RU2141943C1 - N-acetyl-l-aspartic acid disodium salt showing antidepressant and nootropic activity - Google Patents

Abstract

FIELD: organic chemistry, amino acid derivatives. SUBSTANCE: invention describes N-acetyl-L-aspartic acid disodium salt of the formula (I)

Description

Изобретение относится к области химии нейроактивных аминокислот и их производных, в частности, к динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты формулы

которая обладает выраженной антидепрессантной и ноотропной активностью, низкой токсичностью и может найти применение в медицине в качестве лекарственного вещества в лекарственных средствах для коррекции памяти при различных нервно-психических заболеваниях, например, при болезнях Альцгеймера и Хантингтона, дегенеративных поражениях головного мозга в старческом возрасте, а также в комплексной терапии алкоголизма.The invention relates to the field of chemistry of neuroactive amino acids and their derivatives, in particular, to the disodium salt of N-acetyl-L-aspartic acid of the formula

which has a pronounced antidepressant and nootropic activity, low toxicity and can be used in medicine as a medicinal substance in drugs for memory correction in various neuropsychic diseases, for example, Alzheimer's and Huntington’s diseases, degenerative brain lesions in old age, and also in the complex therapy of alcoholism.

Известно, что N-ацетил-L-аспарагиновая кислота (NAA) является естественным продуктом метаболизма нервной ткани, в значительных количествах содержится в центральной нервной системе и, предположительно, участвует в биосинтезе ацетилхолина и миелина в нейронах, а также способствует выделению возбуждающих аминокислот-нейромедиаторов [Trackenmiller M.Е., Namboodri N.А. , Brownstein N. J., Neclo J.H. N-Acetylation of L-aspartate in the nervous system: differential distribution of a specific enzyme // J. Neurochem. - 1985. - Vol. 45. - P. 1658 - 1662]. Содержание NAA в норме составляет во фронтальном лобном белом веществе головного мозга 16,6±3,3 мкмоль/г (или 2,9±0,6 г/кг сырого вещества мозга), в таламусе 17,2±1,3 мкмоль/г (3,0±0,2 г/кг) [Barker P.B., Soher B.J., Blackband S.J., Chatham J.C., Mathews V.P., Bryan R. N. Quantitation of proton NMR spectra of the human brain using tissue water as an internal concentration reference // NMR Biomed. - 1993. - Vol. 6. -P. 89 - 94]. It is known that N-acetyl-L-aspartic acid (NAA) is a natural product of the metabolism of nervous tissue, is found in significant quantities in the central nervous system and, presumably, is involved in the biosynthesis of acetylcholine and myelin in neurons, and also contributes to the release of excitatory amino acids-neurotransmitters [Trackenmiller M.E., Namboodri N.A. , Brownstein N. J., Neclo J.H. N-Acetylation of L-aspartate in the nervous system: differential distribution of a specific enzyme // J. Neurochem. - 1985. - Vol. 45. - P. 1658 - 1662]. Normally, the content of NAA in the frontal frontal frontal white matter of the brain is 16.6 ± 3.3 μmol / g (or 2.9 ± 0.6 g / kg of crude brain matter), in the thalamus 17.2 ± 1.3 μmol / g (3.0 ± 0.2 g / kg) [Barker PB, Soher BJ, Blackband SJ, Chatham JC, Mathews VP, Bryan RN Quantitation of proton NMR spectra of the human brain using tissue water as an internal concentration reference // NMR Biomed. - 1993. - Vol. 6. -P. 89 - 94].

