RU2137835C1 - Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата - Google Patents
Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2137835C1 RU2137835C1 RU98120178A RU98120178A RU2137835C1 RU 2137835 C1 RU2137835 C1 RU 2137835C1 RU 98120178 A RU98120178 A RU 98120178A RU 98120178 A RU98120178 A RU 98120178A RU 2137835 C1 RU2137835 C1 RU 2137835C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzyme
- carrier
- polyethylene oxide
- reaction mixture
- peo
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, может найти применение в медицине и ветеринарии для лечения различных заболеваний, где необходим ферментативный гидролиз белков некротических тканей и гнойных масс, а также гидролиз фибрина и растворение тромбов крови. Иммобилизацию протеолитического фермента, преимущественно протосубтилина, проводят на полиэтиленоксиде с молекулярной массой 1500-4000 Да путем облучения тормозным γ-излучением дозой 0,9-1,1 Мрад, при соотношении фермент-носитель 1:(2-6). При этом перед иммобилизацией реакционную смесь очищают от балластных белков солевым осаждением с помощью фосфата натрия и хлорида кальция. Добавляют полиэтиленоксид с мол. массой 4000 Да в качестве наполнителя в количестве 50-300 мг/мл и подвергают лиофильному высушиванию. Способ позволяет получить лиофилизат иммобилизованного ферментного препарата, который сохраняет стабильность в течение двух лет при хранении при температуре до +20oC. Способ обеспечивает получение лекарственной формы препарата в виде устойчивой таблеткообразной пористой массы. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу иммобилизации протеолитических ферментов, и может найти применение в медицине и ветеринарии при получении препаратов иммобилизованных ферментов.
Известны различные способы иммобилизации ферментов на носителях.
Известны способы иммобилизации путем адсорбции фермента на носителях с высокоразвитой поверхностью, а также путем включения фермента в различные гелевые структуры (Иммобилизованные ферменты. Под. ред. И.В. Березина. T.1, М., Изд-во МГУ, 1976, с. 79-140).
Недостатком таких способов является малая прочность связи фермента с носителем, в результате чего фермент в процессе эксплуатации может диффундировать с носителя в раствор.
Известны также способы иммобилизации, заключающиеся в ковалентном связывании фермента с предварительно активированным носителем. Активация носителя необходима для создания на нем функциональных групп, способных взаимодействовать с молекулами фермента.
Известен, например, способ получения иммобилизованного протеолитического комплекса, включающий растворение содержащего альдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение протеолитического комплекса, полученного из Aspergillus oryzae KC. В качестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трис-оксиметиламинометановом буфере pH 8,05, а присоединение фермента осуществляют при соотношении носитель-фермент 1:1 - 3 (а.с. N 1041567, кл. C 12 N 11/10, опубл. 15.09.83. Бюл. N34).
Недостатки известного способа - дефицитный и дорогостоящий носитель - ксилоуронид, низкая стабильность целевого продукта, необходимость хранения препарата в условиях холодильника при 0-4oC.
Известен также способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата (ИФП), включающий следующие последовательные стадии (а.с. N 730694, кл. C 08 B 37/02, опубл. 30.04.80, Бюл. N16):
1. Активирование носителя - декстрана с мол. массой 20 кДа, в реакции периодатного окисления (степень окисления носителя γ = 6-48%).
1. Активирование носителя - декстрана с мол. массой 20 кДа, в реакции периодатного окисления (степень окисления носителя γ = 6-48%).
2. Приготовление реакционной смеси: окисленный декстран растворяют в воде до концентрации 50 мг/мл и смешивают с раствором фермента - террилитина, в 0,1 М боратном буфере pH 8,5.
3. Иммобилизация фермента: реакционную смесь перемешивают в течение 2 часов при 21±1oC, затем добавляют 0,1 М раствор боратного буфера, содержащего боргидрид натрия и перемешивают еще в течение 40 мин.
4. Обессоливание ИФП: путем диализа на холоде (4±2oC) против дистиллированной воды в течение 48 часов.
5. Отделение избытка несвязавшегося фермента гель-фильтрацией.
6. Лиофильное высушивание.
Получают препарат с удельной активностью 7,4 ПЕ/мг.
Недостатками известного способа являются - сложность процесса (длительный процесс активирования носителя, значительные затраты времени, энергетических ресурсов и сырья).
- низкое качество целевого продукта.
