RU2125888C1 - Method of preparing monomeric albumin - Google Patents

Abstract

FIELD: biochemical methods. SUBSTANCE: albumin is obtained from albumin-containing solution by denaturation of foreign proteins with ethanol in presence of caprylic acid followed by separation of albumin from centrifuge. Clarified centrifuge is diluted with distilled water or physiologically acceptable buffer to 1-10% ethanol concentration and albumin is concentrated by ultrafiltration followed by diafiltration. Then, albumin is pasteurized in bulk, cooled, and subjected to additional sterilizing filtration. EFFECT: enabled monomer protein preparation. 2 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к способу получения альбумина. The invention relates to medicine, namely to a method for producing albumin.

Препараты сывороточного альбумина, применяемые в настоящее время, занимают первое место по частоте и объему трансфузий среди препаратов крови, в связи с чем качественным показателям альбумина уделяется первоочередное внимание. The currently used serum albumin preparations take the first place in the frequency and volume of transfusions among blood products, and therefore, priority is given to the quality of albumin.

Основным показателем качества альбумина является сохранение нативности молекул альбумина в процессе получения и хранения препарата. Поэтому препарат с высоким содержанием мономерного альбумина имеет более высокую лечебную эффективность, осмотическую активность, длительный период циркуляции в организме и отличается отсутствием аллергических реакций (1). The main indicator of the quality of albumin is the preservation of the nativeness of albumin molecules during the preparation and storage of the drug. Therefore, a drug with a high content of monomeric albumin has a higher therapeutic efficacy, osmotic activity, a long period of circulation in the body and is characterized by the absence of allergic reactions (1).

В литературе известны способы получения мономерного альбумина. Однако они не нашли применения в крупномасштабном производстве либо из-за использования химических реагентов, не разрешенных Фармакопеей, таких как йодацетамид (2), либо из-за применения дорогостоящих реагентов - полиэтиленгликоля, ЭДТА, глютатиона, цистеина или малеиновой кислоты (3, 4, 5, 6), либо из-за больших капитальных и текущих затрат, которые требуются при использовании хроматографического оборудования и сорбентов (7). Methods for producing monomeric albumin are known in the literature. However, they did not find application in large-scale production either because of the use of chemicals not approved by the Pharmacopoeia, such as iodoacetamide (2), or because of the use of expensive reagents - polyethylene glycol, EDTA, glutathione, cysteine or maleic acid (3, 4, 5, 6), or because of the large capital and current costs that are required when using chromatographic equipment and sorbents (7).

Самый распространенный этанольный метод Кона достаточно трудоемкий, дорогостоящий, требует специального оборудования на всех этапах получения, отличается многостадийностью процесса, относительно малым выходом конечного продукта и не позволяет получать альбумин с высоким содержанием мономеров (8). Cohn's most common ethanol method is rather laborious, expensive, requires special equipment at all stages of production, is characterized by a multi-stage process, a relatively low yield of the final product, and does not allow the production of albumin with a high content of monomers (8).

Наиболее близким к заявляемому способу является метод получения альбумина с использованием каприлата натрия (9). Способ предусматривает разделение смеси белков этиловым спиртом в концентрации (25% по объему) в присутствии каприлата натрия (0,3% по объему), отделение осадка денатурированных белков центрифугированием, осветляюшую фильтрацию центрифугата, осаждение очищенного альбумина, растворение осадки с последующим отделением спирта известными приемами и стабилизацией целевого продукта. На этом способе основан промышленный регламент производства альбумина (10). Closest to the claimed method is a method for producing albumin using sodium caprylate (9). The method involves separation of a protein mixture of ethanol in concentration (25% by volume) in the presence of sodium caprylate (0.3% by volume), separation of the precipitate of denatured proteins by centrifugation, clarification of the centrifugate filtration, precipitation of purified albumin, dissolution of the precipitate, followed by separation of the alcohol by known methods and stabilization of the target product. The industrial regulation of albumin production is based on this method (10).

