RU2128514C1 - Method of anti-inflammatory agent preparing - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: method involves treatment of cattle placenta of the first half of pregnancy. Method involves milling, homogenization, selective extraction, disinfection of extract, autolysis and aseptic filtration. An agent can be used in medicine and pharmacology. Method provides preparing an agent showing anti-inflammatory effect and exhibiting broad range of effect by trial and error of set of purposeful actions and regimens used for treatment of the parent biological raw that determine properties of obtained protein-peptide agent, i.e. its high effectiveness and absence of adverse, in part, allergic effects in curative using. EFFECT: enhanced efficiency. 2 cl, 2 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармакологии и медицинской практике при лечении воспалительных процессов различной этиологии. The invention relates to biotechnology and can be used in pharmacology and medical practice in the treatment of inflammatory processes of various etiologies.

Наиболее близким к заявляемому решению является способ получения противовоспалительного средства, состоящий в измельчении биологического сырья - плаценты человека, ее экстракции физиологическим раствором, отделении полученного экстракта и его консервировании [М.Д. Машковский. Лекарственные средства. М. : Медицина, Изд. II, т. П, 1988, с. 154.]. В результате указанных приемов в экстракт переходят все высокомолекулярные белки и клетчатый материал, содержащийся в плаценте. Closest to the claimed solution is a method of obtaining an anti-inflammatory agent, which consists in grinding biological raw materials - human placenta, its extraction with physiological saline, separation of the obtained extract and its conservation [M.D. Mashkovsky. Medicines M.: Medicine, Ed. II, t. P, 1988, p. 154.]. As a result of these techniques, all high molecular weight proteins and cellular material contained in the placenta pass into the extract.

Однако способ-прототип не обеспечивает получения высокоэффективного противовоспалительного средства, поскольку стимулирует иммунную систему больного, таким образом, только опосредованно влияет на воспалительный процесс. А его состав таков, что может вызвать аллергические реакции организма. However, the prototype method does not provide a highly effective anti-inflammatory drug, since it stimulates the patient’s immune system, thus, only indirectly affects the inflammatory process. And its composition is such that it can cause allergic reactions of the body.

Особенности природы получаемого средства не позволяют использовать его эффективно в ряде воспалительных заболеваний. The nature of the obtained product does not allow its effective use in a number of inflammatory diseases.

Задачей настоящего изобретения является создание способа получения противовоспалительного средства с широким диапазоном действия путем подбора совокупности целенаправленных действий и режимов обработки исходного биологического сырья, которые определяют свойства получаемого белково-пептидного средства, а именно его высокую эффективность и отсутствие побочных, в частности, аллергических проявлений при его лечебном использовании. The objective of the present invention is to provide a method for producing an anti-inflammatory agent with a wide range of actions by selecting a combination of targeted actions and processing modes of the initial biological raw materials that determine the properties of the resulting protein-peptide agent, namely its high efficiency and the absence of side effects, in particular, allergic manifestations medicinal use.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения противовоспалительного средства, включающем в себя предварительную обработку биологического сырья, экстракцию его в физиологическом растворе, отделение экстракта, согласно изобретению в качестве биологического сырья используют детскую плаценту крупного рогатого скота первой половины стельности, а предварительную обработку указанного сырья осуществляют путем удаления из него кровеносных сосудов и выдерживания его при температуре не выше 10^oC в течение суток, затем после гомогенизации сырья и разбавления его в физиологическом растворе в соотношении 1 : (1-7) выдерживают его до полной экстракции растворимых белков, а к отделенному экстракту добавляют консервант в количестве менее 0,05%, после чего образовавшийся продукт выдерживают при условиях, обеспечивающих полную агрегацию нерастворимых частиц, отделяют образовавшуюся взвесь и полученный раствор термостатируют в течение 7 - 12 суток при температуре 40^oC и затем после асептического фильтрования выдерживают раствор в течение 30 суток при температуре 10^oC.The problem is solved in that in a method for producing an anti-inflammatory agent, including pretreatment of biological raw materials, extraction in physiological saline, separation of the extract, according to the invention, baby placenta of cattle of the first half of pregnancy are used as biological raw materials, and preliminary processing of said raw materials carried out by removing it from the blood vessel and keeping it at a temperature not higher than 10 ^o C for one day, and then after homo After raw materials are diluted and diluted in physiological saline in a ratio of 1: (1-7), they are kept until complete extraction of soluble proteins, and a preservative is added to the separated extract in an amount of less than 0.05%, after which the resulting product is maintained under conditions ensuring complete aggregation insoluble particles, the resulting suspension is separated and the resulting solution is thermostated for 7-12 days at a temperature of 40 ^o C and then after aseptic filtration the solution is kept for 30 days at a temperature of 10 ^o C.

