RU2125092C1 - Method of synthesis of fucosylated carbohydrate, method of synthesis of fucosylated sialylated carbohydrate molecule, reaction system in vitro - Google Patents
Method of synthesis of fucosylated carbohydrate, method of synthesis of fucosylated sialylated carbohydrate molecule, reaction system in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- RU2125092C1 RU2125092C1 RU94026248A RU94026248A RU2125092C1 RU 2125092 C1 RU2125092 C1 RU 2125092C1 RU 94026248 A RU94026248 A RU 94026248A RU 94026248 A RU94026248 A RU 94026248A RU 2125092 C1 RU2125092 C1 RU 2125092C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- compound
- guanosine
- carbohydrate
- gdp
- fucosyltransferase
- Prior art date
Links
- 0 CC(C1)N1C1=C(**)C(**)C(CP(O*)O*)O1 Chemical compound CC(C1)N1C1=C(**)C(**)C(CP(O*)O*)O1 0.000 description 3
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение предоставляет усовершенствованные способы ферментативного получения углеводов, особенно фукозилированных углеводов. В нем предложен усовершенствованный синтез гликозил-1- или 2-фосфатов, в результате использования как химических, так и ферментативных средств. Затем эти фосфорилированные гликозиды используют для получения нуклеотидов сахаров, которые в свою очередь используют как донорные сахара для гликозилирования акцепторных углеводов. Наиболее предпочтительным является использование раскрытых способов для фукозилирования. The present invention provides improved methods for the enzymatic production of carbohydrates, especially fucosylated carbohydrates. It proposes an improved synthesis of glycosyl 1- or 2-phosphates, as a result of the use of both chemical and enzymatic agents. These phosphorylated glycosides are then used to produce sugar nucleotides, which in turn are used as donor sugars for glycosylation of acceptor carbohydrates. Most preferred is the use of the disclosed methods for fucosylation.
В настоящем изобретении предложен способ получения фукозилированных углеводов в единой реакционной смеси, включающие стадии: использования фукозилтрансферазы для создания O-гликозидной связи между нуклеозид-5'-дифосфо-фукозой и доступной гидроксильной группой углеводной акцепторной молекулы до получения фукозилированного углевода и нуклеозид-5'-дифосфата; рециркулирование in situ нуклеозид-5'-дифосфата с фукозой до образования соответствующей нуклеозид-5'-дифосфо-фукозы. Предпочтительные способы настоящего изобретения включают использование гуанина в качестве основания для нуклеозида, использование каталитических количеств нуклеозидов, использование N-ацетигликозамина, галактозы, N-ацетилгалактозамина или N-ацетиллактозамина в качестве углеводной акцепторной молекулы, и использование сиалилированной углеводной акцепторной молекулы. The present invention provides a method for producing fucosylated carbohydrates in a single reaction mixture, comprising the steps of: using fucosyl transferase to create an O-glycosidic bond between a nucleoside-5'-diphospho-fucose and an accessible hydroxyl group of a carbohydrate acceptor molecule to obtain a fucosylated carbohydrate and nucleoside-5'- diphosphate; in situ recycling of nucleoside 5'-diphosphate with fucose to form the corresponding nucleoside 5'-diphospho-fucose. Preferred methods of the present invention include using guanine as the base for a nucleoside, using catalytic amounts of nucleosides, using N-acetyglycosamine, galactose, N-acetylgalactosamine or N-acetylactosamine as a carbohydrate acceptor molecule, and using a sialylated carbohydrate acceptor molecule.
В настоящем изобретении далее рассматривается вышеуказанный способ получения фукозилированной сиалилированной углеводной молекулы через ферментативное образование гликозидных связей в единой реакционной смеси, включающий: создание первой гликозидной связи между дифосфонуклеозид-активированным гликозильным донором, таким, как UDP-Gal, и доступной гидроксильной группой углеводной акцепторной молекулы, такой, как GlcNAc, с использованием первой гликозилтрансферазы, такой, как β-1,4- галактозилтрансфераза, при получении Ga1βI, 4GlcNAc; создание второй гликозидной связи между монофосфонуклеозид-активированным сиалильным донором, таким, как CMP-NeuAc, и доступной гидроксильной группой акцепторной молекулы сахара, такой, как гидроксил в 3-положении Gal Ga1βI, 4GlcNAc, с использованием сиалилтрансферазы, такой, как α-2,3- сиалилтрансфераза; создание третьей гликозидной связи между дифосфонуклеозидактивированным фукозильным донором, таким, как GDP-Fuc, и доступной гидроксильной группой акцепторной молекулы сахара, например, в 3-положении гидроксила GlcNAc Ga1β1,4- GlcNAc, с использованием такой фукозилтрансферазы, как α- 1,3/4-фукозилтрансфераза, где, по крайней мере, одна из стадий (a), (b) или (c) включает далее образование in situ фосфонуклеотид-активированного гликозильного донора из каталитического количества соответствующего монофосфатного и дифосфатного нуклеозида. Наиболее предпочтительны способы настоящего изобретения, в которых продукт с фукозилированным сиалилированным углеводным фрагментом является таким сиалилированным льюисовым лигандом, как сиалил Lex(SLex) или сиалил Lea (SLea), и где фукозу переносят из фукозилированного донора к гидроксильной группе N-ацетилглюкозаминового или галактозного остатка углеводной акцепторной молекулы.The present invention further describes the above method for producing a fucosylated sialylated carbohydrate molecule through enzymatic formation of glycosidic bonds in a single reaction mixture, comprising: creating the first glycosidic bond between a diphosphonucleoside-activated glycosyl donor, such as UDP-Gal, and an available hydroxyl group of a carbohydrate acceptor molecule, such as GlcNAc using the first glycosyltransferase, such as β-1,4-galactosyltransferase, to obtain Ga1βI, 4GlcNAc; creating a second glycosidic bond between a monophosphonucleoside activated sialyl donor, such as CMP-NeuAc, and an accessible hydroxyl group of an acceptor sugar molecule, such as hydroxyl at the 3-position Gal Ga1βI, 4GlcNAc, using sialyltransferase, such as α-2, 3-sialyltransferase; the creation of a third glycosidic bond between a diphosphonucleosidated fucosyl donor, such as GDP-Fuc, and an accessible sugar acceptor molecule, for example, at the 3-position of the hydroxyl GlcNAc Ga1β1,4-GlcNAc, using a fucosyl transferase such as α-1,3 / 4-fucosyltransferase, where at least one of steps (a), (b) or (c) further comprises the in situ formation of a phosphonucleotide-activated glycosyl donor from a catalytic amount of the corresponding monophosphate and diphosphate nucleoside. Most preferred are the methods of the present invention in which the product with the fucosylated sialylated carbohydrate moiety is a sialylated Lewis ligand such as sialyl Le x (SLe x ) or sialyl Le a (SLe a ), and where fucose is transferred from the fucosylated donor to the hydroxyl group of the N-acetylglucosamine or a galactose residue of a carbohydrate acceptor molecule.
Рассматриваемый способ охватывает многочисленные катализируемые гликозилтрансферазой реакции в единой реакционной смеси, и предпочтительны такие способы, в которых одну гликозилтрансферазу выбирают из группы, состоящей из α-2,3- сиалилтрансферазы, α-2,4- сиалилтрансферазы, α-2,6- сиалилтрансферазы и α-2,8- сиалилтрансферазы. Настоящее изобретение включает фукозилирование олигосахарида, и предпочтительны такие фукозилтрансферазы, которые выбирают из группы, состоящей из: α-1,2- фукозилтрансферазы, α-1,3/4- фукозилтрансферазы, α-1,3- фукозилтрансферазы, α-1,6- фукозилтрансферазы и α-1,4- фукозилтрансферазы. Наиболее предпочтительные фукозилтрансферазы включают β- галактозилазо -α-1,2- фукозилтрансферазу, N-ацетиглюкозамин α-1,3- фукозилтрансферазу, N-ацетилглюкозамин -α-1,4- фукозилтрансферазу и N-ацетил-глюкозамин α-1,6- фукозилтрансферазу. This method encompasses numerous glycosyltransferase-catalyzed reactions in a single reaction mixture, and methods are preferred in which one glycosyltransferase is selected from the group consisting of α-2,3-sialyltransferase, α-2,4-sialyltransferase, α-2,6-sialyltransferase and α-2,8-sialyltransferase. The present invention includes fucosylation of an oligosaccharide, and fucosyl transferases which are selected from the group consisting of: α-1,2-fucosyl transferase, α-1,3 / 4-fucosyl transferase, α-1,3-fucosyl transferase, α-1,6 - fucosyl transferases and α-1,4-fucosyl transferases. Most preferred fucosyltransferases include β-galactosylase-α-1,2-fucosyltransferase, N-acetyglucosamine α-1,3-fucosyltransferase, N-acetylglucosamine -α-1,4-fucosyltransferase and N-acetyl-glucosamine α-1,6- fucosyl transferase.
Углеводные акцепторные молекулы практически неограничены, так как гликозилтрансферазы не селективны относительно положений соседних сахаров. Таким образом, это могут быть любые углеводные замещенные молекулы, в которых углевод является Ga1β1,4G1cNAc молекулой или ее аналогом, или она может оканчиваться Ga1β1,4G1cNAc-X фрагментом, где X представляет органическую молекулу. Дополнительные углеводные акцепторные молекулы, которые являются субстратами для фукозилазы, включают аналоги Ga1β1,4G1cNAc и Ga1β1, 4Glclac-X. Примерами таких молекул являются лактоза, NeuAcα1,6Ga1β1, 4GlcNAc, Ga1β1, 3GlcNAc, Ga1β1,4-G1uca1 (лактал), NeuAcα2,3Ga1β1,4G1uca1, 2-галоидзамещенные продукты реакции вышеуказанных глюкалей, Ga1β1,4/5- Ga1β1,4G1cNAcβ-O- аллил и т.п. Следует также учитывать, что углеводная акцепторная молекула должна содержать доступную гидроксильную группу на сахариде, с которой связана фукозильная или другая донорная группа сахара, а гидроксил, который должен присутствовать, определяется гликозилтрансферазным ферментом, который используют в этой реакции. Carbohydrate acceptor molecules are practically unlimited, since glycosyltransferases are not selective relative to the positions of neighboring sugars. Thus, it can be any carbohydrate substituted molecule in which the carbohydrate is a Ga1β1,4G1cNAc molecule or its analogue, or it can end with a Ga1β1,4G1cNAc-X fragment, where X represents an organic molecule. Additional carbohydrate acceptor molecules that are substrates for fucosylase include analogues of Ga1β1,4G1cNAc and Ga1β1, 4Glclac-X. Examples of such molecules are lactose, NeuAcα1.6Ga1β1, 4GlcNAc, Ga1β1, 3GlcNAc, Ga1β1,4-G1uca1 (lactal), NeuAcα2,3Ga1β1,4G1uca1, 2-halogen-substituted reaction products of the above-mentioned
Рассматриваемый здесь способ включает далее регенерацию каталитических количеств нуклеотидов, которые используют для создания нуклеозидных сахаров. Предпочтительными основаниями для нуклеотидов являются цитидин, гуанин или уродин. Доноры моносахароидов активируются такими нуклеотидными сахарами, как цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовая кислота, гуанидин-5'-дифосфофукоза и уродин-5'-дифосфогалактоза. The method contemplated herein further includes the regeneration of catalytic amounts of nucleotides that are used to create nucleoside sugars. Preferred bases for nucleotides are cytidine, guanine or urodin. Monosaccharoid donors are activated by nucleotide sugars such as cytidine-5'-monophospho-N-acetylneuraminic acid, guanidine-5'-diphosphofucose and urodin-5'-diphosphogalactose.
Помимо вышеуказанных способов, настоящее изобретение включает также in vitro реакционные системы. Такие системы называют инертным или нереакционноспособными контейнерами, или отделениями, сохраняющими реагенты, используемые для проведения вышеуказанных реакций. Более конкретно, эти реакционные системы содержат, как минимум, фукозилтрансферазу и нуклеозиддифосфофукозо-образующие ферменты. Эти реакционные системы могут, кроме того, содержать гуанозиндифосфофукозофосфорилазу в качестве GDP-фукозо-образующих ферментов, киназу, такую, как пируваткиназу или фруктозо-1,6-дифосфаткиназу, ацетилкиназу или фукозокиназу. Другие реагенты могут включать NADPH регенерационную систему гуанозиндифосфатманнозы и гуанозиндифосфоманнозопирофосфорилазу. Если присутствует NADPH система, она может включать каталитическое количество NADP, изопропанол в количестве от около 1 до около 10%, предпочтительно, от около 2 до около 4% вес/объем реакционной системы, и алкоголь-дегидрогеназу. In addition to the above methods, the present invention also includes in vitro reaction systems. Such systems are called inert or non-reactive containers, or compartments that retain the reagents used to carry out the above reactions. More specifically, these reaction systems contain at least fucosyl transferase and nucleoside diphosphofucose-forming enzymes. These reaction systems may also contain guanosine diphosphofucosophosphorylase as GDP-fucose-forming enzymes, a kinase such as pyruvate kinase or fructose-1,6-diphosphate kinase, acetyl kinase or fucose kinase. Other reagents may include the NADPH guanosine diphosphate mannose regeneration system and guanosine diphosphomannose pyrophosphorylase. If a NADPH system is present, it may include a catalytic amount of NADP, isopropanol in an amount of from about 1 to about 10%, preferably from about 2 to about 4%, by weight / volume of the reaction system, and alcohol dehydrogenase.
Ряд химических способов для синтеза олигосахаридов также здесь описан. Один способ включает получение гликозил-1-или 2-фосфата за счет реакции защищенного гликозильного кольца, содержащего гидроксил в аномерном положении (1- или 2-положение) с трехвалентным фосфитилирующим реагентом до получения защищенного гликозил 1- или 2-фосфит-защищенного кольца. Защищенный фосфит окисляют до получения соответствующего фосфата, который используют в ферментативной реакции. Гликозильное кольцо может далее включать галактозил, глюкозил, фукозил, N-ацетилглюкозил и маннозил, также как и другие сахариды. Предпочтительными трехвалентными фосфитилирующими агентами являются такие дибензил-N, N-диалкилфосфорамидиты, как дибензил-N, N-диэтилфосфороамидит. Такие диалкилы являются низшими алкилами, содержащими 1 - 5 атомов углерода включительно, и они могут быть одинаковы или различны. В этом случае далее используют такие защитные реагенты, как ацетил или бензил. Гликозильное кольцо необязательно представляет группу, состоящую из D- или L-альдоз, содержащих четыре, пять или шесть атомов углерода, или образует группу, состоящую из D- или L-кетоз, содержащих четыре, пять или шесть атомов углерода, а также сахаридов, содержащих вплоть до девяти атомов углерода в цепи сахарида. A number of chemical methods for the synthesis of oligosaccharides are also described herein. One method involves preparing
Далее настоящее изобретение включает новые промежуточные соединения для получения гликозил-1- или 2-фосфатов. Предпочтительным промежуточным соединением является защищенный фосфитилмоносахарид формулы I:
где
R1 представляет арил или низший алкил;
x независимо является кислородом или азотом;
R2 независимо является ацильной, бензильной, силильной или алкильной защитной группой;
R3 независимо представляет -CH3, -OR2, -CH2OR2, -CH(OR2)-CH(OR2) или -CH(OR2)-CH(OR2)-CH(OR2);
R4 представляет водород (H), карбоксил или C1 - C5 или бензилкарбоксилатный сложный эфир; а
n является целым числом 1 или 2.Further, the present invention includes new intermediates for the preparation of glycosyl 1- or 2-phosphates. A preferred intermediate is a protected phosphityl monosaccharide of formula I:
Where
R 1 represents aryl or lower alkyl;
x is independently oxygen or nitrogen;
R 2 independently is an acyl, benzyl, silyl or alkyl protecting group;
R 3 independently represents —CH 3 , —OR 2 , —CH 2 OR 2 , —CH (OR 2 ) —CH (OR 2 ), or —CH (OR 2 ) —CH (OR 2 ) —CH (OR 2 );
R 4 represents hydrogen (H), carboxyl or C 1 - C 5 or benzylcarboxylate ester; a
n is an integer of 1 or 2.
В предпочтительной группе соединений формулы I R4 представляет водород, так что формула I становится формулой II, приводимой ниже, где R1, R2, R3 и X и n имеют указанные ранее значения.In a preferred group of compounds of formula I, IR 4 is hydrogen, so that formula I becomes formula II below, wherein R 1 , R 2 , R 3 and X and n are as previously defined.
Одной из групп наиболее предпочтительных соединений являются те, в которых моносахарид является шестичленным кольцом, R4 представлен H, а каждый X является кислородом, например, манноза или фукоза. Предпочтительны соединения, в которых R1 представляет бензил, а R2 представляет бензил или ацетил. Примеры предпочтительных промежуточных соединений включают дибензилфосфитил-2,3,4,6-тетра-O-ацетил-D-маннозид или дибензилфосфитил-2,3,4-три-O-ацетил-L-фукозид.
One of the groups of the most preferred compounds are those in which the monosaccharide is a six-membered ring, R 4 is H, and each X is oxygen, for example mannose or fucose. Compounds in which R 1 is benzyl and R 2 is benzyl or acetyl are preferred. Examples of preferred intermediates include dibenzylphosphityl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-mannoside or dibenzylphosphityl-2,3,4-tri-O-acetyl-L-fucoside.
Другой группой наиболее предпочтительных соединений являются те, в которых моносахарид является шестичленным кольцом, R1 и R2 имеют указанные ранее значения, один X представляет азот, а остальные кислород. Примеры соединений этой группы включают GlaNAc, GalNAc и NeuAc. Примерами этих соединений служат дибензилфосфитил-2-ацетамидо-2-деокси-3,4,6-три-O-ацетил-D-глюкозид и 2-ацетамидо-2-деокси-3,4,6-три-O-ацетил-D-галактозид.Another group of the most preferred compounds are those in which the monosaccharide is a six-membered ring, R 1 and R 2 are as previously defined, one X is nitrogen and the rest is oxygen. Examples of compounds of this group include GlaNAc, GalNAc and NeuAc. Examples of these compounds are dibenzylphosphityl-2-acetamido-2-deoxy-3,4,6-tri-O-acetyl-D-glucoside and 2-acetamido-2-deoxy-3,4,6-tri-O-acetyl D-galactoside.
Раскрыт также моносахаридный аналог, который является 2,3,4-три-O-бензоил -α-L- фукопиранозилбромидом. A monosaccharide analogue, which is 2,3,4-tri-O-benzoyl-α-L-fucopyranosyl bromide, is also disclosed.
Фраза "доступная гидроксильная группа" относится к гидроксизамещенному углероду, образующему часть кольца углеводной акцепторной молекулы, которая может образовывать гликозидную связь в результате действия гликозилтрансферазы, переносящей моно- или дифосфонуклеозид-активированный гликозильный донор на доступный углерод. "Доступная гидроксильная группа" обычно находится в 3-положении для фукозилирования. The phrase “available hydroxyl group” refers to a hydroxy-substituted carbon that forms part of the ring of a carbohydrate acceptor molecule that can form a glycosidic bond as a result of the action of a glycosyltransferase transferring a mono- or diphosphonucleoside-activated glycosyl donor to the available carbon. The "available hydroxyl group" is usually at the 3-position for fucosylation.
Фраза "защищенное гликозильное кольцо" относится к гликозильным кольцам, в которых доступные амино- или гидрокси-заместители прореагировали с ацильной, бензильной, силильной или алкильной защитными группами. Такие группы описаны в книге Грина Т.В. (Green T.W., "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1981). The phrase "protected glycosyl ring" refers to glycosyl rings in which available amino or hydroxy substituents have reacted with acyl, benzyl, silyl or alkyl protecting groups. Such groups are described in Green's book T.V. (Green T.W., "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1981).
