase in the activity of phagocytic cells. Probably, these mechanisms play an important role in the implementation of the therapeutic effect of the drug in experimentally induced pathological conditions - sepsis, systemic lupus erythematosus and pharmacological myelodepression.

Примеры клинического применения. Examples of clinical use.

Пример N 1. Больной П., 27 лет. Переведен в хирургическое отделение ГКБ N 67 21.04.89 г. Диагноз: Перитониальный сепсис, катаболическая фаза септикопиемии. Болен с 20.03.89 г. 5.04.89 г. была произведена операция по поводу острого аппендицита. Через 11 дней развился гнойный перитонит. Больной вял, адинамичен, кожные покровы бледные, цианоз губ, акроцианоз тахипноэ до 34 в минуту. Сердечные тоны глухие, тахикардия до 120 в мин, АД 115/80 мм рт.ст., на ЭКГ признаки гипоксии миокарда, печень на 2,5 см выступает из-под реберной дуги, край печени болезненный. Брюшная стенка напряжена, симптом Щеткина-Блюберга положительный. В моче белок 0,99 г/л, лейкоцитов 2-3 в поле зрения. В крови лейкоцитоз 14,5•10⁹/л с нейтрофильным сдвигом влево, п/я нейтрофилы - 25%, с/я - 55%, эозинофилы - 1%, лимфоциты - 12%, моноциты - 7%. Гематокрит - 33%, СОЭ - 3 мм/ч, ЛИИ - 7,1%. Реакция HCT лейкоцитов - 115 ед. плотности. Фагоцитоз: ФИ - 65, фагоцитарное число - 3,7. Процент переваривания - 31. Температура колебалась от 37,5^oC (утром) до 39,5^oC (вечером). Больной ранее подвергался интенсивному лечению: массивная доза антибиотиков; переливание крови и плазмы; детоксикационная терапия. Несмотря на лечение, септикопиемия прогрессировала. В связи с этим на фоне интенсивной терапии было проведено лечение препаратом Спленопид. Препарат вводили внутримышечно в дозе 20 мл, 1 раз в день, в течение 4 дней. На фоне общего тяжелого состояния положительная динамика появилась на 2-й день после первого введения Спленопида. Больной активнее вступал в контакт, улучшилось общее состояние, появился аппетит, слизистые покровы стали более розовыми, уменьшился цианоз губ, температура тела снизилась до величин: 36,5^oC (утром) до 37,5^oC (вечером). Частота пульса 75 в мин., АД - 120/70 мм рт. ст., тоны сердца ясные. Симптом Блюмберга стал отрицательным. Печень несколько уменьшилась до 1,5 см. Количество белка в моче снизилось - 0,33 г/л. Количество лейкоцитов - 11,4•10⁹/л, п/я - 15%, с/я - 55%, эозинофилы - 1%, лимфоциты - 20%, моноциты - 9%, ЛИИ - 4,2%, СОЭ - 25 мм/ч, Hct - 45%, HCT - 159. Фагоцитарный индекс - 72, фагоцитарное число - 6,4, процент переваривания - 46.Example No. 1. Patient P., 27 years old. Transferred to the surgical department of Clinical Hospital N 67 04/21/89. Diagnosis: Peritonial sepsis, catabolic phase of septicopyemia. Sick from 03/20/89, 04/05/89, an operation was performed for acute appendicitis. After 11 days, purulent peritonitis developed. The patient is lethargic, adynamic, pale skin, cyanosis of the lips, acrocyanosis of tachypnea up to 34 per minute. Cardiac tones are deaf, tachycardia up to 120 rpm, blood pressure 115/80 mm Hg, ECG signs of myocardial hypoxia, 2.5 cm liver protrudes from under the costal arch, the edge of the liver is painful. The abdominal wall is tense, the symptom of Shchetkin-Blueberg is positive. In urine, protein is 0.99 g / l, white blood cells 2-3 in the field of view. In the blood, leukocytosis is 14.5 • 10 ⁹ / L with a neutrophilic shift to the left, n / a neutrophils - 25%, s / I - 55%, eosinophils - 1%, lymphocytes - 12%, monocytes - 7%. Hematocrit - 33%, ESR - 3 mm / h, LII - 7.1%. The reaction of HCT leukocytes - 115 units. density. Phagocytosis: PHI - 65, phagocytic number - 3.7. The percentage of digestion is 31. The temperature ranged from 37.5 ^o C (in the morning) to 39.5 ^o C (in the evening). The patient has previously undergone intensive treatment: a massive dose of antibiotics; blood and plasma transfusions; detoxification therapy. Despite treatment, septicopyemia progressed. In this regard, against the background of intensive therapy, treatment with Splenopid was carried out. The drug was administered intramuscularly at a dose of 20 ml, 1 time per day, for 4 days. Against the background of a general serious condition, positive dynamics appeared on the 2nd day after the first injection of Splenopid. The patient came into contact more actively, general condition improved, appetite appeared, mucous membranes became more pink, lip cyanosis decreased, body temperature decreased to values: 36.5 ^o C (in the morning) to 37.5 ^o C (in the evening). The heart rate is 75 min., HELL - 120/70 mm RT. Art., heart sounds are clear. Blumberg's symptom became negative. The liver decreased slightly to 1.5 cm. The amount of protein in the urine decreased - 0.33 g / l. The number of leukocytes - 11.4 • 10 ⁹ / l, s / I - 15%, s / I - 55%, eosinophils - 1%, lymphocytes - 20%, monocytes - 9%, LII - 4.2%, ESR - 25 mm / h, Hct - 45%, HCT - 159. Phagocytic index - 72, phagocytic number - 6.4, digestion percentage - 46.

