RU2152150C1 - Method for obtaining in vitro healthy planting material of gerbera jamesonii bolus - Google Patents

Abstract

FIELD: agriculture and biotechnology, in particular, production of in vitro healthy planting material in tissue culture. SUBSTANCE: method involves sterilizing cuttings; explanting; passivating microcuttings; providing in vitro sprouts rhizogenesis. While preparing cuttings, they are sterilized in staged mode, first for 30 min in 0.5%-benlate solution, with following 15 min sterilization in 10%-chloramine solution. Method further involves four-fold washing in distilled water at 10-12 min time intervals; planting and cultivating explants on medium containing 5 mg/l of kinetin, 0.1 mg/l of indolyacetic acid, 10 mg/l of adenine, 40 g/l of saccharose, 8 g/l of agar; alternating microcuttings passivation and cultivation cycles on medium containing 5 mg/l of kinetin, 40 mg/l of saccharose, 8 g/l of agar, and on medium containing 1 mg/l of biologically active preparation, 40 g/l of saccharose, 8 g/l of agar, and in vitro rhizogenesis at 50% concentration of mineral salts (except for FeNa-ethylenediaminetetraacetate), with addition of 1 mg/l of indolyacetic acid, 25 g/l of saccharose, 7 g/l of agar, with pH value being within the range of 5.6-5.8. EFFECT: simplified micromultiplication pattern, reduced production costs and labor consumption and decreased occupied spaces. 4 tbl

Description

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам получения оздоровленного посадочного материала в культуре ткани, сохранению и воспроизводству генофонда цветочных культур. The invention relates to agriculture, and in particular to methods for producing healthy planting material in tissue culture, preservation and reproduction of the gene pool of flower crops.

Известен способ семенного размножения герберы. Для получения полноценных семян растения следует опылять искусственно. Пыльцу для опыления собирают со зрелых соцветий через 3-4 дня после их распускания, подсушивают и помещают в небольшой стакан. В сухом помещении пыльца хранится 50-70 дней. Цветки опыляют мягкой кисточкой, нанесением на рыльце пестика легким прикосновением. Созревают семена летом через 18-20 дней после опыления, весной и осенью через 30-35 дней; на одном соцветии созревают до 100 семян. Их собирают, подсушивают при +24....35^o и очищают от летучек. В таком состоянии их можно хранить 4-5 месяцев; при необходимости более длительного хранения (до 1 года) семена помещают в эксикатор с безводным хлоридом кальция и хранят при +5^o. В качестве субстрата для посева семян используют смесь торфа и перлита, торфа и песка, среднезернистый песок, дерновую землю и т.д. Ими набивают небольшие ящики и слегка уплотняют. Сеют семена в субстрат по схеме 2х2х3 см. Ящики с семенами переносят в культивационное помещение с температурой +21. ..24^o, влажностью субстрата 70% и прикрывают бумагой или марлей. Первые всходы появляются через 4-6 дней, а массовые - через 10-15 дней. На 30-40 сутки после посева семян проводят пикировку сеянцев в ящики, горшки, стаканчики различных размеров. В качестве субстрата используют те же компоненты, что и при посеве семян. Спустя 6-8 недель после пикировки растения бывают готовы для высадки на постоянное место [1]. Существенным недостатком данного способа размножения является высокая гетерозиготность семенного потомства, низкая продуктивность и декоративность цветов.A known method of seed reproduction of gerbera. To obtain full seeds, plants should be pollinated artificially. Pollen for pollination is collected from mature inflorescences 3-4 days after they bloom, dried and placed in a small glass. In a dry room, pollen is stored for 50-70 days. The flowers are pollinated with a soft brush, applying a pestle on the stigma with a light touch. Seeds ripen in the summer 18-20 days after pollination, in the spring and autumn 30-35 days; up to 100 seeds ripen on one inflorescence. They are collected, dried at +24 .... 35 ^o and cleaned of flies. In this state, they can be stored for 4-5 months; if necessary, longer storage (up to 1 year), the seeds are placed in a desiccator with anhydrous calcium chloride and stored at +5 ^o . As a substrate for sowing seeds, a mixture of peat and perlite, peat and sand, medium-grained sand, turf soil, etc. are used. They stuff small boxes and slightly compact. Sow the seeds in the substrate according to the scheme 2x3x3 cm. Boxes with seeds are transferred to the cultivation room with a temperature of +21. ..24 ^o , substrate moisture 70% and cover with paper or gauze. The first seedlings appear after 4-6 days, and mass - after 10-15 days. On 30-40 days after sowing the seeds, pickling of seedlings is carried out in boxes, pots, glasses of various sizes. As a substrate, the same components are used as for sowing seeds. 6-8 weeks after the dive, the plants are ready for planting in a permanent place [1]. A significant disadvantage of this method of reproduction is the high heterozygosity of seed offspring, low productivity and decorative colors.