Многие патологические состояния ЦНС сопровождаются существенным снижением содержания NAA. Например, при интракраниальных опухолях мозга уровень NAA в лобном белом веществе понижается до 11,4±1,4 мкмоль/г (2,0±0,2 г/кг), то есть на 31% [Manton D.J., Lowry M., Blackband S.J., Horsman A. Determination of proton matabolite concentrations and relaxation parametres in normal human brain and intracranial tumours NMR Biomed. - 1995. - Vol. 8. - P. 104-112] . При болезни Альцгеймера отмечено уменьшение содержания NAA в гиппокампе в среднем на 38%, а в миндалевидном теле - на 28% [Jaarsma D., Veenma D.L., Korf J. N-acetylaspartate and N-acetylaspartylglutanate levels in Alzheimer's diseases post-mortem brain tissue // J. Neurol. Sci. - 1994. - Vol. 127. -P. 230 - 233]. Еще более значительное понижение концентрации NAA отмечено при болезни Хантингтона - на 55% в коре головного мозга и на 25% в церебральном кортексе [Dunlop D.S., Mc Hale D.M., Lajtha A. Decreased brain N-acetylaspartate in Huntington's disease // Brain Res. - 1992. - Vol. 580. - P. 44 - 48]. Обнаружено, что содержание NAA существенно понижается и при черепно-мозговой травме [Промыслов М.Ш. Обмен веществ в мозге и его регуляция при черепно-мозговой травме. M.: Медицина, 1984. -С. 50- 66]. Many pathological conditions of the central nervous system are accompanied by a significant decrease in the content of NAA. For example, in intracranial brain tumors, the level of NAA in the frontal white matter decreases to 11.4 ± 1.4 μmol / g (2.0 ± 0.2 g / kg), that is, by 31% [Manton DJ, Lowry M., Blackband SJ, Horsman A. Determination of proton matabolite concentration and relaxation parametres in normal human brain and intracranial tumors NMR Biomed. - 1995. - Vol. 8. - P. 104-112]. In Alzheimer's disease, a decrease in the NAA content in the hippocampus by an average of 38%, and in the amygdala, by 28% [Jaarsma D., Veenma DL, Korf J. N-acetylaspartate and N-acetylaspartylglutanate levels in Alzheimer's diseases post-mortem brain tissue // J. Neurol. Sci. 1994. Vol. 127. -P. 230 - 233]. An even more significant decrease in the concentration of NAA was observed in Huntington's disease - by 55% in the cerebral cortex and by 25% in the cerebral cortex [Dunlop D.S., Mc Hale D.M., Lajtha A. Decreased brain N-acetylaspartate in Huntington's disease // Brain Res. - 1992. - Vol. 580. - P. 44 - 48]. It was found that the content of NAA significantly decreases during traumatic brain injury [M.Sh. Metabolism in the brain and its regulation during traumatic brain injury. M .: Medicine, 1984.-S. 50-66].

Нами впервые было показано, что рацемическая N-ацетил-DL-аспарагиновая кислота в виде динатриевой соли при внутрибрюшинном введении белым мышам и крысам в дозах 1-50 мг/кг оказывает выраженное антидепрессантное и ноотропное действие, а при повышении дозы до 100 мг/кг проявляет психостимулирующие свойства [Патент РФ N 2051672, опубл. 10.01.96, Бюл. N 1. МКИ⁶ A 61 K 31/195. Ковалев Г.В., Рахимов А.И., Сажин В.А., Озеров А.А., Яницкая А.В., Петров В.И. Средство, обладающее антидепрессантной и ноотропной активностью] . Однако N-ацетил-DL-аспарагиновая кислота содержит в своем составе 50% балластного компонента, имеющего D-конфигурацию, который не проявляет психотропной активности и приводит к необходимости увеличения дозы используемого препарата.We have shown for the first time that racemic N-acetyl-DL-aspartic acid in the form of disodium salt when administered intraperitoneally to white mice and rats at doses of 1-50 mg / kg has a pronounced antidepressant and nootropic effect, and when the dose is increased to 100 mg / kg exhibits psychostimulating properties [RF Patent N 2051672, publ. 01/10/96, Bull. N 1. MKI ⁶ A 61 K 31/195. Kovalev G.V., Rakhimov A.I., Sazhin V.A., Ozerov A.A., Yanitskaya A.V., Petrov V.I. An agent with antidepressant and nootropic activity]. However, N-acetyl-DL-aspartic acid contains 50% of the ballast component having the D configuration, which does not exhibit psychotropic activity and leads to the need to increase the dose of the drug used.

Целью настоящего изобретения является разработка нового малотоксичного психотропного лекарственного средства, обладающего повышенной антидепрессантной и ноотропной активностью. The aim of the present invention is to develop a new low-toxic psychotropic drug with increased antidepressant and nootropic activity.

Сущность изобретения заключается в использовании динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты в качестве психотропного средства, обладающего антидепрессантной и ноотропной (антиамнестической) активностью. The essence of the invention lies in the use of the disodium salt of N-acetyl-L-aspartic acid as a psychotropic agent having antidepressant and nootropic (antiamnestic) activity.

Существенным отличием использования оптически чистой динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты от предложенного ранее рацемического аналога, имеющего DL-конфигурацию, является отсутствие в составе лекарственного средства N-ацетил-D- аспарагиновой кислоты, не являющейся носителем психотропных свойств и не оказывающей статистически значимого ноотропного или антидепрессантного действия. Увеличение в 2 раза содержания активного компонента, имеющего L-конфигурацию, в составе лекарственного средства позволяет существенно повысить уровень его психотропной активности и соответственно понизить дозу его введения, необходимую для достижения желаемого терапевтического эффекта. Кроме того, использование оптически чистой N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты понижает вероятность возникновения побочных эффектов при клиническом использовании предлагаемого лекарственного средства, поскольку известно, что производные D-аспарагиновой кислоты, например, N-метил-D-аспартат (NMDA), оказывают отрицательное влияние на процессы памяти и обучения [Mondadori С., Weiskrantz L., Buerki М. NMDA receptor antagonists can anhance or impaire learning performance in animal // Exp. Brain Res. - 1989. - Vol. 75. P. 449 - 456]. A significant difference between the use of the optically pure disodium salt of N-acetyl-L-aspartic acid from the previously proposed racemic analogue with a DL configuration is the absence of N-acetyl-D-aspartic acid in the drug, which is not a carrier of psychotropic properties and does not statistically significant nootropic or antidepressant action. A 2-fold increase in the content of the active component having the L configuration in the composition of the drug can significantly increase the level of its psychotropic activity and, accordingly, lower the dose of its administration necessary to achieve the desired therapeutic effect. In addition, the use of optically pure N-acetyl-L-aspartic acid reduces the likelihood of side effects in the clinical use of the proposed drug, since it is known that derivatives of D-aspartic acid, for example, N-methyl-D-aspartate (NMDA), have negative impact on the processes of memory and learning [Mondadori S., Weiskrantz L., Buerki M. NMDA receptor antagonists can anhance or impaire learning performance in animal // Exp. Brain Res. - 1989. - Vol. 75. P. 449 - 456].