Ближайшим к заявляемому способу - прототипом является способ получения иммобилизованного протеолитического комплекса, заключающийся в следующем (а. с. N 1442548, кл. C 12 N 11/00, опубл. 07.12.88, Бюл. N45):
1. Протосубтилин Г10Х, представляющий собой комплекс бактериальных нейтральных и щелочных протеаз из Вас. subtilis, растворяют в 0,05 М боратном буфере pH 8,4 при 2-4oC в течение 30 мин, а нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием при 7000 g в течение 30 мин. К полученному супернатанту добавляют 10%-ный водный раствор полиэтиленоксида с мол. массой 600 - 2000 Да, преимущественно 1500 Да, в соотношении носитель - протосубтилин 1: (7,5-8,5). Смесь фермента с носителем облучают тормозным γ - излучением в дозе 2,3 - 2,7 Мрад. При этом получают водорастворимый иммобилизованный ферментный препарат с протеолитической активностью 80 - 120 ПЕ/мл. Препарат представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета, которую хранят при 4 - 8oC.
1. Протосубтилин Г10Х, представляющий собой комплекс бактериальных нейтральных и щелочных протеаз из Вас. subtilis, растворяют в 0,05 М боратном буфере pH 8,4 при 2-4oC в течение 30 мин, а нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием при 7000 g в течение 30 мин. К полученному супернатанту добавляют 10%-ный водный раствор полиэтиленоксида с мол. массой 600 - 2000 Да, преимущественно 1500 Да, в соотношении носитель - протосубтилин 1: (7,5-8,5). Смесь фермента с носителем облучают тормозным γ - излучением в дозе 2,3 - 2,7 Мрад. При этом получают водорастворимый иммобилизованный ферментный препарат с протеолитической активностью 80 - 120 ПЕ/мл. Препарат представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета, которую хранят при 4 - 8oC.
Недостатками известного способа являются:
- недостаточно высокое качество целевого продукта;
- низкая стабильность препарата при хранении (через две недели хранения при комнатной температуре препарат теряет 80% активности).
- недостаточно высокое качество целевого продукта;
- низкая стабильность препарата при хранении (через две недели хранения при комнатной температуре препарат теряет 80% активности).
Известно, что водные растворы иммобилизованных ферментных препаратов (ИФП) нестабильны в процессе хранения, поэтому задача получения высокостабильных лекарственных форм ИФП является актуальной.
Технической задачей изобретения является повышение стабильности целевого продукта.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.
Готовят реакционную смесь путем растворения протеолитического фермента (ПФ), преимущественно протосубтилина ГЗХ, в Na-фосфатном буферном растворе (pH 7,2 - 8,2) полиэтиленоксида (ПЭО) с мол. массой 1500 - 4000 Да при соотношении фермент: носитель 1:(2-6). Полученную смесь очищают путем солевого осаждения балластных белков и удаления последних фильтрованием. Фильтрат подвергают облучению тормозным γ-излучением в дозе 0,9 - 1,1 Мрад. К полученному иммобилизованному на ПЭО протеолитическому ферменту добавляют ПЭО с мол. массой 4000 Да в количестве 50-300 мг/мл, раствор подвергают стерилизующей фильтрации, фасуют во флаконы вместимостью 10 см3 по 1,2 и 5 мл и лиофильно высушивают.
В результате получают препарат с активностью 460 ПЕ во флаконе (коммерческое название "Имозимаза аморфная"), представляющий собой таблеткообразную пористую массу, от белого до белого с кремовым оттенком цвета, хорошо растворимую в воде. Срок хранения препарата при температуре до 20oC составляет 2 года.
Получаемый заявляемым способом ИФП может быть применен в любой области медицины и ветеринарии для лечения различных заболеваний, где необходим ферментативный гидролиз белков некротических тканей и гнойных масс.
Определяющими существенными отличиями заявляемого способа от прототипа являются:
1. Ковалентное связывание фермента с носителем осуществляют при экспериментально подобранном, оптимальном соотношении фермент:носитель, равном 1: (2-6), что позволяет повысить качество и стабильность целевого продукта, так как при соотношении фермент - носитель менее 1: 2 не достигается устойчивой стабилизации, а при соотношении более 1: 6 происходит частичное осаждение ферментативного белка носителем.