Известен и способ вегетативного размножения герберы - деленками. По этому способу отбирают относительно здоровые, высокопродуктивные растения. Их освобождают от субстрата, тщательно отмывают, надземную массу удаляют. Поверхность куста обрабатывают одним из поверхностно стерилизующих агентов для предотвращения развития грибных заболеваний. Куст герберы делится отточенным ножом (скальпелем), который после деления каждого куста дезинфицируется. В каждой части деленки оставляют укороченный росточек, состоящий из 3-5 листочков и минимального количества корней. 50% листьев на деленке удаляют для уменьшения транспирации в процессе укоренения. Деленки тщательно дезинфицируют и намачивают в растворе ауксина для усиления ризогенеза. Одно двулетнее растение делится на 2-6 деленок, трехлетка - на 8-12 деленок, которые высаживают в субстрат на укоренение. Разработаны температурные режимы воздуха и субстрата, относительной влажности воздуха и субстрата, приемы агротехники, поверхностной стерилизации деленок и субстратов, стимуляции ризогенеза и т.д. От одного растения в годичном цикле размножения можно получить 50-100 саженцев. Получаемый посадочный материал при размножении герберы деленками является генетически однородным [2]. Недостатком данного способа является низкий коэффициент размножения, возможность передачи с посадочным материалом грибных, бактериальных, вирусных и микоплазменных заболеваний. There is also known a method of vegetative propagation of gerbera - dividends. In this method, relatively healthy, highly productive plants are selected. They are freed from the substrate, washed thoroughly, the aerial mass is removed. The surface of the bush is treated with one of the surface sterilizing agents to prevent the development of fungal diseases. The gerbera bush is divided by a sharpened knife (scalpel), which, after dividing each bush, is disinfected. In each part of the delenki, a shortened sprout is left, consisting of 3-5 leaves and a minimum number of roots. 50% of the leaves in the divide are removed to reduce transpiration during rooting. Delenka is thoroughly disinfected and soaked in auxin solution to enhance rhizogenesis. One biennial plant is divided into 2-6 delenki, three-year-old - into 8-12 delenki, which are planted in the substrate for rooting. The temperature regimes of air and substrate, relative humidity of air and substrate, methods of agricultural technology, surface sterilization of delenes and substrates, stimulation of rhizogenesis, etc. have been developed. From one plant in the annual cycle of reproduction, you can get 50-100 seedlings. The resulting planting material during the propagation of gerbera by delenki is genetically homogeneous [2]. The disadvantage of this method is the low reproduction rate, the possibility of transmission with planting material of fungal, bacterial, viral and mycoplasma diseases.