Синтез динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты был осуществлен путем ацетилирования незамещенной L-аспарагиновой кислоты в водной среде уксусным ангидридом с последующим выделением и нейтрализацией едким натром или карбонатом натрия. The disodium salt of N-acetyl-L-aspartic acid was synthesized by acetylation of unsubstituted L-aspartic acid in aqueous medium with acetic anhydride, followed by isolation and neutralization with sodium hydroxide or sodium carbonate.

Пример 1. Динатриевая соль N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты (лабораторный шифр Na₂-L-AcAsp). Суспензию 50,0 г (0,38 моль) L-аспарагиновой кислоты в 250 мл дистиллированной воды нагревают на кипящей водяной бане до температуры 95-97^oC (растворение аминокислоты неполное) и при интенсивном перемешивании добавляют 100,0 мл (1,06 моль) свежеперегнанного уксусного ангидрида с такой скоростью, чтобы поддерживать слабое кипение реакционной массы (15 - 20 мин). После полного растворения аминокислоты реакционную массу перемешивают в течение 2 ч при температуре 70 - 75^oC, отгоняют в вакууме смесь воды и уксусной кислоты, остаток растворителя удаляют в течение 1 ч при температуре 95 - 100^oC в вакууме при остаточном давлении 2 - 4 мм рт. ст. Полученную N-ацетил-L-аспарагиновую кислоту растворяют при нагревании в 200 - 250 мл дистиллированной воды, добавляют порциями 40,0 г (0,38 моль) безводного карбоната натрия и доводят pH раствора до 8,0 - 8,5 путем добавления 10%-ного раствора едкого натра. Добавляют 5,0 г активированного угля, перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч, фильтруют, упаривают в вакууме, остаток растворителя удаляют в течение 1 ч при температуре 95 - 100^oC в вакууме при остаточном давлении 2 - 4 мм рт. ст. и получают 85 - 86 г (95,5 - 96,5%) моногидрата динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты в виде гигроскопичного белого или светло-желтого хрупкого стекловидного вещества, T_разл. > 200^oC, [α] $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{20}}{\text{D}}$ = - 6,2^o (в 2 н. растворе HCl).Example 1. Disodium salt of N-acetyl-L-aspartic acid (laboratory code Na ₂ -L-AcAsp). A suspension of 50.0 g (0.38 mol) of L-aspartic acid in 250 ml of distilled water is heated in a boiling water bath to a temperature of 95-97 ^o C (partial dissolution of the amino acid) and 100.0 ml (1.06 are added with vigorous stirring) mol) of freshly distilled acetic anhydride at such a rate as to maintain a weak boiling of the reaction mixture (15 - 20 min). After complete dissolution of the amino acid, the reaction mass is stirred for 2 hours at a temperature of 70 - 75 ^o C, a mixture of water and acetic acid is distilled off in vacuo, the solvent residue is removed for 1 h at a temperature of 95 - 100 ^o C in vacuum at a residual pressure of 2-4 mmHg Art. The resulting N-acetyl-L-aspartic acid is dissolved by heating in 200 - 250 ml of distilled water, 40.0 g (0.38 mol) of anhydrous sodium carbonate are added portionwise and the pH of the solution is adjusted to 8.0 - 8.5 by adding 10 % sodium hydroxide solution. 5.0 g of activated carbon are added, stirred at room temperature for 4 hours, filtered, evaporated in vacuo, the solvent residue is removed for 1 hour at a temperature of 95-100 ^° C in vacuum at a residual pressure of 2-4 mmHg. Art. and 85 to 86 g (95.5 to 96.5%) of N-acetyl-L-aspartic acid disodium monohydrate are obtained in the form of a hygroscopic white or light yellow brittle glassy substance, T _decomp. > 200 ^o C, [α] $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{20}}{\text{D}}$ = - 6.2 ^o (in 2 N. HCl solution).