Преимущества этого каприлатного метода в сравнении с другими каприлатными методами (4, 5, 11) в том, что процесс денатурации примесных белков ведется при температуре от 0 до 30^oC, что существенно снижает энергозатраты. Кроме того, только данный способ получения альбумина отвечает требованиям ВОЗ, согласно которым время выдерживания альбумина при температуре 60^oC не должно превышать 11 ч (12), в отличие от других модификаций каприлатного способа (4, 5, 11).The advantages of this caprilate method in comparison with other caprilat methods (4, 5, 11) are that the process of denaturation of impurity proteins is carried out at a temperature from 0 to 30 ^o C, which significantly reduces energy consumption. In addition, only this method of producing albumin meets the WHO requirements, according to which the exposure time of albumin at a temperature of 60 ^o C should not exceed 11 hours (12), in contrast to other modifications of the caprilate method (4, 5, 11).

Однако, используя прототип, не удается получить мономерный альбумин из-за смены его фазового состояния в процессе получения: перевод в осадок при высоких концентрациях денатурирующего агента (40% этанол) и лиофильное высушивание способствуют образованию агрегатов. Пастеризацию конечного продукта проводят во флаконах, без дальнейшего удаления денатурированных белков и липопротеинов из лекарственной формы препарата. Это приводит к полимеризации альбумина и отрицательно сказывается на стабильности препарата при хранении. Кроме того, отсутствует контроль температуры непосредственно в растворе альбумина во время пастеризации и отсчет времени ведется по достижении температуры 60^oC водой, окружающей флаконы с препаратом. Недостаточное время прогрева может представлять вирусологическую опасность в отношении вирусов гепатита и СПИДа, а передерживание препарата при этой температуре ведет к полимеризации альбумина.However, using the prototype, it is not possible to obtain monomeric albumin due to a change in its phase state during production: precipitation at high concentrations of the denaturing agent (40% ethanol) and freeze drying contribute to the formation of aggregates. The pasteurization of the final product is carried out in vials, without further removal of the denatured proteins and lipoproteins from the dosage form of the drug. This leads to the polymerization of albumin and adversely affects the stability of the drug during storage. In addition, there is no temperature control directly in the albumin solution during pasteurization and the countdown is carried out upon reaching a temperature of 60 ^o C water surrounding the vials with the drug. Insufficient warm-up time can be a virological danger for hepatitis and AIDS viruses, and overexposure of the drug at this temperature leads to the polymerization of albumin.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа, условия проведения которого позволяют сохранить мономерность и апирогенность альбумина в процессе производства и хранения. The problem to which the invention is directed is the development of a method, the conditions of which allow to maintain the monomerism and pyrogen-free nature of albumin during production and storage.

Достигаемый технический результат заключается в получении мономерного апирогенного альбумина, стабильного при хранении и значительном сокращении времени проведения технологического процесса. Кроме того, заявляемый способ позволяет повысить выход конечного продукта. Achievable technical result consists in obtaining monomeric pyrogen-free albumin, stable during storage and a significant reduction in the time of the process. In addition, the inventive method allows to increase the yield of the final product.

Сущность метода заключается в следующем. Альбумин получают из альбуминсодержащих растворов денатурацией примесных белков этанолом в присутствии каприлат-иона, удаляют денатурированные белки, осветляют центрифугат микрофильтрацией, разводят фильтрат до содержания этанола 1-10%, концентрируют альбумин ультрафильтрацией с последующей диафильтрацией. После этого выполняют стерилизующую фильтрацию, проводят пастеризацию "бач"-методом (в объеме), после чего проводят дополнительную стерилизующую фильтрацию для удаления денатурированных белков и липопротеинов фильтрацией. В заключение осуществляют розлив целевого продукта. The essence of the method is as follows. Albumin is obtained from albumin-containing solutions by denaturation of impurity proteins with ethanol in the presence of caprylate ion, denatured proteins are removed, the centrifugate is clarified by microfiltration, the filtrate is diluted to an ethanol content of 1-10%, and albumin is concentrated by ultrafiltration followed by diafiltration. After this, sterilizing filtration is performed, pasteurization by the “bach” method (in volume) is carried out, after which additional sterilizing filtration is carried out to remove denatured proteins and lipoproteins by filtration. In conclusion, carry out the bottling of the target product.