Термин "углевод(ы)" включает любой органический фрагмент, содержащий углеводы, ковалентно связанные с любыми мономерными сахаридами. Он включает дисахариды, олигосахариды, гликолипиды, гликопротеины и неприродные связи, такие, как связи сахаридов с органическими соединениями, которые в природе не связаны с сахарами. The term “carbohydrate (s)” includes any organic moiety containing carbohydrates covalently linked to any monomeric saccharides. It includes disaccharides, oligosaccharides, glycolipids, glycoproteins and non-natural bonds, such as bonds of saccharides with organic compounds that are not naturally associated with sugars.
Фраза "углеводная акцепторная молекула" относится к молекуле, содержащей по крайней мере один моносахарид, где этот моносахарид имеет одну или более доступную гидроксильную группу для образования гликозидных связей с моно- или ди-фосфонуклеозид-активированным гликозильным донором. The phrase “carbohydrate acceptor molecule” refers to a molecule containing at least one monosaccharide, where the monosaccharide has one or more hydroxyl groups available to form glycosidic bonds with a mono- or diphosphonucleoside-activated glycosyl donor.
Фраза "каталитическое количество" относится к концентрациям реагентов, которые присутствуют в относительно небольших количествах по сравнению с количествами реагентов, которые присутствуют в стехиометрических количествах, и их концентрация в значительной степени не уменьшается в процессе реакции. Те реагенты, которые присутствуют в каталитических количествах, обычно является активирующими реагентами, которые затем регенерируют и возвращают в реакцию за счет побочных реакций. The phrase “catalytic amount” refers to concentrations of reactants that are present in relatively small amounts compared to amounts of reactants that are present in stoichiometric amounts, and their concentration does not substantially decrease during the reaction. Those reagents that are present in catalytic amounts are usually activating reagents, which are then regenerated and returned to the reaction due to side reactions.
Фраза "моно- или дифосфонуклеозид-активированный гликозильный донор" или "активированная донорная молекула" относятся к таким нуклеотидным сахарам, как уридин-5'-дифосфо-галактоза. Эти соединения содержат высокоэнергетические связи, которые облегчают образование гликозильной связи с углеводной акцепторной молекулой. Нуклеозид может состоять из любых природных оснований и сахаров, и может также включать незначительное количество производных, таких как метил- или азозамещенные основания, дегидроксилированные или защищенные гидроксильные группы на сахарах, и тиофосфатные аналоги дифосфатного фрагмента. The phrase "mono- or diphosphonucleoside-activated glycosyl donor" or "activated donor molecule" refers to nucleotide sugars such as uridine-5'-diphospho-galactose. These compounds contain high-energy bonds that facilitate the formation of a glycosyl bond with a carbohydrate acceptor molecule. A nucleoside may consist of any natural bases and sugars, and may also include a small amount of derivatives, such as methyl or azo substituted bases, dehydroxylated or protected hydroxyl groups on sugars, and thiophosphate analogues of the diphosphate moiety.
Фраза "гликозидная связь" относится к кислород/углеродной связи, которая обычно бывает между сахарами. Она может быть либо α, либо β по своей конфигурации, и обычно включает реакцию дегидратации, когда дифосфонуклеозид-активированный гликозильный донор переносят на доступный углерод углеводный акцепторной молекулы, используя гликозилтрансферазу. The phrase “glycosidic bond” refers to the oxygen / carbon bond that usually occurs between sugars. It can be either α or β in its configuration, and usually involves a dehydration reaction when a diphosphonucleoside-activated glycosyl donor is transferred to an accessible carbon carbohydrate acceptor molecule using glycosyl transferase.
Фраза "гликозильное кольцо" относится к сахару или аминосахару, содержащему 5 или 6 атомов углерода в кольце. Сюда входят альдозы, дезоксиальдозы и кетозы, независимо от ориентации или конфигурации связей у асимметричного углерода. Они включают такие сахара, как рибоза, арабиноза, ксилоза, аллоза, альтроза, глюкоза, идоза, галактоза, талоза, рибулоза, ксилулоза, псикоза, N-ацетилгклозамин, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилманнозамин, N-ацетилнейраминовая кислота, фруктоза, сорбоза, тагатоза, рамноза и фукоза. The phrase "glycosyl ring" refers to sugar or amino sugar containing 5 or 6 carbon atoms in the ring. This includes aldoses, deoxyaldoses, and ketoses, regardless of the orientation or configuration of the bonds in asymmetric carbon. These include sugars such as ribose, arabinose, xylose, allose, altrose, glucose, idose, galactose, talose, ribulose, xylulose, psicose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylmannosamine, N-acetylneuraminic acid, fructose, , tagatose, ramnose and fucose.
Термин "гликозилтрансфераза" относится к семейству ферментов, которые соединяют дифосфонуклеозид-активированный гликозильный донор с доступным углеродом углеводной акцепторной молекулы за счет гликозидной связи. Эти ферменты включают как выделенные из природных источников, так и из источников генетических модифицированных для выделения таких ферментов. Семейство гликозилтрансфераз включает сиалилтрансферазы, N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, N-ацетилгалактозаминилтрансферазы, фукозилтрансферазы, маннозилтрансферазы, галактозилтрансферазы и КДО трансферазы. The term "glycosyltransferase" refers to a family of enzymes that connect a diphosphonucleoside-activated glycosyl donor to an accessible carbon of a carbohydrate acceptor molecule via a glycosidic bond. These enzymes include both isolated from natural sources and from genetically modified sources for the isolation of such enzymes. The glycosyltransferase family includes sialyltransferases, N-acetylglucosaminyltransferases, N-acetylgalactosaminyltransferases, fucosyltransferases, mannosyltransferases, galactosyltransferases, and CDO transferases.
Фраза "NADPH регенерационная система" относится к компоненту ферментов, которые рециклизует NADP, образующийся in situ ферментативной реакции обратно в NADPH. Обычно такая система основана на алкогольдегидрогеназном превращении спирта (изопропила) в кетон (ацетон). The phrase "NADPH regeneration system" refers to a component of the enzymes that recycles NADP, which is formed in situ by the enzymatic reaction back to NADPH. Typically, such a system is based on the alcohol dehydrogenase conversion of alcohol (isopropyl) to ketone (acetone).
Фраза "сиалилированный лиганд Льюиса" относится к молекуле, способной связываться либо с ELAM рецептором, либо с GMP-140 рецептором протеинов. Химически определенные эти лиганды включают природные трисахаридные лиганды SLex и SLea и их производные. Такие производные включают незначительные замещения гидроксильных групп на водород, алкил, алкокси, галоид, гликозил и т. п. , молекулы гликалей, соединения с гликозильным кольцом, где кислород кольца с S или NH и их алкильные, окисленные или ацильные производные, присоединение аномерного углерода к углеводам или органическим молекулам, изменение в ориентации и положении гликозидых связей или замену энантиомеров природных сахаров.The phrase “sialylated Lewis ligand” refers to a molecule capable of binding to either the ELAM receptor or the GMP-140 protein receptor. Chemically defined these ligands include the natural trisaccharide ligands SLe x and SLe a and their derivatives. Such derivatives include minor substitutions of hydroxyl groups with hydrogen, alkyl, alkoxy, halogen, glycosyl, etc., glycol molecules, compounds with a glycosyl ring, where the oxygen rings are with S or NH and their alkyl, oxidized or acyl derivatives, the addition of anomeric carbon to carbohydrates or organic molecules, a change in the orientation and position of glycosidic bonds or the replacement of enantiomers of natural sugars.
Фраза "стехиометрическое соотношение" относится к количеству исходного продукта, который присутствует в прямом соотношении с продуктами реакции. Реагент существует в стехиометрическом соотношении с конечными продуктами, так как его обычно используют в реакциях получения конечного продукта и не регенерируют в процессе реакции. Стехиометрическое соотношение обычно составляет около 1 : 1 или 2 : 1 (отношение исходного продукта к конечному). The phrase "stoichiometric ratio" refers to the amount of the starting material that is present in direct proportion to the reaction products. The reagent exists in a stoichiometric ratio with the final products, since it is usually used in reactions to obtain the final product and does not regenerate during the reaction. The stoichiometric ratio is usually about 1: 1 or 2: 1 (ratio of starting product to final).
Фраза "трехвалентный фосфитилирующий реагент" относится к реагенту, который реагирует с гидроксильной группой органического соединения с образованием фосфит-содержащего продукта, который можно окислить окисляющим реагентом до получения фосфатного соединения после удаления защитных групп. The phrase “trivalent phosphitylating reagent” refers to a reagent that reacts with the hydroxyl group of an organic compound to form a phosphite-containing product that can be oxidized with an oxidizing reagent to produce a phosphate compound after deprotection.
Сокращения:
ADP - аденозин-5'-дифосфат,
ATP - аденозин-5'-дифосфат,
CMP, цитидин-5'-монофосфат,
CDP, цитидин-5'-дифосфат,
CTP, цитидин-5'-трифосфат,
CMP, NeuAc цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовая кислота,
Fuc, фукоза,
Fk, фукокиназа,
Fuc-1-P, фукозо-1-фосфат,
Fuc - T, фукозилтрансфераза,
Ga1, галактоза,
Ga1NAc, N-ацетилгалактозамин,
GTP, гуанозин-5'-трифосфат,
GDP-Fuc, гуанозин-5'-дифосфофукоза,
GDP, гуанозин-5'-дифосфат,
GDP-Man, гуанозин-5'-дифосфоманноза,
GDP-ManPP, GDP-маннозо-пиррофосфорилаза,
GDP-FUCPP, GDP-фукозо-пиррофосфорилаза,
G1c-1-P, глюкозо-1-фосфат,
G1cNAc, N-ацетилглюкозамин,
ManNAc, N-ацетилманнозамин,
NADP(NADPH), никотинамидадениндинуклеотидфосфат,
NeuAc, N-ацетилнейраминовая кислота,
NMK, нуклеозидмонофосфаткиназа,
MK, миокиназа,
PPase, неорганическая пирофосфатаза,
PK, пируваткиназа,
PEP, фосфо(енол)пируват,
Pyr, пируват,
PPi, неорганическая пирофосфатаза,
P, неорганический фосфат,
Rha, раминоза,
UDP, уридин-5'-дифосфат,
UTP, уридин-5'-трифосфат,
UDP-G1c, уридин-5'-дифосфо-глюкоза,
UDP-Ga1, уридин-5'-дифосфо-галактоза.Abbreviations:
ADP - adenosine 5'-diphosphate,
ATP - adenosine 5'-diphosphate,
CMP, cytidine-5'-monophosphate,
CDP, cytidine 5'-diphosphate,
CTP, cytidine 5'-triphosphate,
CMP, NeuAc cytidine-5'-monophospho-N-acetylneuraminic acid,
Fuc, Fucose,
Fk, fucokinase,
Fuc-1-P, fucose-1-phosphate,
Fuc - T, fucosyltransferase,
Ga1, galactose,
Ga1NAc, N-acetylgalactosamine,
GTP, guanosine 5'-triphosphate,
GDP-Fuc, guanosine-5'-diphosphofucose,
GDP, guanosine 5'-diphosphate,
GDP-Man, guanosine-5'-diphosphomannose,
GDP-ManPP, GDP-mannose-pyrophosphorylase,
GDP-FUCPP, GDP-fucose pyrophosphorylase,
G1c-1-P, glucose-1-phosphate,
G1cNAc, N-Acetylglucosamine,
ManNAc, N-acetylmannosamine,
NADP (NADPH), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,
NeuAc, N-Acetylneuraminic Acid,
NMK, nucleoside monophosphate kinase,
MK, myokinase,
PPase, inorganic pyrophosphatase,
PK, pyruvate kinase,
PEP, phospho (enol) pyruvate,
Pyr, pyruvate,
PPi, inorganic pyrophosphatase,
P, inorganic phosphate,
Rha, Raminose,
UDP, uridine-5'-diphosphate,
UTP, uridine-5'-triphosphate,
UDP-G1c, uridine-5'-diphospho-glucose,
UDP-Ga1, uridine-5'-diphospho-galactose.
Во многих использованных здесь структурных формулах имеются только две или три группы, связанные с углеродными атомами кольца. Обычно не изображенные группы представляют собой атомы водорода, и обычно не изображают их связи с атомами углерода, если только их изображение нежелательно, с точки зрения стереометрии. В других формулах зачерненные клинообразные линии изображают связи над плоскостью чертежа, а сужающиеся клиновидные линии используются для обозначения связей расположенных снизу плоскости чертежа. Волнистой линий изображают связи двух типов (и α, и β).
На фиг. 1 представлена типичная временная зависимость превращения GDP-маннозы в GDP-фукозу в результате NADPH окисления с использованием измерений оптической плотности (Abs).In many of the structural formulas used here, there are only two or three groups associated with the carbon atoms of the ring. Usually the groups not shown are hydrogen atoms, and usually they do not represent their bonds with carbon atoms, unless their image is undesirable from the point of view of stereometry. In other formulas, blackened wedge-shaped lines depict connections above the drawing plane, and tapering wedge-shaped lines are used to denote connections located below the drawing plane. The wavy lines depict the connection of two types (and α, and β).
In FIG. Figure 1 shows a typical time dependence of the conversion of GDP mannose to GDP fucose as a result of NADPH oxidation using absorbance measurements (Abs).
Кривая A: контрольная кювета без GDP-маннозы. Curve A: control cell without GDP mannose.
Кривая B: то же, что и для контроля, но с добавлением 1 мкмоль GDP-маннозы. Curve B: the same as for control, but with the addition of 1 μmol of GDP mannose.
По оси ординат отложены единицы поглощения на 340 нм, а по оси абсцисс - минуты. The ordinate axis is the absorption unit at 340 nm, and the abscissa axis is minutes.
На фиг. 2 представлены три картины A, B и С - хроматограммы ВЖЭХ - элюирование для превращения GDP-маннозы в GDP-фукозу в момент времени 0 (A), спустя 3 ч (2) и спустя 6 ч (C) соответственно после начала реакции. In FIG. Figure 2 shows three patterns A, B and C — HPLC chromatograms — elution to convert GDP mannose to GDP fucose at time 0 (A), 3 hours later (2) and 6 hours later (C), respectively, after the start of the reaction.
По оси ординат отложено относительное поглощение на 254 нм, а по оси абсцисс - минуты. Relative absorption at 254 nm is plotted on the ordinate axis, and minutes on the abscissa axis.
На фиг. 3 представлен график, который иллюстрирует синергическое ингибирование α-1,3- фукозилтрансферазы гуанозин-5'-дифосфата (GDP) с соединением 50 в присутствии 0.2 мМ 14C-GDP-фукозы и 20 мМ MnCl2 при pH 6.2.In FIG. Figure 3 is a graph that illustrates the synergistic inhibition of guanosine 5'-diphosphate α-1,3-fucosyltransferase (GDP) with
Использованы следующие символы: открытый треугольник - нет ингибирования; закрашенный треугольник - 0.05 мМ GDP; пустой квадрат - 34 мМ соединения 50; пустой круг - 0.05 мМ GDP плюс 34 мМ соединения 50. The following symbols are used: open triangle - no inhibition; the filled triangle is 0.05 mM GDP; empty square - 34
По оси ординат отложены единицы обратной исходной вязкости образовывающегося продукта (I/v), а по оси абсцисс - обратная величина концентрации N-ацетиллактозамина (LacNAc). The units of the inverse initial viscosity of the resulting product (I / v) are plotted along the ordinate, and the inverse of the concentration of N-acetylactosamine (LacNAc) is plotted along the abscissa.
Настоящее изобретение относится к in situ мультиферментативной реакции, в которой углеводная акцепторная молекула подвергается фукозилированию нуклеозид-5'-дифосфофукозой за счет фукозилтрансферазы, где нуклеозид-5'-дифосфофукоза предпочтительно ферментативно образуется из каталитических количеств нуклеотидов (см. общие схемы 1 и 2 далее). The present invention relates to an in situ multienzymatic reaction in which a carbohydrate acceptor molecule undergoes fucosylation of nucleoside-5'-diphosphofucose by fucosyl transferase, where nucleoside-5'-diphosphofucose is preferably enzymatically formed from catalytic amounts of nucleotides (see
Эти и все последующие схемы приведены в конце описания. These and all subsequent diagrams are given at the end of the description.
Более конкретно, раскрытое изобретение предлагает улучшенный способ получения предшественников нуклеотидных сахаров, которые действуют как донорские субстраты для реакций гликозилтрансферазы. Эти способы включают как химические, так и ферментативные средства. Химическое усовершенствование относится к повышению выхода и стабильности промежуточных соединений - защищенных сахаров, которые используют для получения гликозил-1 или 2-фосфитов, которые в свою очередь окисляют до фосфатов, которые конденсируют с нуклеозидмонофосфатами до получения нуклеозид-5'-дифосфосахаров или нуклеотидных сахаров. More specifically, the disclosed invention provides an improved method for preparing nucleotide sugar precursors that act as donor substrates for glycosyl transferase reactions. These methods include both chemical and enzymatic agents. Chemical improvement refers to increasing the yield and stability of intermediates - protected sugars, which are used to produce glycosyl-1 or 2-phosphites, which in turn are oxidized to phosphates, which are condensed with nucleoside monophosphates to produce nucleoside-5'-diphosphosugars or nucleotide sugars.
Другим аспектом настоящего изобретения является усовершенствование мультиферментативной системы, включающей более одной гликозилтрансферазной реакции для синтеза углеводов, где одно усовершенствование состоит в использовании каталитических количеств нуклеотида. Нуклеотиды регенерируются из моно- или дифосфатных форм в трифосфатную форму за счет использования in situ ферментативной реакции одновременно с реакциями гликозилтрансферазы. Используют каталитические количества нуклеотида из-за ингибирующего действия нуклеотидов на гликозилтрансферазы. Another aspect of the present invention is the improvement of a multienzymatic system comprising more than one glycosyltransferase reaction for the synthesis of carbohydrates, where one improvement is the use of catalytic amounts of a nucleotide. Nucleotides are regenerated from mono- or diphosphate forms to triphosphate due to the use of an in situ enzymatic reaction simultaneously with glycosyl transferase reactions. Catalytic amounts of nucleotide are used due to the inhibitory effect of nucleotides on glycosyl transferases.
Родственные патенты США, содержащие основные материалы, относящиеся к раскрытию изобретения: заявка N 07/670701, поданная 18 марта 1991; N 07/707600, поданная 30 мая 1991; N 07738211, поданная 30 июля 1991 и озаглавленная "Олигосахаридные ферментативные субстраты и ингибиторы: способы и композиции"; N 07/852409, поданная 16 марта 1992, и N 07/889652, поданная 26 мая 1992. Все они включены сюда в качестве ссылок. Related US Patents Containing Essential Materials Related to the Disclosure of the Invention: Application No. 07/670701, filed March 18, 1991; N 07/707600, filed May 30, 1991; N 07738211, filed July 30, 1991 and entitled "Oligosaccharide Enzymatic Substrates and Inhibitors: Methods and Compositions"; N 07/852409, filed March 16, 1992, and N 07/889652, filed May 26, 1992. All of them are included here as a reference.
A. Фукозилирование. A. Fucosylation.
Один из аспектов настоящего изобретения концентрируется на использования вышеописанной и сравнительной технологии для фукозилирования углеводов. Фукозилирование является обычной терминальной модификацией для многих биологически активных углеводов, таких как антигены Льюиса; как сиалилированные так и несиалилированные. One aspect of the present invention focuses on the use of the above and comparative technology for fucosylation of carbohydrates. Fucosylation is a common terminal modification for many biologically active carbohydrates, such as Lewis antigens; both sialylated and non-sialylated.
