RU2146288C1 - Method of preparing homoprobiotic bacterial preparation containing living lactic bacteria - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: bacterial preparation is designed for preventing and treating animal and poultry diseases and as well for preparing gnotobiotic organisms. To isolate natural bacterial complexes, native biomaterial is selectively decontaminated by diluting it with liquid lactic bacterium-selective nutrient medium. This procedure allows removing accidentally occurring in biomaterial microorganisms foreign for given animal and poultry species. Subsequent treatment of diluted biomaterial with blood serum (or with immunoglobulin preparations) from the same animal or poultry family enables most complete removal of foreign microflora. Once fried of all contaminating microorganisms, biomaterial is cultured under anaerobic conditions. Resulting biomass is then reseeded, without isolating pure cultures into nutrient medium, and recultured under anaerobic conditions. EFFECT: more efficiently reduced mortality in chickens upon oral administration under industrial poultry keeping. 3 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактерийных препаратов, и может быть использовано для профилактики и лечения заболеваний животных и птиц, а также производства гнотобиологических организмов (SPF- животных и птиц). The invention relates to biotechnology, in particular the production of bacterial preparations, and can be used for the prevention and treatment of diseases of animals and birds, as well as the production of gnotobiological organisms (SPF-animals and birds).

Создание крупных птицеводческих и животноводческих предприятий выдвинуло ряд новых экологических и клинических проблем, многие из которых не решены до настоящего времени. Среди них можно назвать такие, как необходимость защиты поголовья от эпизоотий, приводящих к падежу молодняка и массовой гибели птицы, защита потребителей продукции от инфекционных агентов, источником которых является мясо животных и птицы - сальмонелл, кампилобактеров, кишечных палочек, иерсиний, листерий, криптоспоридий и др., предотвращение распространения в природе антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов животного происхождения и т. п. Установлено, например, что 77% случаев сальмонеллеза человека вызваны сальмонеллами птичьего происхождения. Ежегодные убытки от заболеваний сальмонеллезом людей и птиц только в США составляют не менее 300 млн. долларов. The creation of large poultry and livestock enterprises raised a number of new environmental and clinical problems, many of which have not been resolved to date. Among them are such as the need to protect the livestock from epizootics that lead to mortality of young animals and mass death of poultry, protecting consumers of products from infectious agents, the source of which is animal and poultry meat - salmonella, campylobacter, Escherichia coli, Yersinia, Listeria, cryptosporidium and etc., preventing the spread in nature of antibiotic-resistant strains of animal microorganisms, etc. It has been established, for example, that 77% of cases of human salmonellosis are caused by bird salmonella its origin. The annual losses from salmonellosis in humans and birds in the United States alone are at least $ 300 million.

Не вызывает сомнений, что спектр потенциальных патогенов домашних животных и птиц будет неуклонно расширяться, что связано как с улучшением диагностики, так и с ухудшением экологической ситуации в отдельных регионах и в мире в целом, обусловливающим нарушение защитных механизмов макроорганизма, в первую очередь его нормальной микрофлоры. Роль нормальной микрофлоры в защите организма хозяина от неблагоприятного действия различных инфекционных и неинфекционных агентов общеизвестна. В естественных условиях нормальная микрофлора животных и птиц формируется прежде всего за счет их инфицирования микрофлорой родителей, а также микроорганизмов из внешней среды. Однако современная технология промышленного животноводства и особенно птицеводства в силу своих особенностей нарушает эволюционно сложившиеся взаимоотношения организма хозяина и его микрофлоры, поскольку эта технология фактически исключает обсеменение потомства нормальной микрофлорой родителей. Поэтому выведенные в инкубаторах цыплята обсеменяются микроорганизмами случайным образом из окружающей среды. Их биопленка неполноценна в плане обеспечения колонизационной резистентности. В связи с этим, инфицирование таких цыплят даже единичными клетками потенциально патогенных микроорганизмов сопровождается быстрым размножением последних, их диссеминацией во внутренние органы с возникновением патологических процессов и массовой гибелью молодняка или формированием особей с длительным носительством патогенных микроорганизмов. There is no doubt that the range of potential pathogens of domestic animals and birds will expand steadily, which is associated with both improved diagnostics and a deterioration of the environmental situation in individual regions and in the world as a whole, causing a violation of the protective mechanisms of the macroorganism, primarily its normal microflora . The role of normal microflora in protecting the host organism from the adverse effects of various infectious and non-infectious agents is well known. Under natural conditions, the normal microflora of animals and birds is formed primarily due to their infection with the microflora of their parents, as well as microorganisms from the external environment. However, the modern technology of industrial animal husbandry and especially poultry farming, due to its characteristics, violates the evolutionary relationships between the host organism and its microflora, since this technology virtually eliminates the seeding of offspring with normal microflora of the parents. Therefore, chickens hatched in incubators are seeded by microorganisms randomly from the environment. Their biofilm is inferior in terms of ensuring colonization resistance. In this regard, infection of such chickens even with single cells of potentially pathogenic microorganisms is accompanied by a rapid multiplication of the latter, their dissemination to internal organs with the occurrence of pathological processes and the mass death of young animals or the formation of individuals with prolonged carriage of pathogenic microorganisms.