В результате осуществления совокупности вышеперечисленных действий получают раствор, представляющий собой пептидно-белковый комплекс, пригодный для использования, например, для инъекций и ингаляций. As a result of the combination of the above actions, a solution is obtained which is a peptide-protein complex suitable for use, for example, for injection and inhalation.

Авторами настоящего изобретения предусмотрено использовать в качестве биологического сырья детскую плаценту крупного рогатого скота первой половины стельности. В этот период стельности наблюдается интенсивный рост плода, что сопровождается активным синтезом низкомолекулярных или регуляторных белков. The authors of the present invention provides for the use of biological placenta of the cattle of the first half of pregnancy as biological raw materials. During this period of pregnancy, intensive growth of the fetus is observed, which is accompanied by the active synthesis of low molecular weight or regulatory proteins.

Использование в качестве сырья для осуществления заявляемого способа детской плаценты крупного рогатого скота отвечает специфичности получаемого средства. The use as a raw material for the implementation of the proposed method of infant placenta in cattle meets the specificity of the funds obtained.

Операция удаления кровеносных сосудов из используемого сырья необходима для того, чтобы исключить в последующих операциях отрицательное влияние балластных белков. The operation to remove blood vessels from the raw materials used is necessary in order to eliminate the negative effect of ballast proteins in subsequent operations.

Дальнейшие операции заявляемого способа направлены на выделение смеси пептидов, определяющей противовоспалительные свойства средства. Further operations of the proposed method are aimed at isolating a mixture of peptides that determines the anti-inflammatory properties of the agent.

Подготовленное сырье промывают водой, охлаждают в течение суток до температуры не выше 10^oC. Такие условия определены тем, что при более высокой температуре охлаждения активность получаемого средства заметно снижается, а время охлаждения обусловлено достижением экстремального состояния клетки и максимальным синтезом стрессовых белков.The prepared raw materials are washed with water, cooled during the day to a temperature of no higher than 10 ^o C. Such conditions are determined by the fact that, at a higher cooling temperature, the activity of the obtained product is noticeably reduced, and the cooling time is due to the extreme state of the cell and the maximum synthesis of stress proteins.

Следующие действия направлены на обработку сырья перед экстракцией из него белково-пептидного комплекса. The following actions are aimed at processing the raw material before extraction of the protein-peptide complex from it.

Этими действиями является измельчение сырья, разбавление его физиологическим раствором в соотношении 1 : (1- 7) и гомогенизация. Следует отметить, что выбор соотношения измельченного сырья и физиологического раствора определяется формой использования получаемого средства. These actions are grinding the raw material, diluting it with physiological saline in a ratio of 1: (1-7) and homogenizing. It should be noted that the choice of the ratio of crushed raw materials and physiological saline is determined by the form of use of the obtained funds.

Гомогенат перемешивают в течение 36 ч при температуре не выше 10^oC, при этом происходит полная экстракция растворимых белков и пептидов. В процессе экстракции образуется нерастворимый осадок, подлежащий отделению, например, центрифугированием или фильтрованием.The homogenate is stirred for 36 hours at a temperature of no higher than 10 ^o C, with the complete extraction of soluble proteins and peptides. During the extraction process, an insoluble precipitate forms which must be separated, for example by centrifugation or filtration.

К экстракту добавляют консервант, количество которого задано границей - не ниже 0,05%, что позволяет подавить действие имеющихся в экстракте бактерий. A preservative is added to the extract, the amount of which is set by the boundary - not less than 0.05%, which allows to suppress the effect of bacteria present in the extract.

При выдерживании экстракта при температуре 12^oC в течение 48 - 96 ч происходит аутолиз белков. При этих условиях под действием ферментов белки расщепляются до низкомолекулярных.When the extract is kept at a temperature of 12 ^o C for 48 - 96 hours, autolysis of proteins occurs. Under these conditions, under the action of enzymes, proteins break down to low molecular weight.

