RU2127310C1

RU2127310C1 - Consortium of strains of microorganism-destructors: aeromonas species, alcaligenes denitrificans, arthrobacter species used for treatment of soil, ground, water from petroleum, petroleum products and mazut residues

Info

Publication number: RU2127310C1
Application number: RU96119716A
Authority: RU
Inventors: Г.П. Голодяев
Original assignee: Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН
Priority date: 1996-10-01
Filing date: 1996-10-01
Publication date: 1999-03-10

Abstract

FIELD: biotechnology, technical microbiology. SUBSTANCE: consortium is isolated from soils of littoral zone of South Far East. Consortium is natural associations of petroleum-oxidizing microorganisms. Oxidative activity of consortium (by the end oxidation product) is 2041 mg CO₂ for 30 days. Advantage of this consortium is a capability to grow on depleted nutrient medium and to oxidize petroleum and petroleum products at high rate. This ensures to use this consortium for biological treatment of soils, grounds and waters polluted with petroleum, petroleum products and mazut residues. EFFECT: enhanced effectiveness of consortium. 1 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке нефтяного загрязнения почв, почвогрунтов и вод на территориях нефтебаз, нефтепромыслов, промпредприятий и других объектах. The invention relates to biotechnology and can be used in the biological treatment of oil pollution of soils, soil and water in oil depots, oil fields, industrial enterprises and other facilities.

Цель изобретения - получение консорциума микроорганизмов - деструкторов нефти для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефтяного загрязнения и остаточной замазученности. The purpose of the invention is to obtain a consortium of microorganisms - oil destructors for cleaning soils, soil and water from oil pollution and residual contamination.

Для достижения поставленной цели выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, прибрежной экосистемы юга Дальнего Востока (Морской торговый порт г. Находка), консорциум микрорганизмов-деструкторов: Aeromonas species КММ НФ 5-2 (КММ НФ - коллекция морских нефтеокисляющих микроорганизмов): Aeromonas species КММ НФ 5-9; Alcaligenes denitrificans КММ НФ 5-1; Alcaligenes denitrificans КММ НФ 5-11; Arthrobacter species КММ НФ 5-7. Это природные ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов, которые сформировались в почве в результате длительного воздействия нефтепродуктов. To achieve this goal, a consortium of destructive microorganisms: Aeromonas species KMM NF 5-2 (KMM NF - a collection of marine oil-oxidizing microorganisms): Aeromonas species was isolated from soils chronically contaminated with oil products from the coastal ecosystem of the south of the Far East (Sea trade port of Nakhodka) KMM NF 5-9; Alcaligenes denitrificans KMM NF 5-1; Alcaligenes denitrificans KMM NF 5-11; Arthrobacter species KMM NF 5-7. These are natural associations of oil-oxidizing microorganisms that have formed in the soil as a result of prolonged exposure to oil products.

Выделенные штаммы микроорганизмов депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, где им присвоены номера: ВКМ В - 2047Д, ВКМ В - 2048Д, ВКМ В - 2049Д, ВКМ В - 2050Д, ВКМ В - 2051Д соответственно. The isolated strains of microorganisms were deposited in the All-Russian collection of microorganisms of the Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of the Russian Academy of Sciences, where they were assigned numbers: VKM B - 2047D, VKM B - 2048D, VKM B - 2049D, VKM B - 2050D, VKM B - 2051D, respectively.

Консорциум штаммов бактерий берут в количествах:
Aeromonas species штамм КММ НФ 5-2 - 30%
Aeromonas species штамм КММ НФ 5-9 - 30%
Alcaligenes denitrificans штамм КММ НФ 5-1 - 15%
Alcaligenes denitrificans штамм КММ НФ 5-11 - 15%
Arthrobacter species штамм КММ НФ 5-7 - 10%
Характеристика штамма Aeromonas species КММ НФ 5-2.A consortium of bacterial strains is taken in quantities:
Aeromonas species strain KMM NF 5-2 - 30%
Aeromonas species strain KMM NF 5-9 - 30%
Alcaligenes denitrificans strain KMM NF 5-1 - 15%
Alcaligenes denitrificans strain KMM NF 5-11 - 15%
Arthrobacter species strain KMM NF 5-7 - 10%
Characterization of the strain Aeromonas species KMM NF 5-2.