Известно множество приемов защиты молодняка птицы и домашних животных от инфекционных заболеваний. Прежде всего, это включение в рацион молодняка разнообразных антибактериальных препаратов и их комплексов. Помимо этого широко используют различные вакцины, бактериофаги и другие антимикробные препараты. Однако длительное применение антибиотиков приводит к селекции антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов, что ведет к удлинению носительства и их диссеминации в окружающую среду. Широкое использование антибиотиков в птицеводстве приводит также к их аккумуляции в мясе птицы с последующим попаданием этих химических соединений в организм потребителя с возможным развитием у последнего разнообразных токсических, аллергических и дисбиотических реакций. Many methods are known for protecting young birds and domestic animals from infectious diseases. First of all, this is the inclusion of a variety of antibacterial drugs and their complexes in the diet of young animals. In addition, various vaccines, bacteriophages and other antimicrobial agents are widely used. However, prolonged use of antibiotics leads to the selection of antibiotic-resistant strains of microorganisms, which leads to an extension of carriage and their dissemination to the environment. The widespread use of antibiotics in poultry also leads to their accumulation in poultry meat with the subsequent entry of these chemical compounds into the consumer's body with the possible development of a variety of toxic, allergic and dysbiotic reactions in the latter.

В настоящее время для восстановления нарушенного микробиоценоза животных и птицы используют разнообразные приемы, прежде всего введение в больших количествах антагонистических штаммов бактерий - представителей нормальной микрофлоры кишечника животных, птиц и человека (кишечных палочек, бифидобактерий, лактобацилл и др.). Описаны многочисленные композиции чистых культур микроорганизмов, выделенных от человека и различных видов животных и птиц, для профилактики и лечения дисбактериозов и кишечных заболеваний у птиц и животных, либо их комбинации со стимуляторами роста бактерий или иммуномодуляторами. Currently, various techniques are used to restore the disturbed microbiocenosis of animals and birds, primarily the introduction of large amounts of antagonistic strains of bacteria - representatives of the normal microflora of the intestines of animals, birds and humans (E. coli, bifidobacteria, lactobacilli, etc.). Numerous compositions of pure cultures of microorganisms isolated from humans and various species of animals and birds are described for the prevention and treatment of dysbacterioses and intestinal diseases in birds and animals, or their combination with bacterial growth stimulants or immunomodulators.

Известны, например, пробиотические препараты для предупреждения колибактериоза у цыплят, приготовленные из монокультуры кишечных палочек, выделенных от кур, или из выделенных от овцы культур лактобацилл и пропионибактерий. Для предупреждения сальмонеллеза и кампилобактериоза предложено скармливать молодняку монокультуры лактобацилл или энтерококков. Известны препараты бактоферон, приготовленный из живых культур бифидобактерий и стрептококков с добавлением интерферона; стрептобифид, представляющий собой сухую биомассу смеси чистых культур бифидобактерий и стрептококков, выделенных от поросят; препарат СБА, содержащий смесь трех штаммов бактерий различных видов - ацидофильных лактобацилл, бифидобактерий и фекальных стрептококков, и предназначенный для профилактики заболеваний поросят; известен комплексный бактерийный препарат для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний животных - энтерацид П, содержащий по одному штамму ацидофильных лактобацилл и фекальных энтерококков, выделенных от песца, бактерийный препарат Биосан для лечения эндометрита коров, содержащий смесь штаммов лактобацилл двух видов, выделенных из влагалища здоровой женщины, и многие другие. For example, probiotic preparations for preventing colibacteriosis in chickens made from monoculture of Escherichia coli isolated from chickens or from lactobacilli and propionibacteria cultures isolated from sheep are known. To prevent salmonellosis and campylobacteriosis, it was proposed to feed young monocultures of lactobacilli or enterococci to young animals. Known preparations are bactoferon prepared from living cultures of bifidobacteria and streptococci with the addition of interferon; streptobifid, which is a dry biomass of a mixture of pure cultures of bifidobacteria and streptococci isolated from piglets; SBA preparation containing a mixture of three strains of bacteria of various types - acidophilic lactobacilli, bifidobacteria and fecal streptococci, and intended for the prevention of diseases of piglets; known is a complex bacterial preparation for the treatment and prevention of gastrointestinal diseases of animals - enteric P, containing one strain of acidophilic lactobacilli and fecal enterococci isolated from Arctic fox, the bacterial preparation Biosan for treating bovine endometritis, containing a mixture of two types of lactobacilli strains isolated from a healthy vagina women, and many others.

Вместе с тем отмечено, что наилучший протективный эффект наблюдается при введении бактериальных культур, выделенных от животного или птицы того же вида. Например, бактерии, выделенные от мышей, свиней и других животных, значительно слабее защищали новорожденных цыплят от инфекционных заболеваний, чем бактерии, выделенные от кур. В этой связи недостатком большинства вышеперечисленных препаратов представляется то, что они содержат бактерии, гетерогенные для организма реципиента, и поэтому транзитом быстро выводятся из организма. В связи с этим трудно ожидать одинаковый позитивный эффект при назначении любого из названных препаратов животным и птицам разных видов. However, it was noted that the best protective effect is observed with the introduction of bacterial cultures isolated from an animal or bird of the same species. For example, bacteria isolated from mice, pigs, and other animals were much less likely to protect newborn chickens from infectious diseases than bacteria isolated from chickens. In this regard, the disadvantage of most of the above drugs is that they contain bacteria that are heterogeneous for the recipient's body, and therefore are quickly excreted in transit from the body. In this regard, it is difficult to expect the same positive effect when prescribing any of these drugs to animals and birds of different species.