Известен также способ размножения герберы in vitro [3], включающий следующие этапы:
1 стерилизацию исходных деленок с последующим их введением в культуру in vitro;
II получение каллусной культуры с последующей регенерацией эксплантов;
III цитологический анализ эксплантов для установления генетической однородности материала с включением этапа их накопления;
IV микроразмножение in vitro.There is also known a method of propagation of gerbera in vitro [3], comprising the following steps:
1 sterilization of the original delenki followed by their introduction into in vitro culture;
II receiving callus culture with subsequent regeneration of explants;
III cytological analysis of explants to establish the genetic homogeneity of the material with the inclusion of the stage of their accumulation;
IV micropropagation in vitro.

Разработанный способ микроразмножения, по мнению авторов, может обеспечить получение до миллиона саженцев от одного маточного растения при годичном цикле выращивания, позволяет освобождать растения от грибной, бактериальной и вирусной инфекции, создает благоприятную возможность для хранения генофонда в стерильных условиях. Данный способ размножения герберы выбран нами в качестве прототипа (см. таблицу А в конце текста). Однако прототип имеет недостатки, заключающиеся в том, что разработанная схема микроразмножения герберы является сложной, ступенчатой, питательные среды включают высокие концентрации агара, сахарозы, кинетина и сульфата аденина. The developed method of micropropagation, according to the authors, can provide up to a million seedlings from one uterine plant during a one-year growing cycle, can free plants from fungal, bacterial and viral infections, and create an opportunity to store the gene pool under sterile conditions. We selected this method of gerbera propagation as a prototype (see table A at the end of the text). However, the prototype has disadvantages, namely, that the developed scheme for micro-propagation of gerbera is complex, stepwise, nutrient media include high concentrations of agar, sucrose, kinetin and adenine sulfate.

Целью изобретения является упрощение схемы микроразмножения, минимизация питательных сред при размножении герберы in vitro. The aim of the invention is to simplify the scheme of micropropagation, minimizing nutrient media during the propagation of gerbera in vitro.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения оздоровленного посадочного материала Gerbera jamesonii Bolus, включающем стерилизацию исходных деленок, эксплантирование, субкультивирование и индукцию ризогенеза in vitro побегов на питательных средах, согласно изобретению деленки намачивают 30 мин в 0,5% растворе бенлата с последующей обработкой в течение 15 мин в 10% растворе хлорамина Б, а затем четырежды промывают стерильной дистиллированной водой с интервалом 10 - 12 мин. Субкультивирование черенков и индукцию ризогенеза проводят на модифицированной питательной среде Мурасиге и др. [3], включающей 5 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 10 мг/л аденина, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара, а чередование циклов микроразмножения на среде с содержанием 5 мг/л кинетина, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара и на среде с содержанием 1 мг/л БАП, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара при pH 5,6-5,8. Сопоставительный анализ заявленного технического решения с прототипом показывает, что предложенный способ микроразмножения герберы отличается упрощенной схемой введения в культуру деленок, режимом стерилизации, составами питательных сред в процессах эксплантирования, субкультивирования с чередованием циклов размножения и питательной средой для ризогенеза in vitro побегов, включающий 50% концентрации минеральных солей (кроме FeNaЭДТА), дополненной 1 мг/л ИУК, 25 г/л сахарозы, 7 г/л агара при pH, равном 5,6-5,8. The problem is achieved in that in the method for producing healthy planting material Gerbera jamesonii Bolus, including sterilization of the initial delenki, explanting, subculturing and inducing rhizogenesis of in vitro shoots on nutrient media, according to the invention, the delenki are soaked for 30 min in a 0.5% solution of benlat with subsequent processing for 15 minutes in a 10% solution of chloramine B, and then washed four times with sterile distilled water with an interval of 10 to 12 minutes. Subculturing of cuttings and the induction of rhizogenesis is carried out on a modified nutrient medium Murashige et al. [3], including 5 mg / l kinetin, 0.1 mg / l IAA, 10 mg / l adenine, 40 g / l sucrose, 8 g / l agar , and the alternation of micropropagation cycles on a medium containing 5 mg / l kinetin, 40 g / l sucrose, 8 g / l agar and on a medium containing 1 mg / l BAP, 40 g / l sucrose, 8 g / l agar at pH 5.6-5.8. A comparative analysis of the claimed technical solution with the prototype shows that the proposed method for microbial propagation of gerbera differs in a simplified scheme for introducing delenok into the culture, sterilization mode, nutrient compositions in the processes of explantation, subculturing with alternating propagation cycles and nutrient medium for rhizogenesis of in vitro shoots, including 50% concentration mineral salts (except FeNaEDTA), supplemented with 1 mg / l IAA, 25 g / l sucrose, 7 g / l agar at a pH of 5.6-5.8.