Морфолого-культуральные признаки. Палочки с закругленными концами, почти овальные, размером 0,8 х 1,5 ммк, подвижные, грамотрицательные, сапрофит. Morphological and cultural characteristics. Sticks with rounded ends, almost oval, size 0.8 x 1.5 mmk, movable, gram-negative, saprophyte.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательной и бродильный, оксидазо- и каталазоположительные. Гидролизуют казеин, желатин, крахмал. Утилизируют глюкозу, фруктозу, мальтозу, трегалозу. Сорбозу, ксилозу не сбраживают. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 30^oC, pH 7,0 - 7,5, не патогенен.Physiological and biochemical properties. Chemorganotrophs. Metabolism of the respiratory and fermentative, oxidase - and catalase-positive. Casein, gelatin, starch are hydrolyzed. Utilize glucose, fructose, maltose, trehalose. Sorbose, xylose are not fermented. Capable of oxidizing petroleum hydrocarbons. Growth temperature 4 - 30 ^o C, pH 7.0 - 7.5, not pathogenic.

Характеристика штамма Aeromonas species КММ НФ 5-9. Characterization of the strain Aeromonas species KMM NF 5-9.

Морфолого-культуральные признаки. Палочки с закругленными концами, размером 0,8 х 1,5 ммк, подвижные, грамотрицательные, сапрофит. Morphological and cultural characteristics. Sticks with rounded ends, size 0.8 x 1.5 mmk, movable, gram-negative, saprophyte.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный и бродильный. Оксидазо- и каталазоположительные. Гидролизуют казеин, желатин, крахмал. Утилизируют глюкозу, фруктозу, мальтозу, трегалозу. Сорбозу, ксилозу не сбраживают. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 30^oC, pH 7,0 - 7,5, не патогенен.Physiological and biochemical properties. Chemorganotrophs. Metabolism is respiratory and fermentative. Oxidase and catalase positive. Casein, gelatin, starch are hydrolyzed. Utilize glucose, fructose, maltose, trehalose. Sorbose, xylose are not fermented. Capable of oxidizing petroleum hydrocarbons. Growth temperature 4 - 30 ^o C, pH 7.0 - 7.5, not pathogenic.

Характеристика штамма Alcaligenes denitrificans КММ НФ 5-1. Characterization of the strain Alcaligenes denitrificans KMM NF 5-1.

Морфолого-культуральные признаки. Одиночные прямые палочки размером 1,0 х 1,8 ммк, подвижные, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, гладкие, полупрозрачные выпуклые колонии. Сапрофит. Morphological and cultural characteristics. Single straight sticks measuring 1.0 x 1.8 mmc, movable, milling, gram-negative. On agarized media form round, smooth, translucent convex colonies. Saprophyte.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный, оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, твин- 80, желатин не гидролизуют. Сорбозу, раффинозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 35^oC, pH 7,0 - 7,5, не патогенен.Physiological and biochemical properties. Chemorganotrophs. Metabolism is respiratory, oxidase - and catalase-positive. Urease does not form. Starch, tween-80, gelatin is not hydrolyzed. Sorbose, raffinose, lactose, mellibiosis, trehalose are not disposed of. Capable of oxidizing petroleum hydrocarbons. Growth temperature 4 - 35 ^o C, pH 7.0 - 7.5, not pathogenic.

Характеристика штамма Alcaligenes denitrificans КММ НФ 5-11. Characterization of the strain Alcaligenes denitrificans KMM NF 5-11.