В отличие от прототипа, в заявляемом способе альбумин извлекают непосредственно из осветленного центрифугата ультрафильтрацией, исключая стадию перевода альбумина в осадок, одновременно во время последующей диафильтрации удаляется этанол, что исключает необходимость лиофилизации. Вместо пастеризации во флаконах используется пастеризация в "объеме" с последующим удалением денатурированных белков и липопротеинов дополнительной стерилизующей фильтрацией. In contrast to the prototype, in the inventive method, albumin is extracted directly from the clarified centrifugate by ultrafiltration, excluding the step of converting albumin to precipitate, while ethanol is removed during subsequent diafiltration, which eliminates the need for lyophilization. Instead of pasteurization in vials, pasteurization in volume is used followed by removal of denatured proteins and lipoproteins by additional sterilizing filtration.

Совокупность признаков заявленного изобретения позволили получить следующие преимущества. Получение альбумина из центрифугата ультрафильтрацией, минуя стадию осаждения, позволяет избежать дегидратации молекулы альбумина и, как следствие, его агрегации и полимеризации. Диафильтрация против 5-7 объемов позволяет достичь такого содержания этанола, при котором не происходит полимеризации во время получения и хранения альбумина. Замена стадии осаждения на ультрафильтрацию позволяет также увеличить выход целевого продукта на 23% (табл. 1) в связи с тем, что альбумин является хорошо растворимым белком плазмы и его невозможно полностью перевести в осадок известными способами. The combination of features of the claimed invention allowed to obtain the following advantages. Obtaining albumin from the centrifugate by ultrafiltration, bypassing the precipitation stage, avoids the dehydration of the albumin molecule and, as a consequence, its aggregation and polymerization. Diafiltration against 5-7 volumes allows you to achieve such an ethanol content that does not polymerize during the production and storage of albumin. The replacement of the precipitation stage by ultrafiltration also allows to increase the yield of the target product by 23% (Table 1) due to the fact that albumin is a highly soluble plasma protein and cannot be completely precipitated by known methods.

Пастеризация стерильного раствора альбумина в объеме позволяет точно осуществлять контроль и регулировать процесс подъема и охлаждения температуры альбумина в процессе пастеризации именно внутри самого раствора препарата. Процесс подъема, выдерживания, охлаждения температуры объективно регистрируется на диаграмме с отметкой времени. Так как процесс ведется при постоянном перемешивании, то достигается равномерность температуры в любой точке раствора, это гарантирует отсутствие высокого градиента температуры. Последующая осветляющая и стерилизующая фильтрация охлажденного продукта позволяет удалить из препарата невидимые невооруженным глазом денатурированные белки, липопротеины, которые остаются в препаратах, пастеризованных во флаконах. Эти нестабильные соединения могут выступать в качестве катализаторов процесса полимеризации во время хранения препарата. Pasteurization of a sterile albumin solution in volume allows you to precisely control and regulate the process of raising and cooling the temperature of albumin during pasteurization exactly inside the drug solution itself. The process of raising, maintaining, cooling the temperature is objectively recorded on a diagram with a time stamp. Since the process is carried out with constant stirring, a uniform temperature is achieved at any point in the solution, this ensures the absence of a high temperature gradient. Subsequent clarifying and sterilizing filtration of the chilled product allows you to remove denatured proteins, lipoproteins that remain in preparations pasteurized in bottles, that are invisible to the naked eye. These unstable compounds can act as catalysts for the polymerization process during drug storage.

Определение молекулярных параметров альбумина - содержания полимеров, димеров, мономеров, фрагментов осуществлялось согласно требованиям Европейской Фармакопеи методом гель-фильтрации на ультрагеле АсА34 (Фармация-ЛКБ, Швеция). The molecular parameters of albumin — the content of polymers, dimers, monomers, and fragments — were determined in accordance with the requirements of the European Pharmacopoeia by gel filtration on AsA34 ultragel (Pharmacia-LKB, Sweden).