Признаки, отличающие заявленное техническое решение от прототипа, не выявлены нами при изучении данной и смежных областей, что обеспечивает заявленному способу микроразмножения герберы соответствие критерию "изобретательский уровень". Signs that distinguish the claimed technical solution from the prototype, were not identified by us in the study of this and related areas, which provides the claimed method of micropropagation of gerbera with the criterion of "inventive step".

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Все подготовительные операции, связанные с культурой ткани герберы, проводят в рабочей комнате, оборудованной стеллажами, сушильным шкафом, автоклавами, дистиллятором и аппаратом У4.2 для изготовления ватно-марлевых пробок. Подготовительные операции состоят из подготовки необходимой посуды, инструментов, приготовления маточных и рабочих растворов макро- и микроэлементов, витаминов и регуляторов роста. Пробирки и другую посуду освобождают от упаковки, складывают в емкость, кипятят, стенки отмывают ершом с моющими средствами, затем промывают под проточной водой, ополаскивают дистиллированной водой. В дальнейшем проводят их сушку и стерилизацию. Сухой горячевоздушной стерилизации при +160... 170^o в течение одного часа подвергают инструменты, пробирки и посуду. По мере охлаждения в пробирки вставляют ватно-марлевые пробки. Для удобства пробирки по 10-20 шт упаковывают в крафт-бумагу, связывают веревкой и автоклавируют при 1,5 атм в течение 1 часа. Стерильные пробирки, инструменты и посуду переносят в операционную комнату. Питательная среда для тканевой культуры включает большой набор минеральных и органических компонентов, которые растворяют в бидистиллированной воде. Для удобства в работе заранее готовят маточные растворы солей отдельно макро- и микроэлементов из расчета на 10 л среды, используя для этого мерные колбы емкостью 100, 500 и 1000 мл с притертыми пробками. Хранятся растворы в холодильнике при температуре +2...3^o. Для приготовления рабочего раствора питательной среды отбирают пипеткой по 5-10 мл каждого солевого раствора. В день приготовления среды готовят только соли железа, а также сахарозы, агара, витаминов, регуляторов роста. Навески компонентов и порции маточных растворов переносят в литровую коническую колбу при постоянном перемешивании магнитной мешалкой. Расчетный объем среды не должен превышать 750 мл. Затем устанавливают требуемую величину pH среды, для чего используют 0,1 н. растворов КОН и HCl. В оставшемся объеме бидистиллированной воды (около 200 мл) растворяют агар при нагревании на водяной бане. Растворы сливают, перемешивая и доводя бидистиллированной водой до 1 л. Готовую среду разливают в простерилизованные пробирки и автоклавируют в течение 20 мин при 0,7-0,9 атм. Срок хранения стерильной среды -не более 5 дней.The inventive method is as follows. All preparatory operations related to the culture of gerbera fabrics are carried out in a working room equipped with shelving, an oven, autoclaves, a distiller and a U4.2 apparatus for making cotton-gauze plugs. Preparatory operations consist of preparing the necessary utensils, tools, preparing uterine and working solutions of macro- and microelements, vitamins and growth regulators. Test tubes and other dishes are freed from packaging, put into a container, boiled, the walls are washed with a ruff with detergents, then washed under running water, rinsed with distilled water. Subsequently, they are dried and sterilized. Dry hot-air sterilization at +160 ... 170 ^o for one hour is subjected to tools, tubes and utensils. As they cool, cotton-gauze plugs are inserted into the tubes. For convenience, test tubes of 10-20 pcs are packed in kraft paper, tied with a rope and autoclaved at 1.5 atm for 1 hour. Sterile tubes, instruments and dishes are transferred to the operating room. Culture medium for tissue culture includes a wide range of mineral and organic components, which are dissolved in bidistilled water. For convenience in operation, mother liquors of salts of macro- and microelements are separately prepared in advance based on 10 l of medium, using 100, 500 and 1000 ml volumetric flasks with ground stoppers for this purpose. Solutions are stored in the refrigerator at a temperature of +2 ... 3 ^o . To prepare a working solution of a nutrient medium, 5-10 ml of each saline solution is taken with a pipette. On the day of preparation of the medium, only iron salts are prepared, as well as sucrose, agar, vitamins, growth regulators. Weighed portions of the components and portions of the mother liquor are transferred into a liter conical flask with constant stirring with a magnetic stirrer. The estimated volume of the medium should not exceed 750 ml. Then set the desired pH of the medium, for which use 0.1 N. KOH and HCl solutions. In the remaining volume of bidistilled water (about 200 ml), agar is dissolved by heating in a water bath. The solutions are drained, mixing and bringing bidistilled water to 1 liter. The finished medium is poured into sterilized tubes and autoclaved for 20 minutes at 0.7-0.9 atm. The shelf life of the sterile medium is not more than 5 days.