Известны способы создания колонизационной резистентности у молодняка кур путем использования чистых культур микроорганизмов, изолированных из зоба, слепой и толстой кишок взрослых кур. Известно также, что защита молодняка птицы от инфекционных заболеваний более выражена при использовании не монокультур, а смеси чистых культур микроорганизмов, состоящие из 2, 6 и даже 28 микроорганизмов, выделенных из зоба и цекума здоровых взрослых кур, причем часть из них не была идентифицирована (1). Однако при данном способе создания гомопробиотического препарата, то есть пробиотика, приготовленного на основе аллохтонных микроорганизмов конкретного вида животных или птиц и предназначенного для применения животным и птицам того же вида, велика вероятность того, что выделенные культуры являются клонами гетерогенных для видовой принадлежности хозяина микроорганизмов, случайно попавших в его пищеварительный тракт с пищей и водой, контаминированных транзиторными бактериями из окружающей среды или животных организмов другой видовой принадлежности (рыб, амфибий, насекомых и других, включая человека). Кроме того, по данным авторов, эффективность смеси бактерий, которую готовили для каждого испытания из сохранявшихся чистых культур, прогрессивно уменьшалась на протяжении 20-недельных испытаний, в то время как эффективность бактериальной смеси, приготовленной для каждого испытания из сохраняемого цекального содержимого, оставалась неизменной. Known methods for creating colonization resistance in young chickens by using pure cultures of microorganisms isolated from goiter, cecum and colon of adult chickens. It is also known that the protection of young birds from infectious diseases is more pronounced when using not monocultures, but a mixture of pure cultures of microorganisms, consisting of 2, 6 and even 28 microorganisms isolated from goiter and cecum of healthy adult chickens, and some of them were not identified ( 1). However, with this method of creating a homoprobiotic preparation, that is, a probiotic prepared on the basis of allochthonous microorganisms of a particular animal or bird species and intended for use by animals and birds of the same species, it is highly probable that the isolated cultures are clones of microorganisms heterogeneous for the species belonging to the host, caught in its digestive tract with food and water, contaminated with transient bacteria from the environment or animal organisms of another species th accessory (fish, amphibians, insects and others, including humans). In addition, according to the authors, the effectiveness of the bacterial mixture that was prepared for each test from preserved pure cultures progressively decreased over the course of 20 weeks of testing, while the effectiveness of the bacterial mixture prepared for each test from stored cecal contents remained unchanged.

Имеются данные о протективном эффекте не только гомопробиотических препаратов, приготовленных из смеси чистых культур фекальных бактерий после культивирования их в анаэробных условиях, но и назначение нативного кишечного содержимого взрослых кур. There is evidence of the protective effect of not only homoprobiotic preparations prepared from a mixture of pure cultures of fecal bacteria after culturing them under anaerobic conditions, but also the purpose of the native intestinal contents of adult chickens.

Защитный эффект в отношении сальмонеллеза при оральном назначении кишечной микрофлоры взрослых птиц установлен в Швеции, где на протяжении 5 лет цекальную бактериальную флору кур вводили 2.86 миллионам цыплят-бройлеров (2). Показано также, что назначение содержимого толстой кишки может оказывать и выраженный терапевтический эффект при назначении птице, инфицированной патогенными энтеробактериями (3). Однако в кишечном содержимом здоровых животных и птиц наряду с высоким содержанием автохтонных бактерий присутствует большое количество разнообразных аллохтонных бактерий, а также грибов. В этой связи назначение молодняку нативного содержимого толстой кишки взрослых животных и птиц с профилактический или лечебной целью сопряжено с риском инфицирования реципиента случайными для него видами бактерий, в том числе патогенными. The protective effect against salmonellosis in the oral administration of the intestinal microflora of adult birds has been established in Sweden, where 2.86 million broiler chickens have been injected with the fecal bacterial flora of chickens for 5 years (2). It was also shown that the appointment of the contents of the colon can have a pronounced therapeutic effect in the appointment of a bird infected with pathogenic enterobacteria (3). However, in the intestinal contents of healthy animals and birds, along with a high content of autochthonous bacteria, there is a large number of various allochthonous bacteria, as well as fungi. In this regard, the appointment of young colon contents of the colon of adult animals and birds for prophylactic or therapeutic purposes is associated with a risk of infection of the recipient with random bacterial species, including pathogenic ones.