Через 3 дня после окончания курса лечения препаратом состояние больного улучшилось. Биохимические и иммунологические показатели нормализовались. Выздоровление наступило через 3 недели. 3 days after the end of the course of treatment with the drug, the patient's condition improved. Biochemical and immunological parameters returned to normal. Recovery occurred after 3 weeks.

Пример N 2. Больная К. , 32 лет. Поступила в институт пульмонологии 5.10.89 г. Диагноз: инфекционно-аллергическая бронхиальная астма, тяжелая форма. Приступы удушья бывают по 10-20 раз в сутки. Болезнь протекает с очень короткими периодами ремиссии (не более месяца). Лечили с помощью бронхолитиков (биротек при приступе удушья) и стероидные гормоны от 2 до 5 мг в сутки. После проведения терапии препарата БАВ отмечено: сначала значительное уменьшение тяжести и частоты приступов удушья, а затем и полное их исчезновение. Количество принимаемых бронхолитиков значительно уменьшилось: больная профилактически использовала 1-2 дозы в день. Прием стероидных гормонов постепенно прекратили совсем. Содержание ЦИК в плазме крови достоверно снизилось в 1,8 раза после первой инъекции препарата Спленопид и оставалось на этом уровне до выписки больной. Концентрация IgE уменьшилась к 10 дню после применения препарата в 2,2 раза по сравнению с исходной величиной. Фагоцитоз увеличился в 2 раза. Исследования до лечения больной БАВ T-клеточного иммунитета с использованием моноклональных антител показало снижение суммарного количества T-лимфоцитов и дисбаланс субпопуляций T-лимфоцитов. После лечения БАВС (3 внутримышечных введения через день по 10 мл) наблюдалось повышение общего числа T-лимфоцитов (с 46,4% до 70,1%), T-хелперов с 36,2% до 43,6%), T-супрессоров (с 16,3% до 20,3%). Example No. 2. Patient K., 32 years old. I entered the Institute of Pulmonology on 5.10.89. Diagnosis: infectious-allergic bronchial asthma, severe. Attacks of suffocation are 10-20 times a day. The disease proceeds with very short periods of remission (no more than a month). Steroid hormones from 2 to 5 mg per day were also treated with bronchodilators (biroteks with an asthma attack). After conducting therapy with the biologically active substance, it was noted: first, a significant decrease in the severity and frequency of asthma attacks, and then their complete disappearance. The number of taken bronchodilators significantly decreased: the patient prophylactically used 1-2 doses per day. The use of steroid hormones gradually stopped completely. The plasma CEC content significantly decreased 1.8 times after the first injection of Splenopid and remained at this level until the patient was discharged. The concentration of IgE decreased by 10 times after administration of the drug 2.2 times compared with the initial value. Phagocytosis increased by 2 times. Studies before treatment of a patient with biologically active substances of T-cell immunity using monoclonal antibodies showed a decrease in the total number of T-lymphocytes and an imbalance of subpopulations of T-lymphocytes. After treatment with BASS (3 intramuscular injections every other day in 10 ml), an increase in the total number of T-lymphocytes (from 46.4% to 70.1%), T-helpers from 36.2% to 43.6%) was observed, T- suppressors (from 16.3% to 20.3%).