(1) Фукозилтрансферазы. (1) Fucosyltransferases.
Фукозилирование возникает под действием фукозилтрансферазы. Фукозилтрансферазы хорошо известны, и их обзор представлен в Adv. Enzymol, 52 : 44 - 56 (1981). Углерод акцепторного углевода обычно является членом кольца глюкозы, галактозы или N-ацетилглюкозамина или их аналогов. O-гликозидная связь обычно бывает в α- ориентации. Наиболее обычным местоположением являются: 2-, 3- или 6-гидроксилы галактозы; 3-, 4- или 6-гидроксильные группы N-ацетилглюкозамина; или 3- или 4-гидроксилы глюкозы. Глюкаль и (5-тио)-глюкозосодеpжащие сахариды могут также быть акцепторным сахаридным фрагментом акцепторного углевода для фукозилтрансферазных ферментов. Fucosylation occurs under the action of fucosyl transferase. Fucosyl transferases are well known and reviewed in Adv. Enzymol, 52: 44-56 (1981). Acceptor carbohydrate carbon is typically a member of the glucose, galactose, or N-acetylglucosamine ring or their analogs. The O-glycosidic bond is usually in the α orientation. The most common locations are: 2-, 3-, or 6-galactose hydroxyls; 3-, 4- or 6-hydroxyl groups of N-acetylglucosamine; or 3- or 4-glucose hydroxyls. Glucal and (5-thio) -glucose-containing saccharides may also be an acceptor saccharide moiety of an acceptor carbohydrate for fucosyl transferase enzymes.
Фукозилтрансферазы можно выделить из природных источников или из рекомбинантных микроорганизмов, которые были генетически изменены для выделения фукозилтрансфераз. Очищенные нативные фукозилтрансферазы были описаны Foster, J. Biol. Chem. 266: 3526 - 3531 (1991); Muramatsu, Eur. J. Biochem., 157: 71 - 75 (1986); и Prieels et al., J. Biol Chem., 256 - 10 456 - 10 463 (1981). Фукозилтрансферазные гены, как сообщалось, были клонированы и экспрессированы Campbell et al. , J. Biol Chem., 259: 11 208 - 11 214 (1984); Larsen, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 87: 6674 - 6678 (1990); и Kukowska - Latallo, et al., Genes and Devel., 4: 1288 - 1303 (1990); Weston et al., J. Biol. Chem., 267: 4152 (1992). Fucosyl transferases can be isolated from natural sources or from recombinant microorganisms that have been genetically modified to isolate fucosyl transferases. Purified native fucosyl transferases have been described by Foster, J. Biol. Chem. 266: 3526 - 3531 (1991); Muramatsu, Eur. J. Biochem., 157: 71-75 (1986); and Prieels et al., J. Biol Chem., 256-10456-10463 (1981). Fucosyltransferase genes have been reported to be cloned and expressed by Campbell et al. J. Biol Chem., 259: 11 208 - 11 214 (1984); Larsen, et al. , Proc. Natl. Acad Sci., U.S.A. 87: 6674-6678 (1990); and Kukowska - Latallo, et al., Genes and Devel., 4: 1288-1303 (1990); Weston et al., J. Biol. Chem., 267: 4152 (1992).
Вообще фукозилтрансферазы являются мембранносвязанными. Так, целые фукозилтрансферазы обычно не растворимы в водном растворе. Для облегчения их использования в способах и реакционных системах настоящего изобретения предпочтительно использовать растворимые ферменты, где нерастворимый цитоплазмический хвост был бы исключен или сделан более гидрофильным за счет селективной делеции или добавления полярных аминокислот. Однако природные неизменные фукозилтрансферазы можно использовать в настоящем изобретении за счет добавления небольших количеств таких неионных детергентов, как Triton X-100. Generally, fucosyl transferases are membrane bound. So, whole fucosyl transferases are usually not soluble in aqueous solution. To facilitate their use in the methods and reaction systems of the present invention, it is preferable to use soluble enzymes where the insoluble cytoplasmic tail would be eliminated or made more hydrophilic due to selective deletion or addition of polar amino acids. However, naturally occurring fucosyl transferases can be used in the present invention by adding small amounts of nonionic detergents such as Triton X-100.
Фукозилтрансферазы представляют собой специфический тип гликозилтрансфераз. Активированная донорская молекула представляет обычно нуклеотид-5'-дифосфофукозу. В реакции вырабатывается нуклеотид как уходящая группа и фукоза, содержащая реакционноспособный карбониевый ион, который образует гликозидную связь с доступной гидроксильной группой акцепторной молекулы. Fucosyl transferases are a specific type of glycosyl transferases. The activated donor molecule is usually a nucleotide 5'-diphosphofucose. The reaction produces a nucleotide as a leaving group and a fucose containing a reactive carbonium ion, which forms a glycosidic bond with the available hydroxyl group of the acceptor molecule.
(2) Условия реакции фукозилирования и субстрата. (2) Reaction conditions for fucosylation and substrate.
Фукозилтрансферазы являются типичными гликозилазами и являются относительно устойчивыми ферментами. Условия реакций, подходящие для большинства гликозилтрансфераз, подходят для фукозилтрансфераз. Так, например, подходящие условия реакций включают температурный интервал от около 10 до 40oC, буферы включают органические и неорганические буферы со значениями pH в интервале физиологических значений pH. Приемлемый интервал значений pH составляет от около 4 до около 9. Концентрации солей составляют от около 0 до 200 мМ и от около 0.1 до около 1.0% неионного детергента (например, Triton X-100), который используют, если по-другому фермент не растворяется в водной среде фукозилирования. Часто возникает необходимость в таком двухвалентном катионе, как Mn2+.Fucosyl transferases are typical glycosylases and are relatively stable enzymes. Reaction conditions suitable for most glycosyltransferases are suitable for fucosyltransferases. For example, suitable reaction conditions include a temperature range of from about 10 to 40 ° C., buffers include organic and inorganic buffers with pH values in the range of physiological pH values. An acceptable pH range is from about 4 to about 9. Salt concentrations are from about 0 to 200 mM and from about 0.1 to about 1.0% non-ionic detergent (e.g., Triton X-100), which is used if the enzyme does not otherwise dissolve in an aqueous environment fucosylation. Often there is a need for such a divalent cation as Mn 2+ .
Углеводные акцепторные молекулы практически ничем не ограничены. Известные местоположения связывания указаны ранее; однако остальная часть углеводных акцепторных молекул не является критической. Фукозилтрансферазы достаточно толерантны к субстрату, и кроме акцепторного сахара, через который фукоза присоединяется, и сахаров, непосредственно соседствующих с акцепторным сахаром, остальная часть структуры субстрата имеет мало значения. Акцепторные углеводные молекулы можно получить исключительно из остатков сахаров, включая моносахариды, из гликопротеинов, из гликолипидов, или из неприродных соединений, в которых сахар акцептирующий фукозу, связан с такими соединениями, как арил, гетероциклы, циклоалканы и ациклические углеводороды. Carbohydrate acceptor molecules are practically unlimited. Known binding locations are indicated earlier; however, the rest of the carbohydrate acceptor molecules are not critical. Fucosyl transferases are fairly tolerant to the substrate, and in addition to the acceptor sugar through which fucose is attached and the sugars directly adjacent to the acceptor sugar, the rest of the substrate structure is of little importance. Acceptor carbohydrate molecules can be obtained solely from sugar residues, including monosaccharides, from glycoproteins, from glycolipids, or from non-natural compounds in which fucose accepting sugar is bound to compounds such as aryl, heterocycles, cycloalkanes and acyclic hydrocarbons.
Предпочтительная углеводная акцепторная молекула оканчивается GalpI, 4GalcNAc-X фрагментом, где X представляет органическую молекулу. Примеры X групп отмечены далее в тексте. Примеры углеводных акцепторных молекул включают Ga1β1,4G1cNAc, лактозу, NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc, Ga1β1,3G1cNAc,Ga1β1,4G1ucal/ (лактал), NeuAcα2, 3Galβ1,4Glucal, 2-галоидзамещенные продукты реакций вышеуказанных глюкалей, Galβ1,4(5-тио)Glc,Galβ1,4GlcNAcβ- O-аллил. A preferred carbohydrate acceptor molecule terminates in the GalpI, 4GalcNAc-X fragment, where X represents an organic molecule. Examples of X groups are noted later in the text. Examples of carbohydrate acceptor molecules include Ga1β1,4G1cNAc, lactose, NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc, Ga1β1,3G1cNAc, Ga1β1,4G1ucal / (lactal), NeuAcα2, 3Galβ1,4Glucal, 2-halogen-substituted reaction products of 5 above, 5 ) Glc, Galβ1,4GlcNAcβ-O-allyl.
SLex или SLea аналог может, таким образом, включать атом галоида вместо одного из кольцевых гидроксилов. Был найден новый способ получения 2- или 3-галоид-моно- или олигосахаридов из их соответствующих гликалей за счет использования хлорпероксидазы. Полученные 2(3)-дезокси-2(3)-галоидсахариды можно затем использовать в обсуждающихся далее синтезах.SLe x or SLe a analogue may thus include a halogen atom instead of one of the ring hydroxyls. A new method has been found for the preparation of 2- or 3-halo-mono- or oligosaccharides from their respective glycals through the use of chloroperoxidase. The resulting 2 (3) -deoxy-2 (3) -halogenosaccharides can then be used in the syntheses discussed below.
В соответствии с этим способом гликаль смешивают с перекисью водорода, выбранным ионом галоида (хлоридом, бромидом или иодидом) и каталитическим количеством хлорпероксидазы (EC 1.11.10) в водном буфере со значением pH около 2.5 - 3.5 до получения реакционной смеси. Полученную реакционную смесь далее поддерживают до тех пор, пока не образуется целевой продукт. Концентрации различных реагентов могут меняться, как это хорошо известно специалистам. Примерные концентрации и синтезы приводятся далее. Таким образом, получают галоидгидрин - продукт и затем его предпочтительно выделяют. In accordance with this method, glycal is mixed with hydrogen peroxide selected by a halogen ion (chloride, bromide or iodide) and a catalytic amount of chloroperoxidase (EC 1.11.10) in an aqueous buffer with a pH value of about 2.5 - 3.5 until the reaction mixture is obtained. The resulting reaction mixture is further maintained until the desired product is formed. The concentration of various reagents may vary, as is well known to specialists. Exemplary concentrations and syntheses are given below. In this way, the halohydrin product is obtained and then it is preferably isolated.
При комнатной температуре обычно время реакции составляет от около 15 мин до 2 - 4 дней. Иодид реагирует быстрее всего, а хлорид реагирует наиболее медленно. At room temperature, the reaction time is usually from about 15 minutes to 2 to 4 days. Iodide reacts most quickly, and chloride reacts most slowly.
Обычно получают термодинамически образующиеся продукты, за исключением тех случаев, когда 1,3-диаксиальные взаимодействия препятствуют образованию 2-аксиально-замещенных продуктов. Если 1,3-диаксиальные взаимодействия присутствуют в реагирующем гликале, у галоид-гидратированных продуктов наблюдается стереоспецифичность в виде α- или β- ориентации галоидной группы, причем образуются также оба аномера 1- или 2-гидроксильной группы. Примеры синтеза 2- или 3-галоидуглеводных акцепторных молекул и их предшественников проиллюстрированы на схемах 3, 4 и 4a далее. Typically, thermodynamically formed products are obtained, unless 1,3-diaxial interactions interfere with the formation of 2-axially substituted products. If 1,3-diaxial interactions are present in the reacting glycal, halogen-hydrated products exhibit stereospecificity in the form of the α- or β-orientation of the halogen group, and both anomers of the 1- or 2-hydroxyl group are also formed. Examples of the synthesis of 2- or 3-halo-carbohydrate acceptor molecules and their precursors are illustrated in
Бромгидратирование сиалильной Lex молекулы с терминальным гликалем (соединение 36 схемы 4a), который имеет конформацию в растворе, аналогичную конформации сиалил Lex приводят к получению продуктов (соединения 37a и 37b). Продукты, имеющие ту же конформацию, что и соединение 36 и сиалил Lex на участке связывающего домена, состоят из NeuAc-Ga1-Fuc в соответствии с NOE исследованиями.Bromohydration of the sialyl Le x molecule with terminal glycal (
Бромированные сахариды можно также получить с использованием N-бромсукцинимида (NBS) в растворителе ацетонитрил-вода. Эту процедуру можно использовать для изменения соотношения образующихся продуктов, таких как соединения 32 и 33, которые получаются в равных количествах ферментативной реакции, и в соотношении 1 : 2.5 (32 : 33) при использовании NBS. 3-галоидное соединение 35 и его изомерный галоидгидратированный продукт, соединение 35a, получают в соотношении 2 : 3 (35 : 35a) с использованием NBS реакций по сравнению с отдельным изомером, соединением 35, в тех случаях, когда используют ферментативную реакцию. Brominated saccharides can also be prepared using N-bromosuccinimide (NBS) in an acetonitrile-water solvent. This procedure can be used to change the ratio of the resulting products, such as
Схема 3 иллюстрирует бромгидратирование D-глюкаля, D-галакталя и D-фукаля и образование соответствующих 2-дезокси-2-броммоносахаридов (соединения 20, 21, 22 и 23). Бромгидратирование сиалаля соединения 34 хлорпероксидазой (CPO) до получения соответствующей 3-дезокси-3-бромсиалильной кислоты соединения 35 также представлено в нижней части схемы 3.
Схема 4 иллюстрирует хлоро- и иодогидратацию галакталя до получения соединений 25, 26 и 27. Представлено на схеме 4 бромгидратирование GalI, 3Glucal (соединение 28) и Gal, 4Glucal (соединение 31) до получения соответствующих α- и β-2- дезокси-2-бром соединений, соединений 29 и 30 и соединений 32 и 33 соответственно.
Активированный донор фукозы, нуклеозид-5'-дифосфофукоза, чаще всего содержит гуанозин; однако существуют и альтернативные доноры, такие как нуклеотид, содержащий любой L-сахар, например L-рамноза и L-идоза. An activated fucose donor, nucleoside-5'-diphosphofucose, most often contains guanosine; however, alternative donors exist, such as a nucleotide containing any L-sugar, for example L-ramnose and L-idose.
Для того чтобы связать реакцию фукозилтрансферазы со второй реакцией гликозилтрансферазы, можно просто использовать преимущество того факта, что оптимальные условия для реакций большинства гликозилтрансфераз перекрываются. Таким образом, данные условия реакции для любой гликозилтрансферазы обеспечивают функционирование известных фукозилтрансфераз. Используя указанные ранее условия реакции для фукозилтрансферазы и используя обычные эксперименты титрования, можно получить условия реакции, подходящие для синтеза фукозилированного олигосахарида, используя только моносахариды. In order to link the fucosyl transferase reaction to the second glycosyl transferase reaction, one can simply take advantage of the fact that the optimal conditions for the reactions of most glycosyl transferases overlap. Thus, these reaction conditions for any glycosyl transferase ensure the functioning of known fucosyl transferases. Using the above reaction conditions for fucosyl transferase and using conventional titration experiments, one can obtain reaction conditions suitable for the synthesis of a fucosylated oligosaccharide using only monosaccharides.
Вообще при выборе условий селективной реакции для множественных реакций гликозилтрансферазы в единой реакционной смеси следует принять во внимание температуру, pH, общую концентрацию осмотически активных ионов, как представлено ранее. Если одной из гликозилтрансфераз является фукозилтрансфераза, приемлемые условия реакции включают интервал pH предпочтительно от около 6.0 до около 8.5, и наиболее предпочтительно, между около 7.0 и около 7.5. Такие двухвалентные катионы, как Mn2+, могут быть использованы, но двухвалентные ионы хелатообразующих агентов нежелательны.In general, when choosing the conditions of a selective reaction for multiple glycosyltransferase reactions in a single reaction mixture, one should take into account temperature, pH, and the total concentration of osmotically active ions, as previously described. If one of the glycosyltransferases is fucosyltransferase, suitable reaction conditions include a pH range of preferably from about 6.0 to about 8.5, and most preferably between about 7.0 and about 7.5. Divalent cations such as Mn 2+ can be used, but divalent ions of chelating agents are undesirable.
Состав буферов не является критическим. Подходят водные буферы, такие как HEPES. Осмомолярность буфера составляет величину от 100 до около 300 мОсм. The composition of the buffers is not critical. Water buffers such as HEPES are suitable. The osmolarity of the buffer is from 100 to about 300 mOsm.
Вышеперечисленные условия, при которых функционируют ферменты, здесь и далее называют условиями биологических реакций. The above conditions under which enzymes function are hereinafter referred to as biological reaction conditions.
Времена реакций меняются в зависимости от субстратов, ферментов и температур. Обычно время реакции составляет 24 - 96 ч. Reaction times vary with substrates, enzymes, and temperatures. Typically, the reaction time is 24 to 96 hours.
В некоторых случаях, если используют галактозилтрансферазу, а моносахаридный акцептор содержит агликон одного положения глюкозы в α- ориентации, условия реакции могут включать лактальбумин, предпочтительно α- лактальбумин. In some cases, if galactosyltransferase is used and the monosaccharide acceptor contains an aglycon of a single glucose position in the α orientation, the reaction conditions may include lactalbumin, preferably α-lactalbumin.
Так, например, реакция сиалилтрансферазы, описанная Ichikawa et al., J. Amer. Chem. Soc. , 113: 4698 - 4700 (1991) может быть связана с рекомбинантной человеческой α- (1,3/4) фукозилтрансферазой Льюиса, как описано Kukowska - Latallo et al., Genes and Devel., 4: 1288 (1990). Реакционная смесь водного буфера (HEPES) имеет интервал pH 7.0 - 7.5, и концентрацию солей 50 - 200 мМ. Реакция протекает при температуре около 37oC.For example, the sialyl transferase reaction described by Ichikawa et al., J. Amer. Chem. Soc. 113: 4698 - 4700 (1991) may be associated with recombinant human α- (1.3 / 4) Lewis fucosyltransferase as described by Kukowska - Latallo et al., Genes and Devel., 4: 1288 (1990). The aqueous buffer reaction mixture (HEPES) has a pH range of 7.0–7.5 and a salt concentration of 50–200 mM. The reaction proceeds at a temperature of about 37 o C.
В. Специфичность субстрата и исследования ингибирования гликозилтрансфераз. B. Specificity of the substrate and glycosyltransferase inhibition assays.