Пирогенность альбумина оценивалась согласно Государственной Фармакопее СССР, 11 издание, вып. 2 (13). Препараты 10% альбумина вводились кроликам в дозе 3 мл/кг массы тела внутривенно. Препарат считали апирогенным, если сумма повышения температур у трех кроликов меньше или равна 1,4^oC(Σ ≤ +1,4)^oC.
Представленные в табл. 1 данные указывают на высокое содержание мономеров (не менее 98%) и отсутствие полимеров, фрагментов в препаратах альбумина, полученных по заявляемому способу. Сравнение с прототипом (табл. 1) наглядно показывает значительное сокращение времени технологического процесса, увеличение выхода альбумина с одного литра плазмы и практически 100% получение апирогенного продукта.Pyrogenicity of albumin was evaluated according to the State Pharmacopoeia of the USSR, 11th edition, vol. 2 (13). Preparations of 10% albumin were administered to rabbits at a dose of 3 ml / kg of body weight intravenously. The drug was considered pyrogen-free if the sum of the temperature increase in three rabbits was less than or equal to 1.4 ^o C (Σ ≤ +1.4) ^o C.
Presented in the table. 1 data indicate a high monomer content (at least 98%) and the absence of polymers, fragments in albumin preparations obtained by the present method. Comparison with the prototype (table. 1) clearly shows a significant reduction in the time of the technological process, an increase in the output of albumin from one liter of plasma and almost 100% production of a pyrogen-free product.

Важным для препарата альбумина является не только нативность свежеприготовленного альбумина, но и сохранение мономерности во время хранения. Представленные данные в табл. 2 указывают на отсутствие достоверных различий в молекулярных параметрах альбумина в течение всего срока наблюдения - 7 лет (при сроке годности препарата 5 лет), следовательно, полученный альбумин стабилен. Способ осуществляют следующим образом. Плазму, центрифугат фракции II + III по Кону или альбуминсодержащий раствор с содержанием белка 1-5,5% обрабатывают этанолом в концентрации 18-35% в присутствии каприлат-иона в концентрации 0,1-0,6% при 0-30^oC, pH 2,0-5,0 и удаляют денатурированные белки центрифугированием. Полученный раствор осветляют фильтрацией, затем 0,1-1,0 М раствором NaOH повышают pH до 6,0-7,5 и разбавляют фильтрат дистиллированной водой или физиологически приемлемым буфером (например, 0,15 М раствором натрий хлорида) до концентрации этанола не выше 10%. Далее проводят ультрафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах или полых волокнах с пределом задержания 10000-30000 Да с последующей диафильтрацией для удаления этанола, солей и низкомолекулярных фрагментов с использованием 5-7 объемов 0-0,15 М раствора натрий хлорида или другого физиологически приемлемого буфера. Затем проводят окончательное концентрирование до содержания белка на 2-3% больше, чем концентрация белка в товарной продукции (от 5 до 25%). Проводят стерилизующую фильтрацию через мембраны 0,1-0,2 мк и перекачивают в стерилизованную емкость с мешалкой и рубашкой из нержавеющей стали или с эмалевым покрытием. Осуществляют пастеризацию раствора при 60^oC в течение 10 ч (повышение температуры осуществляют в течение 1 ч). После пастеризации альбумин охлаждают до температуры 10-20^oC в течение 1 ч, а затем проводят дополнительную стерилизующую фильтрацию и розлив по флаконам.Important for the albumin preparation is not only the nativeness of freshly prepared albumin, but also the preservation of monomerity during storage. The data presented in table. 2 indicate the absence of significant differences in the molecular parameters of albumin during the entire observation period - 7 years (with a shelf life of 5 years), therefore, the resulting albumin is stable. The method is as follows. Cohn plasma centrifugate fraction II + III or albumin-containing solution with a protein content of 1-5.5% is treated with ethanol at a concentration of 18-35% in the presence of caprylate ion at a concentration of 0.1-0.6% at 0-30 ^o C pH 2.0-5.0 and the denatured proteins are removed by centrifugation. The resulting solution is clarified by filtration, then a 0.1-1.0 M NaOH solution is used to increase the pH to 6.0-7.5 and the filtrate is diluted with distilled water or a physiologically acceptable buffer (for example, 0.15 M sodium chloride solution) to an ethanol concentration of above 10%. Then, ultrafiltration is carried out in a tangential flow on membranes or hollow fibers with a retention limit of 10000-30000 Yes, followed by diafiltration to remove ethanol, salts and low molecular weight fragments using 5-7 volumes of 0-0.15 M sodium chloride solution or other physiologically acceptable buffer. Then the final concentration is carried out until the protein content is 2-3% more than the protein concentration in the marketable products (from 5 to 25%). Sterilizing filtration is carried out through 0.1-0.2 microns membranes and pumped into a sterilized container with a stirrer and a stainless steel jacket or with an enamel coating. The solution is pasteurized at 60 ^° C. for 10 hours (temperature increase is carried out for 1 hour). After pasteurization, albumin is cooled to a temperature of 10-20 ^o C for 1 h, and then carry out additional sterilizing filtration and bottling.