Пример 2. Динатриевые соли N-ацетил-D- и N-ацетил-DL-аспарагиновой кислоты (лабораторные шифры Na₂-D-AcAsp и Na₂-DL-AcAsp), используемые в качестве препаратов сравнения, получают аналогично, исходя из 5,0 г (0,038 моль) соответствующей аминокислоты.Example 2. Disodium salts of N-acetyl-D- and N-acetyl-DL-aspartic acid (laboratory ciphers Na ₂ -D-AcAsp and Na ₂ -DL-AcAsp) used as reference preparations, are obtained similarly, starting from 5 , 0 g (0.038 mol) of the corresponding amino acid.

Изучение психотропной активности и токсических свойств динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты (Na₂-L-AcAsp) и препаратов сравнения проводили на белых беспородных крысах массой 150 - 200 г и мышах-самцах массой 18 - 22 г, полученных из питомника РАМН "Белый мох".The study of the psychotropic activity and toxic properties of the disodium salt of N-acetyl-L-aspartic acid (Na ₂ -L-AcAsp) and comparison preparations was carried out on white outbred rats weighing 150 - 200 g and male mice weighing 18 - 22 g, obtained from the nursery RAMS "White Moss".

Оценка влияния соединений на спонтанную двигательную (СДА) и исследовательскую (ИА) активность животных проводилась на методике "открытого поля" [Хаунина Р. А. , Лапин И.П. Фенибут - новый транквилизатор // Хим.- фарм. журн. - 1976. - Вып. 12. - С. 125 - 127]. Транквилизирующие (антифобические) свойства веществ изучали на модели поднятого "плюс"-лабиринта [Pellow S., Chopin P. , File S.E. Validation of open:closed arm entries in an elevated plusmaze as a mezure of anxiety in the rat // J. Neurosci. Res. Method. - 1985. - Vol. 14. - p. 149 - 167]. Определение антидепрессантной активности соединений проводили по тесту "форсированного" плавания [Porsolt R.D., Anton G., Blavet N. Behavioural despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments // Eur. J. Pharm. - 1978. - Vol. 47. -P. 379 - 391]. Изучение влияния веществ на формирование энграмм и когнитивную деятельность выполнено на моделях условной реакции пассивного избегания (УРПИ) [Bures J., Buresova О. Nootropic drugs // 21 Ann Czecoslovak. Psychopharmacolog. Meet. - 1979. -P. 7- 12] и условной реакции активного избегания (УРАИ) [Крауклис А. А. Саморегуляция высшей нервной деятельности. - Рига, Медицина, 1964. - 326 с.], оценивались также анальгетические и противосудорожные свойства веществ. Углубленное изучение антидепрессантной активности Na₂-L-AcAsp проводили на модели конкурентного избегания аверсивного раздражителя [Кампов-Полевой А. Б. Изучение особенностей формирования алкогольной мотивации у крыс // Фармакология экспериментального алкоголизма. Под. ред. Бурова Ю.В. - М., Медицина, 1982. - С. 130 - 135] в собственной модификации [Петров В.И., Григорьев И.А., Горбунов С.Г. Методика оценки зоосоциального поведения крыс в психофармакологии // Журн. эксп. клинич. фармакол. - 1996. -Т. 59.- Вып. 4. -С. 65 - 70].Evaluation of the effect of compounds on spontaneous motor (SDA) and research (IA) activity of animals was carried out on the method of "open field" [Haunina R. A., Lapin I.P. Phenibut - a new tranquilizer // Chem. - Pharm. journal - 1976. - Vol. 12. - S. 125 - 127]. The tranquilizing (antiphobic) properties of substances were studied on the model of the raised “plus” maze [Pellow S., Chopin P., File SE Validation of open: closed arm entries in an elevated plusmaze as a mezure of anxiety in the rat // J. Neurosci . Res. Method - 1985. - Vol. 14. - p. 149 - 167]. Determination of the antidepressant activity of the compounds was carried out according to the “forced” swimming test [Porsolt RD, Anton G., Blavet N. Behavioural despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments // Eur. J. Pharm. - 1978. - Vol. 47. -P. 379 - 391]. The study of the influence of substances on the formation of engrams and cognitive activity was carried out on models of the conditioned reaction of passive avoidance (passive avoidance reaction) [Bures J., Buresova O. Nootropic drugs // 21 Ann Czecoslovak. Psychopharmacolog. Meet. - 1979. -P. 7-12] and the conditioned reaction of active avoidance (URAI) [A. Krauklis. Self-regulation of higher nervous activity. - Riga, Medicine, 1964. - 326 p.], The analgesic and anticonvulsant properties of the substances were also evaluated. An in-depth study of the antidepressant activity of Na ₂ -L-AcAsp was carried out on the model of competitive avoidance of an aversive stimulus [Kampov-Polevoy A. B. Study of the formation of alcohol motivation in rats // Pharmacology of experimental alcoholism. Under. ed. Burova Yu.V. - M., Medicine, 1982. - P. 130 - 135] in its own modification [Petrov V.I., Grigoryev I.A., Gorbunov S.G. Methodology for assessing the zoosocial behavior of rats in psychopharmacology // Zh. exp the clinic. pharmacol. - 1996. -T. 59.- Iss. 4. -C. 65 - 70].