Известен способ получения гомопробиотического бактериального препарата для профилактики кишечных заболеваний птиц, особенно сальмонеллеза (4). Способ предусматривает анаэробное культивирование известными методами содержимого слепой кишки птицы в присутствии эпителиальных клеток пищеварительного тракта, например зоба птиц, с последующим после культивирования выделением чистых культур бактерий, наращиванием биомассы, ее отделением от питательной среды с последующим ее замораживанием или лиофилизацией. Для приготовления препарата используют лишь штаммы бактерий с высокой адгезивной активностью (не менее 10 бактерий на 1 эпителиальную клетку), отобранные в Fuller adhesion test. Изолированные таким образом штаммы были идентифицированы как Lactobacillus acidophilus, L.fermentum, L.lactis и Clostridium spp. Конечный препарат готовят путем раздельного культивирования отобранных бактерий на питательной среде типа MRS-бульон или VL-бульон в анаэробных условиях при 35^oC в течение ночи. По окончании культивирования готовят смесь культур путем помещения в питательный бульон по несколько капель каждой культуры и культивирования смеси в анаэробных условиях в течение 2 дней. Затем бактериальные клетки отделяют от питательного бульона, высушивают или замораживают. Возможно совместное культивирование отобранных штамов.A known method for producing a homoprobiotic bacterial preparation for the prevention of intestinal diseases of birds, especially salmonellosis (4). The method involves anaerobic cultivation by known methods of the contents of the cecum of the bird in the presence of epithelial cells of the digestive tract, such as goiter, followed by cultivation of the isolation of pure cultures of bacteria, the growth of biomass, its separation from the nutrient medium, followed by freezing or lyophilization. For the preparation of the preparation, only bacterial strains with high adhesive activity (at least 10 bacteria per 1 epithelial cell) selected in the Fuller adhesion test are used. Thus isolated strains were identified as Lactobacillus acidophilus, L.fermentum, L. lactis and Clostridium spp. The final preparation is prepared by separately culturing the selected bacteria on a nutrient medium such as MRS-broth or VL-broth under anaerobic conditions at 35 ^° C. overnight. At the end of the cultivation, a mixture of cultures is prepared by placing several drops of each culture in a nutrient broth and cultivating the mixture under anaerobic conditions for 2 days. Then the bacterial cells are separated from the nutrient broth, dried or frozen. Perhaps co-cultivation of selected strains.

Таким образом, культивирование содержимого цекума в анаэробных условиях и последующий отбор бактерий по их способности к адгезии позволяет повысить эффективность получаемого препарата за счет использования при получении конечного пробиотического препарата бактерий с высокими адгезивными характеристиками. При данном способе конструирования препарата определяющей является адгезивная активность бактерий к эпителиальным клеткам. Вместе с тем известно, что многие чужеродные для хозяина бактерии, включая патогенные кишечные микроорганизмы, также обладают неспецифической адгезивной активностью. Кроме того, они могут нести плазмидные трансмиссивные гены, кодирующие образование у них структур, определяющих повышенную специфическую адгезию к эпителиальным клеткам (типа антигенов К-88 и К-99 у эшерихий, выделенных от поросят и цыплят, поверхностных белков у стрептококков и т.д.). Thus, the cultivation of the contents of cecum under anaerobic conditions and the subsequent selection of bacteria according to their ability to adhere to it makes it possible to increase the efficiency of the resulting preparation by using bacteria with high adhesive characteristics when preparing the final probiotic preparation. With this method of constructing the drug, the adhesive activity of bacteria to epithelial cells is determining. However, it is known that many bacteria alien to the host, including pathogenic intestinal microorganisms, also have nonspecific adhesive activity. In addition, they can carry plasmid transmissible genes that encode the formation of structures in them that determine increased specific adhesion to epithelial cells (such as K-88 and K-99 antigens in Escherichia isolated from piglets and chickens, surface proteins in streptococci, etc. .).

Цель изобретения - получение гомопробиотического бактерийного препарата, содержащего живые молочнокислые бактерии (молочнокислые бактерии - большая гетерогенная группа грамположительных анаэробных и микроаэрофильных бактерий, которые при утилизации углеводов накапливают в среде молочную кислоту). Поставленная цель достигается тем, что пробиотик готовят на основе естественных симбиотических комплексов автохтонных анаэробных микроорганизмов, присутствующих в нормальной микрофлоре кишечника здоровых животных и/или птиц конкретного вида, которые в последующем и будут выступать в качестве реципиента данного пробиотика. Для выделения естественных комплексов бактерий проводят селективную деконтаминацию нативного биоматериала путем его разведения жидкой селективной для молочнокислых бактерий питательной средой, что позволяет удалить из биоматериала случайно попавшие в него чужеродные для данного вида животных и птиц микроорганизмы. Последующая обработка разведенного биоматериала сывороткой крови (или иммуноглобулиновыми препаратами) того же вида животных или птиц позволяет максимально полно удалить постороннюю микрофлору. После освобождения биоматериала от всех контаминирующих микроорганизмов его культивируют в анаэробных условиях с последующим пересевом полученной биомассы без выделения чистых культур в питательную среду, пригодную для накопления биомассы молочнокислых бактерий, и вновь культивируют в анаэробных условиях. The purpose of the invention is the production of a homoprobiotic bacterial preparation containing live lactic acid bacteria (lactic acid bacteria are a large heterogeneous group of gram-positive anaerobic and microaerophilic bacteria that accumulate lactic acid in the medium during carbohydrate utilization). This goal is achieved in that the probiotic is prepared on the basis of natural symbiotic complexes of autochthonous anaerobic microorganisms present in the normal intestinal microflora of healthy animals and / or birds of a particular species, which will subsequently act as a recipient of this probiotic. To isolate the natural complexes of bacteria, the native biomaterial is selectively decontaminated by diluting it with a liquid selective nutrient medium for lactic acid bacteria, which makes it possible to remove microorganisms alien to this species of animals and birds from the biomaterial. Subsequent processing of the diluted biomaterial with blood serum (or immunoglobulin preparations) of the same species of animals or birds allows the most complete removal of extraneous microflora. After releasing the biomaterial from all contaminating microorganisms, it is cultivated under anaerobic conditions, followed by reseeding the resulting biomass without isolation of pure cultures in a nutrient medium suitable for the accumulation of biomass of lactic acid bacteria, and again cultivated under anaerobic conditions.