Пример N 1. Берут 200 л донорской плазмы. Путем фракционирования плазмы по Кону получают фракцию II+III, в количестве 380 л, содержащую 25% этанола, 2% белка, и pH 7,0. К полученному раствору добавляют каприловую кислоту до ее конечной концентрации 0,3%. Температуру раствора устанавливают 16^oC подачей теплой воды в рубашку реактора, pH смеси снижают 1 М раствором соляной кислоты в количестве 10,3 л до pH смеси 3,3, перемешивают в течение 15 минут при 16^oC. Затем pH смеси смещают до 4,4 1 М раствором NaOH, после чего центрифугируют для удаления образовавшегося осадка. Центрифугат осветляют фильтрацией через фильтрокартон Ф-1 (Тамбов). Получают фильтрат в объеме 424 л, содержащий 1,3% белка. В растворе подводят pH 1 М NaOH до pH 6,5 и добавляют 550 л дистиллированной воды до концентрации этанола в растворе 10%. Концентрируют раствор ультрафильтрацией до 9% белка на ультрафильтрационной установке с полыми волокнами ВПУ-15 с последующей диафильтрацией в постоянном объеме против 5 объемов 0,45% раствора натрий хлорида. Проводят окончательное концентрирование до содержания белка 10,5%. Проводят стерилизующую фильтрацию и заливают 52 л полуфабриката альбумина в стерильный сосуд, вместимостью 60 л из нержавеющей стали (с мешалкой и рубашкой). Осуществляют пастеризацию при 60^oC в течение 10 ч (повышение температуры осуществляют в течение 1 ч). После пастеризации раствор в течение 1 часа охлаждают до температуры 20^oC путем подачи холодной водопроводной воды в рубашку реактора. Проводят осветляющую, а затем стерилизующую фильтрацию. Целевой продукт разливают по флаконам. Выход альбумина - 90,25% Пирогенность препарата составляет: +0,2; +0,3; +0,3^oC, в сумме +0,8^oC. Молекулярные параметры (%): полимеры 0, димеры - 0,9, мономеры - 99,1, фрагменты - отсутствуют. Длительность технологического цикла - 20 ч.Example No. 1. Take 200 l of donor plasma. By Cohn plasma fractionation, a fraction of II + III is obtained, in an amount of 380 L, containing 25% ethanol, 2% protein, and a pH of 7.0. Caprylic acid is added to the resulting solution to a final concentration of 0.3%. The temperature of the solution is set to 16 ^° C. by supplying warm water to the jacket of the reactor, the pH of the mixture is reduced by 1 M hydrochloric acid in an amount of 10.3 L to a pH of 3.3, stirred for 15 minutes at 16 ^° C. Then the pH of the mixture is shifted to 4 , 4 1 M NaOH solution, and then centrifuged to remove the precipitate formed. The centrifugate is clarified by filtration through filter board F-1 (Tambov). A 424 L filtrate containing 1.3% protein is obtained. The solution was adjusted with a pH of 1 M NaOH to a pH of 6.5 and 550 l of distilled water was added to an ethanol concentration of 10% in the solution. The solution is concentrated by ultrafiltration to 9% protein in an ultrafiltration unit with VPU-15 hollow fibers, followed by diafiltration in a constant volume against 5 volumes of a 0.45% sodium chloride solution. The final concentration is carried out to a protein content of 10.5%. Sterilized filtration is carried out and 52 l of prefabricated albumin is poured into a sterile vessel with a capacity of 60 l of stainless steel (with stirrer and jacket). Pasteurization is carried out at 60 ^° C. for 10 hours (temperature increase is carried out for 1 hour). After pasteurization, the solution is cooled for 1 hour to a temperature of 20 ^o C by supplying cold tap water into the jacket of the reactor. A clarifying and then sterilizing filtration is carried out. The target product is poured into bottles. The output of albumin is 90.25%. Pyrogenicity of the drug is: +0.2; +0.3; +0.3 ^o C, in the amount of +0.8 ^o C. Molecular parameters (%): polymers 0, dimers 0.9, monomers 99.1, fragments absent. The duration of the technological cycle is 20 hours.