В качестве препаратов сравнения при оценке психотропной активности веществ использовали пирацетам (Polfa) в дозе 400 мг/кг и имипрамин в дозе 10 мг/кг. Все препараты и исследуемые вещества вводились внутрибрюшинно за 1 ч до проведения экспериментов. В отдельной серии экспериментов исследовали нейротропную активность Na₂-L-AcAsp в условиях in vivo. Влияние Na₂-L-AcAsp на функциональную активность катехоламинергических систем мозга изучали на моделях фенаминовой стереотипии и апоморфиновой гипотермии [Самойлов М.О. Базисные молекулярно-клеточные механизмы адаптивных реакций мозга // Физиол. журн. - 1995. -Т. 81.- Вып. 8.-С. 3 - 11]. Оценка холинергических свойств Na₂-L-AcAsp проводилась на модели ареколин-индуцированного тремора, серотонин-позитивная активность соединения оценивалась по его влиянию на динамику развития и выраженность "кивательного" синдрома у мышей, вызванного введением 5-окситриптофана (200 мг/кг) [Жарковский А.М., Аликмейтис Л.Х., Нехилаке Л. Место фенибута среди психотропных препаратов // Механизм действия и клиника производных гамма-аминомасляной кислоты: Труды по медицине Тартусского гос. ун-та. - 1988. -Вып. 687. - С. 102 - 103]. Исследовали также противосудорожное действие Na₂-L-AcAsp на модели судорог, вызванных введением пикротоксина (3 мг/кг) и влияние соединения на общеугнетающий эффект гексенала [Раевский К. С. Фармакология нейролептиков. М., Медицина, 1976. -271 с.].Piracetam (Polfa) at a dose of 400 mg / kg and imipramine at a dose of 10 mg / kg were used as comparison drugs in assessing the psychotropic activity of substances. All drugs and test substances were administered intraperitoneally 1 hour before the experiments. In a separate series of experiments, the neurotropic activity of Na ₂ -L-AcAsp was studied in vivo. The effect of Na ₂ -L-AcAsp on the functional activity of catecholaminergic systems of the brain was studied on the models of phenamine stereotype and apomorphine hypothermia [Samoilov M.O. Basic molecular-cellular mechanisms of adaptive brain reactions // Fiziol. journal - 1995. -T. 81.- Iss. 8.-S. 3 - 11]. Evaluation of the cholinergic properties of Na ₂ -L-AcAsp was carried out on a model of arecoline-induced tremor, the serotonin-positive activity of the compound was evaluated by its effect on the dynamics of development and severity of the “nodding” syndrome in mice induced by the administration of 5-hydroxytryptophan (200 mg / kg) [ Zharkovsky AM, Alikmeitis L.Kh., Nekhilake L. The place of phenibut among psychotropic drugs // Mechanism of action and clinic of derivatives of gamma-aminobutyric acid: Proceedings in medicine of the Tartu state. un-that. - 1988. -Vyp. 687. - S. 102 - 103]. The anticonvulsant effect of Na ₂ -L-AcAsp was also investigated on the model of seizures induced by picrotoxin (3 mg / kg) and the effect of the compound on the general suppressing effect of hexenal [K. Raevsky. Pharmacology of antipsychotics. M., Medicine, 1976. -271 S.].