Исходные экспланты для культуры in vitro изолируют из чистосортных маточных растений, которые выращивают так, чтобы точка роста была выше уровня субстрата. При такой посадке розетки листьев образуются на стеблевых частях растения и позволяет получить стерильную культуру побегов с наибольшим выходом. Скальпелем отрезают от растения черенок, обрывают наружные листья, а оставшуюся вегетативную почку размером 1,0-3,0 см, состоящую из верхушки побега и 3-5 листовых черешков и субапикальной части стебля (меристема), аккуратно протирают ватой, смоченной в 70% этаноле. Почки помещают в марлевые мешочки и затягивают веревкой. В этом мешочке проводит все операции, связанные с поверхностной стерилизацией и последующей их промывкой в условиях стерильного бокса. The initial explants for in vitro culture are isolated from pure-breed mother plants that are grown so that the growth point is higher than the level of the substrate. With this planting, rosettes of leaves are formed on the stem parts of the plant and allows you to get a sterile shoot culture with the greatest yield. Cuttings are cut from the plant with a scalpel, outer leaves are torn off, and the remaining vegetative bud of 1.0-3.0 cm in size, consisting of the top of the shoot and 3-5 leaf petioles and the subapical part of the stem (meristem), is gently wiped with cotton soaked in 70% ethanol. The kidneys are placed in gauze bags and tightened with a rope. In this bag, it carries out all operations related to surface sterilization and their subsequent washing in a sterile box.

Для лучшей прилипаемости стерилизующего вещества к поверхности изолированной ткани герберы в приготовленные растворы (по 200 мл) добавляют 2-3 капли детергента Твин-20. Приготовленные мешочки с почками погружают на 30 мин в 0,5% раствор бенлата, затем переносят их на 15 мин в 10% раствор хлорамина Б и четырежды промывают с интервалом 10-12 мин стерильной дистиллированной водой. For better adherence of the sterilizing substance to the surface of an isolated gerbera fabric, 2-3 drops of Tween-20 detergent are added to the prepared solutions (200 ml each). The prepared kidney bags are immersed for 30 minutes in a 0.5% solution of benlat, then they are transferred for 15 minutes in a 10% solution of chloramine B and washed four times with an interval of 10-12 minutes with sterile distilled water.