Пример N 2. Исходное сырье - центрифугат II+III (из плацентарной сыворотки), в количестве 380 л, содержащий 25% этанола, 2,3% белка, pH раствора 7,0. К полученному раствору добавляют каприлат натрия до конечной концентрации 0,35%. Операции по получению фильтрата проводят по примеру 1. Далее в фильтрате (объем 424 л) подводят pH 7,2 и разбавляют 0,02 М раствором натрий хлорида температуры 16^oC в соотношении 1:1,5. Первоначально концентрируют ультрафильтрацией до 7% белка на ультрафильтрационной установке фирмы Миллипор (Pellicon Cassette, мембраны PTGC, 10000 Да, 10 м²) с последующей диафильтрацией в постоянном объеме против 6 объемов апирогенной дистиллированной воды. Проводят окончательное концентрирование до 20,5% по белку. Стерильно фильтруют через мембрану 0,2 мк (фирмы Миллипор). Передавливают 26 л полуфабриката в стерильный эмалированный сосуд, вместимостью 60 л (с мешалкой и рубашкой). После пастеризации охлаждают до температуры 20^oC в течение 45 минут. Стерильно фильтруют и разливают по флаконам Выход: 88,10%. Тест на пирогенность: повышение температуры на +0,1; +0,2; +0,2^oC (Σ = +0,5^oC). Молекулярные параметры (%): полимеры 0, димеры 0,4, мономеры 99,6, фрагменты 0. Время, необходимое для получения 20% альбумина - 22 ч.Example N 2. The feedstock is a centrifugate II + III (from placental serum), in an amount of 380 l, containing 25% ethanol, 2.3% protein, the pH of the solution is 7.0. Sodium caprylate is added to the resulting solution to a final concentration of 0.35%. The operations to obtain the filtrate are carried out according to example 1. Next, in the filtrate (volume 424 l), a pH of 7.2 is adjusted and diluted with a 0.02 M solution of sodium chloride at a temperature of 16 ^° C. in a ratio of 1: 1.5. Initially, ultrafiltration was concentrated to 7% protein on a Millipore ultrafiltration unit (Pellicon Cassette, PTGC membranes, 10,000 Da, 10 m ² ) followed by diafiltration in a constant volume against 6 volumes of pyrogen-free distilled water. The final concentration is up to 20.5% for protein. Sterilely filtered through a 0.2 μm membrane (Millipore company). 26 l of the semi-finished product is pushed into a sterile enameled vessel with a capacity of 60 l (with stirrer and jacket). After pasteurization, it is cooled to a temperature of 20 ^o C for 45 minutes. Sterilely filtered and poured into vials. Yield: 88.10%. Pyrogenicity test: temperature increase by +0.1; +0.2; +0.2 ^o C (Σ = +0.5 ^o C). Molecular parameters (%): polymers 0, dimers 0.4, monomers 99.6, fragments 0. The time required to obtain 20% albumin is 22 hours.