1. Ковалентное связывание фермента с носителем осуществляют при экспериментально подобранном, оптимальном соотношении фермент:носитель, равном 1: (2-6), что позволяет повысить качество и стабильность целевого продукта, так как при соотношении фермент - носитель менее 1: 2 не достигается устойчивой стабилизации, а при соотношении более 1: 6 происходит частичное осаждение ферментативного белка носителем.
2. Перед иммобилизацией проводят очистку ферментного препарата от балластных белков путем последовательного добавления в реакционную смесь фосфорнокислого натрия и хлористого кальция. В результате реакции
происходит коагуляция и осаждение балластных белков, чему способствует выпадающий в осадок фосфат кальция. Данная стадия позволяет простым способом (без использования центрифугирования) обеспечить освобождение от балласта, что способствует повышению качества целевого продукта и снижению дозы тормозного γ-излучения в 2-3 раза по сравнению с прототипом (с 2,3 - 2,7 до 0,9 - 1,1 Мрад).
происходит коагуляция и осаждение балластных белков, чему способствует выпадающий в осадок фосфат кальция. Данная стадия позволяет простым способом (без использования центрифугирования) обеспечить освобождение от балласта, что способствует повышению качества целевого продукта и снижению дозы тормозного γ-излучения в 2-3 раза по сравнению с прототипом (с 2,3 - 2,7 до 0,9 - 1,1 Мрад).
Перед лиофилизацией в ИФП вводят целевую добавку (наполнитель), в качестве которой используют ПЭО с мол.массой 4000 Да в количестве 50 - 300 мг/мл, что позволяет предохранить ИФП от потери активности при лиофильном высушивании, а также повысить стабильность препарата при хранении. Неожиданно оказалось, что именно данный синтетический полимер - ПЭО с мол. массой 4000 Да в концентрации от 50 до 300 мг/мл является оптимальным наполнителем для получения лекарственной формы ИПФ, так как он одновременно выполняет функцию и стабилизатора и структурообразователя, позволяющего получить после лиофилизации таблеткообразную пористую плотную массу препарата. Использование ПЭО-4000 в качестве наполнителя вызвано также его доступностью (выпускается отечественной промышленностью), разрешенностью использования в медицине и приемлемой ценой.
В таблице 1 представлены данные по влиянию добавок ПЭО-4000 на качество целевого продукта (формирование таблетки).
Из таблицы 1 видно, что добавление к ИПФ ПЭО-4000 в количестве 50 - 300 мг/мл, преимущественно 50 - 100 мг/мл, обеспечивает формирование таблеткообразной плотной массы препарата.
В табл. 2 и 3 представлены данные по хранению лиофильно высушенного препарата "Имозимаза" при комнатной температуре (18 - 20oC) в сравнении с хранением жидкой формы препарата, полученного по способу - прототипу.
Из табл. 2 и 3 видно, что через 28 дней хранения при температуре 20 - 25oC ИФП, полученный по способу - прототипу теряет 50 - 78% исходной протеолитической активности, а через 12 месяцев хранения потеря активности составляет более 95%. ИФП, полученный заявляемым способом, может храниться при комнатной температуре без потери активности в течение 12 месяцев.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Готовят реакционную смесь. Для этого 30 г ПЭО-1500 растворяют в 300 мл 0,025 М Na-фосфатного буфера (pH 8,2), добавляют 7,5 г протосубтилина ГЗХ (соотношение фермент: носитель 1:4), смесь перемешивают при температуре 18- 20oC в течение 30 минут. Затем проводят осаждение балластных белков путем коагуляции. Для этого в смесь последовательно добавляют до полного растворения 1,3 г натрия фосфорнокислого (Na2HPO4•12H2O) до конечной концентрации 0,45% и 1,9 г хлорида кальция (CaCl2•6H2O) до конечной концентрации 0,63%. После добавления хлорида кальция в реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция, который адсорбирует балластные белки. Смесь выдерживают 12 часов при температуре +4 +8oC для полного осаждения балластных белков. Далее реакционную смесь фильтруют через бумажные фильтры ("белая лента"). Объем фильтрата составляет 300 мл. Полученный фильтрат облучают тормозным γ-излучением в дозе 1 Мрад. В процессе облучения происходит иммобилизация фермента на полимерном носителе. Выход по активности составляет 85%. После облучения в раствор, содержащий иммобилизованный на ПЭО-1500 протосубтилин (ИФП), вводят ПЭО-4000 в количестве 15 г на 300 мл раствора (50 мг/мл) и перемешивают до полного растворения. Затем проводят стерилизующую фильтрацию полученной смеси через мембранный фильтр (Millipore) с размером пор 0,2 микрона. Стерильный фильтрат разливают в стерильные флаконы вместимостью 10 см3 по 1 мл и лиофильно высушивают. После лиофилизации получают препарат, содержащий в одном флаконе 6,4 мг ИПФ (по белку) с активностью 300 ПЕ, 100 мг ПЭО-1500, 50 мг ПЭО- 4000.