Сосуды со стерилизованным материалом прикрывают перевернутыми стерильными чашками Петри. В асептических условиях пинцетом и скальпелем удаляют листовые черешки, прикрывающие апекс. Отрезают верхушку побега размером 1-2 мм и стерильной иглой переносят в пробирку на поверхность агаризованной питательной среды 1 (табл. 1). Приведенный метод стерилизации почек обеспечивает наибольший выход стерильного материала на стадии эксплантирования, хотя 60% высаженных эксплантов погибает от инфекции и действия концентраций стерилизующих веществ. Культивирование эксплантов проводят на питательной среде 1, дополненной 5 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 10 мг/л адениниа, 40 г/л сахарозы и 8 г/л агара. Сравнительная оценка результатов экспериментальных исследований показала достаточно высокую эффективность влияния приведенных компонентов в процессах микроразмножения сортов герберы (табл. 2). Пробирки с высаженными апексами переносят в вегетационную камеру при +25^o, 16-часовом фотопериоде, относительной влажности 70% и интенсивности освещения 5000 лк.Vessels with sterilized material are covered with inverted sterile Petri dishes. Under aseptic conditions, leaf petioles covering the apex are removed with tweezers and a scalpel. Cut off the tip of the shoot with a size of 1-2 mm and transfer it to a test tube on the surface of agarized nutrient medium 1 with a sterile needle (Table 1). The given method of kidney sterilization provides the greatest yield of sterile material at the explantation stage, although 60% of the explant landed dies from infection and the action of concentrations of sterilizing substances. The explants are cultured on nutrient medium 1 supplemented with 5 mg / L kinetin, 0.1 mg / L IAA, 10 mg / L adeninia, 40 g / L sucrose and 8 g / L agar. A comparative evaluation of the results of experimental studies showed a rather high efficiency of the influence of the components in the micropropagation of gerbera varieties (Table 2). Tubes with planted apexes are transferred to the growing chamber at +25 ^o , a 16-hour photoperiod, relative humidity of 70% and light intensity of 5000 lux.

На 28-30 сутки формируются вегетативные побеги герберы. В ряде случаев после первых двух недель культивирования наблюдается незначительное инфицирование некоторых эксплантов. В этом случае проводят повторную стерилизацию. Для этого в ламинар-боксе достают из сосуда зараженный эксплант, отрезают инфицированную часть и погружают на 2-3 мин в 5% раствор хлорамина Б, ополаскивают в стерильной воде и высаживают на свежую питательную среду того же состава. On the 28-30th day, vegetative shoots of gerbera are formed. In some cases, after the first two weeks of cultivation, a slight infection of some explants is observed. In this case, re-sterilization is carried out. To do this, in the laminar box, the infected explant is taken from the vessel, the infected part is cut off and immersed in a 5% solution of chloramine B for 2-3 minutes, rinsed in sterile water and planted on fresh nutrient medium of the same composition.

Метод микроразмножения основан на двух явлениях: а) возникновении почек из существующих тканей меристем; б) образование меристематических очагов и дифференциация стеблевых почек. Меристематическое происхождение in vitro таким способом гарантирует им генетическую однородность. Для увеличения коэффициента размножения образовавшиеся экспланты пересаживают на питательную среду 2 (табл. 1). Введение в питательную среду 5 мг/л БАП индуцировало максимальное пробуждение и развитие пазушных почек герберы. От одной меристематической верхушки за один пассаж в ряде случаев получено до 30 побегов (табл. 3). Однако при длительном пассировании этих побегов на средах с той же концентрацией БАП новообразующиеся побеги имели морфологические изменения, плохо укоренялись, погибали, что, вероятно, было связано с накоплением фитогормона в тканях больше необходимого уровня. Отмеченное явление позволило сделать вывод о необходимости чередования циклов культивирования на средах с различными цитокининами при одновременном обеспечении достаточной скорости микроразмножения in vitro. The method of micropropagation is based on two phenomena: a) the emergence of kidneys from existing meristem tissues; b) the formation of meristematic foci and the differentiation of stem buds. The in vitro meristematic origin in this way guarantees them genetic homogeneity. To increase the reproduction coefficient, the formed explants are transplanted onto a nutrient medium 2 (Table 1). The introduction of 5 mg / l of BAP into the nutrient medium induced the maximum awakening and development of the axillary gerbera buds. From one meristematic apex per passage, in some cases, up to 30 shoots were obtained (Table 3). However, with prolonged passivation of these shoots on media with the same concentration of BAP, the newly formed shoots had morphological changes, poorly rooted, and died, which was probably due to the accumulation of phytohormone in tissues higher than the required level. The noted phenomenon made it possible to conclude that it is necessary to alternate cultivation cycles on media with various cytokinins while ensuring a sufficient rate of micropropagation in vitro.