Определение острой токсичности (ЛД₅₀) Na₂-L-AcAsp проводили на крысах при подкожном, внутримышечном, внутривенном и пероральном введении по методу Литчфилда и Вилкоксона [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л., Наука, 1963. - 152 с.]. Изучение кумулирующих свойств Na₂-L-AcAsp проводили по методу Когана и Станкевича [Коган Ю.С. Общая токсикология пестицидов. - Киев, Здоровье, 1981. - 280 с.], биохимические показатели крови определяли на основании рекомендаций [Саноцкий В.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия). - М., Медицина, 1970. - 211 с.]. Влияние Na₂-L-AcAsp на репродуктивную функцию животных оценивали на основании комплексного подхода, включающего определение функциональной активности зрелых сперматозоидов, оценку морфоструктуры гонад, способности самцов к полноценному оплодотворению, анализ плодного материала на возможное наличие тератогенного эффекта, характеристику полового поведения животных [Методические указания по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию // Сост. Дыбан А.П., Пучков В.Ф., Торчинский А.М. и др. - М. , 1986. - 24 с.]. Мутагенные свойства Na₂-L-AcAsp изучали в тесте Эймса в модификации с преинкубацией на штаммах бактерий сальмонелла тифимуриум [Maron D. M., Ames B.N. Revised method for the Salmonella mutagenicity test // Mutat. Res. -1987. - Vol. 113. -P. 173 - 213], по оценке цитогенетической активности на основе учета аберрации хромосом в клетках костного мозга мышей [Методические указания по изучению мутагенной активности химических веществ при обосновании их ПДК в воде // Сост. Журков B.C., Красовский Г. Н., Жолдакова З.И. и др. - М., 1986. - 41 с.], а также по наличию и выраженности доминантных летальных мутаций у плодовых мушек линии Drosophila melanogaster.The determination of acute toxicity (LD ₅₀ ) of Na ₂ -L-AcAsp was performed in rats by subcutaneous, intramuscular, intravenous and oral administration according to the method of Litchfield and Wilcoxon [Belenky M.L. Elements of a quantitative assessment of the pharmacological effect. - L., Nauka, 1963. - 152 p.]. The study of the cumulative properties of Na ₂ -L-AcAsp was carried out according to the method of Kogan and Stankevich [Kogan Yu.S. General toxicology of pesticides. - Kiev, Health, 1981. - 280 p.], Blood biochemical parameters were determined on the basis of recommendations [V. Sanotsky. Methods for determining the toxicity and hazard of chemicals (toxicometry). - M., Medicine, 1970. - 211 p.]. The effect of Na ₂ -L-AcAsp on the reproductive function of animals was evaluated on the basis of an integrated approach, including determining the functional activity of mature spermatozoa, assessing the gonad morphostructure, the ability of males to fully fertilize, analyzing fetal material for the possible presence of a teratogenic effect, and characterizing the sexual behavior of animals [Methodical instructions to study the embryotoxic effect of pharmacological substances and their effect on reproductive function // Comp. Dyban A.P., Puchkov V.F., Torchinsky A.M. and others - M., 1986. - 24 S.]. The mutagenic properties of Na ₂ -L-AcAsp were studied in the Ames test in a modification with pre-incubation of typhimurium salmonella bacteria strains [Maron DM, Ames BN Revised method for the Salmonella mutagenicity test // Mutat. Res. -1987. - Vol. 113. -P. 173 - 213], according to the assessment of cytogenetic activity based on accounting for chromosome aberration in mouse bone marrow cells [Guidelines for the study of the mutagenic activity of chemicals in substantiating their MPC in water // Comp. Zhurkov BC, Krasovsky G.N., Zholdakova Z.I. and others - M., 1986. - 41 pp.], as well as the presence and severity of dominant lethal mutations in fruit flies of the Drosophila melanogaster line.

Результаты исследований статистически обрабатывались по методу Вилкоксона-Уитни-Манна. The research results were statistically processed using the Wilcoxon-Whitney-Mann method.

При изучении поведения крыс на модели "открытого поля" было установлено, что соединение Na₂-L-AcAsp в дозе 50 мг/кг увеличивало двигательную, а в дозах 1, 10 и 50 мг/кг и исследовательскую активность животных. Увеличение под влиянием соединения в дозе 50 мг/кг актов короткого груминга можно расценивать как проявление анксиогенного действия вещества. При этом рацемический аналог - соединение Na₂-DL-AcAsp достоверно увеличивало исследовательскую активность крыс только в дозе 100 мг/кг (табл. 1).When studying the behavior of rats on the model of the "open field" it was found that the compound Na ₂ -L-AcAsp at a dose of 50 mg / kg increased motor, and at doses of 1, 10 and 50 mg / kg and the research activity of animals. An increase under the influence of the compound at a dose of 50 mg / kg of acts of short grooming can be regarded as a manifestation of the anxiogenic effect of the substance. Moreover, the racemic analogue, the compound Na ₂ -DL-AcAsp, significantly increased the research activity of rats only at a dose of 100 mg / kg (Table 1).

Результаты изучения антидепрессантной активности соединений по тесту форсированного плавания представлены в табл. 2. Полученные данные отчетливо указывают на наличие у соединения Na₂-L-AcAsp в дозах 1 и 10 мг/кг (внутрибрюшинное введение) и 30 мг/кг (пероральное введение) антидепрессантных свойств. Соединение Na₂-L-AcAsp приводило к достоверному снижению времени иммобилизации в тесте форсированного плавания и увеличению количества попыток избегания аверсивной среды. При сравнительной оценке эффективности изучаемого вещества с рацемическим аналогом Na₂-DL-AcAsp и препаратом имипрамином установлено наличие у соединения Na₂-L-AcAsp более выраженных в сопоставимых по отношению к ЛД₅₀ дозах антидепрессантных свойств на использованной экспериментальной модели.The results of studying the antidepressant activity of the compounds by the forced swimming test are presented in table. 2. The data obtained clearly indicate the presence of Na ₂ -L-AcAsp in doses of 1 and 10 mg / kg (intraperitoneal administration) and 30 mg / kg (oral administration) of antidepressant properties. The compound Na ₂ -L-AcAsp led to a significant reduction in the time of immobilization in the forced swimming test and an increase in the number of attempts to avoid the aversive medium. A comparative evaluation of the effectiveness of the studied substance with the racemic analogue of Na ₂ -DL-AcAsp and the drug imipramine revealed the presence of the compound Na ₂ -L-AcAsp more pronounced in doses of antidepressant properties comparable with LD ₅₀ in the experimental model used.