Препарат растворяется в воде в течение 1 минуты, сохраняет стабильность в течение 2 лет.
Пример 2.
Готовят реакционную смесь. Для этого 75 г ПЭО-1500 растворяют в 300 мл 0,025 М Na-фосфатного буфера (pH 8,2), добавляют 15 г протосубтилина, смесь перемешивают в течение 30 минут и последовательно добавляют до полного растворения натрий фосфорнокислый до конечной концентрации 0,45% и кальций хлористый до конечной концентрации 0,63%. Смесь выдерживают 12 часов до полного осаждения балластных белков, затем осадок отфильтровывают на бумажном фильтре. Полученный очищенный фильтрат (V - 300 мл) облучают тормозным γ-излучением в дозе 1,0 Мрад на ускорителе электронов ЭЛВ-2. Выход по активности составляет 86%. В раствор, содержащий ИФП добавляют 30 г ПЭО-4000 (100 мг/мл), перемешивают до полного растворения, проводят стерилизующую фильтрацию полученной смеси через мембранный фильтр с размером пор 0,2 микрона. Стерильный фильтрат разливают в стерильные флаконы вместимостью 10 см3 по 1 мл и лиофильно высушивают. Один флакон содержит 13 мг ИПФ (по белку) с активностью 660 ПЕ, 250 мг ПЭО-1500, 100 мг ПЭО-4000.
Препарат сохраняет стабильность в течение 2 лет при хранении при температуре не выше 20oC.
Пример 3.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что соотношение фермент: носитель в реакционной смеси устанавливают 1:2. Для этого 30 г ПЭО-1500 растворяют в 300 мл 0,025 М Na-фосфатного буфера (pH 8,2), добавляют 15 г протосубтилина и смесь перемешивают. К полученному после иммобилизации ИПФ добавляют ПЭО-4000 в количестве 300 мг/мл. Один флакон препарата содержит 17 мг ИПФ (по белку) с активностью 720 ПЕ, 100 мг ПЭО-1500, 300 мг ПЭО-4000.
Пример 4.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что соотношение фермент: носитель в реакционной смеси устанавливают 1:6, а в качестве носителя используют ПЭО-4000. Для этого 30 г ПЭО-4000 растворяют в 300 мл 0,025 М Na-фосфатного буфера (pH 8,2), добавляют 5 г протосубтилина и смесь перемешивают. Перед лиофилизацией к раствору ИФП добавляют ПЭО-4000 в количестве 50 мг/мл.
Один флакон препарата содержит 1,8 мг ИПФ (по белку) с активностью 190 ПЕ, 150 мг ПЭО-4000.
Использование предлагаемого способа позволяет по сравнению с прототипом:
- повысить качество целевого продукта;
- увеличить стабильность препарата ИПФ ("Имозимаза") в процессе хранения,
- обеспечить возможность получения устойчивой таблеткообразной пористой массы.
- повысить качество целевого продукта;
- увеличить стабильность препарата ИПФ ("Имозимаза") в процессе хранения,
- обеспечить возможность получения устойчивой таблеткообразной пористой массы.