α- 1,3/4FucT. Фукозилтрансфераза, способная переносить FUC фрагмент из GDP-Fuc на 3- и 4-OH группы GlcNAc с образованием Lexили Lea, является α- 1,3/4FucT (Fukowska-Latallo et al. , Gene and Debelopment 4: 1288 (1990); Dumas et al. , Bioorg. and Med. Chem. Lett. 1: 425 (1990)). Как следует из приводимой далее табл. 1, фермент катализирует фукозилирование Galβ1,3GlcNAc быстрее (Vотн 580), нежели Galβ 4GlcNac (LacNAc) (Vотн 100) (примеры 1 и 4) при концентрации 10 мМ углеводного акцептора. Сиалилированный LacNAc (пример 7) также является субстратом для этого фермента, обеспечивающим синтез (Dumas et al., Bioorg. and Med. Chem. Lett., 1: 425 (1991)) сиалил Lex. Интересно, что Galβ1,4 (5-тио)-Glc (Gautheron - Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong et al. J. Am. Chem. Soc., 113: 8137 - 8245 (1991)] является лучшим субстратом, нежели соответствующий дисахарид, лактоза (примеры 2 и 3) в тех же условиях. Каждый из субстратов табл. 1 представляет углеводный акцептор фукозы из фукозильного донора с использованием этого фермента. Однако Galβ1,4 дезоксиноджиримицин (Gautheron - Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong et al. J. Am. Chem. Soc. , 113: 8137 - 8245 (1991)) (пример 11) является ингибитором (ИК50 40 мМ). Из-за ограниченного количества α- 1,3/4Fuc, дальнейшие исследования не проводились.α- 1.3 / 4FucT. A fucosyl transferase capable of transferring a FUC fragment from GDP-Fuc to the 3- and 4-OH groups of GlcNAc to form Le x or Le a is α-1,3 / 4FucT (Fukowska-Latallo et al., Gene and Debelopment 4: 1288 ( 1990); Dumas et al., Bioorg. And Med. Chem. Lett. 1: 425 (1990)). As follows from the following table. 1, the enzyme catalyzes fucosylation of Galβ1,3GlcNAc faster (V rel 580) than Galβ 4GlcNac (LacNAc) (V rel 100) (examples 1 and 4) at a concentration of 10 mM carbohydrate acceptor. Sialylated LacNAc (Example 7) is also a synthesis substrate for this enzyme (Dumas et al., Bioorg. And Med. Chem. Lett., 1: 425 (1991)) sialyl Le x . Interestingly, Galβ1,4 (5-thio) -Glc (Gautheron - Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong et al. J. Am. Chem. Soc. , 113: 8137-8245 (1991)] is a better substrate than the corresponding disaccharide, lactose (examples 2 and 3) under the same conditions. Each of the substrates of Table 1 represents a fucose carbohydrate acceptor from a fucosyl donor using this enzyme. However,
α- 1,3FucT. Этот фермент ответствен за получение сиалил Lex в человеческой плазме типа α- 1,3FucT, который недавно был клонирован, сверхэкспрессирован (Weston et al., J. Biol Chem., 267: 4152 (1992)) и использован в синтезе. В табл. 2 представлена специфичность субстрата, и, как ожидалось, тот фермент более специфичен для LacNAc (V/Km 2.9, пример 1), нежели Gal β-1,3 GlcNAc (V/Km 0.22, пример 5). Аналогично результату для α- 1,3/4FucT (пример 3, табл. 1), Gal β-1,4/5-тио/Glc также является субстратом для α- FucT (пример 3, табл. 2). В отличие от α- 1,3/4 фермента лактал (пример 6) является субстратом для α- 1,3 фермента.α- 1,3FucT. This enzyme is responsible for the production of sialyl Le x in human plasma of type α-1,3FucT, which has recently been cloned, overexpressed (Weston et al., J. Biol Chem., 267: 4152 (1992)) and used in the synthesis. In the table. 2 shows the specificity of the substrate, and, as expected, that enzyme is more specific for LacNAc (V / K m 2.9, example 1) than Gal β-1,3 GlcNAc (V / K m 0.22, example 5). Similar to the result for α-1,3 / 4FucT (Example 3, Table 1), Gal β-1,4 / 5-thio / Glc is also a substrate for α-FucT (Example 3, Table 2). In contrast to the α-1,3 / 4 enzyme, lactal (Example 6) is a substrate for the α-1,3 enzyme.
Трисахарид NeuAc α-2,3 Gal β-1,4 GlcNAc (пример 7), предшественник сиалил Lex, является наилучшим субстратом с относительной максимальной скоростью 620% в расчете на LacNAc. α- 2,6-связанный сиалозид (пример 10) примерно в 50 раз менее активен в качестве субстрата, нежели α- 2,3-изомер. Весьма нежелательно, что фермент может также переносить Fuc на глюкальсодержащий сиалилированный трисахарид (Vотн. 330%, пример 9).Trisaccharide NeuAc α-2,3 Gal β-1,4 GlcNAc (Example 7), the precursor of sialyl Le x , is the best substrate with a relative maximum speed of 620% per LacNAc. The α-2,6-linked sialoside (Example 10) is about 50 times less active as a substrate than the α-2,3 isomer. It is highly undesirable that the enzyme can also transfer Fuc to a glucally-containing sialylated trisaccharide (
Что же касается связывания, этот фермент имеет более высокое сродство и дисахаридами (примеры 1, 3, 4, 6), нежели с трисахаридами. Возрастание сродства наблюдается, когда GlcNAc фрагмент LacNAc заменяют 5-тио-Glc, глюкалем (Haworth et al., J. Chem. Soc. 2644 (1990)) или GlcAc- β-O-аллилом. Лактоза, однако, обладает очень низким сродством, хотя относительная скорость Vмакс достаточно велика (150%). Каждый из субстратов табл. 2 является углеводным акцептором для фукозы из фукозильного донора, использующего этот фермент.As for binding, this enzyme has a higher affinity for disaccharides (examples 1, 3, 4, 6) than for trisaccharides. An increase in affinity is observed when the GlcNAc fragment of LacNAc is replaced with 5-thio-Glc, glucal (Haworth et al., J. Chem. Soc. 2644 (1990)) or GlcAc-β-O-allyl. Lactose, however, has a very low affinity, although the relative velocity V max is quite high (150%). Each of the substrates of the table. 2 is a carbohydrate acceptor for fucose from a fucosyl donor using this enzyme.
В наших исследованиях ингибирования α 1,3FucT (табл. 3) наблюдение того факта, что 3'-дезокси-Lac-Nac β- O-аллил (Gautheron - Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 8137 - 8245 (1991)) является слабым ингибитором (пример 5), согласуется с более ранними сообщениями о дезоксигенированных олигосахаридах для гликозилтрансфераз (Hindsgaul et al., J. Biol Chem. 266: 17 858 (1991)). Среди акцепторных углеводных субстратных аналогов, которые были исследованы, Galβ1,4 дезоксиноджиримицин оказался наиболее потенциальным ингибитором (пример 4, ИК50 = 8 мМ).In our studies of the inhibition of
Два азасахара (Kajimoto et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 6679 (1991)), которые, как известно, являются потенциальными ингибиторами α- фукозидазы, были проанализированы в качестве акцепторных аналогов (примеры 8 и 9), и было обнаружено, что они являются умеренными ингибиторами относительно LacNAc для FucT (ИК50 около 34 - 52 мМ). Дезоксиноджиримицин оказался, однако, субстратом для α- 1,4GalT (Wong et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 8137 - 8145 (1991)). GDP-Man также является потенциальным ингибитором α- 1,3-FucT (ИК50 2 мМ).Two azasaharas (Kajimoto et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 6679 (1991)), which are known to be potential α-fucosidase inhibitors, were analyzed as acceptor analogues (Examples 8 and 9), and it was found that they are moderate inhibitors relative to LacNAc for FucT (IR 50 about 34 - 52 mm). Deoxynojirimycin, however, turned out to be a substrate for α-1,4GalT (Wong et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 8137 - 8145 (1991)). GDP-Man is also a potential inhibitor of α-1,3-FucT (
Для исследования продуктов ингибирования наше внимание было сфокусировано на выделенном нуклеозиддифосфате. GDP является побочным продуктом ферментативного фукозилирования и представляет собой очень эффективный неконкурирующий ингибитор по отношению к LacNAc (Kii = 0.13 мМ. Kis = 0.16 мМ, пример 10). Другой нуклеозиддифосфат, UDP выделенный при ферментативном галактозилировании, также весьма эффективный потенциальный ингибитор GalT (Ki = 0.46 мМ). GDP-Fuc является потенциальным ингибитором α- 1,3FucT в концентрациях выше 0.2 мМ в присутствии 10 мМ LacNAc. Однако он не является ингибитором α- 1,4/4 FucT.To study the products of inhibition, our focus was on isolated nucleoside diphosphate. GDP is a by-product of enzymatic fucosylation and is a very effective non-competitive inhibitor against LacNAc (K ii = 0.13 mm. K is = 0.16 mm, example 10). Another nucleoside diphosphate, UDP isolated during enzymatic galactosylation, is also a very effective potential GalT inhibitor (K i = 0.46 mM). GDP-Fuc is a potential inhibitor of α-1,3FucT at concentrations above 0.2 mM in the presence of 10 mM LacNAc. However, it is not an inhibitor of α-1,4 / 4 FucT.
В дополнении к азасахарам примеров 8 и 9 в табл. 3, другие азасахара, такие, как соединения 51, 52 и 53 (далее), также ингибируют α- фукозидазную активность, как и соединение 50 (пример 9, табл. 3). Соединения 50 - 53 демонстрируют Ki значения с этим ферментом 4.22, 8 и 1.4 мкМ соответственно (cм. также Dumas et al., Bioorg, and Med. Chem. Lett., 2:33 (1992)).In addition to the azasaharas of examples 8 and 9 in table. 3, other azasugars, such as
Помимо соединения 50 было обнаружено, что соединение 53 также является конкурирующим ингибитором человеческой плазмы типа α- 1,3-фукозилтрансферазы. ИК50 относительно LacNAc составляет 80 мМ. Кроме того, GDP, который образуется в реакции фукозилирования из GDP-Fuc и является неконкурирующим ингибитором, если присутствует при ИК50, 0.05 мМ, демонстрирует явное синергическое ингибирование в присутствии либо соединения 50, либо 53. Данные исследования ингибирования для соединения 50 представлены на фиг. 3. Этот синергический эффект может быть связан с взаимодействием между GDP и азасахаром в активном сайте фермента до образования комплекса, который имитирует структуру переходного состояния реакции фукозилпереноса.
In addition to
Вышеуказанные результаты обеспечивают способ ингибирования реакции гликозилтрансферазы, например, реакции фукозилтрансферазы. В соответствии с этим способом такую гликозилтрансферазу, как α-1,3-фукозилтрансферазу человеческой плазмы, углеводную акцепторную молекулу, такую как LacNAc, и активированную гликозильную донорскую молекулу, такую как GDP-Fuc, и ингибирующее количество такого азасахара, как любое из соединений 50 или 53, смешивают в водной среде и поддерживают в условиях биологической реакции в течение промежутка времени, достаточного для ингибирования реакции гликозилтрансферазы. The above results provide a method of inhibiting a glycosyl transferase reaction, for example, a fucosyl transferase reaction. According to this method, a glycosyltransferase such as α-1,3-fucosyltransferase of human plasma, a carbohydrate acceptor molecule, such as LacNAc, and an activated glycosyl donor molecule, such as GDP-Fuc, and an inhibitory amount of such azasacchar, like any of the
Более предпочтительно присутствие ингибирующего количества нуклеозиддифосфатного продукта реакции гликозилирования, такого как UDP или GDP, где GDP-Fuc является донором гликозилирования. Ингибирующие количества азасахара и нуклеозиддифосфата, когда они присутствуют, предпочтительно составляют по крайней мере 10% от их индивидуальных ИК50 значений, и более предпочтительно эти количества составляют по крайней мере 50% от их индивидуальных ИК50 значений, измеренных in vitro, как обсуждается далее для конкретных реакций гликозилирования, которые нужно ингибировать. Можно также использовать концентрации, превышающие ИК50. Обычно реакцию гликозилирования ингибируют по крайней мере на 25%, и более предпочтительно по крайней мере на 50%.More preferably, the presence of an inhibitory amount of a nucleoside diphosphate glycosylation reaction product, such as UDP or GDP, where GDP-Fuc is a glycosylation donor. The inhibitory amounts of azasugar and nucleoside diphosphate, when present, preferably comprise at least 10% of their individual IR 50 values, and more preferably these amounts comprise at least 50% of their individual IR 50 values, measured in vitro, as discussed below for specific glycosylation reactions to be inhibited. Concentrations in excess of IR 50 may also be used. Typically, the glycosylation reaction is inhibited by at least 25%, and more preferably at least 50%.
Ингибирование гликозилирования происходит как in vitro, так и in vivo. Примеры исследований in vitro ингибирования приводятся далее. Для использования in vivo фермент, гликозильный донор и акцепторные молекулы и GDP присутствуют в животном-хозяине, которое может быть лабораторным животным, например мышью, крысой или кроликом, или это может быть человек. Азасахар вводят хозяину обычно применяемым способом введения лекарственных препаратов, хорошо известным специалистам. При желании можно также вводить дополнительные количества GDP. Условия биологической реакции задаются организмом млекопитающего-хозяина. Добавочный азасахар поддерживают в организме млекопитающего-хозяина до тех пор, пока он не выделяется или не катаболизируется. Glycosylation inhibition occurs both in vitro and in vivo. Examples of in vitro inhibition studies are provided below. For in vivo use, an enzyme, a glycosyl donor, and acceptor molecules and GDP are present in a host animal, which may be a laboratory animal, such as a mouse, rat, or rabbit, or it may be a human. Azasahar is administered to the host by a commonly used method of drug administration, well known to those skilled in the art. If desired, additional amounts of GDP may also be administered. The biological response conditions are set by the host mammalian organism. Supplemental azasugar is maintained in the host mammal until it is secreted or catabolized.
C. Химический и ферментативный способы получения GDP-фукозы. C. Chemical and enzymatic methods for producing GDP-fucose.
Фукозилтрансферазную циклическую реакцию можно вести, либо добавляя стехиометрические количества соответствующего сахарного нуклеотида, например GDP-фукозу, или предпочтительно сахарный нуклеотид можно создавать за счет каталитических количеств соответствующего нуклеотида и стехиометрических количеств PEP и Man-I-P или Fuc-I-P. The fucosyl transferase cyclic reaction can be carried out either by adding stoichiometric amounts of the corresponding sugar nucleotide, for example GDP fucose, or preferably the sugar nucleotide can be created by catalytic amounts of the corresponding nucleotide and stoichiometric amounts of PEP and Man-I-P or Fuc-I-P.
GDP-фуккоза является предпочтительным активированным сахарным донором для известной фукозилтрансферазы. Ее трудно и дорого получать, и для других описываемых далее реакционных циклов предпочтительно, чтобы ее синтез включал in situ регенерацию ее нуклеотидных предшественников. Общая схема представлена в фукозном цикле схемы 1. GDP fucose is the preferred activated sugar donor for the known fucosyl transferase. It is difficult and expensive to obtain, and for the other reaction cycles described below, it is preferable that its synthesis includes in situ regeneration of its nucleotide precursors. The general scheme is presented in the fucose cycle of
(1) Химической синтез фукозо-1-фосфата и GDP-фукозы. (1) Chemical synthesis of fucose-1-phosphate and GDP-fucose.
Химический синтез GDP-Fuc основан на соединении фукозо-1-фосфата и такого активированного GMP, как GMP-морфолидат (cм. (a) Кочетков с сотр. Adv. Garbohydr. Chem. Biochem. 28:307 (1973); (b) Moffat, Methods Enzymol., 8:136 (1966); и (c) Roseman et al., Am. Chem. Soc., 83:659 (1961)). За счет относительно высокой лабильности фукозо-1-фосфата и GDP-Fuc известные химические выходы для синтеза Fuc-I-P и реакции присоединения Fuc-I-P и GMP производного были низки. Описанo несколько синтезов фукозо-1-фосфата. Так как только Fuc-I-P среди сахарных нуклеотидов имеет термодинамически нестабильный β- фосфатный фрагмент на аномерном центре фукозы, стереохимию аномерного центра трудно контролировать. Здесь предложены два эффективных способа для GDP-Fuc: один химический, другой - ферментативный. The chemical synthesis of GDP-Fuc is based on the combination of fucose-1-phosphate and an activated GMP such as GMP morpholidate (see (a) Kochetkov et al. Adv. Garbohydr. Chem. Biochem. 28: 307 (1973); (b) Moffat, Methods Enzymol., 8: 136 (1966); and (c) Roseman et al., Am. Chem. Soc., 83: 659 (1961)). Due to the relatively high lability of fucose-1-phosphate and GDP-Fuc, the known chemical yields for the synthesis of Fuc-I-P and the addition reaction of the Fuc-I-P and GMP derivative were low. Several syntheses of fucose-1-phosphate have been described. Since only Fuc-I-P among sugar nucleotides has a thermodynamically unstable β-phosphate fragment at the anomeric center of fucose, the stereochemistry of the anomeric center is difficult to control. Two effective methods for GDP-Fuc are proposed here: one is chemical and the other is enzymatic.
Первый - химический синтез GDP-Fuc - осуществила группа Barker (Nunez et al. , Can. J. Chem., 59:2086 (1981). Для получения фукозо-1-фосфата они использовали 2,3,4-три-O-ацетил -β-/ L-фукозу, полученную из соответствующего бромпроизводного с последующей кристаллизацией и фосфорилированием полученного β- аномера. Группа Hindsgaul (Gokhale, Can. J. Chem., 68:1063 (1990)) использовала реакцию гликозилирования ацетофукозилбромида и дибензилфосфаттетрабутиламмонийной соли для получения относительно нестабильного гликозилфосфата (менее 10 мин при хроматографии на силикагеле). Schmidt et al., (Schmidt et al., Liebigs Am. Chem. 191:121 (1991)) использовали фукозилимидат и получали продукт гликозилирования без кислотного катализатора Льюиса с высоким выходом. Группа Van Boom (Westerduinn et al., Tetrahedron Lett., 27: 1211 (1986)) использовала трехвалентный фосфитилирующий агент на 2,3,4-тио-O-бензилфукозе и превращение в α- фукозилфосфат. The first, chemical synthesis of GDP-Fuc, was carried out by the Barker group (Nunez et al., Can. J. Chem., 59: 2086 (1981). They used 2,3,4-tri-O- to produce fucose-1-phosphate. acetyl-β- / L-fucose obtained from the corresponding bromine derivative followed by crystallization and phosphorylation of the obtained β-anomer. The Hindsgaul group (Gokhale, Can. J. Chem., 68: 1063 (1990)) used the glycosylation reaction of acetofucosyl bromide and dibenzylphosphate tetrabutylammonium producing relatively unstable glycosyl phosphate (less than 10 minutes by silica gel chromatography) Schmidt et al., (Schmidt et al., Liebigs Am. Chem. 191: 121 (1991) used fucosylimidate and obtained a glycosylation product without a high yield Lewis acid catalyst. The Van Boom group (Westerduinn et al., Tetrahedron Lett., 27: 1211 (1986)) used a trivalent phosphitylating agent on 2,3,4-thio-O-benzyl fucose and conversion to α-fucosyl phosphate.