При температурах, отличных от указанной, процесс может менять свое направление с образованием побочных продуктов. Выбор температуры в диапазоне 48-96^oC зависит от исходной концентрации плаценты в физрастворе.At temperatures other than that indicated, the process may change direction with the formation of by-products. The choice of temperature in the range of 48-96 ^o C depends on the initial concentration of the placenta in saline.

В процессе аутолиза происходит коагуляция белковых и клеточных элементов, их отделяют, а полимерный раствор для инкубирования помещают в термостат при 40^oC на 7-12 суток. В процессе термостатирования происходит дальнейшая агрегация клеточных материалов, они осаждаются, в результате чего резко снижается количество балласта и одновременно завершается процесс аутолиза.In the process of autolysis, coagulation of protein and cellular elements occurs, they are separated, and the polymer solution for incubation is placed in a thermostat at 40 ^o C for 7-12 days. In the process of thermostating, further aggregation of cellular materials takes place, they are deposited, as a result of which the amount of ballast is sharply reduced and the process of autolysis ends.

После асептического фильтрования и выдерживания раствора при температурах не выше 10^oC в течение 30 суток полученный продукт пригоден для применения. Его можно использовать для инъекций, ингаляций и т.д.After aseptic filtering and maintaining the solution at temperatures not higher than 10 ^o C for 30 days, the resulting product is suitable for use. It can be used for injection, inhalation, etc.

В случае получения лекарственной формы в виде свечей средство, обладающее противовоспалительной активностью может быть эмульгировано с общепринятой в данной области основой для свечей при определенном соотношении, мас.%:
Раствор - 30-50
Основа - 50-70
Найденное авторами изобретения вышеуказанное соотношение определено тем, что при более высоких количествах активного раствора и основы возможно расслоение получаемой смеси для свечей, а меньшее количество компонентов не позволяет достигнуть необходимого лечебного эффекта.In the case of obtaining a dosage form in the form of suppositories, an agent having anti-inflammatory activity can be emulsified with the suppository base generally accepted in the art in a certain ratio, wt.%:
Solution - 30-50
Base - 50-70
The above ratio found by the inventors is determined by the fact that with higher amounts of the active solution and the base, the resulting mixture for candles can be stratified, and a smaller number of components does not allow to achieve the necessary therapeutic effect.

Изобретение поясняется конкретными примерами. The invention is illustrated by specific examples.

Пример 1. Из ткани детской плаценты коровы в количестве 1 кг удаляли крупные кровеносные сосуды, ткань измельчали и подвергали гомогенизации при 8^oC, гомогенат разбавляли охлажденным изотоническим раствором в соотношении 1 : 3 по объему.Example 1. Large blood vessels were removed from the tissue of the baby placenta of a cow in an amount of 1 kg, the tissue was crushed and homogenized at 8 ^° C, the homogenate was diluted with a cooled isotonic solution in a ratio of 1: 3 by volume.

Полученную смесь выдерживали при постоянном перемешивании при 8^oC в течение 36 ч.The resulting mixture was kept under constant stirring at 8 ^o C for 36 hours

Образовавшийся осадок удаляли центрифугированием при 3000 об/мин. The precipitate formed was removed by centrifugation at 3000 rpm.

К полученному экстракту при постоянном перемешивании добавляли консервант из расчета 1000 мл 1%-ного раствора хинозола в физиологическом растворе на 1 л экстракта. To the obtained extract, with constant stirring, a preservative was added at the rate of 1000 ml of a 1% solution of quinosol in physiological saline per 1 liter of extract.

Затем экстракт ткани плаценты выдерживали 48 ч при температуре 12^oC.Then the placental tissue extract was kept for 48 hours at a temperature of 12 ^o C.

Образовавшиеся в процессе этой операции нерастворимые частицы удаляют фильтрованием через фильтр с размером пор 0,45 мкм. The insoluble particles formed during this operation are removed by filtration through a filter with a pore size of 0.45 μm.

Фильтрат термостатировали при 40^oC в течение 7 суток, после асептического фильтрования продукт выдерживали в герметически закрытом сосуде в течение 30 суток при 10^oC.The filtrate was thermostated at 40 ^o C for 7 days, after aseptic filtration, the product was kept in a sealed vessel for 30 days at 10 ^o C.

После асептического фильтрования средство ампулировали. After aseptic filtration, the agent was ampouled.