Пример N 3. Исходное сырье плазма или сыворотка крупного рогатого скота. В 200 л сыворотки вводят каприловую кислоту до концентрации 0,5%, 96% этанол с температурой "10^oC" до конечной концентрации 25 об.%. Операции по получению центрифугата осуществляют согласно примеру 1. Далее центрифугат осветляют микрофильтрацией в тангенциальном потоке на микрофильтрационной установке (0,2 мк) фирмы Sartorius (ФРГ). В фильтрате подводят pH 1 М раствором гидроокиси натрия до pH 6,8 и разбавляют 0,02 М раствором натрий хлорида температуры 16^oC в соотношении 1:1,5. Проводят концентрирование альбумина ультрафильтрацией до 6% белка на ультрафильтрационной установке фирмы Sartorius с площадью 8 м² с последующей диафильтрацией в постоянном объеме против 7 объемов физиологического раствора. Проводят окончательное концентрирование до 5,3% по белку. Стерильно фильтруют через мембрану 0,2 мк (фирмы Гельман, США). Передавливают 104 л полуфабриката в стерильный эмалированный сосуд, вместимостью 150 л (с мешалкой и рубашкой). Осуществляют пастеризацию при 60^oC в течение 10 ч (повышение температуры осуществляют в течение 1 ч). После пастеризации охлаждают до температуры 15^oC в течение 45 минут. Стерильно фильтруют и разливают по флаконам. Выход: 87,66%. Тест на пирогенность: повышение температуры на +0,1; +0,1; +0,2^oC (Σ = +0,4^oC). Молекулярные параметры, %: полимеры 0, димеры 0,5, мономеры 99,5, фрагменты 0. Время, необходимое для получения 5% альбумина - 20 ч.Example No. 3. Raw materials plasma or cattle serum. Caprylic acid is introduced into 200 l of serum to a concentration of 0.5%, 96% ethanol with a temperature of "10 ^o C" to a final concentration of 25 vol.%. Operations to obtain a centrifugate are carried out according to example 1. Next, the centrifuge is clarified by microfiltration in a tangential flow in a microfiltration unit (0.2 microns) of the company Sartorius (Germany). The pH of the filtrate was adjusted with a 1 M sodium hydroxide solution to a pH of 6.8 and diluted with a 0.02 M sodium chloride solution at a temperature of 16 ^° C in a ratio of 1: 1.5. Albumin is concentrated by ultrafiltration up to 6% protein on an Sartorius ultrafiltration unit with an area of 8 m ² followed by diafiltration in a constant volume against 7 volumes of physiological saline. The final concentration is carried out up to 5.3% for protein. Sterilely filtered through a 0.2 μm membrane (Gelman, USA). Squeeze 104 l of the semi-finished product into a sterile enameled vessel with a capacity of 150 l (with stirrer and jacket). Pasteurization is carried out at 60 ^° C. for 10 hours (temperature increase is carried out for 1 hour). After pasteurization, cool to a temperature of 15 ^o C for 45 minutes. Sterilely filtered and poured into vials. Yield: 87.66%. Pyrogenicity test: temperature increase by +0.1; +0.1; +0.2 ^o C (Σ = +0.4 ^o C). Molecular parameters,%: polymers 0, dimers 0.5, monomers 99.5, fragments 0. The time required to obtain 5% albumin is 20 hours.

Предложенная технология производства мономерного альбумина позволяет получать мономерный апирогенный вирусобезопасный альбумин, стабильный при хранении. The proposed technology for the production of monomeric albumin makes it possible to obtain monomeric pyrogen-free virus-safe albumin that is stable during storage.

Источники информации
1) Auerswald W., Binder В., Dolechel W, Vergleich industriell Hergestellter Humanalbumine hinsichtlich des gehaltes an albuminaggregation. -Annales Immunologlae Hungaricae. / Ed. by Institute for serobacteriological production and research "Human", -1972, v. 16,37.Sources of information
1) Auerswald W., Binder B., Dolechel W, Vergleich industriell Hergestellter Humanalbumine hinsichtlich des gehaltes an albuminaggregation. -Annales Immunologlae Hungaricae. / Ed. by Institute for serobacteriological production and research "Human", -1972, v. 16.37.

2) Me Meramy R.H. and Lee Y, Microheterogeneity in albumin: a contaminarit. Arch. Bioohem. Biophys. 1967, 122, 635-643. 2) Me Meramy R.H. and Lee Y, Microheterogeneity in albumin: a contaminarit. Arch. Bioohem. Biophys. 1967, 122, 635-643.

3) Способ получения мономерного альбумина плазмы крови. Авт. св. СССР N 1250301. A 61 K 35/14, 1986. 3) A method for producing monomeric plasma albumin. Auth. St. USSR N 1250301. A 61 K 35/14, 1986.