При изучении антидепрессантных свойств соединения Na₂-L-AcAsp на модели конкурентного избегания аверсивного раздражителя было установлено, что при обучении пары животных в условиях конкуренции за сухую площадку устанавливаются отношения доминирования и подчинения, что проявляется в снижении количества попыток сталкивания и особенно эффективности попыток сталкивания подчиненными животными животных, занимающих доминирующее положение. При введении на второй день эксперимента (воспроизведение) подчиненным животным соединения Na₂-L-AcAsp в дозе 10 мг/кг наблюдалось достоверное увеличение частоты попыток сталкивания доминирующего партнера при некотором увеличении эффективности сталкиваний. Полученные результаты свидетельствуют о сочетании у соединения Na₂-L-AcAsp психостимулирующей и антидепрессантной активности, что приводит к увеличению моторной активности животных (табл.3).When studying the antidepressant properties of the compound Na ₂ -L-AcAsp on the model of competitive avoidance of an aversive stimulus, it was found that when training a pair of animals in a competition for a dry area, the dominance and submission relationships are established, which manifests itself in a decrease in the number of collision attempts and especially the effectiveness of collision attempts by subordinates animals of animals in a dominant position. When a 10 mg / kg compound of Na ₂ -L-AcAsp was introduced on the second day of the experiment (reproduction) to the subordinate animals, a significant increase in the frequency of attempts to collide the dominant partner was observed with a slight increase in collision efficiency. The results obtained indicate a combination of psychostimulating and antidepressant activity in the compound Na ₂ -L-AcAsp, which leads to an increase in the motor activity of animals (Table 3).

Результаты изучения транквилизирующих, анальгетических и противосудорожных свойств соединения Na₂-L-AcAsp свидетельствуют об отсутствии у данного вещества этих видов активности.The results of a study of the tranquilizing, analgesic and anticonvulsant properties of the compound Na ₂ -L-AcAsp indicate the absence of these types of activity in this substance.

Данные по изучению антиамнестических свойств соединения Na₂-L-AcAsp на модели нарушения УРПИ представлены в табл.4. В ходе экспериментов установлено, что изучаемое соединение при однократном введении в дозе 50 мг/кг приводит к значительному увеличению латентного периода захода в темный отсек по сравнению с животными контрольной группы, что свидетельствует о наличии у вещества отчетливой антиамнестической активности. При этом препарат сравнения пирацетам оказывает равнозначный антиамнестический эффект только в дозе 400 мг/кг.The data on the study of the antiamnestic properties of the compound Na ₂ -L-AcAsp in the model of passive avoidance reaction are presented in Table 4. During the experiments, it was found that the studied compound, when administered once at a dose of 50 mg / kg, leads to a significant increase in the latent period of entry into the dark compartment compared with animals in the control group, which indicates the presence of a distinct antiamnestic activity in the substance. In this case, the comparison drug piracetam has an equivalent antiamnestic effect only at a dose of 400 mg / kg.

В отдельной серии экспериментов изучалось влияние соединения Na₂-L-AcAsp в сравнении с D- и DL-аналогами на динамику обучения животных навыку активного избегания аверсивного раздражителя (УРАИ) при внутрибрюшинном введении веществ в дозе 50 мг/кг за 1 ч до тестирования. В ходе эксперимента было установлено, что изучаемые соединения оказывают различное по выраженности психотропное действие. Наиболее выраженное ноотропное действие проявило соединение Na₂-L-AcAsp, превосходившее по эффективности рацемический DL-аналог. При изучении ноотропного действия D-стереоизомера динатриевой соли N-ацетиласпарагиновой кислоты не было выявлено различий в динамике обучения крыс по сравнению с контролем (табл. 5, фиг. 1). Результаты статистического анализа полученных результатов показали наличие достоверных межгрупповых отличий в динамике обучения животных УРАИ [F_A(9;353) = 23,7; p < 0,01. F_B(3; 353) = 6,4; p < 0,01]. Таким образом, сравнительная оценка фармакологического эффекта соединения Na₂-L-AcAsp с его D-стереоизомером и рацемической DL-формой подтвердила правильность выбора L-формы вещества как наиболее эффективной.In a separate series of experiments, we studied the effect of the Na ₂ -L-AcAsp compound in comparison with D and DL analogues on the dynamics of animal learning to actively avoid aversive stimulus (URAI) with intraperitoneal administration of substances at a dose of 50 mg / kg 1 hour before testing. During the experiment, it was found that the compounds studied have a different psychotropic effect. The most pronounced nootropic effect was exerted by the compound Na ₂ -L-AcAsp, which exceeded the racemic DL analogue in efficiency. When studying the nootropic effect of the D-stereoisomer of the disodium salt of N-acetyl aspartic acid, there were no differences in the dynamics of rat training compared with the control (Table 5, Fig. 1). The results of a statistical analysis of the results showed the presence of reliable intergroup differences in the dynamics of animal learning URAI [F _A (9; 353) = 23.7; p <0.01. F _B (3; 353) = 6.4; p <0.01]. Thus, a comparative assessment of the pharmacological effect of the compound Na ₂ -L-AcAsp with its D-stereoisomer and racemic DL-form confirmed the correct choice of the L-form of the substance as the most effective.