Здесь раскрыты два усовершенствованных подхода к химическому синтезу GDP-фукозы (см. схемы 5 - 7 далее). В одном из них (схема 5) используют реакцию гликозилирования бензоилированного (Bz) фукозилбромида (соединение 3) и дибензилфосфата. Использование бензоильной группы вместо ацетильной в качестве защитной группы обеспечивает повышенную стабильность фукозильного производного и стереоселективность реакции гликозолирования. Гликозилирование соединения 3 и дибензилфосфата (Linshorst et al., Carbohydr. Rev. 209: 119 (1991)) протекает спокойно, и в результате получают продукт присоединения с 95%-ным выходом. Как и ожидалось, соединение 4 оказывается достаточно стабильным для того, чтобы его можно было очистить на хроматографической колонке с силикагелем (более 3 ч); однако уже очищенный материал оказывается нестабильным. Если очищенное соединение 4 оставить на ночь при комнатной температуре, обнаруживается некоторое количество продуктов разложения и аномеризации. Следует заметить, что очищенное соединение 4 используют на следующей стадии сразу же. Удаление бензильных групп с фосфата, фрагмента и бензольных групп осуществляют поэтапно, как было указано ранее (Gokhale et al., Can. J. Chem., 68: 1063 (1990)). Two improved approaches to the chemical synthesis of GDP-fucose are disclosed here (see Schemes 5-7 below). In one of them (Scheme 5), the glycosylation reaction of benzoylated (Bz) fucosyl bromide (compound 3) and dibenzyl phosphate is used. The use of a benzoyl group instead of acetyl as a protective group provides increased stability of the fucosyl derivative and stereoselectivity of the glycosolation reaction. Glycosylation of
В другом варианте используют трехвалентный фосфитилирующий агент, такой как дибензил-N,N-диэтилфосфороамидит (DDP), который используют для получения дигидроксиацетилфосфата (DHAP) (см. схему 6 далее (Pederson et al., Tetrahedron, 47: 2643 (1991)). Так, 2,3,4-тио-O-ацетилфукозу, соединение 7, полученную либо химическим, либо ферментативным деацетилированием (Hennen et al. , J. Org. Chem. 53: 4943 (1988)), фосфинируют DDP в присутствии тетразола. Реакция протекает спокойно с 79%-ным выходом соединения 8, соединений формул I и II, которые окисляют до соответствующего фосфатного соединения 9. Удаление защиты у соединения 9 осуществляют аналогично получению соединения 5 из соединения 4. In another embodiment, a trivalent phosphitylating agent such as dibenzyl-N, N-diethylphosphoroamidite (DDP) is used, which is used to prepare dihydroxyacetyl phosphate (DHAP) (see
Реакция фосфитилирования с использованием (BnO2)PNEt2 (DDP), проиллюстрированная на схеме 6, весьма подходит для получения различных фосфитов и соответствующих фосфатов с высокими выходами. Дальнейшие примеры соединений и подробности обсуждаются далее в разделе H.The phosphitylation reaction using (BnO 2 ) PNEt 2 (DDP), illustrated in
Fuc-1-P эффективно активируют превращением в триалкиламмониевую соль при взаимодействии с гуанозин-5'-монофосфоморфолидатом (1 : 2) в таком растворителе, как пиридин. Полученный продукт, GDP-Euc, соединение 12, очищают, используя обычную хроматографическую колонку. Эти реакции представлены далее в схеме 7. Fuc-1-P is effectively activated by conversion to the trialkylammonium salt by reaction with guanosine-5'-monophosphomorpholidate (1: 2) in a solvent such as pyridine. The resulting product, GDP-Euc,
(2) Ферментативное получение GDP-фукозы. (2) Enzymatic production of GDP-fucose.
Ферментативное получение GDP-фукозы предпочтительно. Ферментативное получение GDP-фукозы описано Schacter et al., Methods of Enzymol., 28: 285 (1972) и проводилось с использованием фукозокиназы и GDP-фукозопирофосфорилазы из печени свиньи. Enzymatic production of GDP-fucose is preferred. Enzymatic production of GDP-fucose is described by Schacter et al., Methods of Enzymol., 28: 285 (1972) and was carried out using fucosokinase and GDP-fucose pyrophosphorylase from pig liver.
Как легко видеть, эту мультиферментативную реакцию можно провести, используя сочетание различных ферментов и высокоэнергетических субстратов. Такие циклы фукозных реакций представлены на схемах 1 и 8, представляя примеры такой мультиферментативной системы. В них фукозу добавляют в стехиометрических количествах наряду с PEP. Каталитические количества PK, FK и GDP-FucPP добавляют вместе с ADP и GDP. Условия реакции аналогичны приведенным ранее для трансфераз. It is easy to see that this multienzymatic reaction can be carried out using a combination of various enzymes and high-energy substrates. Such cycles of fucose reactions are presented in
(3) Манноза в качестве исходного материала. (3) Mannose as starting material.
В другом варианте GDP-Fuc можно получить эффективно в результате получения GDP-маннозы и последующего ферментативного превращения в GDP-Fuc. Предшественником GDP-Man является Man-1-P, соединение 18. Man-1-P получают, используя тот же подход, что и для получения фукозо-1-P. Предпочтительно использовать ацетальные защитные группы для получения маннозно-пер-O-ацетата, что представлено на схеме 9 ниже. В другом варианте Man-1-P можно ферментативно получить способом, аналогичным Glc-1-P. In another embodiment, GDP-Fuc can be obtained efficiently by obtaining GDP-mannose and subsequent enzymatic conversion to GDP-Fuc. The precursor of GDP-Man is Man-1-P,
Ферментативный синтез GDP-фукозы из маннозо-1-фосфата in situ с образованием GDP-маннозы достигают в результате комбинации двух ферментативных систем: GDP-маннозо-пирофосфорилазы и GDP-фукозных синтетических ферментов. Регенерация NADPH необходима для образования GDP-фукозы. Такую регенерацию можно осуществить, используя NADPH, зависимую алкоголь-дегидрогеназу из Thermoanaerobacterium brokii в присутствии изопропанола или глюкозофосфат-дегидрогеназы в присутствии глюкозы. GDP-маннозо-пирофосфилазу можно получить из дрожжей, как указано далее; но другие источники, как, например, Arthrobacter (Preiss et al., J. Biol. Chem. 239: 3119 (1964)), Escherichia coli (Lieberman et al. , J. Bact., 101: 965 (1970)), а также из млекопитающих (Smoot et al., Eur. J. Biochem., 148: 83 (1985)) были описаны. The enzymatic synthesis of GDP-fucose from mannose-1-phosphate in situ with the formation of GDP-mannose is achieved as a result of a combination of two enzymatic systems: GDP-mannose-pyrophosphorylase and GDP-fucose synthetic enzymes. NADPH regeneration is necessary for the formation of GDP-fucose. Such regeneration can be carried out using NADPH, dependent alcohol dehydrogenase from Thermoanaerobacterium brokii in the presence of isopropanol or glucose phosphate dehydrogenase in the presence of glucose. GDP mannose pyrophosphylase can be obtained from yeast, as follows; but other sources, such as Arthrobacter (Preiss et al., J. Biol. Chem. 239: 3119 (1964)), Escherichia coli (Lieberman et al., J. Bact., 101: 965 (1970)), and also from mammals (Smoot et al., Eur. J. Biochem., 148: 83 (1985)) have been described.
Превращение GDP-фукозы из GDP-маннозы впервые сообщали Ginsburg and Kirkman (Ginsburg et al., J. Am. Chem. Soc., 80: 3481 (1958). Этот фермент частично очищают и используют для демонстрации превращения GDP-маннозы в GDP-фукозу из A. aerogenes (ATCC 12 658), которое в настоящее время переименовано в Klebsiella pneumoniae (Ginsburg, J. Biol. Chem., 235: 2196 (1960)). Эта реакция оказалась NADPH-зависимой. Yamamoto et al., также сообщает о синтезе GDP-фукозы из GDP-маннозы с использованием фермента, полученного из Agrobacterium radiobarter (Yamamoto et al., Agric. Biol. Chem., 48: 823 (1984)). The conversion of GDP fucose from GDP mannose was first reported by Ginsburg and Kirkman (Ginsburg et al., J. Am. Chem. Soc., 80: 3481 (1958). This enzyme is partially purified and used to demonstrate the conversion of GDP mannose to GDP fucose from A. aerogenes (
Далее описано превращение маннозо-1-фосфата в GDP-фукозу in situ с образованием GDP-маннозы. Маннозо-1-фосфат превращают в GDP-фукозу за счет комбинации двух ферментных систем, GDP-маннозопирофосфорилазы и GDP-фукозы - синтетическиx ферментов, с регенерацией NADPH. Хотя начальный результат дает низкий выход, однако ожидают, что, если удастся достичь более высоких активностей ферментов, выход можно существенно повысить. Эти реакции представлены на схемах 10 и 11. The following describes the conversion of mannose-1-phosphate to GDP-fucose in situ with the formation of GDP-mannose. Mannose-1-phosphate is converted to GDP-fucose through a combination of two enzyme systems, GDP-mannose pyrophosphorylase and GDP-fucose - synthetic enzymes, with the regeneration of NADPH. Although the initial result gives a low yield, it is expected that if higher enzyme activities can be achieved, the yield can be significantly increased. These reactions are shown in
Для синтеза фукозилированного олигосахарида используют кофакторную систему регенерации, в которой выделившийся GDP превращают в GTP с помощью фосфоенолпирувата (PEP) и пируваткиназы (PK), а полученный NADP превращают в NADPH за счет 2-пропанола в присутствии алкоголь-дегидрогеназы. Используя α- 1,3/4 фукозилтрансферазу, Gal-β-1,3 GlcNAc превращают в Gal-β-1,3 (Fuc-α-1,4) GlcNAc (Dumas et al., Biomed. Chem. Lett. 1 : 425 (1991)). For the synthesis of a fucosylated oligosaccharide, a cofactor regeneration system is used in which the released GDP is converted to GTP using phosphoenolpyruvate (PEP) and pyruvate kinase (PK), and the resulting NADP is converted to NADPH due to 2-propanol in the presence of alcohol dehydrogenase. Using α-1,3 / 4 fucosyltransferase, Gal-β-1,3 GlcNAc is converted to Gal-β-1,3 (Fuc-α-1,4) GlcNAc (Dumas et al., Biomed. Chem. Lett. 1 : 425 (1991)).
D. Рециркулирование нуклеотидов. D. Recycling of nucleotides.
Так как гликозилтрансферазы часто ингибируются нуклеотидами, предпочтительно, чтобы концентрация нуклеотидов поддерживалась минимальной. Регенерация нуклеозидтрифосфатов из нуклеотидных донорных сахаров позволяет использовать каталитические количества нуклеотидов, которые эффективно исключает нежелательное ингибирование активности гликозилтрансферазы. Регенерация нуклеотидов может служить в качестве высокоэнергетичных связей нуклеотидфукозильных донорских молекул, требуемых для того, чтобы условия реакции поддерживали ферментативные реакции как пируваткиназы, так и гуанозин-5'-дифосфофукозо-пирофосфорилазы. Пример системы рециркулирования представлен на схеме 12 далее. Since glycosyltransferases are often inhibited by nucleotides, it is preferred that the nucleotide concentration is kept to a minimum. The regeneration of nucleoside triphosphates from nucleotide donor sugars allows the use of catalytic amounts of nucleotides, which effectively eliminates undesirable inhibition of glycosyltransferase activity. Nucleotide regeneration can serve as high-energy bonds of nucleotide-fucosyl donor molecules required for the reaction conditions to support enzymatic reactions of both pyruvate kinase and guanosine-5'-diphosphofucose-pyrophosphorylase. An example of a recycling system is shown in
Эти активированные донорские моносахаридные генерационные системы поддерживают реакции гликозилтрансферазы. Системы регенерации включают активированный донорский моносахарид и ферменты для регенерации активированного нуклеотидного сахарного донора из их соответствующих фосфатного донора, нуклеотидного и сахарного донора. Ферменты в регенерационной системе включают такие киназы, как пирувактиназа, ацетилкиназа и 1,6-дифосфофруктокиназа соответственно, и нуклеотид-сахаропирофосфорилазы, такие как GDP-Fuc-PP. Фосфатные доноры включают PEP, ацетилфосфат и D-фруктозо-1,6-дифосфат. These activated donor monosaccharide generation systems support glycosyl transferase reactions. Regeneration systems include an activated donor monosaccharide and enzymes for the regeneration of an activated nucleotide sugar donor from their respective phosphate donor, nucleotide and sugar donor. Enzymes in the regeneration system include kinases such as pyruvactinase, acetyl kinase and 1,6-diphosphofructokinase, respectively, and nucleotide-sugar pyrophosphorylases, such as GDP-Fuc-PP. Phosphate donors include PEP, acetyl phosphate and D-fructose-1,6-diphosphate.
Некоторые фосфатные доноры могут ингибировать активность других ферментов в системе, и доноры следует поэтому выбирать осторожно. Нуклеотид, который фосфорилируется киназой, следует выбирать так, чтобы он функционировал как подходящий субстрат для нуклеотид-сахарофосфорилазы. Some phosphate donors may inhibit the activity of other enzymes in the system, and donors should therefore be selected with caution. The nucleotide that is phosphorylated by the kinase should be selected so that it functions as a suitable substrate for the nucleotide sacchosphosphorylase.
Описанная ранее регенерационная система может ингибироваться обратным механизмом, если концентрация неорганического пирофосфата избыточна. Использование каталитических количеств неорганической пирофосфатазы исправляет эту проблему. The regeneration system described previously can be inhibited by the reverse mechanism if the concentration of inorganic pyrophosphate is excessive. The use of catalytic amounts of inorganic pyrophosphatase corrects this problem.
E. Сиалильные лиганды Льюиса. E. Sialyl Lewis Ligands.
Предпочтительными конечными продуктами, получаемыми и описанными способами, являются фармацевтически активные углеводы. Такие продукты включают сиалильные лиганды Льюиса (см. схемы 1 и 13. Группа R на съеме 13 может быть водородом или органической группой X, как было указано ранее). Сиалильные лиганды Льюиса определяют как любое соединение, которое связывается с селектирующим рецептором, как раскрыто у Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 5224 - 6228 (1991). Эти лиганды типифицируют по их концевым структурам (силиловая кислота и фукоза), находящимся на гликопротеинах и гликолипидах. Эти лиганды включают природные лиганды сиалил Lex (SLex) и сиалил Lea (SLea). Далее эти лиганды включают неприродные аналоги, которые связываются аналогичным образом с природными рецепторами лигандов. Так, например, аналоги лигандов можно получить с олигосахаридными аналогами акцепторов для гликозилтрансфераз. Некоторые акцепторные аналоги хорошо известны и включают дезоксигенированные олигосахариды, описанные Hindsgaul et al., J. Biol. Chem., 266: 17 858 - 17 862 (1991).Preferred end products obtained and described by methods are pharmaceutically active carbohydrates. Such products include Lewis sialyl ligands (see
Аналоги лигандов легко получить, используя вышеуказанные способы, и легко тестировать, используя описываемые далее анализы. Так, например, рецепторы, распознают лиганд, который был модифицирован из природного сайта в результате реакции эпимеризации (из GlcNAc в GalNAc) или изменения ориентации одной из гликозидных связей (с α-2,6 на β-2,6 связь). Примеры таких способов приведены далее. Ligand analogs are easy to obtain using the above methods and easy to test using the assays described below. For example, receptors recognize a ligand that has been modified from a natural site as a result of an epimerization reaction (from GlcNAc to GalNAc) or a change in orientation of one of the glycosidic bonds (from α-2.6 to β-2.6 bond). Examples of such methods are given below.
Галактозилирование. Galactosylation.
Были разработаны две мультиферментные системы для синтеза LacNAc с in situ регенерацией кофактора. Одна начинает с Glc-I-P и использует UDP-Glc пирофосфорилазу (EC 2.7.7.9, UDPGP) и UDP-Gal 4 эпимеразу (EC 5.1.3.2, UDPGP) (Wong et al., J. Org. Chem. 47:5416 (1982); Auge et al., Carbohydr. Rev. 151: 147 (1986); Thiem. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30:1163 (1991); Thiem. et al., Synthesis, 141 (1992)). Это представлено на схеме 14 далее, где NacGlcp O-аллил (соединение 40; х является O-аллилом) используют в качестве иллюстративного акцептора для GalT. UDP-галактозу получают из UDP-Glc с UDPGE; однако такое равновесие благоприятствует образованию UDP-Glc, и Glc-I-P следует получать отдельно. Glc-I-P можно получить, используя реакцию фосфитилирования, которая обсуждается. Two multienzyme systems have been developed for the synthesis of LacNAc with in situ cofactor regeneration. One starts with Glc-IP and uses UDP-Glc pyrophosphorylase (EC 2.7.7.9, UDPGP) and UDP-
Остальные используют Gal вместо Glc-I-P в качестве предшественника донора и UDPGP, галактокиназу (GK; EC 2.7.1.6) и Gal-I-P-Руридил-трансферазу (Gal-I-P UP; EC 2.7.7.12). Это представлено на схеме 15 с использованием I-13C-Gal, что иллюстрируется на схеме заштрихованным кружком в положении I. GK специфична для галактозы и обеспечивает непосредственное получение Gal-I-P, который превращают в UDP-Gal с помощью Gal-I-P UT и UDP-Gal. Последняя система, как было показано, пригодна для получения [Gal-l-13C]-LacNAc.The rest use Gal instead of Glc-IP as a precursor to the donor and UDPGP, galactokinase (GK; EC 2.7.1.6) and Gal-IP-Ruridyl transferase (Gal-IP UP; EC 2.7.7.12). This is shown in
Мультиферментная система начинается с 113C-Gal (99 атомных % от Isotec Inc. , Miamisburg, OH), GlcNAc-О-аллила (соединение 40) (Lee et al., Carbohydr, Rev., 37:193 (1974)), фосфоенолпирувата (PEP) и каталитических количеств Glc-I-P, ATP и UDP. UDP превращают в UTP с помощью пируваткиназы (PK; EC 2.7.1.40) и PED, и UTP реагирует с Glc-I-P катализируемым UDPGP до получения UDP-Glc. Побочный продукт, неорганический пирофосфат (PPi) разлагают неорганической пирофосфатазой (PPase; EC 3.6.1.1). За счет Gal-I-P UT, UDP-Gal реагирует с 13C-Gal-I-P, получаемой из 13C-Gal и ATP в присутствии GK, до получения UDP-13C-Gal и Glc-I-P. 13C-Cal из UDP-13C-Gal переносят на акцептор (GalcNAc β-О-аллил) с помощью GalT до получения Gal-I-13C-содержащего LacNAc β- аллила (соединение 41). Полученный UDP снова превращают в UDTP в реакции PK и PEP с выделенной Gal-I-P до регенерации UDP-Glc. Используя эту мультиферментную систему, Gal-I-13C-LaNAc β-О-аллил получают с 54%-ным выходом. Тот же способ используют для получения немеченого LaNac и аналогов. Примеры аналогов 41a-c проиллюстрированы на схеме.The multienzyme system begins with 1 13 C-Gal (99 atomic% from Isotec Inc., Miamisburg, OH), GlcNAc-O-allyl (compound 40) (Lee et al., Carbohydr, Rev., 37: 193 (1974)) phosphoenolpyruvate (PEP) and catalytic amounts of Glc-IP, ATP and UDP. UDP is converted to UTP using pyruvate kinase (PK; EC 2.7.1.40) and PED, and UTP reacts with Glc-IP catalyzed UDPGP to obtain UDP-Glc. An inorganic pyrophosphate (PPi) by-product is decomposed by inorganic pyrophosphatase (PPase; EC 3.6.1.1). Due to the Gal-IP UT, UDP-Gal reacts with 13 C-Gal-IP, obtained from 13 C-Gal and ATP in the presence of GK, to obtain UDP- 13 C-Gal and Glc-IP. 13 C-Cal from UDP- 13 C-Gal is transferred to an acceptor (GalcNAc β-O-allyl) using GalT to obtain Gal-I- 13 C-containing LacNAc β-allyl (compound 41). The resulting UDP is again converted to UDTP in PK and PEP reactions with isolated Gal-IP before UDP-Glc regeneration. Using this multienzyme system, Gal-I- 13 C-LaNAc β-O-allyl was obtained in 54% yield. The same method is used to obtain unlabeled LaNac and analogues. Examples of
Сиалилирование. Sialylation
Мультиферментативная система для сиалилирования начинается с NeuAc, Gal-I-13C-LacNAc β-О-аллил, PEP, и каталитические количества ATP и CMP, что представлено на схеме 16 далее. CMP превращают в CDP с помощью нуклеозидмонофосфаткиназы (EC 2.7.4.4, NMK) в присутствии ATP, который регенерируют из побочного продукта ADP, катализируемого PK в присутствии PEP, затем CTP за счет PEP с помощью PK. CTP затем подвергают взаимодействию с NeuAc с CMP-NeuAc-синтетазой (EC 2.7.7.42) до получения CMP-NeuAc. Побочный продукт PPi гидролизуют до Pi за счет PPазы. Сиалилирование LacNAc β-О-аллила завершают с помощью CMP-NeuAc и α-2,3-сиалилтрансферазы (α-2,3 SiaT; EC 2.4.99.6). Выделившийся CMP снова превращают в CDP, CTP и, наконец, в CMP-NeuAc. Используя эту систему, получают Gal-I-13C-NeuAc α-2,3 Gal β-1,4GlcNac β-O-аллил (соединение 42), а также немеченые трисахариды.The multienzyme system for sialylation begins with NeuAc, Gal-I- 13 C-LacNAc β-O-allyl, PEP, and catalytic amounts of ATP and CMP, as shown in
Интересно, что лактал (Gal β-I, 4Glucal) также является хорошим субстратом для α-2,3 SiaT, что позволяет синтезировать NeuAc α-2,3 Gal β-1,4 Glucal (соединение 43), представлено на схеме 16 с 21%-ным выходом. Лакталь получают либо химически (Haworth et al., J. Chem. Soc., 2644 (1930)), либо ферментативно, используя GalT и глюкаль (Gautheron-Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1130 (1991); Wong et al., J. Am. Chem. Soc. 113:8137 - 8245 (1991)) Гликальсодержащий олигосахарид, такой как соединение 43, можно превратить в другие сиалильные Lex производные, используя химические способы, разработанные Данишевским и др. (Griffith et al., J. Am. Chem. Spc. 112: 581 (1990); Halcomb et al., J. Am. Chem. Soc. 111:6661 (1989); Kessler et al. , Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 29:425 (1990); Thiem et al., Synthesis, 696 (1978)). Соединение 43 также можно галоидировать до получения 2-гало-2-дезокси-Glc производных.Interestingly, lactal (Gal β-I, 4Glucal) is also a good substrate for α-2,3 SiaT, which allows the synthesis of NeuAc α-2,3 Gal β-1,4 Glucal (compound 43), shown in
Способом, аналогичным представленному на схеме 16, используя α- 2,6-сиалилтрансферазу (EC 2.4.99.1) с Gal β-1,4 GlcNAc в качестве акцепторного углевода, получают с выходом 22% NeuAc α-2,6Gal β-1,4GlcNAc после протекания реакции в течениe двух дней при комнатной температуре. In a manner similar to that shown in
Фукозилирование. Fucosylation.