Полученная таким образом биомасса может быть использована в жидком, лиофилизированном или замороженном виде в качестве гомопробиотика для коррекции микробиоценоза кишечника или конструирования микробной экологии молодняка животных и птиц при их массовом выращивании или получения SPS-гнотобионтов. Thus obtained biomass can be used in liquid, lyophilized or frozen form as a homoprobiotic to correct intestinal microbiocenosis or to construct the microbial ecology of young animals and birds during their mass cultivation or to obtain SPS gnitobionts.

Установлено, что слизистые желудочно-кишечного тракта начинают реагировать на вводимые орально микроорганизмы синтезом lgA только, если количество микроорганизмов составляет 10⁶ и более клеток на грамм содержимого кишки. Поэтому любые микроорганизмы, обнаруживаемые в пищеварительном тракте в количествах менее 10⁶ КОЕ, являются транзиторными и чужеродными. В связи этими данными для механического удаления возможной контаминации исходного биоматериала посторонними транзиторными микроорганизмами кишечное содержимое донора разводят селективной средой не менее, чем до 10^-6.It was found that the mucous membranes of the gastrointestinal tract begin to respond to orally administered microorganisms by lgA synthesis only if the number of microorganisms is 10 ⁶ or more cells per gram of intestinal contents. Therefore, any microorganisms found in the digestive tract in quantities of less than 10 ⁶ CFU are transient and foreign. In connection with these data, for the mechanical removal of possible contamination of the initial biomaterial by extraneous transient microorganisms, the intestinal contents of the donor are diluted with a selective medium of no less than 10 ^-6 .

Известно, что сывороточные иммуноглобулины различных классов способствуют инактивации и устранению чужеродных микроорганизмов. Это подтверждено тем фактом, что 99% бактерий - представителей индигенной анаэробной кишечной флоры не покрыты секреторными иммуноглобулинами, в то время как энтеробактерии, энтерококки, другие аэробные и анаэробные транзиторные микроорганизмы полностью покрыты lgA. Основываясь на этих данных, окончательное удаление посторонней микрофлоры из разведенного биоматериала, взятого от донора, осуществляют внесением в разведенный до 10^-6 биоматериал сыворотки крови (или комплексного иммуноглобулинового препарата) того вида животных или птиц, для которого предназначен изготавливаемый по заявляемому способу гомопробиотик.It is known that serum immunoglobulins of various classes contribute to the inactivation and elimination of foreign microorganisms. This is confirmed by the fact that 99% of bacteria - representatives of indigenous anaerobic intestinal flora are not covered with secretory immunoglobulins, while enterobacteria, enterococci, other aerobic and anaerobic transient microorganisms are completely covered with IgA. Based on these data, the final removal of extraneous microflora from the diluted biomaterial taken from the donor is carried out by introducing into the diluted up to 10 ^-6 biomaterial of blood serum (or complex immunoglobulin preparation) of the species of animals or birds for which the homoprobiotic manufactured by the present method is intended.

Пример 1. Подготовка исходного биоматериала, микробиологическая оценка его состава. Example 1. Preparation of the source biomaterial, microbiological evaluation of its composition.

Свежевзятые образцы фекалий живых здоровых взрослых кур из племенного хозяйства или содержимое слепой кишки забитых здоровых птиц помещают в свежередуцированный тиогликолевый физиологический раствор для транспортировки в бактериологическую лабораторию. В качестве биоматериала можно использовать лиофилизированные или криоконсервированные образцы. Freshly taken feces samples of live healthy adult chickens from the breeding farm or the contents of the cecum of slaughtered healthy birds are placed in a freshly reduced thioglycol physiological saline solution for transport to a bacteriological laboratory. Lyophilized or cryopreserved samples can be used as biomaterial.

Из доставленного биоматериала готовят серийные десятикратные разведения используемой для транспортировки средой, из которых затем производят высевы проб в объеме 0,05-0,1 мл капельным методом на селективные и дифференциально-диагностические среды плотные Эндо, Плоскирева, Сабуро, Рогозы, маннит-солевой, азидовый агары, среда для выделения клостридий и полужидкая БС-среда с пропионатом лития. Посевы культивируют в анаэробных условиях при 42^oC в течение 24-72 часов. Состав микрофлоры здоровых кур-бройлеров приведен в таблице 1.Serial tenfold dilutions of the medium used for transportation are prepared from the delivered biomaterial, from which the samples are then sown in the amount of 0.05-0.1 ml by the drop method on selective and differential diagnostic media, dense Endo, Ploskireva, Saburo, Rogozy, mannitol salt, azide agar, clostridia isolation medium and semi-liquid BS medium with lithium propionate. Crops are cultured under anaerobic conditions at 42 ^o C for 24-72 hours. The microflora composition of healthy broiler chickens is shown in table 1.

Как видно из таблицы, молочнокислые бактерии (энтерококки, лактобациллы и бифидобактерии) присутствуют в фекалиях здоровых кур-бройлеров в значительном количестве. Видовой состав лактобацилл характеризуется широким спектром видов (видовой состав лактобацилл определяли по спектру утилизации углеводов) - Lactobacillus acidophilus, L.alimentarius, L.fermentum, L.brevis, L.buchneri, L.plantarum, L.salivarius, L.lactis. As can be seen from the table, lactic acid bacteria (enterococci, lactobacilli and bifidobacteria) are present in feces of healthy broiler chickens in significant quantities. The species composition of lactobacilli is characterized by a wide range of species (the species composition of lactobacilli was determined by the spectrum of carbohydrate utilization) - Lactobacillus acidophilus, L.alimentarius, L.fermentum, L.brevis, L.buchneri, L.plantarum, L. salivarius, L. lactis.