Результаты экспериментов по определению возможного механизма действия соединения Na₂-L-AcAsp по его влиянию на активность различных медиаторных систем мозга в условиях in vivo не выявило его моноамин- и холинергического действия. В то же время наблюдаемое изменение реакции животных на моделях пикротоксиновых судорог и клофелиновой гипотермии косвенно свидетельствует о модулирующей BAK-ергической активности соединения Na₂-L-AcAsp.The results of experiments to determine the possible mechanism of action of the compound Na ₂ -L-AcAsp by its effect on the activity of various mediator systems of the brain in vivo did not reveal its monoamine and cholinergic effects. At the same time, the observed change in the reaction of animals in models of picrotoxin seizures and clonid hypothermia indirectly indicates the modulating BAK-ergic activity of the compound Na ₂ -L-AcAsp.

Данные по острой суточной токсичности соединения Na₂-L-AcAsp в сравнении с аналогами и эталонными препаратами представлены в табл.6 и 7. Соединение Na₂-L-AcAsp в опытах на белых мышах проявляет в 1,4 раза меньшую токсичность по сравнению с соответствующей DL-формой. Определение параметров острой токсичности соединения Na₂-L-AcAsp в опытах на крысах при внутривенном, подкожном, внутримышечном и пероральном введении позволяет отнести эти вещество к классу малотоксичных.The data on acute daily toxicity of the Na ₂ -L-AcAsp compound in comparison with analogues and reference preparations are presented in Tables 6 and 7. The Na ₂ -L-AcAsp compound in experiments on white mice shows 1.4 times less toxicity compared to corresponding DL form. Determination of the parameters of acute toxicity of the compound Na ₂ -L-AcAsp in experiments on rats with intravenous, subcutaneous, intramuscular and oral administration allows these substances to be classified as low toxic.

Изучение влияния соединения Na₂-L-AcAsp на репродуктивную функцию крыс не выявило его отрицательного влияния на воспроизведение потомства. Соединение Na₂-L-AcAsp при его субхроническом пероральном введении в дозах 50 мг/кг (эффективная доза ЕД₅₀), 80 мг/кг (промежуточная доза) и 110 мг/кг (1/100 от ЛД₅₀) не вызывает у животных обоего пола нарушений половой функции, не влияет на внутриутробное развитие плодов и физическое развитие потомства в постнатальном периоде.Studying the effect of the compound Na ₂ -L-AcAsp on the reproductive function of rats did not reveal its negative effect on the reproduction of offspring. The compound Na ₂ -L-AcAsp when it is subchronic oral administration in doses of 50 mg / kg (effective dose of ED ₅₀ ), 80 mg / kg (intermediate dose) and 110 mg / kg (1/100 of LD ₅₀ ) does not cause animals both sexes sexual dysfunction, does not affect the intrauterine development of the fetus and the physical development of the offspring in the postnatal period.

Использование комплекса тестерных систем, способных учитывать все типы генетических повреждений, не выявило у соединения Na₂-L-AcAsp мутагенной и первичной канцерогенной активности.The use of a complex of tester systems capable of taking into account all types of genetic damage did not reveal mutagenic and primary carcinogenic activity in the Na ₂ -L-AcAsp compound.

Таким образом, динатриевая соль N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты является малотоксичным лекарственным веществом, обладающим более выраженным антидепрессантным и ноотропным действием по сравнению с эталонными препаратами имипрамином и пирацетамом, а также известным структурным аналогом - динатриевой солью N-ацетил-DL-аспарагиновой кислоты. Сочетание выраженных антидепрессантных и ноотропных свойств у динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты позволяет считать это соединение перспективным для лечения широкого ряда нервно-психических заболеваний. Thus, the disodium salt of N-acetyl-L-aspartic acid is a low-toxic drug with a more pronounced antidepressant and nootropic effect compared to the reference drugs imipramine and piracetam, as well as the well-known structural analogue, the disodium salt of N-acetyl-DL-aspartic acid . The combination of pronounced antidepressant and nootropic properties in the disodium salt of N-acetyl-L-aspartic acid allows us to consider this compound promising for the treatment of a wide range of neuropsychic diseases.

Claims (1)

Динатриевая соль N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты формулы

обладающая антидепрессантной и ноотропной активностью.Disodium salt of N-acetyl-L-aspartic acid of the formula

possessing antidepressant and nootropic activity.

Images