Проведенные экспериментальные исследования по микроразмножению позволили разработать среды с оптимальным уровнем цитокининов (2а и 2б, табл. 1 и 4). Введение в питательную среду 2а 5 мг/л кинетина, а в среду 2б 1 мг/л БАП в комплексе с приведенными в таблице 1 компонентами питательных сред с учетом параметров вегетации в фитотронированной камере, позволили избежать токсического действия цитокининов и получить полноценные микрочеренки. Цикл микроразмножения (активация новообразования пазушных почек и микроклонирование развивающихся побегов) повторяли 12-15 раз в течение 2 лет (табл. 4). При более длительном культивировании скорость размножения уменьшалась, появлялись неактивные почки, усиливался каллусогенез. The conducted experimental studies on micropropagation made it possible to develop media with the optimal level of cytokinins (2a and 2b, Tables 1 and 4). The introduction of 2a 5 mg / L kinetin into the nutrient medium, and 1 mg / L BAP on Wednesday in combination with the components of the nutrient medium given in Table 1, taking into account the parameters of vegetation in the phytotron chamber, made it possible to avoid the toxic effect of cytokinins and obtain complete microcircuits. The micropropagation cycle (activation of the neoplasm of the axillary kidneys and the microcloning of developing shoots) was repeated 12-15 times for 2 years (Table 4). With a longer cultivation, the reproduction rate decreased, inactive kidneys appeared, and callusogenesis intensified.

Сформированные побеги переносят на среду 3 для ризогенеза (табл. 1). Питательная среда включает 50% концентрации минеральных солей (кроме FeNaЭДТА) по прописи (3), с добавлением 1 мг/л ИУК, 25 г/л сахарозы, 7 г/л агара при pH 5,6-5,8. На 20-24 сутки побеги герберы образуют корни и достигают стандартных размеров. Полученные растения-регенераты герберы легко адаптируются в условиях in vivo. В зависимости от преследуемых целей (размножение селекционного, коллекционного материала, сохранение in vitro генофонда) используется технологическая последовательность поэтапного прохождения экспланта на различных составах питательных сред:

а дня длительного массового размножения - следующая технологическая последовательность:

Предлагаемый способ размножения посадочного материала Gerbera jamesonii Bolus (клон, гибрид, сорт и мериклон) является промышленно применимым и позволяет воспроизводить, сохранять и получать генетически однородные высококачественные жизнеспособные растения при одновременном упрощении схемы прохождения технологических этапов (из схемы исключены этапы получения каллусной культуры и цитологический анализ эксплантов для установления генетической однородности получаемого посадочного материала). Применение разработанных прописей питательных сред в комплексе с параметрами in vivo способствует сокращению материально-трудовых затрат и производственных площадей.The formed shoots are transferred to medium 3 for rhizogenesis (Table 1). The nutrient medium includes a 50% concentration of mineral salts (except FeNaEDTA) as prescribed (3), with the addition of 1 mg / L IAA, 25 g / L sucrose, 7 g / L agar at a pH of 5.6-5.8. On days 20-24, gerbera shoots form roots and reach standard sizes. The resulting gerbera regenerated plants are easily adaptable in vivo. Depending on the objectives pursued (reproduction of selection, collection material, preservation of the gene pool in vitro), the technological sequence of explant phased passage on various nutrient media is used:

and days of prolonged mass reproduction - the following technological sequence:

The proposed method of propagation of planting material Gerbera jamesonii Bolus (clone, hybrid, cultivar and Meriklon) is industrially applicable and allows you to reproduce, save and obtain genetically uniform high-quality viable plants while simplifying the flow of technological stages (the stages of obtaining callus culture and cytological analysis are excluded from the scheme explants to establish the genetic uniformity of the resulting planting material). The use of the developed prescriptions of nutrient media in combination with in vivo parameters helps to reduce material and labor costs and production space.

Источники информации
1. Reinhard B., Werner D., Wolfgang F., et al. Gerbera. Neuman Verlag. 1969, 180 s.Sources of information
1. Reinhard B., Werner D., Wolfgang F., et al. Gerbera. Neuman Verlag. 1969, 180 s.

2. Звигздыня В. А. , Гутмане Л.Я., Муценице Г.Я. Гербера в Латвии. Зинатне, 1984, 140 с. 2. Zvigzdynia V. A., Gutmane L. Ya., Mutsenitsa G. Ya. Gerbera in Latvia. Zinatne, 1984, 140 p.

3. Murashige T. , Serpa M., Jones B. Clonal Multiplication of Gerbera through Tissue Culture. HortScience, v.9(3), 1974, pp.175-180. 3. Murashige T., Serpa M., Jones B. Clonal Multiplication of Gerbera through Tissue Culture. HortScience, v. 9 (3), 1974, pp. 175-180.

Claims (1)

Способ получения оздоровленного in vitro посадочного материала Gerbera jamesonii Bolus, включающий стерилизацию деленок, эксплантирование, пассирование микрочеренков, ризогенез побегов, отличающийся тем, что деленки стерилизуют 30 мин в 0,5%-ном растворе бенлата, затем 15 мин в 10%-ном растворе хлорамина Б и четырехкратно промывают стерильной дистиллированной водой с интервалом в 10 - 12 мин, а индукцию органогенеза и субкультивирование эксплантов проводят на питательной среде Мурасиге и др., дополненной 5 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 10 мг/л ИУК, 10 мг/л аденина, 40 г/л сахарозы и 8 г/л агара, причем циклы культивирования чередуют при содержании 5 мг/л кинетина, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара и при содержании 1 мг/л бензиламинопурина (БАП), 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара, при этом ризогенез побегов in vitro проводят при 50% концентрации минеральных солей (кроме FeNa ЭДТА), дополненной 1 мг/л ИУК, 25 г/л сахарозы, 7 г/л агара при pH 5,6 - 5,8. A method of obtaining a healthy in vitro planting material of Gerbera jamesonii Bolus, including sterilization of delenki, explantation, passivation of micrograins, shoot rhizogenesis, characterized in that delenki are sterilized for 30 minutes in a 0.5% solution of benlat, then 15 minutes in a 10% solution chloramine B and four times washed with sterile distilled water with an interval of 10-12 minutes, and the induction of organogenesis and subculturing of explants is carried out on a nutrient medium Murashige et al. supplemented with 5 mg / l kinetin, 0.1 mg / l IAA, 10 mg / l IAA, 10 mg / L adenine, 40 g / l of sucrose and 8 g / l of agar, and the culture cycles are alternated with a content of 5 mg / l of kinetin, 40 g / l of sucrose, 8 g / l of agar and with a content of 1 mg / l of benzylaminopurine (BAP), 40 g / l of sucrose, 8 g / l of agar, while in vitro rhizogenesis of shoots is carried out at 50% concentration of mineral salts (except FeNa EDTA) supplemented with 1 mg / l of IAA, 25 g / l of sucrose, 7 g / l of agar at pH 5.6 - 5 ,eight.

Images