Пример 2. Деконтаминация биоматериала от аллохтонной микрофлоры. Example 2. Decontamination of biomaterial from allochthonous microflora.

Деконтаминацию биоматериала от аллохтонной микрофлоры, присутствующей в образце в количестве менее 10⁶ КОЕ/г, осуществляют путем последовательного десятикратного разведения испытуемого образца. Готовят 2 параллельных ряда пробирок с последовательными десятикратными разведениями биоматериала любой жидкой питательной средой, пригодной для выделения и культивирования лактобацилл и бифидобактерий, например МРС или БС, являющимися в настоящее время оптимальными для выращивания лактобацилл и бифидобактерий.Decontamination of the biomaterial from allochthonous microflora present in the sample in an amount of less than 10 ⁶ CFU / g is carried out by successive ten-fold dilution of the test sample. Two parallel rows of test tubes are prepared with successive ten-fold dilutions of the biomaterial with any liquid nutrient medium suitable for isolation and cultivation of lactobacilli and bifidobacteria, for example, MRS or BS, which are currently optimal for growing lactobacilli and bifidobacteria.

Берут стандартную питательную среду для выделения бифидобактерий сухую (БС) производства Государственного научного центра прикладной микробиологии МЗ РФ (г. Оболенск Московской обл.) следующего состава в г/л (см. табл.2). They take a standard nutrient medium for isolation of dry bifidobacteria (BS) produced by the State Scientific Center for Applied Microbiology of the Ministry of Health of the Russian Federation (Obolensk, Moscow Region) with the following composition in g / l (see Table 2).

50.35 г сухой среды тщательно размешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения, стерилизуют автоклавированием при температуре 110^oC в течение 30 минут и охлаждают до температуры 50-45^oC.50.35 g of dry medium is thoroughly mixed in 1 l of distilled water, heated to boiling, sterilized by autoclaving at a temperature of 110 ^o C for 30 minutes and cooled to a temperature of 50-45 ^o C.

Первый ряд состоит из пробирок до разведения 10^-9 и предназначен для оценки общего количественного содержания лактобацилл и бифидобактерий в исходном биоматериале. Второй ряд предназначен для получения биомассы этих бактерий и состоит из пробирок с биоматериалом до разведения 10^-6. Для окончательной деконтаминации биоматериала от чужеродных микроорганизмов, присутствующих в биоматериале в сопоставимых с молочнокислыми бактериями количествах (более 10⁶ КОЕ/г), и получения симбиотических сообществ индигенных лактобацилл и бифидобактерий, свободных от схожих микроорганизмов иного происхождения, попавших в организм птицы-донора с водой и пищей, и гарантированного удаления аллохтонных, включая патогенные, бактерий, осуществляют 2-й этап деконтаминации.The first row consists of tubes prior to dilution 10 ^-9 and is designed to assess the total quantitative content of lactobacilli and bifidobacteria in the original biomaterial. The second row is designed to obtain biomass of these bacteria and consists of tubes with biomaterial before breeding 10 ^-6 . For the final decontamination of biomaterial from foreign microorganisms present in the biomaterial in amounts comparable to lactic acid bacteria (more than 10 ⁶ CFU / g), and for the production of symbiotic communities of indigenous lactobacilli and bifidobacteria free from similar microorganisms of other origin that have been ingested by donor birds and food, and guaranteed removal of allochthonous, including pathogenic, bacteria, carry out the 2nd stage of decontamination.

В пробирку из последнего десятикратного разведения биоматериала второго ряда, приготовленного с использованием жидкой питательной среды МРС или БС, добавляют комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП), приготовленный из крови кур по способу, описанному в патенте РФ N 2050858 10%, в количестве 5-20% от объема исследуемого образца. КИП был приготовлен из крови кур того же птицеводческого хозяйства, в котором проводили настоящее исследование, и содержал в значительных количествах иммуноглобулины всех основных классов (lgG 40-50%, lgM 25-30%, lgA 25%). КИП характеризуется выраженной специфической активностью в отношении возбудителей основных инфекционных заболеваний кур, в т.ч. сальмонелл и энтеропатогенных эшерихий, ротавирусов, а также других потенциально патогенных микроорганизмов. Содержимое пробирки тщательно перемешивают встряхиванием, герметично закрывают пробкой и помещают в термостат при 42^oС на 48 часов. Культивирование ведут в анаэробных условиях.In a test tube from the last ten-fold dilution of second-row biomaterial prepared using MRS or BS nutrient medium, a complex immunoglobulin preparation (CIP) prepared from chicken blood is added according to the method described in RF patent N 2050858 10%, in an amount of 5-20% from the volume of the test sample. Instrumentation was prepared from the blood of chickens of the same poultry farm in which the present study was conducted and contained significant quantities of immunoglobulins of all main classes (IgG 40-50%, IgM 25-30%, IgA 25%). Instrumentation is characterized by pronounced specific activity against pathogens of the main infectious diseases of chickens, including salmonella and enteropathogenic Escherichia, rotaviruses, as well as other potentially pathogenic microorganisms. The contents of the tube are thoroughly mixed by shaking, sealed with a stopper and placed in a thermostat at 42 ^o C for 48 hours. Cultivation is carried out under anaerobic conditions.

Пример 3. Приготовление гомопробиотического препарата. Example 3. Preparation of a homoprobiotic preparation.