Клонированный человеческий фермент используют для фукозилирования при стехиометрическом количестве GDP-Fuc (99 атомных %, поставка Isotec Inc. Miamisburg, OH), что представлено на схеме 17 ниже. The cloned human enzyme is used for fucosylation with a stoichiometric amount of GDP-Fuc (99 atom%, supplied by Isotec Inc. Miamisburg, OH) as shown in
Таким образом, фукозилирование сиалил LacNAc β-O- аллила (соединение 42) дает сиалил Lex, соединение 44, после очистки на силикагеле и BioGel-P-2. LacNAc β-O- аллил (соединение 41) и сиалилгликаль (соединение 43) также фукозилируют до получения Lex трисахарида (соединение 45) и сиалил Lex гликаля (соединения 46) соответственно, причем два последние соединения представлены на схеме 16. Интересно, что α-1,3-FucT и α- 1,3FucT акцептирует Gal β-1,4/5-тио/Glc до получения (5-тио) Glc-Lex аналога, Gal β-1,4-(Fuc α-1,3)-(5-тио)Glc, как показано далее на схеме 18.Thus, fucosylation of sialyl LacNAc β-O-allyl (compound 42) gives sialyl Le x ,
Что же касается in situ регенерации GDP-Fuc превращение Man-I-P в GDP-Fuc, за счет GDP-Man, основанного на биосинтетическом способе GDP-Fuc в микроорганизмах, то она была впервые исследование и представлена на схеме 19. "Акцептор-OH" схем 19 и 20 является гидроксильной группой углеводного акцепторного субстрата, как те, которые перечислены в табл. 2. As for the in situ regeneration of GDP-Fuc, the conversion of Man-IP to GDP-Fuc, due to GDP-Man, based on the biosynthetic method of GDP-Fuc in microorganisms, it was the first study and is presented in
Микробные ферменты используют из-за их доступности. Кроме того, эта система позволяет регенерировать GDP-Man. GDP-Man-пирофосфорилаза (GDP-ManPP) была обнаружена в дрожжах (Munch-Peterson, Methods in Ezymol., 5: 171 (1962); Simon et al., J. Org. Chem., 55: 1834 (1990) и, как известно, GDP-Fuc генерирующие ферменты существуют в бактериях (Ginsburg, J. Biol. Chem. 235: 2196 (1960); Ginsburg, Methods in Enzymol., 8: 293 (1966) Klebsiella Pneumonia. В этой регенерации GTP образуется из GDP в присутствии PEP и PK. Man-I-P реагирует с GTP с образованием GTP-Man за счет GTP-Man PP из высушенных клеток дрожжей. GDP-Man трансформируют в GDP-Fuc в присутствии NADPH и GDP-Fuc генерирующих ферментов, частично очищенных из бактерий. Окисленный NADP рециркулирует обратно в NADPH за счет Thermoanaerobium brockii алкоголь-дегидрогеназы (TADH) (EC 1.1.1.1) и изопропанола. Получение GDP-Man и GDP-Fuc подтверждено данными ВЖЭХ, и фукозилирование LacNAc β-O-аллила и соединения 42 до получения соединений 45 и 44 в количестве 5 - 10 мг завершается. Препаративный синтез сиалил Lex с in situ регенерацией GDP-Fuc с использованием очищенных ферментов, находится на стадии разработки.Microbial enzymes are used because of their availability. In addition, this system allows the regeneration of GDP-Man. GDP-Man pyrophosphorylase (GDP-ManPP) has been detected in yeast (Munch-Peterson, Methods in Ezymol., 5: 171 (1962); Simon et al., J. Org. Chem., 55: 1834 (1990) and GDP-Fuc-generating enzymes are known to exist in bacteria (Ginsburg, J. Biol. Chem. 235: 2196 (1960); Ginsburg, Methods in Enzymol., 8: 293 (1966) Klebsiella Pneumonia. In this regeneration, GTP is formed from GDP in the presence of PEP and PK. Man-IP reacts with GTP to form GTP-Man by GTP-Man PP from dried yeast cells. GDP-Man is transformed into GDP-Fuc in the presence of NADPH and GDP-Fuc generating enzymes partially purified from bacteria oxidized NADP is recycled back to NADPH by Thermoanaerobium brockii al fire-dehydrogenase (TADH) (EC 1.1.1.1) and isopropanol Preparation of GDP-Man and GDP-Fuc was confirmed by HPLC and fucosylation of LacNAc β-O-allyl and
Альтернативный способ начинают с Fuc-I-P, который превращает в GDP-Fuc, катализируемый GDP-Fuc пирофосфорилазой (GDP-Fuc P), что представлено на схеме 20 далее). (Ishihara et al., J. Biol. Chem., 243: 1103 (1968); Ishihara et al., J. Biol. Chem., 243: 1110 (1968); Schachter et al., Methods in Enzymol, 28: 285 (1972); Richards et al., Biochim. Biophys. Acta, 484: 353 (1977); Kilker et al., Biochim. Biophys. Acta, 570: 271 (1979)). GDP-Fuc P частично очищают из свиной печени (Ishihara et al., J. Biol. Chem. 243: 1110 (1968)) и было показано, что регенерационная система, изображенная на схеме 20, является функциональной в аналитическом масштабе для получения Lex и сиалил Lex.An alternative method is started with Fuc-IP, which converts to GDP-Fuc, catalyzed by GDP-Fuc pyrophosphorylase (GDP-Fuc P), as shown in
В дополнениe к сиалильным антигенам Льюиса, SLex и SLea, и им соответствующим аналогам aнтигены группы крови ABH также являются важными олигосахаридами.In addition to the Lewis sialyl antigens, SLe x and SLe a , and their corresponding analogs, ABH blood antigens are also important oligosaccharides.
В настоящем изобретении предложен быстрый и экономичный способ получения всех этих соединений. Так, например, для получения SLea, который представляет собой NeuAc α-2,3 Gal β-1,3(Fuc α- 1,4)GlcNAc, объединяют следующие три гликозилтрансферазы: β-1,3-галактозилтрансферазу, α- 2,3-сиалилтрансферазу и α-1,4-фукозилтрансферазу. Условия реакции и вспомогательные субстраты ферментов для регенерации сахарных нуклеотидов, как было указано ранее.The present invention provides a quick and economical method for preparing all of these compounds. So, for example, to obtain SLe a , which is NeuAc α-2,3 Gal β-1,3 (Fuc α-1,4) GlcNAc, the following three glycosyl transferases are combined: β-1,3-galactosyl transferase, α-2 , 3-sialyltransferase and α-1,4-fucosyltransferase. Reaction conditions and auxiliary substrates of enzymes for the regeneration of sugar nucleotides, as previously indicated.
Так, для H-активных олигосахаридов O-группы крови антиген, который имеет структуру Fuc α-1,2Gal β-R, где R может быть β-1,3GlcNAc-R1 или β-1,3-GalNAc-R1 и где R1 является рестриктированным олигосахаридом, можно объединить следующие гликозилтрансферазы: β-1,3-галактозилтрансферазу и α-1,2-фукозилтрансферазу с соответствующими вспомогательными компонентами реакции и в указанных ранее условиях для SLex или SLeа до получения Fuc α-1,2Gal β-1,3-GlcNAc-R1. Группа R1 O-группы крови, таким образом, представляет другую X группу, обсуждавшуюся ранее, как и R1 группы для A- и B-групп крови.So, for H-active blood O-type oligosaccharides, an antigen that has the structure Fuc α-1,2Gal β-R, where R may be β-1,3GlcNAc-R1 or β-1,3-GalNAc-R1 and where R1 is a restricted oligosaccharide, the following glycosyltransferases can be combined: β-1,3-galactosyltransferase and α-1,2-fucosyltransferase with the corresponding auxiliary reaction components and under the above conditions for SLe x or SLe a to obtain Fuc α-1,2Gal β- 1,3-GlcNAc-R1. The R1 group of the O blood group, therefore, represents the other X group discussed previously, as well as the R1 group for the A and B blood groups.
Для A-активных олигосахаридов антиген A-группы крови, который имеет структуру GalNac α-1,3(Fuc α-1,2)Gal β-R, где R может быть β1,3 GlcNAc-R1 или β-1,33 GalNAc-R1 и где R1 является рестриктированным олигосахаридом, можно объединить следующие гликозилтрансферазы: β-1,3-галактозилтрансферазу, α- 1,2-фукозилтрансферазу, α-1,3N-ацетилгалактозаминилтрансферазу с соответствующими вспомогательными компонентами реакции и в указанных ранее условиях до получения GAlNAc α/ -1,3(Fuc α-1,2)Gal β-1,3GlcNAc-R1. For A-active oligosaccharides, an A-blood antigen that has the structure GalNac α-1,3 (Fuc α-1,2) Gal β-R, where R may be β1,3 GlcNAc-R1 or β-1,33 GalNAc -R1 and where R1 is a restricted oligosaccharide, the following glycosyltransferases can be combined: β-1,3-galactosyltransferase, α-1,2-fucosyltransferase, α-1,3N-acetylgalactosaminyltransferase with the corresponding auxiliary reaction components and under the above conditions before obtaining GAlNA α / -1.3 (Fuc α-1,2) Gal β-1,3GlcNAc-R1.
Для B-активных олигосахаридов, антиген B-группы крови, который имеет структуру Gal α-1,3(Fuc α-1,2)Gal β-R, где R может быть β-1,3GlcNAc-R1 или β-1,3GalNAc-R1, и где R1 является рестриктированным олигосахаридом, можно объединить следующие гликозилтрансферазы: β-1,3-галактозилтрансферазу α-1,2-фукозилтрансферазу, α-1,3-галактозилтрансферазу с соответствующими вспомогательными компонентами реакции и условиями, которые указаны ранее, до получения Gal α- 1,3(Fuc α-1,2)Gal β-1,3GlcNAc-R1. For B-active oligosaccharides, a blood B-group antigen that has the structure Gal α-1,3 (Fuc α-1,2) Gal β-R, where R may be β-1,3GlcNAc-R1 or β-1, 3GalNAc-R1, and where R1 is a restricted oligosaccharide, the following glycosyltransferases can be combined: β-1,3-galactosyltransferase α-1,2-fucosyltransferase, α-1,3-galactosyltransferase with the corresponding auxiliary reaction components and the conditions indicated above, to obtain Gal α-1,3 (Fuc α-1,2) Gal β-1,3GlcNAc-R1.
Таким образом, предложен катализируемый ферментами постадийный синтез олигосахаридов, включающий фукозилированные и фукозированные сиалилированные углеводные молекулы, в котором продукты каждой из реакций гликозилирования выделяют перед следующей стадией гликозилирования. Такие реакции гликозилирования могут использовать (и предпочтительно используют) обсуждавшиеся ранее стадии рециркулирования. Thus, an enzyme-catalyzed stepwise synthesis of oligosaccharides is proposed, including fucosylated and fucosized sialylated carbohydrate molecules, in which the products of each glycosylation reaction are isolated before the next glycosylation step. Such glycosylation reactions can use (and preferably use) the previously discussed recycling steps.
Также представлены многочисленные гликозилирования в единой реакционной смеси для получения тех же фукозилированных и фукозилированных сиалилированных углеводных молекул. Используют здесь и реакции рециркулирования, обсуждавшиеся ранее. Кроме того, Km и Vотн. данные, представленные в табл. 1 и 2 и опубликованные значения используют для установления концентраций реагентных образцов таким образом, чтобы свести к минимуму побочные реакции. Для контроля за образованием продукта можно также использовать представленные в табл. 3 ингибиторы.Numerous glycosylations in a single reaction mixture are also presented to produce the same fucosylated and fucosylated sialylated carbohydrate molecules. The recycling reactions discussed earlier are also used here. In addition, K m and V rel. the data presented in table. 1 and 2 and published values are used to establish concentrations of reagent samples in such a way as to minimize adverse reactions. To control the formation of the product can also be used are presented in table. 3 inhibitors.
Представлены также мультистадийные реакции гликозилирования в единой реакционной смеси для получения вышеуказанных продуктов, но такие, в которых один фермент или необходимый для гликозилирования реагент добавляют после практического завершения других реакций, так что одна реакция гликозилирования начинается после того, как по крайней мере одна или предпочтительно две другие реакции гликозилирования практически завершены. В одном из примеров синтеза все реагенты и ферменты, представленные на схеме 1, за исключением фукозилтрансферазы (FucT), добавляют к реакционной смеси, и NeuAc α-2,3Gal β-1,4GlcNAc-OR образуется, что видно на схеме 16, для образования соединения 42, где R является аллилом. После образования такого соединения, как соединение 42 схемы 16, добавляют FucT, такую как α-1,3-фукозилтрансфераза или α-1,3/4-фукозилтрансфераза, и образуется такой фукозилированный сиалилированный углевод, как соединение 44 схемы 17. В другом варианте, FucT фермент может присутствовать, и тогда можно опустить такой предшественник фукозильного донора, как фукоза. Аналогично фукоза может присутствовать без фосфорилирующего ее фермента, фукозокиназы. Multistage glycosylation reactions are also presented in a single reaction mixture to produce the above products, but those in which one enzyme or the reagent necessary for glycosylation is added after the practical completion of the other reactions, so that one glycosylation reaction begins after at least one or preferably two other glycosylation reactions are almost complete. In one synthesis example, all the reagents and enzymes shown in
F. Получение производных фукозилированных продуктов с образованием лигандов. F. Preparation of derivatives of fucosylated products to form ligands.
Описанные ранее фукозилированные продукты являются гаптенами, которые лучше функционируют как лиганды, будучи связаны с более крупными фрагментами. Такие фрагменты включают протеины, гликопротеины, гликолипиды и небиологические аналоги таких молекул. Обычно восстанавливающий конец сахара связан со свободным амином или меркаптаном гликозидной связью. Липосомы пригодны для получения мультивалентной макромолекулы. Различные способы пригодны для получения липосом, как указано, например, в Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), в патенте США N 4235871, N 4501728 и N 4837028. The fucosylated products previously described are haptens that function better as ligands when bound to larger fragments. Such fragments include proteins, glycoproteins, glycolipids and non-biological analogues of such molecules. Typically, the reducing end of the sugar is bound to the free amine or mercaptan by a glycosidic bond. Liposomes are suitable for the preparation of a multivalent macromolecule. Various methods are suitable for producing liposomes, as indicated, for example, in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), in US patent N 4235871, N 4501728 and N 4837028.
G. Анализ активности сиалильного лиганда Льюиса. G. Activity Analysis of the Lewis Sialyl Ligand.
Один из вариантов настоящего изобретения относится к получению сиалилированных льюисовых антигенов как в природной форме, так и в виде имитаций или аналогов. Эти антигены играют роль в межклеточной адгезии, а также в воспалительных процессах и других болезненных состояниях человека и млекопитающих. Для облегчения продуцирования этих антигенов по способу настоящего изобретения полезно проанализировать полученные продукты по их способности связываться с природными рецепторами сиалилированных льюисовых антигенов, например, ELAM и GMP140 рецепторами. Такие анализы подробно описаны Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 6224-6228 (1991) и Phillips et al. , Science, 250: 1130-1132 (1990). One of the variants of the present invention relates to the production of sialylated Lewis antigens both in natural form and in the form of simulations or analogues. These antigens play a role in intercellular adhesion, as well as in inflammatory processes and other painful conditions in humans and mammals. To facilitate the production of these antigens by the method of the present invention, it is useful to analyze the products obtained by their ability to bind to natural sialylated Lewis antigen receptors, for example, ELAM and GMP140 receptors. Such assays are described in detail by Polley et al., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 88: 6224-6228 (1991) and Phillips et al. Science 250: 1130-1132 (1990).
Хотя возможен целый ряд анализов, предпочтительным анализом является тот, в котором определяют способность антигенов блокировать или ингибировать связывание клеток с соответствующими адгезионными рецепторами и клетками, экспрессирующими соответствующий сиалилированный льюисовый антиген. Связывание оценивают визуально под микроскопом. Предпочтительными клетками, экспрессирующими рецепторы, являются активированные тромбоциты или эндотелиальные клетки. Эти рецепторы являются частью семейства, известного как селектины, или LEC-CAM, и включают LEC-CAM-1, ELAM-1, GMP-140 и CD62. Лиганды найдены на нейтрофилах, моноцитах и опухолевых клетках. Although a number of assays are possible, a preferred assay is one that measures the ability of antigens to block or inhibit the binding of cells to their respective adhesion receptors and cells expressing the corresponding sialylated Lewis antigen. Binding is evaluated visually under a microscope. Preferred receptor expressing cells are activated platelets or endothelial cells. These receptors are part of a family known as selectins, or LEC-CAM, and include LEC-CAM-1, ELAM-1, GMP-140, and CD62. Ligands are found on neutrophils, monocytes, and tumor cells.