В течение 1,5 лет после лечения препаратом приступов удушья у больной не наблюдалось. Предвестники наступающего приступа легко купировались 1 дозой биротека. Within 1.5 years after treatment with the drug, asthma attacks were not observed in the patient. The harbingers of the upcoming attack were easily stopped with a 1-dose library.

Пример N 3. Больная С., 38 лет. Поступила в клинику института Ревматологии 6.12.89 г. Диагноз: Ревматоидный артрит (РА), активность III. Жалобы на боли в суставах - коленных, правом тазобедренном, голеностопном, в мелких суставах кистей. Выраженная утренняя скованность суставов. Снижение силы сжатия в кистях. Припухлость суставов. Лечение - кортикостероидная терапия, эффективность от лечения гемособции была не удовлетворительная, в связи с чем был проведен курс лечения путем внутримышечного введения 1 раз в сут и в течение 10-х дней по 15 мл препарата Спленопид. Example No. 3. Patient S., 38 years old. Was admitted to the clinic of the Institute of Rheumatology 6.12.89, the Diagnosis: Rheumatoid arthritis (RA), activity III. Complaints of pain in the joints - knee joints, right hip, ankle joints, in small joints of the hands. Pronounced morning stiffness of the joints. Reduced compression force in the hands. Swelling of the joints. Treatment - corticosteroid therapy, the effectiveness of the treatment of hemostasis was not satisfactory, and therefore a course of treatment was carried out by intramuscular injection once a day and for 10 days, 15 ml of Splenopid.

После введения препарата наблюдалась существенная положительная динамика (табл. 3). Самым ранним положительным симптомом явилось значительное уменьшение болей в суставах, что отмечалось уже на 2-й день после введения БАВ. Через неделю после второй процедуры утренняя скованность снизилась на 37%, остальные показатели суставного синдрома изменились недостоверно. Существенная положительная динамика суставного синдрома с достоверными изменениями показателей произошла к концу первого месяца после применения препарата - уменьшились длительность утренней скованности, число воспаленных и болезненных суставов, отмечалось значительное снижение болей в суставах и суставного индекса Ричи. Сила сжатия кистей и окружность проксимальных межфаланговых суставов не изменилась. В течение года наблюдения прогрессирования суставного синдрома не наблюдалось. After administration of the drug, a significant positive dynamics was observed (Table 3). The earliest positive symptom was a significant reduction in joint pain, which was noted already on the 2nd day after the introduction of biologically active substances. A week after the second procedure, morning stiffness decreased by 37%, other indicators of the articular syndrome changed unreliably. Significant positive dynamics of the articular syndrome with significant changes in indicators occurred by the end of the first month after the use of the drug - the duration of morning stiffness, the number of inflamed and painful joints decreased, a significant decrease in joint pain and Richie's joint index was noted. The compression force of the hands and the circumference of the proximal interphalangeal joints has not changed. During the year of observation, the progression of articular syndrome was not observed.

Представляет интерес влияние препарата на внесуставные проявления заболевания. Через месяц после проведения лечения БАВ у 3 больных исчезли ревматоидные узелки, у 2 уменьшились проявления нейропатии и у 3 - дигитального артрита. Клиническая эффективность БАВ подтверждалась снижением воспалительной активности по результатам лабораторных показателей (табл. 4). Of interest is the effect of the drug on extra-articular manifestations of the disease. One month after the treatment of biologically active substances, rheumatoid nodules disappeared in 3 patients, manifestations of neuropathy decreased in 2, and digital arthritis in 3. The clinical effectiveness of biologically active substances was confirmed by a decrease in inflammatory activity according to the results of laboratory parameters (table. 4).