Морфолого-культуральные признаки. Одиночные прямые палочки размером 0,5 х 1,2 ммк, подвижные, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют небольшие, гладкие, выпуклые слизистые полупрозрачные колонии. Сапрофит. Morphological and cultural characteristics. Single straight sticks measuring 0.5 x 1.2 mmk, movable, milling, gram-negative. On agarized media form small, smooth, convex mucous translucent colonies. Saprophyte.

Характеристика штамма Arthrobacter species КММ НФ 5-7. Characterization of the strain Arthrobacter species KMM NF 5-7.

Морфолого-культуральные признаки. Короткие палочки с возрастом укорачиваются до кокков, диаметром 10 ммк, грамположительные. На плотных питательных средах образуют округлые, гладкие блестящие, беловатые колонии. Сапрофит. Morphological and cultural characteristics. Short sticks shorten with age to cocci, with a diameter of 10 mmc, gram-positive. On dense nutrient media form rounded, smooth, shiny, whitish colonies. Saprophyte.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Каталазоположительные, оксидазоотрицательные. Желатин гидролизуют. Крахмал, твин- 80 не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 35^oC, pH 7,0 - 7,5, не патогенен.Physiological and biochemical properties. Chemorganotrophs. Metabolism is respiratory. Catalase-positive, oxidase-negative. Gelatin is hydrolyzed. Starch, tween-80 is not disposed of. Capable of oxidizing petroleum hydrocarbons. Growth temperature 4 - 35 ^o C, pH 7.0 - 7.5, not pathogenic.

Предлагаемый консорциум микроорганизмов хорошо растет на жидкой среде следующего состава, г/л: NH₄NО₃ - 1,0, K₂HPO₄ - 1,0, KH₂PO₄ - 1,0, MgSO₄ - 0,2, CaCl₂ - 0,02, FeCl - 2 капли концентрированного раствора, вода дистиллированная - 1000 мл. В качестве единственного источника углерода добавляют 10 мл нефтепродукта.The proposed consortium of microorganisms grows well on a liquid medium of the following composition, g / l: NH ₄ NO ₃ - 1.0, K ₂ HPO ₄ - 1.0, KH ₂ PO ₄ - 1.0, MgSO ₄ - 0.2, CaCl ₂ - 0.02, FeCl - 2 drops of a concentrated solution, distilled water - 1000 ml. As a single carbon source, 10 ml of oil is added.

Оптимальная температура роста 25 - 30^oC, pH 7,0 - 7,2 (Ворошилова, Дианова. Микробиология, т. 31, вып. 4, 1952).The optimum growth temperature is 25-30 ^o C, pH 7.0 - 7.2 (Voroshilova, Dianova. Microbiology, vol. 31, issue 4, 1952).

Интенсивный рост консорциума наблюдается при использовании среды следующего состава, г/л: K₂HPO₄ - 10,0, KH₂PO₄ - 1,0, NH₄NО₃ - 2,0, вода дистиллированная - 1000 мл, нефтепродукт - 10 мл (Дядечко, Толстокорова, Морозова. А.с. N 1076446, 1984).The intensive growth of the consortium is observed when using the following composition, g / l: K ₂ HPO ₄ - 10.0, KH ₂ PO ₄ - 1.0, NH ₄ NO ₃ - 2.0, distilled water - 1000 ml, oil - 10 ml (Uncle, Tolstokorova, Morozova. A.S. N 1076446, 1984).

Среда, состоящая из 0,3% водного раствора нитроаммофоски, где азот, фосфор и калий сбалансированы по 17%, способствует активному нарастанию биомассы консорциума. An environment consisting of a 0.3% aqueous solution of nitroammofoski, where nitrogen, phosphorus and potassium are balanced at 17%, contributes to an active increase in the biomass of the consortium.