Claims (3)
1. Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата, включающий приготовление реакционной смеси, содержащей протосубтилин с полиэтиленоксидом, с последующим облучением полученной смеси тормозным γ-излучением, отличающийся тем, что соотношение фермент - носитель устанавливают равным 1: (2-6), из реакционной смеси перед облучением проводят солевое осаждение балластных белков, а целевой продукт подвергают лиофильной сушке в присутствии полиэтиленоксида с мол.массой 4000 Да в количестве 50-300 мг/мл.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве носителя для иммобилизации фермента используют полиэтиленоксид с мол.массой 1500-4000 Да.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что балластные белки осаждают путем последовательного добавления в реакционную смесь сначала фосфорнокислого натрия до конечной концентрации 0,45%, а затем хлорида кальция до конечной концентрации 0,63%.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU98120178A RU2137835C1 (ru) | 1998-11-10 | 1998-11-10 | Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU98120178A RU2137835C1 (ru) | 1998-11-10 | 1998-11-10 | Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2137835C1 true RU2137835C1 (ru) | 1999-09-20 |
Family
ID=20212065
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU98120178A RU2137835C1 (ru) | 1998-11-10 | 1998-11-10 | Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2137835C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003059326A1 (en) * | 2001-12-26 | 2003-07-24 | Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo 'aksis' | Pharmaceutical composition having thrombolytic, anti-inflammatory and cytoprotective properties |
WO2010021570A1 (ru) * | 2008-08-18 | 2010-02-25 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" | Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом |
-
1998
- 1998-11-10 RU RU98120178A patent/RU2137835C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Черкасова Т.А. и др. Ковалентная иммобилизация протеиназ на полимерных матрицах с эпоксигруппами. Прикладная биохимия и микробиология. М.: Наука, 1991, т.27, вып.6, с.807-843. * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003059326A1 (en) * | 2001-12-26 | 2003-07-24 | Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo 'aksis' | Pharmaceutical composition having thrombolytic, anti-inflammatory and cytoprotective properties |
US7429377B2 (en) | 2001-12-26 | 2008-09-30 | Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo “Aksis” | Therapeutic composition containing a plurality of immobilized proteases |
CN1517126B (zh) * | 2001-12-26 | 2010-06-16 | 未来科技管理公司 | 具有血栓溶解、抗炎和细胞保护性能的药物组合物 |
WO2010021570A1 (ru) * | 2008-08-18 | 2010-02-25 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" | Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом |
EP2327777A1 (en) * | 2008-08-18 | 2011-06-01 | Scientific Future Management SFM | Method for immobilising biologically active substances on polymer carriers (variants) and conjugates produced by said method |
EP2327777A4 (en) * | 2008-08-18 | 2014-09-10 | Scient Future Man Sfm | METHOD FOR IMMOBILIZING A BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE ON POLYMERIC (AND VARIANT) AND CONJUGATED MEDIA OBTAINED THEREFROM |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1142833B (zh) | 聚-β-1→4-N-乙酰基葡糖胺 | |
US4970156A (en) | Immobilization of active protein by cross-linking to inactive protein | |
RU2099354C1 (ru) | Очищенное производное циклодекстрина, клатратный комплекс очищенного производного циклодекстрина с лекарственным средством, фармацевтическая композиция | |
KR102080929B1 (ko) | 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재 및 이의 제조방법 | |
CN108178780B (zh) | 一种短肽修饰单宁酸纳米抗菌剂及其制备方法 | |
US20170000924A1 (en) | E-polylysine hydrogel and preparation method and application thereof | |
JPS59113889A (ja) | 固定化酵素もしくは固定化微生物菌体の製造方法 | |
RU2137835C1 (ru) | Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата | |
CN107254460B (zh) | 一种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶及其应用 | |
WO2003059326A1 (en) | Pharmaceutical composition having thrombolytic, anti-inflammatory and cytoprotective properties | |
US3171831A (en) | Thiolation of proteins by reaction with homocysteine thiolactone in the presence of tertiary amine | |
US4560556A (en) | Fibronectin-physiologically active substance complex and method of preparation thereof | |
CN110755638A (zh) | 一种具有骨靶向性的药物载体及其制备方法与应用 | |
SU1128601A1 (ru) | Урокиназа,иммобилизированна на фибриногене | |
CN2920163Y (zh) | 纳米止血贴 | |
JPH04121187A (ja) | ポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミナーゼおよびその製造法 | |
EP0137743A2 (en) | Topically administrable pharmaceutical compositions | |
RU2235061C2 (ru) | Способ получения микрогранул на основе гидроксилапатита кальция | |
RU2270861C1 (ru) | Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата протеаз | |
Schröder et al. | Inorganic Polyphosphate: Coacervate Formation and Functional Significance in Nanomedical Applications | |
CA2096690A1 (en) | Hydrophilic creams for delivery of therapeutic agents | |
JP5137491B2 (ja) | 水酸化アルミニウム吸着体の吸着性及び/又は溶出性の改変方法 | |
Vernikovskii et al. | Immobilized proteases for wound cleaning | |
RU2819793C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата бромелайна и аскорбата хитозана в виде густого раствора | |
RU2630668C1 (ru) | Субстанция протеолитического фермента на основе Протосубтилина ГЗХ, иммобилизованного на хитозане, и композиция для лечения гнойно-некротических ран |