Наблюдалось достоверное снижение СОЭ, фибриногена, альфа-2 и гамма-глобулинов. Достигнуто существенное снижение ревматоидного фактора, уменьшалась концентрация циркулирующих иммунных комплексов. Активность заболевания снизилась до I-II степени. При исследовании показателей фагоцитоза (табл. 5) наблюдалось резкое возрастание HCT-теста, процента фагоцитоза и фагоцитарного числа сразу после введения, свидетельствующее о стимулирующем влиянии препарата на фагоцитарную активность полиморфно-ядерных лейкоцитов у больных РА. Исследования T-клеточного иммунитета показали снижение в исходе по сравнению с контрольной группой общего числа T-лимфоцитов (CD1+) преимущественно за счет субпопуляции супрессоров/киллеров (CD8+). Иммунорегуляторный индекс был резко повышен за счет снижения субпопуляции CD8+ при неизмененном количестве CD4+. После введения препарата происходило возрастание содержания супрессоров/киллеров, иммунорегуляторный индекс приблизился к нормальным величинам. Следовательно, влияние Спленопида на T-лимфоциты при их сниженном количестве можно определить как иммуностимулирующее. A significant decrease in ESR, fibrinogen, alpha-2 and gamma globulins was observed. A significant decrease in rheumatoid factor was achieved, the concentration of circulating immune complexes decreased. The activity of the disease decreased to I-II degree. In the study of phagocytosis indicators (Table 5), a sharp increase in the HCT test, the percentage of phagocytosis and phagocytic number immediately after administration was observed, indicating a stimulating effect of the drug on the phagocytic activity of polymorphic nuclear leukocytes in patients with RA. Studies of T-cell immunity showed a decrease in outcome compared with the control group of the total number of T-lymphocytes (CD1 +) mainly due to a subpopulation of suppressors / killers (CD8 +). The immunoregulatory index was sharply increased due to a decrease in the subpopulation of CD8 + with an unchanged amount of CD4 +. After the administration of the drug, the content of suppressors / killers increased, the immunoregulatory index approached normal values. Therefore, the effect of Splenopid on T-lymphocytes with their reduced number can be defined as immunostimulating.

Таким образом, экспериментальные и клинические исследования показали высокую эффективность препарата Спленопид и широкий спектр его иммуностимулирующей активности, направленной на различные звенья гуморального и клеточного иммунитета и приводящего к успешному лечению патологий с их нарушениями. Стабильность препарата Спленопид при длительном хранении, а также высокая степень очистки, обусловившая отсутствие побочных реакций при его применении, простота способа изготовления, его экономичность и доступность сырья создает перспективы для широкого внедрения препарата в клиническую практику. Thus, experimental and clinical studies have shown the high effectiveness of the drug Splenopid and a wide range of its immunostimulating activity, aimed at various links of humoral and cellular immunity and leading to the successful treatment of pathologies with their disorders. The stability of the drug Splenopid during long-term storage, as well as a high degree of purification, which caused the absence of adverse reactions during its use, the simplicity of the manufacturing method, its economy and availability of raw materials create prospects for the widespread introduction of the drug in clinical practice.

Литература
1. Николаев С. Д. и др. Теоретические и экспериментальные предпосылки использования перфузатов ксеноселезенки в клинической практике. Экспериментальные и клинические аспекты ксеноспленотерапии, Ижевск: Экспертиза, 1977, с.17-23.Literature
1. Nikolaev S. D. et al. Theoretical and experimental prerequisites for the use of xenospleen perfusates in clinical practice. Experimental and clinical aspects of xenosplenotherapy, Izhevsk: Expertise, 1977, p.17-23.

2. SU 1152801, 1985. 2. SU 1152801, 1985.

3. RU 2033796, 30.04.95. 3. RU 2033796, 04.30.95.

4. Цыпин А.Б., Онищенко Н.А,, Мануйлов Б.М. и др. Разработка, получение и некоторые свойства нового иммуномодулятора пептидной природы на ткани селезенки. Ж. Иммунология, 1995, N 7, с.33-36. 4. Tsypin A.B., Onishchenko N.A., Manuylov B.M. et al. Development, preparation and some properties of a new immunomodulator of peptide nature on spleen tissue. J. Immunology, 1995, N 7, p. 33-36.

5. ERO 21997, 29.04.87. 5. ERO 21997, 04.29.87.

6. WO 445581, 11.09.91. 6. WO 445581, 09/11/91.

7. Методические рекомендации. Применение перфузата ксеноселезенки в лечении больных с обширным гнойно-деструктивными заболеваниями легких и плевры с осложненным течением, Новосибирск, 1992. 7. Methodical recommendations. The use of xenospleen perfusate in the treatment of patients with extensive purulent-destructive diseases of the lungs and pleura with a complicated course, Novosibirsk, 1992.