В типичном анализе выделяют нейтрофилы, расслаивая обработанную гепарином кровь на Mono-Poly Resolving Medium (разделяющая среда от Ficoll-Hypaque-Flow Laboratories), с последующим центрифугированием в течение 25 мин при 2000 об/мин, а затем еще 25 мин при 2500 об/мин. In a typical assay, neutrophils are isolated by stratifying heparin-treated blood onto a Mono-Poly Resolving Medium (separation medium from Ficoll-Hypaque-Flow Laboratories), followed by centrifugation for 25 min at 2000 rpm, and then another 25 min at 2500 rpm min
Тромбоциты можно выделить таким способом. Кровь берут у здорового донора-человека в шприц, содержащий ACD антикоагулянт (декстроза, 2,0 г, цитрат натрия 2,49 г и лимонная кислота 1,25 г до 100 мл dH2O) в соотношении 6 частей крови на 1 часть антикоагулянта. Эту кровь центрифугируют при 800 об/мин (примерно 90•g) в течение 15 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость собирают и центрифугируют при 1200 об/мин (примерно 400•g) в течение 6 мин. Надосадочную жидкость удаляют и центрифугируют при 2000 об/мин (примерно 1200•g) в течение 10 мин для осаждения тромбоцитов. Комок тромбоцитов промывают дважды Tyrode-HEPES буфером, pH 6,5 (NaCl 8,0 г, KCl 0,2 г, NaH2PO4 • H2O 0,57 г; MgCl2 • H2O 0,184 г; NaHCO3 0,1 г; декстроза 1,0 г; и HEPES 2,383 г; доводят до 1 л деионизированной водой, pH устанавливают 6,5 1 н NaOH) с последующей одной промывкой в PBS. Тромбоциты суспендируют в концентрации 108/мл в PBS, а затем активируют, инкубируя в течение 20 мин при комнатной температуре с тромбином при конечной концентрации 0,25 ед/мл.Platelets can be distinguished in this way. Blood is drawn from a healthy human donor into a syringe containing an ACD anticoagulant (dextrose, 2.0 g, sodium citrate 2.49 g and citric acid 1.25 g to 100 ml dH 2 O) in a ratio of 6 parts of blood per 1 part of anticoagulant . This blood is centrifuged at 800 rpm (approximately 90 x g) for 15 minutes at room temperature. The supernatant was collected and centrifuged at 1200 rpm (approximately 400 x g) for 6 minutes. The supernatant was removed and centrifuged at 2000 rpm (approximately 1200 x g) for 10 minutes to pellet the platelets. The platelet bundle is washed twice with Tyrode-HEPES buffer, pH 6.5 (NaCl 8.0 g, KCl 0.2 g, NaH 2 PO 4 • H 2 O 0.57 g; MgCl 2 • H 2 O 0.184 g; NaHCO 3 0.1 g; dextrose 1.0 g; and HEPES 2.383 g; adjusted to 1 L with deionized water, adjusted to pH 6.5 with 1 N NaOH) followed by one wash in PBS. Platelets are suspended at a concentration of 10 8 / ml in PBS and then activated by incubating for 20 min at room temperature with thrombin at a final concentration of 0.25 u / ml.
Для анализа 20 мкл суспензии тромбоцитов (2 • 108 мл) помещают в ампулу Эппендорфа для центрифуги. Добавляют равный объем олигосахарида, приготовленного с концентрациями от 200 до 0,3 мкг/мл, или гликолипид-липосомного препарата (полученного описанным ранее способом), с концентрациями от 2 до 0,25 мкг/мл, и ампулы оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Затем добавляют 20 мкл препарата нейтрофилов (2 • 106/мл), и ампулы оставляют выстаиваться при комнатной температуре еще 20 мин.For analysis, 20 μl of platelet suspension (2 x 10 8 ml) is placed in an Eppendorf ampoule for centrifuge. An equal volume of oligosaccharide prepared with concentrations from 200 to 0.3 μg / ml or glycolipid-liposome preparation (obtained as described above) with concentrations from 2 to 0.25 μg / ml is added, and the ampoules are left at room temperature for 20 min Then add 20 μl of the neutrophil preparation (2 • 10 6 / ml), and the ampoules are left to stand at room temperature for another 20 minutes.
Адгезию активированных тромбоцитов к нейтрофилам оценивают под микроскопом. Обычно оценивают 100 нейтрофилов. Их оценивают как позитивные, если к ним присоединены два или более из тромбоцитов, и как негативные, если связаны менее двух тромбоцитов. The adhesion of activated platelets to neutrophils is evaluated under a microscope. Usually, 100 neutrophils are evaluated. They are rated as positive if two or more of the platelets are attached to them, and as negative if less than two platelets are connected.
H. Усовершенствованный способ получения глимкозил-1 или 2-P. H. Improved method for the preparation of glycosyl-1 or 2-P.
Фосфорилированные сахара, содержащие фосфат на аномерном углеводе (1- или 2-положение), представляют ценность в описываемых реакциях и некоторые из них доступны коммерчески. В настоящем изобретении предложены усовершенствованные способы селективного фосфорилирования этого углерода моносахаридорв. Усовершенствование включает использование трехвалентного фосфитилирующего реагента для переноса фоcфитильного фрагмента на нужный углерод. Полученный фосфит используют затем для получения соответствующего фосфата, который используют в ферментативной реакции, описанной здесь. Phosphorylated sugars containing phosphate on an anomeric carbohydrate (1- or 2-position) are valuable in the described reactions and some of them are commercially available. The present invention provides improved methods for the selective phosphorylation of this carbon monosaccharidorum. Improvement includes the use of a trivalent phosphitylating reagent to transfer the phosphityl moiety to the desired carbon. The resulting phosphite is then used to produce the corresponding phosphate, which is used in the enzymatic reaction described herein.
Защищенный фосфитильный моносахарид соответствует приводимой далее формуле I:
где каждый из R1 может быть одинаковым или различным и представляет такую арильную группу, как фенил или бензил, или C1-C5 низшую алкильную группу;
X независимо является кислородом или азотом,
R2 независимо является ацилом, бензилом, силилом или алкильной защитной группой или X-R2 вместе отсутствуют и заменены водородом;
R3 независимо является водородом (-H), -CH3, -OR2, -CH2OR2, -CH(OR2)-CH(OR2), -CH(OR2)-CH(OR2)-CH-(OR2) , -NH2 или -NHR2;
R4 представляет водород (H), карбоксил или C1-C5-алкил или бензилкарбоксилат; а
n = 1 или 2, предпочтительно 2.The protected phosphityl monosaccharide corresponds to the following formula I:
where each of R 1 may be the same or different and represents an aryl group such as phenyl or benzyl, or a C 1 -C 5 lower alkyl group;
X is independently oxygen or nitrogen,
R 2 independently is acyl, benzyl, silyl or an alkyl protecting group, or XR 2 together are absent and replaced by hydrogen;
R 3 independently is hydrogen (-H), -CH 3 , -OR 2 , -CH 2 OR 2 , -CH (OR 2 ) -CH (OR 2 ), -CH (OR 2 ) -CH (OR 2 ) - CH- (OR 2 ), -NH 2 or -NHR 2 ;
R 4 represents hydrogen (H), carboxyl or C 1 -C 5 alkyl or benzyl carboxylate; a
n = 1 or 2, preferably 2.
Рассматриваемые защищенные фосфитилмоносахариды включают производные сиалильной кислоты, KDO, KDN или аналогичные соединения, в которых R4 является карбоксилом или сложноэфирной группой кaрбоксилата. В предпочтительной группе соединений формулы I R4 представляет водород. В таком случае формула I превращается в формулу II, где R1, R2, R3, X и n имеют указанные ранее значения:
Следует учитывать, что каждая R1 группа может отличаться от других. Это проистекает из того факта, что реагент фосфитилирования можно получить в реакции PCl3 с таким вторичным амином, как диизопропиламин, и двумя молями спирта. Смешивая спиртовую часть реакционной смеси, можно получить реагент фосфитилирования и фосфит, которые будут иметь две различные R1 группы, например бензил и этил. Предпочтительно, чтобы обе R1 группы были одинаковы, и наиболее предпочтительно, чтобы обе были бензильными или фенильными группами, как те группы, которые можно удалить гидрогенолизом.Contemplated protected phosphityl monosaccharides include sialic acid derivatives, KDO, KDN, or similar compounds in which R 4 is a carboxyl or carboxylate ester group. In a preferred group of compounds of formula I, IR 4 is hydrogen. In this case, the formula I turns into the formula II, where R 1 , R 2 , R 3 , X and n have the above meanings:
It should be borne in mind that each R 1 group may differ from others. This stems from the fact that the phosphitylation reagent can be obtained by reacting PCl 3 with a secondary amine such as diisopropylamine and two moles of alcohol. By mixing the alcohol portion of the reaction mixture, a phosphitylation reagent and a phosphite can be obtained, which will have two different R 1 groups, for example benzyl and ethyl. Preferably, both R 1 groups are the same, and most preferably both are benzyl or phenyl groups, such as those that can be removed by hydrogenolysis.
Следует также учитывать, что каждый X может быть кислородом или азотом, и особенно рассматриваются соединения, в которых есть обе группы, например защищенный сиалилдибензилфосфат, соединение 97. R2 защитные группы включают такие ацильные группы, как C1-C5 ацильные группы, например формил, ацетил, пивалоил и пентаноил, бензоильные и фталоильные группы, алкилзащитные группы и силильные группы. Примеры алкильных групп включают такие C1-C5 алкилы, как метил, этил, изопропил, трет.-бутил, циклопентил и пентил. Ацетали и кетали, полученные из C1-C5 алкилкетонов или альдегидов, таких как наиболее предпочтительный ацетон и формальдегид, могут также образовывать алкилзащитную группу. Бензальдегид также рассматривается как ацетальобразующая защитная группа. Такие кетали и ацетали являются хорошо известными защитными группами в химии сахаридов. Примеры силильных защитных групп включают три-C1-C5 алкилсилильные группы, такие как триметилсилил, трет.-бутилдиметилсилил и т.п. , C1-C5-алкилдифенилсилильные защитные группы, такие как дифенилметилсилильная группа, ди-C1-C5 алкилфенилсилильные защитные группы такие, как фенилдиметилсилильная группа и трифенилсилильная защитная группа.It should also be borne in mind that each X can be oxygen or nitrogen, and compounds in which both groups are present are particularly contemplated, for example, protected sialyldibenzylphosphate,
Обычно предпочтительно, чтобы все защитные группы были одинаковы или, если они различны, чтобы их можно было селективно удалять в различных реакциях. Так, например, бензильную группу можно удалять в присутствии ацетильной группы гидрогенолизом, тогда как ацетильную группу можно удалять в присутствии бензильной группы, обрабатывая таким первичным амином, как бензиламин. Ацетил является наиболее предпочтительной защитной группой такой, как O-ацетильная группа в аномерном положении (1- или 2-положении), и его можно легко удалять в присутствии других O-ацетильных группу в других положениях кольца, обрабатывая первичным амином. It is generally preferred that all protecting groups are the same or, if different, so that they can be selectively removed in different reactions. For example, a benzyl group can be removed in the presence of an acetyl group by hydrogenolysis, while an acetyl group can be removed in the presence of a benzyl group by treatment with a primary amine such as benzylamine. Acetyl is the most preferred protecting group, such as the O-acetyl group at the anomeric position (1- or 2-position), and it can be easily removed in the presence of other O-acetyl group at other ring positions by treatment with a primary amine.
Следует отметить, что X-R2 может отсутствовать и может быть заменен водородом. Как таковой защищенный моносахарид является дезоксимоносахаридом, что видно на примере соединений 97 и 101 - 113.It should be noted that XR 2 may be absent and may be replaced by hydrogen. As such, the protected monosaccharide is a deoxyximonosaccharide, as can be seen in
Следует учитывать, что если n = 2 в формуле I, что предпочтительно для сахаров с шестичленным кольцом, обе из (R3-CH)групп не обязательно должны быть одинаковы, и обычно отличаются. Так, например, для защитного фукозилфосфита соединение 8, обсуждавшееся ранее в отношении схемы 6, одна R3 группа представляет CH3, тогда как другая представляет O-ацетил (OAc). Аналогично для защищенного маннозилфосфита соединения 16, обсуждавшегося в отношении схемы 9, один R3 представляет CH2OAc группу, тогда как другой является OAc группой. Формулу I можно в другом варианте представить как формулу IA далее, где каждый из R1 может быть одинаковым или различным и представляет такие арильные группы, как фенил или бензил, или C1-C5 низшую алкильную группу; X независимо представляет кислород или водород;
R2 независимо представляет ацильную, бензильную, силильную или алкильную защитную группу, или X-R2 вместе отсутствуют и заменены водородом;
R3 независимо представляет водород (-H), -CH3, -OR2, -CH2OR2, -CH(OR2)-CH(OR2), или -CH(OR2)-CH-(OR2)-CH(OR2);
R4 представляет водород (H), карбоксил или C1-C5-алкил, или бензил карбоксилат; а
m = 0 или 1, так что если m = 0, (CH-X-R2) группа отсутствует, и образуется пятичленное кольцо, а если m = 1, тогда присутствует (CH-X-R2) группа, и моносахарид имеет шестичленное кольцо, что является предпочтительным.It should be noted that if n = 2 in formula I, which is preferred for six-membered ring sugars, both of the (R 3 -CH) groups need not be the same, and usually differ. So, for example, for protective fucosylphosphite,
R 2 independently represents an acyl, benzyl, silyl or alkyl protecting group, or XR 2 together are absent and replaced by hydrogen;
R 3 independently represents hydrogen (-H), -CH 3 , -OR 2 , -CH 2 OR 2 , -CH (OR 2 ) -CH (OR 2 ), or -CH (OR 2 ) -CH- (OR 2 ) -CH (OR 2 );
R 4 represents hydrogen (H), carboxyl or C 1 -C 5 alkyl, or benzyl carboxylate; a
m = 0 or 1, so if m = 0, (CH-XR 2 ) the group is absent and a five-membered ring is formed, and if m = 1, then a (CH-XR 2 ) group is present, and the monosaccharide has a six-membered ring, which is preferred.
В соответствии с предпочтительностью защищенных моносахаридных фосфитов с шестичленными кольцами формулу IA можно представить как формулу IB, где R1-4 и X имеют значения, указанные для формулы IA.
According to the preferred six-membered ring protected monosaccharide phosphites, formula IA can be represented as formula IB, where R 1-4 and X are as defined for formula IA.
В соответствии с предпочтительностью соединений, в которых R4 представляет водород, формулу II можно представить как формулу IIA (ниже). В соответствии с предпочтительностью для защищенных моносахаридов с шестичленными кольцами (где m = 1) формулу IIA можно представить как формулу IIB (ниже). R1-3, m и X те же, что и в формуле IA.In accordance with the preferred compounds in which R 4 represents hydrogen, formula II can be represented as formula IIA (below). According to preference for the protected monosaccharides with six-membered rings (where m = 1), formula IIA can be represented as formula IIB (below). R 1-3 , m and X are the same as in formula IA.
За исключением отмеченных различий в значения R групп в формулах I, II, IA, IB и IIA значения X, ацил, силил, алкил и других групп в этих формулах одинаковы.
With the exception of the noted differences in the values of R groups in formulas I, II, IA, IB, and IIA, the values of X, acyl, silyl, alkyl, and other groups in these formulas are the same.
Трехвалентные фосфитилирующие реагенты были определены ранее. Доступные трехвалентные фосфитилирующие реагенты включают: дибензил-N,N-диэтилфосфороамидит, 2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфороамидит или 2-цианоэтил-N,N-диизопропилхлорфосфороамидит. Trivalent phosphitylation reagents have been previously determined. Available trivalent phosphitylation reagents include: dibenzyl-N, N-diethylphosphoroamidite, 2-cyanoethyl-N, N, N ', N'-tetraisopropylphosphoroamidite or 2-cyanoethyl-N, N-diisopropylchlorophosphoroamidite.
Способ получения защищенного моносахаридного фосфита из незамещенного (незащищенного) моносахарида представляет собой многостадийный способ, начинающийся с любого моносахарида (альдозы или кетозы без ограничения конформацией или ориентацией). Моносахарид вначале защищают по каждому свободному гидроксилу (или амину), используя стандартные защитные реагенты, такие как ацильные, бензильные, силильные или алкильные группы, как обсуждалось ранее. Затем защитные группы, обычно C1-C5-ацильные или бензильные группы в 1- или 2-положении, селективно удаляют, используя либо свиную липазу поджелудочной железы, либо алкил или бензиламин в таком неводном полярном растворителе, как тетрагидрофуран или дихлорметан. Трехвалентный фосфитилирующий реагент вводят затем в 1- или 2-пoложение в анаэробных условиях, используя ароматический вторичный или третичный амин в качестве конденсирующего агента, например 1,2,4-триазол, тетразол, имидазол или пиридиний-паратолуолсульфонат. В настоящее время предпочтительными конденсирующими агентами являются триазол или тетразол. Затем полученный продукт окисляют, используя такие оксиданты, как перекись водорода или трет.-бутил-гидроксипероксид. У полученной фосфорильной группы удаляют защиту до получения фосфатной соли (например, натриевой), используя восстановление (водород/палладий) для бензильных производных и щелочную обработку для 2-цианоэтильных производных.A method for producing a protected monosaccharide phosphite from an unsubstituted (unprotected) monosaccharide is a multi-stage process starting with any monosaccharide (aldose or ketose without restriction in conformation or orientation). The monosaccharide is first protected for each free hydroxyl (or amine) using standard protective reagents such as acyl, benzyl, silyl or alkyl groups, as discussed previously. Then, protecting groups, usually C 1 -C 5 acyl or benzyl groups at the 1- or 2-position, are selectively removed using either porcine pancreatic lipase or alkyl or benzylamine in a non-aqueous polar solvent such as tetrahydrofuran or dichloromethane. The trivalent phosphitylating reagent is then introduced into the 1- or 2-position under anaerobic conditions using an aromatic secondary or tertiary amine as a condensing agent, for example, 1,2,4-triazole, tetrazole, imidazole or pyridinium-paratoluenesulfonate. Currently preferred condensing agents are triazole or tetrazole. The resulting product is then oxidized using oxidizing agents such as hydrogen peroxide or tert-butyl hydroxyperoxide. The resulting phosphoryl group is deprotected to a phosphate salt (e.g., sodium) using reduction (hydrogen / palladium) for benzyl derivatives and an alkaline treatment for 2-cyanoethyl derivatives.
Таким образом, используя вышеуказанные реакции получают ряд фосфитов и соответствующих фосфатов. Примерные соединения (в виде фосфатов), которые были получены из 2-ацетамидо-2-дезокси-D-галактозы (CalNAc), соединение 89, 2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюкозы (ClcNAc, соединение 90), D-галактозы (Cal, соединение 91), D-глюкозы (Clc, соединение 92), D-маннозы (Man, соединения 18 и 93), L-рамнозы (Rha, соединение 94), L-фукозы (Fuc, соединение 5) и N-ацетилнейраминовой кислоты (NeuAc, соединение 99). На схемах 21 - 23 ниже представлены эти реакции. Фосфит 2-фталимидоил-2-дезокси-D-глюкозо-3,4,6-триацетата (соединение 100) также получают представленным на схеме 23 способом с примерно 90%-ным выходом. Thus, using the above reactions, a series of phosphites and corresponding phosphates are obtained. Exemplary compounds (as phosphates) that were prepared from 2-acetamido-2-deoxy-D-galactose (CalNAc),
В табл. 4 далее представлены значения различных "R" групп (R1-4), использованных в этих схемах. В табл. 5 представлены выходы и соотношения аномеров для различных соединений схем 21 - 23 и табл. 4.In the table. 4 below presents the meanings of the various “R” groups (R 1-4 ) used in these schemes. In the table. Figure 5 shows the yields and ratios of anomers for various compounds of Schemes 21-23 and Table. 4.