Полученное средство "Инфламафертин" представляет собой прозрачную соломенно-желтого цвета жидкость с pH 5,7 - 6,2, показатель преломления 1,3370 - 1,3383, содержание сухого остатка 28,90 - 29,25 мг/мл. The resulting agent “Inflamafertin" is a clear straw-yellow liquid with a pH of 5.7 - 6.2, a refractive index of 1.3370 - 1.3383, and a solids content of 28.90 - 29.25 mg / ml.

Пример 2. При приготовлении свечей противовоспалительного действия брали полученный по примеру 1 раствор в количестве 50 г, и в нем эмульгировали масло-какао в количестве 70 г, при температуре не выше 50^oC. После эмульгирования масса была разлита в формы.Example 2. In the preparation of anti-inflammatory suppositories, the solution obtained in Example 1 was taken in an amount of 50 g, and cocoa butter in an amount of 70 g was emulsified in it, at a temperature not exceeding 50 ^o C. After emulsification, the mass was poured into molds.

В эксперименте препарат обладает выраженной противовоспалительной активностью при различных путях введения и в широком диапазоне доз. Не вызывает аллергических реакций организма. In the experiment, the drug has a pronounced anti-inflammatory activity in various routes of administration and in a wide range of doses. Does not cause allergic reactions of the body.

Испытания препарата проводили на 240 коровах с клиническим диагнозом - атония матки, катаральный, серозный гнойно-катаральный эндометрит. Препарат вводили внутримышечно по 5 мл 1 раз в день всем больным коровам в течение 5 дней. The drug was tested on 240 cows with a clinical diagnosis of uterine atony, catarrhal, serous purulent-catarrhal endometritis. The drug was administered intramuscularly in a dose of 5 ml once a day to all sick cows for 5 days.

В контрольной группе коров с аналогичным диагнозом проводили лечение общепринятыми ветеринарными препаратами. In the control group of cows with a similar diagnosis, treatment with conventional veterinary drugs was performed.

В опытной группе выздоровевших коров было на 85% больше, чем в контрольной группе. There were 85% more cows in the experimental group of recovered cows than in the control group.

Таким образом, особенности заявляемого способа определяют свойства получаемого препарата, заключающиеся в высокой эффективности лечения воспалительных процессов различной этиологии. Thus, the features of the proposed method determine the properties of the resulting drug, which consists in the high efficiency of the treatment of inflammatory processes of various etiologies.

Claims (2)

1. Способ получения противовоспалительного средства, включающий предварительную обработку биологического сырья, экстракцию его в физиологическом растворе, отделение экстракта, отличающийся тем, что в качестве биологического сырья используют детскую плаценту крупного рогатого скота первой половины стельности, а предварительную обработку указанного сырья осуществляют путем удаления из него кровеносных сосудов и выдерживания его при температуре не выше 10^oC в течение суток, затем после гомогенизации сырья и разбавления его физиологическим раствором в соотношении 1 : (1 - 7) выдерживают его до полной экстракции растворимых белков, а к отделенному экстракту добавляют консервант в количестве менее 0,05%, после чего образовавшийся продукт выдерживают при условиях, обеспечивающих полную агрегацию нерастворимых частиц, отделяют образовавшуюся взвесь и полученный раствор термостатируют в течение 7 - 12 суток при температуре 40^oC, и затем после асептического фильтрования выдерживают раствор в течение 30 суток при температуре 10^oC.1. A method of obtaining an anti-inflammatory agent, including pre-treatment of biological raw materials, extraction in physiological saline, separation of the extract, characterized in that the biological placenta use baby placenta of cattle of the first half of pregnancy, and preliminary processing of these raw materials is carried out by removing from it blood vessels and keeping it at a temperature not exceeding 10 ^o C during the day, then after the homogenization of the raw material and diluting it physiologically With a solution of 1: (1 - 7), it is maintained until complete extraction of soluble proteins, and a preservative in an amount of less than 0.05% is added to the separated extract, after which the resulting product is maintained under conditions ensuring complete aggregation of insoluble particles, and the resulting suspension is separated and the resulting solution is thermostated for 7 to 12 days at a temperature of 40 ^o C, and then after aseptic filtration, the solution is kept for 30 days at a temperature of 10 ^o C. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно полученный раствор эмульгируют с основой для свечей при следующем их соотношении, мас.%:
Раствор - 30 - 50
Основа - 50 - 702. The method according to claim 1, characterized in that the additionally obtained solution is emulsified with a base for candles in the following ratio, wt.%:
Solution - 30 - 50
Base - 50 - 70