4) SchneiderW. , H.Lefevre, H.Fiedler and L.J. McCarty. An alternative method of large scale plasma fractionation for the isolation of serum albumin. Blut, 1975, band 30, seite 121-134. 4) SchneiderW. , H. Lefevre, H. Fiedler and L.J. McCarty. An alternative method of large scale plasma fractionation for the isolation of serum albumin. Blut, 1975, band 30, seite 121-134.

5) Способ получения альбумина. Патент СССР N 743564. A 61 K 37/02, 1980. 5) A method for producing albumin. USSR patent N 743564. A 61 K 37/02, 1980.

6) Способ выделения альбумина. Патент СССР 1127525. A 61 K 37/02, 1977. 6) A method for isolating albumin. USSR patent 1127525. A 61 K 37/02, 1977.

7) Curling J.M., L.O.Lindquist, S.Eriksson. Chromatographic processing- of human plasma - a pilot plant study. Process Biochemistry, 1977, april, 22-28. 7) Curling J.M., L.O. Lindquist, S. Ericksson. Chromatographic processing- of human plasma - a pilot plant study. Process Biochemistry, 1977, april, 22-28.

8) Kistler P. Develop. Biol. Standard., 1974, 27, 198-202. 8) Kistler P. Develop. Biol. Standard., 1974, 27, 198-202.

9) Иванов М.И., А.А.Фром, А.А.Никитенко, В.М. Русанов, А.Е.Киселев, Л.И. Скобелев. Способ получения сывороточного альбумина. Авт. св. СССР N 467536. A 61 K 23/02, 1976. 9) Ivanov M.I., A.A. From, A.A. Nikitenko, V.M. Rusanov, A.E. Kiselev, L.I. Skobelev. A method of obtaining serum albumin. Auth. St. USSR N 467536. A 61 K 23/02, 1976.

10) Промышленный регламент производства альбумина из гемолизированной плазмы и сыворотки крови человеку. МЗ СССР, Москва, 1991. 10) Industrial regulations for the production of albumin from hemolyzed plasma and human serum. USSR Ministry of Health, Moscow, 1991.

11) Способ получения альбумина. Патент СССР N 591126. A 61 K 37/02, 1978. 11) A method for producing albumin. USSR patent N 591126. A 61 K 37/02, 1978.

12) СТД ВОЗ N 840. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 43 доклад ВОЗ, Женева 1994, стр. 109. Приложение 2. Требования к сбору, обработке и контролю качества крови, компонентов крови и препаратов плазмы (Требования к биологическим препаратам N 27, пересмотр 1992 г). 12) WHO STD N 840. WHO Expert Committee on Standardization of Biological Preparations. 43 WHO Report, Geneva 1994, p. 109. Appendix 2. Requirements for the collection, processing, and quality control of blood, blood components, and plasma preparations (Requirements for Biological Preparations N 27, 1992 revision).

13) Государственная фармакопея СССР. 11 издание, вып. 2, стр. 184. 13) The State Pharmacopoeia of the USSR. 11th edition, issue 2, p. 184.

Claims (1)

Способ получения альбумина из альбуминсодержащих растворов, включающий введение в них каприлат-иона в присутствии этанола, удаление образовавшегося осадка центрифугированием, осветление центрифугита фильтрованием, концентрирование продукта и стерилизующую фильтрацию, отличающийся тем, что осветленный центрифугат разводят дистиллированной водой или физиологически приемлемым буфером до концентрации 1 - 10%, концентрируют альбумин ультрафильтрацией с последующей диафильтрацией, после стерилизующей фильтрации проводят пастеризацию "в объеме" при постоянном перемешивании, альбумин охлаждают и проводят дополнительную стерилизующую фильтрацию. A method for producing albumin from albumin-containing solutions, including adding caprylate ion to them in the presence of ethanol, removing the precipitate formed by centrifugation, clarifying the centrifuge by filtration, concentrating the product and sterilizing filtration, characterized in that the clarified centrifuge is diluted with distilled water or a physiologically acceptable buffer to a concentration of 1 - 10%, albumin is concentrated by ultrafiltration followed by diafiltration, after sterilizing filtration pasteurization is carried out " screen "with constant stirring, albumin cooled and an additional sterilizing filtration is carried out.

Images