После культивирования делают контрольные посевы биоматериала для определения количества микроорганизмов (в соответствии с примером 1) и наличия посторонней микрофлоры. В случае отсутствия роста на средах Эндо, Плоскирева, Сабуро, маннит-солевом агаре делают пересев материала (1:10) в свежую жидкую питательную среду для культивирования лакто- и бифидобактерий (среды МРС или БС) и культивируют в анаэробных условиях при 42^oC в течение 48 часов. Полученная биомасса представляет собой симбиотический комплекс лактобацилл и бифидобактерий индигенного происхождения. Для длительного сохранения полученной биомассы ее подвергают лиофилизации или замораживанию и используют в качестве гомопробиотика для коррекции, или конструирования микробной экологии новорожденных цыплят, или для профилактики и лечения инфекционных заболеваний взрослых кур.After cultivation, make control crops of biomaterial to determine the number of microorganisms (in accordance with example 1) and the presence of extraneous microflora. In the absence of growth on Endo, Ploskirev, Saburo, mannitol salt agar media, the material is sowed (1:10) into a fresh liquid nutrient medium for cultivation of lacto- and bifidobacteria (MPC or BS medium) and cultured under anaerobic conditions at 42 ^o C within 48 hours. The resulting biomass is a symbiotic complex of lactobacilli and bifidobacteria of indigenous origin. To preserve the resulting biomass for a long time, it is lyophilized or frozen and used as a homoprobiotic to correct or construct the microbial ecology of newborn chickens, or to prevent and treat infectious diseases of adult chickens.

Таким же способом может быть приготовлен пробиотический препарат для других видов животных и птиц на основе культивирования в анаэробных условиях на селективных питательных средах детерминантных видов микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры этого вида животных и птиц с деконтаминацией иммуноглобулиновым препаратом, приготовленным из сыворотки крови того же вида животных и птиц. In the same way, a probiotic preparation for other animal and bird species can be prepared on the basis of cultivation under anaerobic conditions on selective nutrient media of determinant species of microorganisms - representatives of the normal microflora of this animal species and birds with decontamination with an immunoglobulin preparation prepared from blood serum of the same animal species and birds.

При необходимости последняя пробирка из второго ряда может быть заменена на две пробирки: 1-я со средой Рогозы для выделения симбиотических ассоциаций только лактобацилл, 2-я со средой БС с азидом и пропионатом лития для выделения только симбиотических ассоциаций бифидобактерий. Все последующие операции осуществляют аналогично описанному выше. Для приготовления комплексного пробиотического препарата полученные биомассы ассоциаций бифидобактерий и лактобацилл смешивают в отношении 1:10 и используют в качестве гомопробиотика. If necessary, the last tube from the second row can be replaced by two tubes: the first one with Rogosa medium for isolation of symbiotic associations of only lactobacilli, the second one with BS medium with azide and lithium propionate for isolation of only symbiotic associations of bifidobacteria. All subsequent operations are carried out as described above. To prepare a complex probiotic preparation, the obtained biomass of the associations of bifidobacteria and lactobacilli are mixed in a ratio of 1:10 and used as a homoprobiotic.

Пример 4. Контроль пробиотического препарата. Example 4. Control of a probiotic preparation.

Контроль полученного пробиотика осуществляют общепринятым методом посева на питательные среды Эндо и ТГС для определения посторонней микрофлоры - на этих средах рост в аэробных условиях отсутствует. The obtained probiotic is monitored by the conventional method of seeding on Endo and TGS nutrient media to determine extraneous microflora - there is no growth under aerobic conditions on these media.

Для оценки количественного содержания лактобацилл и бифидобактерий в готовом гомопробиотике делают разведения на полужидких средах Рогозы и БС с пропионатом лития. При этом содержание бифидобактерий и лактобацилл в пробиотике не менее 10⁸ КОЕ/мл. Все определения ведут общепринятыми методами.To assess the quantitative content of lactobacilli and bifidobacteria in the finished homoprobiotic, dilutions are made on semi-liquid media of Rogosa and BS with lithium propionate. The content of bifidobacteria and lactobacilli in the probiotic is at least 10 ⁸ CFU / ml. All definitions are generally accepted methods.

Изучение видовой принадлежности лактобацилл и бифидобактерий, содержащихся в препарате, проводят на основе изучения культуральных и ферментативных характеристик изолированных из комплекса гомопробиотика отдельных штаммов лакто- и бифидобактерий. Выделенные штаммы лактобацилл идентифицтированы как L.acidophilus, L.fermentum, L.lactis, L.plantarum Lactobacillus spp.; бифидобактерии - B.bifidum, B.longum, Bifidobacterium spp. The study of the species of lactobacilli and bifidobacteria contained in the preparation is carried out on the basis of studying the cultural and enzymatic characteristics of individual strains of lactobacilli and bifidobacteria isolated from the homoprobiotic complex. The isolated strains of lactobacilli were identified as L. acidophilus, L.fermentum, L. lactis, L. plantarum Lactobacillus spp .; bifidobacteria - B. bifidum, B. longum, Bifidobacterium spp.

Пример 5. Оценка эффективности оральной инокуляции пробиотического препарата. Example 5. Evaluation of the effectiveness of oral inoculation of a probiotic preparation.

Пробиотик изготавливали по вышеописанному в примерах 2 и 3 способу. The probiotic was made according to the method described above in examples 2 and 3.