8. Цыпин А. Б. , Ведерникова Л.А. Спленоперфузия в комплексном лечении тяжелых форм системной красной волчанки, ревматоидного артрита и бронхиальной астмы. В об.: Проблемы трансплантологии и искусственных органов, М., 1994, с.131-140. 8. Tsypin A. B., Vedernikova L. A. Splenoperfusion in the complex treatment of severe forms of systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis and bronchial asthma. In about: Problems of transplantology and artificial organs, M., 1994, S. 131-140.

Claims (7)

1. Пептиды из клеток селезенки млекопитающих, обладающие иммуностимулирующей активностью, полученные экстракцией клеток после их митогенной стимуляции и отделения экстракта, отличающиеся тем, что они представляют собой пептиды с мол. м. 400 - 50000 дальтон, полученные стимуляцией клеток митогеном в процессе отмывки ткани селезенки, разрушением клеток, диспергированной в воде, предварительно гомогенизированной ткани и ультрафильтрацией отделенного экстракта через капиллярные фильтры с размером пор с границей раздела 50000 дальтон. 1. Peptides from mammalian spleen cells with immunostimulating activity obtained by extraction of cells after their mitogenic stimulation and separation of the extract, characterized in that they are peptides with mol. m. 400 - 50,000 daltons obtained by stimulation of cells with mitogen during the washing of spleen tissue, destruction of cells dispersed in water, pre-homogenized tissue and ultrafiltration of the separated extract through capillary filters with a pore size of 50,000 daltons. 2. Способ получения пептидов, обладающих иммуностимулирующей активностью, путем стимуляции клеток селезенки млекопитающих митогеном, их экстракции и отделения экстракта, отличающийся тем, что стимуляцию клеток митогеном проводят в процессе отмывки ткани селезенки, разрушение клеток осуществляют замораживанием-размораживанием ткани, диспергированной в дистиллированной воде после предварительной гомогенизации органа, с последующей ультразвуковой обработкой и ультрафильтрацией отделенного экстракта через капиллярные фильтры с размером пор с границей раздела 50000 дальтон. 2. A method of producing peptides having immunostimulating activity by stimulating mammalian spleen cells with mitogen, extracting and separating the extract, characterized in that mitogen stimulation of the cells is carried out in the process of washing spleen tissue, cell destruction is carried out by freezing-thawing of tissue dispersed in distilled water after preliminary homogenization of the organ, followed by ultrasonic treatment and ultrafiltration of the separated extract through capillary filters with size At a time with an interface of 50,000 daltons. 3. Лекарственный препарат, обладающий иммуностимулирующей активностью, включающий биологически активное вещество и физиологически пригодный наполнитель или носитель, отличающийся тем, что в качестве биологически активного вещества используют пептиды по п.1 в количестве 10 - 15 мг в дозе. 3. A drug having immunostimulating activity, including a biologically active substance and a physiologically acceptable excipient or carrier, characterized in that the peptides according to claim 1 are used as a biologically active substance in an amount of 10-15 mg per dose. 4. Лекарственный препарат по п.3, отличающийся тем, что в качестве наполнителя используют желатиноль и раствор гентамицина. 4. The drug according to claim 3, characterized in that gelatin and a gentamicin solution are used as filler. 5. Лекарственный препарат по п.3 или 4, отличающийся тем, что его лиофилизуют замораживанием ультрафильтрата с наполнителем при -35^oC и высушивают в течение 48 ч при температуре в сублимационной камере -30^oC и в вакууме 0,1 тор.5. The drug according to claim 3 or 4, characterized in that it is lyophilized by freezing the ultrafiltrate with a filler at -35 ^o C and dried for 48 hours at a temperature in the sublimation chamber -30 ^o C and in a vacuum of 0.1 torr. 6. Лекарственный препарат по п. 5, отличающийся тем, что он является стабильным при хранении в течение двух лет. 6. The drug according to claim 5, characterized in that it is stable during storage for two years. 7. Способ лечения гнойно-септических заболеваний путем комплексной терапии, отличающийся тем, что больному дополнительно вводят внутримышечно лекарственный препарат, обладающий иммуностимулирующей активностью по любому из пп.3 - 6 ежедневно, однократно в течение суток в количестве 5 - 20 мг белка в течение 7 - 10 дней. 7. A method of treating purulent-septic diseases by complex therapy, characterized in that the patient is additionally injected intramuscularly with a drug having immunostimulating activity according to any one of claims 3 to 6 daily, once a day for 5 to 20 mg of protein for 7 - 10 days.

Images