Заявленный консорциум был выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, путем высева почвенного образца на агаризованную и жидкую питательные среды. Обычно выделенные штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов имеют невысокую активность, поэтому необходимо повысить их активность путем адаптации. The claimed consortium was isolated from soils chronically contaminated with oil products by plating a soil sample on agarized and liquid nutrient media. Typically, isolated strains of oil-oxidizing microorganisms have low activity, so it is necessary to increase their activity by adaptation.

Адаптацию нефтеокисляющих микроорганизмов к повышенным концентрациям нефтепродуктов в среде проводят путем частых пересевов на свежую питательную среду. Делают это для того, чтобы в питательной среде не происходило накопление токсических метаболитов микробного происхождения и чтобы выделить более устойчивые особи нефтеокисляющих микроорганизмов, т.к. ослабленные клетки гибнут или плохо растут. Интенсивный рост дают только клетки физиологически активные. Таким образом проводят отбор активных клеток и получают консорциум. The adaptation of oil-oxidizing microorganisms to increased concentrations of oil products in the medium is carried out by frequent reseeding on a fresh nutrient medium. They do this in order to prevent the accumulation of toxic metabolites of microbial origin in the nutrient medium and to isolate more stable individuals of oil-oxidizing microorganisms, because weakened cells die or grow poorly. Intensive growth is given only by physiologically active cells. Thus, the selection of active cells is carried out and a consortium is obtained.

Методом математического анализа установлено, что в данном консорциуме бактерии рода Aeromonas являются доминирующими видами и типично часто встречаемыми формами бактерий - до 60% всех микроорганизмов в популяции нефтеокислителей. Бактерии рода Alcaligenes относятся к содоминантным видам (30% от общего числа бактерий консорциума). Arthrobacter species КММ НФ 5-7 относится к типично редкому виду по встречаемости и составляет 10%. By the method of mathematical analysis, it was found that in this consortium bacteria of the genus Aeromonas are the dominant species and typically encountered forms of bacteria - up to 60% of all microorganisms in the oil oxidizing population. Bacteria of the genus Alcaligenes belong to co-dominant species (30% of the total number of bacteria of the consortium). Arthrobacter species KMM NF 5-7 refers to a typically rare species in terms of occurrence and is 10%.

Окислительную активность консорциума определяют по конечному продукту окисления, т.е. по выделению CO₂.The oxidative activity of the consortium is determined by the final oxidation product, i.e. for the emission of CO ₂ .

В колбы емкостью 500 мл, последовательно герметично соединенные, вносят поглотитель углекислоты BaOH. В колбу с инокулянтом вносят 250 мл среды Ворошиловой - Диановой, 2,5 мл нефтепродукта и 5 мл трехсуточной культуры консорциума с содержанием 1,0•10⁵ кл/мл. Подачу атмосферного воздуха проводят с помощью дозатора А - 2 со скоростью 34 мл/мин. Для того, чтобы в колбу с инокулянтом не поступал CO₂, воздух пропускает через 2 колбы с поглотителем CO₂, и аэрация инокулянта проходит без углекислоты. После окисления нефтепродуктов аэрируемый воздух дополнительно проходит через 2 колбы с поглотителем CO₂, далее BaOH оттитровывают HCl и определяют окислительную способность по количеству выделенного углекислого газа. Для установления чистоты опыта одновременно ставят при таких же условиях еще 2 контроля. Один с реактивами, без консорциума и нефтепродуктов, другой с реактивами, нефтепродуктами, но без консорциума. В контроле содержание CO₂ не обнаружено. Длительность опыта 30 суток. Окислительная активность консорциума составляет 2041 мг CO₂.In a 500 ml flask connected in series hermetically connected, a BaOH absorbent is introduced. 250 ml of Voroshilova-Dianova medium, 2.5 ml of oil product and 5 ml of a three-day culture of the consortium containing 1.0 • 10 ⁵ cells / ml are added to the flask with the inoculant. The supply of atmospheric air is carried out using dispenser A - 2 at a speed of 34 ml / min. In order to prevent CO ₂ from entering the flask with the inoculant, air passes through 2 flasks with a CO ₂ absorber, and the inoculant is aerated without carbon dioxide. After oxidation of petroleum products, the aerated air additionally passes through 2 flasks with a CO ₂ absorber, then BaOH is titrated with HCl and the oxidative ability is determined by the amount of carbon dioxide emitted. To establish the purity of the experiment, two more controls are simultaneously set under the same conditions. One with reagents, without a consortium and oil products, the other with reagents, oil products, but without a consortium. In the control, the content of CO _{2 was} not detected. The duration of the experiment is 30 days. The oxidative activity of the consortium is 2041 mg CO ₂ .