Эксперимент был проведен на базе подмосковного экспериментального хозяйства ВНИТИП. The experiment was conducted on the basis of the VNITIP experimental facility near Moscow.

13107 однодневных цыплят после их посадки в птичник с напольным содержанием были орально инокулированы с питьевой водой гомопробиотическим препаратом. Первую контрольную группу составили цыплята в количестве 21432 голов, находящиеся в аналогичных условиях в других птичниках и получающие антибиотик левомицетин по принятой в хозяйстве схеме. Вторую контрольную группу составили 18747 цыплят, получавших с питьевой водой сухой бифидумбактерин, приготовленный на основе производственных штаммов бифидобактерий человеческого происхождения. 13107 one-day-old chickens, after they were placed in an outdoor house, were orally inoculated with drinking water using a homoprobiotic preparation. The first control group consisted of chickens in the amount of 21432 heads, which are in similar conditions in other houses and receive the antibiotic chloramphenicol according to the scheme adopted on the farm. The second control group consisted of 18,747 chickens who received dry bifidumbacterin, prepared on the basis of industrial strains of bifidobacteria of human origin, with drinking water.

Контроль за гибелью цыплят опытной и контрольных групп вели ежедневно в течение 30 дней. Control over the death of chickens of the experimental and control groups was carried out daily for 30 days.

Результаты испытаний приведены в таблице 3. The test results are shown in table 3.

Анализ представленных в таблице данных свидетельствует, что оральное применение приготовленного по данному способу гомопробиотического препарата в условиях промышленного птицеводства снижает гибель цыплят бройлеров более эффективно по сравнению с общепринятыми приемами (применение антибиотиков и пробиотиков на основе монокультур бифидобактерий человеческого происхождения). Патологоанатомическое вскрытие и бактериологическое исследование погибших цыплят опытной группы в подавляющем большинстве случаев не выявили каких-либо признаков их гибели от известных инфекционных агентов. An analysis of the data presented in the table indicates that the oral administration of a homoprobiotic preparation prepared according to this method in industrial poultry farming reduces the death of broiler chickens more efficiently than conventional methods (the use of antibiotics and probiotics based on monocultures of bifidobacteria of human origin). Pathological autopsy and bacteriological examination of dead chickens of the experimental group in the vast majority of cases did not reveal any signs of their death from known infectious agents.

Таким образом, предложен способ получения гомопробиотика на основе индигеннных лактобацилл и бифидобактерий, присутствующих в кишечнике конкретного вида животных и птиц. Thus, a method for producing a homoprobiotic based on indigenous lactobacilli and bifidobacteria present in the intestines of a particular species of animals and birds is proposed.

Список литературы. List of references.

1. GIeeson T.M., Starvic S, Blanchfield B. Protection of chicks against Salmonella infection with a mixture of pure cultures of intestinal bacteria. Avian Dis, 1989 Oct-Dec, 33(4), P. 636-42. 1. GIeeson T.M., Starvic S, Blanchfield B. Protection of chicks against Salmonella infection with a mixture of pure cultures of intestinal bacteria. Avian Dis, 1989 Oct-Dec, 33 (4), P. 636-42.

2. Wierup M., Wold-Troell M, Nurmi E. et al. Epidemiological evaluation of the salmonella-controling effect of a nationwide use of a comprtitive exclusion culture in poultry. Acta Vet. Scand. Suppi., 1988, 84, 309-311. 2. Wierup M., Wold-Troell M, Nurmi E. et al. Epidemiological evaluation of the salmonella-controling effect of a nationwide use of a comprtitive exclusion culture in poultry. Acta Vet. Scand. Suppi., 1988, 84, 309-311.

3. Weinack O.M Snoeyenbos GH, Soerjadi-Liem AS et al. Therapeutic trials with native intestinal microflora for salmonella typhimurium infections in chickens. Avian. Dis., 1985, 29 (4), 1230-1234. 3. Weinack O. M Snoeyenbos GH, Soerjadi-Liem AS et al. Therapeutic trials with native intestinal microflora for salmonella typhimurium infections in chickens. Avian Dis., 1985, 29 (4), 1230-1234.

4. Патент США N 4689226. Приоритет 25.08.87 г. НКИ 424/93. МПК А 01 N 63/00. 4. US patent N 4689226. Priority 08.25.87, NKI 424/93. IPC A 01 N 63/00.

Claims (1)

Способ получения гомопробиотического бактерийного препарата, содержащего живые молочнокислые бактерии, путем разведения нативного биоматериала донора с последующим культивированием в анаэробных условиях на селективных питательных средах и накопления их биомассы, отличающийся тем, что разведение нативного биоматериала донора проводят питательной средой, пригодной для селекции молочнокислых бактерий, с последующей обработкой разведенного биоматериала сывороткой крови или иммуноглобулиновым препаратом, приготовленным из крови животных или птиц того же вида, что и донор, а наращивание биомассы полученного комплекса молочнокислых бактерий проводят без выделения чистых культур. A method for producing a homoprobiotic bacterial preparation containing live lactic acid bacteria by diluting the native donor biomaterial with subsequent cultivation under anaerobic conditions on selective nutrient media and accumulating their biomass, characterized in that the native donor biomaterial is diluted with a nutrient medium suitable for selection of lactic acid bacteria, subsequent processing of the diluted biomaterial with blood serum or an immunoglobulin preparation prepared from human blood otnyh or birds of the same species as the donor, and the capacity of biomass resulting complex lactic acid bacteria is carried out without isolation of pure cultures.

Images