Таким образом, предлагаемый консорциум штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов обладает более высокой скоростью окисления нефтепродуктов. Thus, the proposed consortium of strains of oil-oxidizing microorganisms has a higher oxidation rate of oil products.

Применение консорциума. Для очистки нефтяного пятна на почве размером 10 х 10 м, глубиной загрязнения 0,1 -0,2 м с содержанием нефтепродуктов 20% берут 0,7 кг минерального удобрения нитроаммофоски, в котором азот, фосфор, калий сбалансированы по 17%, растворяют в 200 л воды. Загрязненный участок поливают водным раствором нитроаммофоски (1 л/м²) за 2 дня до вспашки. После вспашки через 2 дня вносят дополнительно водный раствор нитроаммофоски. Норма полива 1 л/м². Эта операция необходима для активизации как сапрофитной, так и аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры. Через неделю после внесения минеральных удобрений вносят инокулянт консорциума (водный раствор). Титр 1,0 • 10¹² клеток в 1 мл. Норма полива 1 л/м². Через месяц содержание нефтепродукта в почве составляет 11%, через 2 месяца - 4%, через 3 месяца нефтепродуктов в почве не обнаружено.Consortium application. To clean an oil slick on soil with a size of 10 x 10 m, a depth of contamination of 0.1 -0.2 m with an oil content of 20%, 0.7 kg of mineral fertilizer nitroammofoski, in which nitrogen, phosphorus, potassium are balanced at 17%, are dissolved in 200 liters of water. The contaminated area is watered with an aqueous solution of nitroammofoski (1 l / m ² ) 2 days before plowing. After plowing after 2 days, an additional aqueous solution of nitroammofoski is added. Watering rate 1 l / m ² . This operation is necessary to activate both saprophytic and native oil-oxidizing microflora. A week after the application of mineral fertilizers, a consortium inoculant (aqueous solution) is introduced. The titer is 1.0 • 10 ¹² cells in 1 ml. Watering rate 1 l / m ² . After a month, the oil content in the soil is 11%, after 2 months - 4%, after 3 months no oil products were found in the soil.

Таким образом, преимуществом предлагаемого консорциума штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов является способность расти на обедненной питательной среде, а также с высокой скоростью окислять нефть и нефтепродукты, что позволяет эффективно использовать его при биологической очистке почв, почвогрунтов и вод, загрязненных нефтепродуктами и остаточной замазученностью. Thus, the advantage of the proposed consortium of strains of oil-oxidizing microorganisms is the ability to grow on a depleted nutrient medium, as well as oxidize oil and oil products at a high rate, which makes it possible to effectively use it in the biological treatment of soils, soil and water contaminated with oil products and residual contamination.

Claims

Консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Acromonas species ВКМ В-2047Д, Acromonas species ВКМ В-2048Д, Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2049Д, Alcaligenes denitrificans ВКМ В - 2050 Д, Arthrobacter species ВКМ В - 2051Д, используемый для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности. Consortium of strains of destructive microorganisms: Acromonas species VKM B-2047D, Acromonas species VKM B-2048D, Alcaligenes denitrificans VKM B-2049D, Alcaligenes denitrificans VKM B-2050D, Arthrobacter species VKM B-2051D, used for soil and soil treatment from oil, oil products and residual oil contamination.