Было обнаружено, что растворители влияют на аномерное соотношение фосфитилированных продуктов. Так, если соединение 70 фосфитилируют в ТГФ, отношение α:β составляет 1 : 6, тогда как для хлороформа этот соотношение меняется на 1 : 2. Solvents have been found to affect the anomeric ratio of phosphitylated products. So, if
Следует отметить, что соединения на схемах и в таблицах, приведенных ранее, включают производные маннозы и фукозы, которым были присвоены другие номера в более ранних обсуждениях. Эти соединения были перенумерованы здесь для большего удобства представления данных. В последующих примерах приводятся обе нумерации. It should be noted that the compounds in the diagrams and tables given earlier include derivatives of mannose and fucose, which were assigned different numbers in earlier discussions. These compounds have been renumbered here for greater convenience in presenting data. In the following examples, both numbers are given.
В соответствии с реакциями, изображенными на схеме 23, был проведен синтез еще нескольких специфических моносахаридных карбокислатов формулы I. Эти соединения являются родственными с D-сиалильной кислотой (соединение 101), D- и L-KDN и D- и L-KDO. Cтроение метиловых сложных эфиров (Me) этих соединений, где R2 представляет ацетил, а R1 представляет бензил, показаны далее как соединения 101 - 113. Подчеркнутые моносахаридные карбоксилаты можно получить в реакциях, катализируемых альдолазой сиалильной кислоты, что показано Gautheron-Le Narvor et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 7816 (1991) и Sugai et al., J. Am. Chem. Soc., (в печати).In accordance with the reactions depicted in
Примеры.
Examples.
После того как было представлено содержание изобретения в общих чертах и было дано руководство для сочетания реакций фукозилтрансферазы с реакциями с выделением энергии, в которых используют каталитические количества недорогих нуклеотидов и с другими реакциями трансферазы, далее приводятся примеры для более детального описания процессов. Эти примеры представлены исключительно с целью иллюстрации, но не являются ограничительными. Специалистам ясно, что многие параметры не являются критическими, и их можно варьировать. After the content of the invention has been outlined and guidelines have been given for combining fucosyltransferase reactions with energy-releasing reactions that use catalytic amounts of inexpensive nucleotides and other transferase reactions, examples are given below for a more detailed description of the processes. These examples are presented for illustrative purposes only, but are not restrictive. It is clear to those skilled in the art that many parameters are not critical and can be varied.
Пример 1. Химический синтез фукозо-1-фосфата (схемы 5 и 6). Example 1. Chemical synthesis of fucose-1-phosphate (
(a) 1,2,3,4-тетра-О-бензоил-L-фукоза (соединение 2)
Бензоилхлорид (21.4 г, 152.3 ммоль, 17.7 мл) прикапывают к охлажденному раствору L-фукозы (5.7 г, 30.5 ммоль) в 100 мл пиридина при 0 - 5oC, и полученную смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Полученную смесь выливают в ледяную воду и экстрагируют этилацетатом (EtOAc). Полученные экстракты последовательно промывают ледяной водой и разбавленной HCl, водным бикарбонатом натрия и рассолом, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют. Полученный продукт используют на следующей стадии без дальнейшей очистки.(a) 1,2,3,4-tetra-O-benzoyl-L-fucose (compound 2)
Benzoyl chloride (21.4 g, 152.3 mmol, 17.7 ml) was added dropwise to a cooled solution of L-fucose (5.7 g, 30.5 mmol) in 100 ml of pyridine at 0-5 ° C, and the resulting mixture was stirred for 3 hours at room temperature. The resulting mixture was poured into ice water and extracted with ethyl acetate (EtOAc). The resulting extracts were washed successively with ice water and diluted with HCl, aqueous sodium bicarbonate and brine, dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated. The resulting product is used in the next step without further purification.
(b) Дибензилфосфорид-2,3,4-три-О-бензоил β- L-фукозид (соединение 4). (b) Dibenzyl phosphoride-2,3,4-tri-O-benzoyl β-L-fucoside (compound 4).
К охлажденному раствору соединения 2 (2.0 г, 3.44 ммоль) в 20 мл CH2Cl2 и Ac2O (2 мл) прикапывают 30% HBr-AcOH (8 мин) при 0 - 5oC, и полученную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Полученную смесь выливают в ледяную воду, и экстрагируют EtOAc. Полученные экстракты последовательно промывают водой, водным бикарбонатом натрия и рассолом, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют до получения соединения 3. Соединение 3 используют на следующей стадии без дополнительной очистки.To a cooled solution of compound 2 (2.0 g, 3.44 mmol) in 20 ml of CH 2 Cl 2 and Ac 2 O (2 ml) was added dropwise 30% HBr-AcOH (8 min) at 0-5 ° C, and the resulting mixture was stirred for 2 hours at room temperature. The resulting mixture was poured into ice water, and extracted with EtOAc. The resulting extracts were washed successively with water, aqueous sodium bicarbonate and brine, dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated to give
1H-ЯМР (CDCl3) δ : 1.36 (3H, д, J = 6.1 Гц, 6-CH3), 4.69 (1H, шир.кв., J = 6.56 Гц, H-5), 5.62 (1H, дд, J = 3.91, 10.5 Гц, H-2), 5.84 (1H, дд, J = 0.97, 3.33 Гц, H-4), 6.01 (1H, дд, J = 3.36, 10.50 Гц, H-3), 6.94 (1H, д, J = 3.92 Гц, H-1);
13C ЯМР (CDCl3) δ 15.8, 68.6, 69.2, 70.4, 89.4, 165.4, 165.6, 165.7 (Здесь и далее в результатах исследования ЯМР и МС встречаются следующие обозначения:
NMR = ЯМР,
S = c (синглет),
d = д (дублет),
t = т (триплет),
q = кв (квартет),
m = м (мультиплет),
br = broad = шир (широкий),
dd = дд (дублет дублетов),
ppm = мд (мил.доли),
Hz = Гц,
HRMS = ВРМС (масс-спектр высокого разрешения),
calcd = рассчитано,
found = найдено. 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 1.36 (3H, d, J = 6.1 Hz, 6-CH 3 ), 4.69 (1H, broad square, J = 6.56 Hz, H-5), 5.62 (1H, dd, J = 3.91, 10.5 Hz, H-2), 5.84 (1H, dd, J = 0.97, 3.33 Hz, H-4), 6.01 (1H, dd, J = 3.36, 10.50 Hz, H-3), 6.94 (1H, d, J = 3.92 Hz, H-1);
13 C NMR (CDCl 3 ) δ 15.8, 68.6, 69.2, 70.4, 89.4, 165.4, 165.6, 165.7 (Hereinafter, the following notation appears in the results of NMR and MS studies:
NMR = NMR
S = c (singlet),
d = d (doublet),
t = t (triplet),
q = q (quartet),
m = m (multiplet),
br = broad = broad (wide),
dd = dd (doublet of doublets),
ppm = ppm (mil.
Hz = Hz
HRMS = VRMS (high resolution mass spectrum),
calcd = calculated
found = found.
Ag2CO3 (1.90 г, 6.89 ммоль) добавляют в охлажденный (0 - 5oC) раствор полученного ранее соединения 3, дибензилфосфата (2.88 г, 10.3 ммоль) и МС (молекулярные сита) 3 
(c) β-/ L-фукозо-1-фосфат (соединение 5)
Соединение 4 (2.32 г, 3.15 ммоль) гидрируют над 5% Pd/C (400 мг) в 60 мл EtOH, и 15 мл 1н NaHCO3 в течение 10 ч. Катализатор отфильтровывают на целитном фильтре. К охлажденному раствору остатка в воде (20 мл при 0 - 5oC прикапывают 20 мл 1н NaOH и полученную смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Полученную смесь осторожно нейтрализуют, добавляя холодный 1н AcOH до pH 7.5, и нерастворимую часть отфильтровывают на целите. Полученный фильтрат разбавляют до 250 мл и вводят в колонку Dowex 1-X8 (HCO2) (2 • 15 см), и элюируют с поэтапным градиентом NH4OAc2; вода (200 мл), 0,1 М MN4OAc2 (200 мл), 0.2 М NH4OAc2 (200 мл) и 0.3 М NH4-OAc2 (200 мл). Фукозу элюируют водой, а целевое соединение 5 элюируют между 0.2 - 0.3 М NH4OAc2. После удаления соли соединение 5 (700 мг, 82%) получают. Данные 1H 13C ЯМР находятся в хорошем соответствии с данными группы Бейкера (Nunez et al., Can. J. Chem. 59: 2086 (1981)).Ag 2 CO 3 (1.90 g, 6.89 mmol) is added to a cooled (0 - 5 o C) solution of the previously obtained
(c) β- / L-fucose-1-phosphate (compound 5)
Compound 4 (2.32 g, 3.15 mmol) was hydrogenated over 5% Pd / C (400 mg) in 60 ml of EtOH, and 15 ml of 1N NaHCO 3 for 10 hours. The catalyst was filtered on a cell filter. To a cooled solution of the residue in water (20 ml at 0-5 ° C, 20 ml of 1N NaOH are added dropwise and the resulting mixture is stirred for 3 hours at room temperature. The resulting mixture is carefully neutralized by adding cold 1N AcOH to pH 7.5, and the insoluble portion is filtered off on The resulting filtrate was diluted to 250 ml and introduced into a Dowex 1-X8 column (HCO 2 ) (2 x 15 cm) and eluted with a stepwise gradient of NH 4 OAc 2 ; water (200 ml), 0.1 M MN 4 OAc 2 (200 ml), 0.2 M NH 4 OAc 2 (200 ml) and 0.3 M NH 4 -OAc 2 (200 ml) Fucose was eluted with water, and
(d) 1,2,3,4-тетра-O-ацетил-L-фукоза (соединение 6). (d) 1,2,3,4-tetra-O-acetyl-L-fucose (compound 6).
Смесь L-фукозы (3.0 г, 18.2 ммоль) и безводного NaOAc (50 мг, 0.61 ммоль) в уксусном ангидриде (20 мл) перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем нагревают при 100oC в течение 2 ч. После охлаждения полученную смесь выливают в ледяную воду, перемешивают в течение 2 ч и экстрагируют хлороформом. Полученные экстракты последовательно промывают водным бикарбонатом натрия и водой, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют. Оставшийся сироп обрабатывают на хроматографической колонке с силикагелем, элюируя смесь толуолэтилацетат (10 : 1) до получения соединения 6 (5.92 г, 98%) в виде смеси α и β (1 : 7, по данным 1H ЯМР).A mixture of L-fucose (3.0 g, 18.2 mmol) and anhydrous NaOAc (50 mg, 0.61 mmol) in acetic anhydride (20 ml) was stirred for 2 hours at room temperature and then heated at 100 ° C. for 2 hours. After cooling, the resulting mixture was poured into ice water, stirred for 2 hours and extracted with chloroform. The extracts obtained were washed successively with aqueous sodium bicarbonate and water, dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated. The remaining syrup was processed on a silica gel column chromatography, eluting with a mixture of toluene ethyl acetate (10: 1), to give compound 6 (5.92 g, 98%) as a mixture of α and β (1: 7, according to 1 H NMR).
(e) 2,3,4-три-O-ацетил-L-фукоза (соединение 7 или 74). (e) 2,3,4-tri-O-acetyl-L-fucose (
i) Химический способ:
Раствор соединения 6 или 67 (3.0 г, 9.0 ммоль) и бензиламина (1.45 г, 13.5 ммоль, 1.47 мл) в ТГФ (35 мл) перемешивают в течение дня при комнатной температуре. Полученную смесь разбавляют хлороформом и последовательно промывают охлажденной льдом разбавленной соляной кислотой, водным бикарбонатом натрия и водой, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют. Оставшийся сироп обрабатывают хроматографически на силикагеле смесью толуола и этилацетата (1 : 1) до получения соединения 7 или 74 (2.40 г, 92%). Данные 1H ЯМР соответствуют литературным. (Hennen et al., J. Org. Chem., 53: 4743 (1988)).i) Chemical method:
A solution of
ii) Ферментативный способ:
Суспензию соединения 6 или 67 (2.5 г, 7,5 ммоль) и свиную липазу поджелудочной железы (5.6 г) в 13% (объем/объем) ДМФ/(фосфатного буфера (50 мл, pH 7) перемешивают в течение 5 дней при комнатной температуре, поддерживая в это время pH за счет 1н NaOH. Полученную смесь фильтруют, а полученный фильтрат экстрагируют этилацетатом. Полученный экстракт промывают водой и сушат над безводным сульфатом магния. Очистку продукта осуществляют как указано ранее, получая соединение 7 или 74 (1.1. г, 48.4%) в виде смеси α и β (1 : 1).ii) Enzymatic method:
A suspension of
(f) Дибензилфосфорид-2,3,4-три-О-ацетил-L-фукозид (соединение 9 или 88). (f) Dibenzylphosphoride-2,3,4-tri-O-acetyl-L-fucoside (
Дибензил-N,N-диэтилфосфороамидат (Pederson et al., Tetrahedron, 47: 2643 (1991) (2.7 г, 8.5 ммоль) прикапывают к раствору соединения 7 или 74 (1.0 г, 3.4 ммоль) и тетразола (1.0 г, 14.5 ммоль) в ТГФ (50 мл) в атмосфере азота при комнатной температуре, и полученную смесь перемешивают в течение часа при комнатной температуре. К этой смеси добавляют эфир (50 мл), и органическую фазу промывают охлажденной льдом соляной кислотой, водным бикарбонатом натрия и водой, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют. Полученный сироп обрабатывают на хроматографической колонке с силикагелем, элюируя смесью гексан-этил-ацетат (4: 1) до получения соединения 8 или 81 (1.43 г, 79%) в виде смеси α и β (1:10). Dibenzyl-N, N-diethylphosphoroamidate (Pederson et al., Tetrahedron, 47: 2643 (1991) (2.7 g, 8.5 mmol) was added dropwise to a solution of
1H ЯМР (CDCl3) δ : 1.22 (3H, d, J 6.50 Hz, 6-CH3), 1.91, 1.99, 2.19 (3H, каждый, s, 3 x OAc), 3.85 (1H, dg, J 1.00, 6.50 Hz, H-5), 4.82-4.96 (4H, m, бензильные протоны), 5.02-5.08 (2H, m, H-2, 3), 5.25 (1H, dd, J 0.50, 3,50 Hz, H-4), 5.32 (1H, dd, J 8.00, 10.50 Hz, H-1). 1 H NMR (CDCl 3 ) δ: 1.22 (3H, d, J 6.50 Hz, 6-CH 3 ), 1.91, 1.99, 2.19 (3H, each, s, 3 x OAc), 3.85 (1H, dg, J 1.00 , 6.50 Hz, H-5), 4.82-4.96 (4H, m, benzyl protons), 5.02-5.08 (2H, m, H-2, 3), 5.25 (1H, dd, J 0.50, 3.50 Hz, H-4), 5.32 (1H, dd, J 8.00, 10.50 Hz, H-1).
К охлажденному раствору соединения 8 или 81 (500 мг, 0.9 ммоль) в 50 мл ТГФ добавляют 30%-ную перекись водорода (7 мл) сразу, и полученную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры, и перемешивают 90 мин. Полученную смесь разбавляют эфиром и промывают ледяным водным тиосульфатом натрия, водным бикарбонатом натрия и водой, сушат над сульфатом магния и концентрируют до получения соединения 9 или 88 (420 мг, 81%). Соединение используют на следующей стадии без дополнительной очистки. Данные 1H ЯМР находятся в хорошем соответствии с литературными. (Schmidt et al., Liebigs Ann. Chem., 191: 121 (1991)).To a cooled solution of
1H-ЯМР (CDCl3) δ : 1.22 (3H, 3, J 10.0 Hz, 6-CH3), 1.91, 1.99, 2.19 (3H каждый, s, 3 x OAc), 3.90 (1H, dq, J 6.50, 7.50 Hz, H-5), 5.00-5.03 (m, H-3, бензильные протоны), 5.03-5.12 (m, бензильные протоны), 5.26 (1H, dd, J 1.00, 3.50 Hz, H-4), 5.27-5.33 (2H, m, H-1,2). HRMS для C26H31O11PCs: рассчитано для (M+C) + 683.0658, найдено 683.0658. 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 1.22 (3H, 3, J 10.0 Hz, 6-CH 3 ), 1.91, 1.99, 2.19 (3H each, s, 3 x OAc), 3.90 (1H, dq, J 6.50 , 7.50 Hz, H-5), 5.00-5.03 (m, H-3, benzyl protons), 5.03-5.12 (m, benzyl protons), 5.26 (1H, dd, J 1.00, 3.50 Hz, H-4), 5.27-5.33 (2H, m, H-1,2). HRMS for C 26 H 31 O 11 PCs: calculated for (M + C) + 683.0658, found 683.0658.
(g) L-фукозо-1-фосфат (соединение 5 или 95),
Соединение 9 или 88 (5.0 г, 9.1 ммоль) гидрируют над 5% Pd/C (400 мг) в EtOH (70 мл) и бикарбонате натрия (30 мл) в атмосфере водорода в течение 3 ч при комнатной температуре, и катализатор отфильтровывают. К охлажденному фильтрату добавляют 1н NaOH при 0-5oC до тех пор, пока раствор не становится сильно щелочным (pH более 13). Полученную смесь перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре и нейтрализуют, добавляя холодную 1н уксусную кислоту до pH 7.5. Полученную смесь фильтруют, разбавляют до 500 мл, вводят в колонку Dowex 1-X8 (HCOO-) смолы и элюируют с линейным градиентом бикарбоната аммония (0-0.5 М). Соответствующие фракции собирают и лиофилизируют. Избыток бикарбоната аммония удаляют, добавляя к раствору смолу Dowex 50 X8 [H+] к раствору лиофилизированного порошка в воде. Смолу отфильтровывают, и полученный фильтрат лиофилизируют. Раствор продукта пропускают через колонну Dowex W-X8 [Na+] с водой и лиофилизируют до получения соединения 5 или 95 (2.61 г, 99%) в виде смеси α и β (1:10, по данным 1H ЯМР). 1H и 13C ЯМР спектры находятся в хорошем соответствии с литературными данными (Nunez et al., Can. J. Chem., 59: 2086 (1981)).(g) L-fucose-1-phosphate (
Пример 2. Химический способ получения GDP-фукозы (соединение 12, схема 7). Example 2. The chemical method of producing GDP-fucose (
Соединение 5 вначале превращают в его триэтиламмонийную соль, пропуская через колонку Dowex 50 W-X8 [Et3NH+ форма] с водой, и лиофилизируют. Лиофилизированную L-фукозо-1-фосфат-триэтиламмонийную соль (соединение 10) (300 мг, 0.83 ммоль) и гуанозин-5'-монофосфатморфолидат (соединение 11, 600 мг, 0.83 ммоль) отдельно сушат, испаряя совместно с пиридином дважды. Затем их объединяют с 20 мл сухого пиридина, и полученную смесь перемешивают в течение 5 дней при комнатной температуре и концентрируют. Полученный продукт очищают на колонке с сефадексом 0 - 25 (суперфайн) (3х65 см), дважды элюируя водой. Соответствующие фракции собирают и пропускают через колонку Dowex 50 W-Xg[Na+] с водой. Фракции собирают и лиофилизируют до получения соединения 12 (300 мг), загрязненного небольшим количеством GMP (по данным 1H ЯМР). 1H ЯМР спектр находится в хорошем соответствии с литературными данными (Gokhale et al., Can. J. Chem., 68 1063 (1990)).
Пример 3. Ферментативное превращение маннозо-I-P в GDP-фукозу и анализы (схемы 9 - 11). Example 3. Enzymatic conversion of mannose-I-P to GDP-fucose and assays (Schemes 9-11).
(a) Получение GDP-маннозопирофосфорилазы для превращения Man-I-P в GDP-маннозу. (a) Obtaining GDP-mannosopyrophosphorylase to convert Man-I-P to GDP-mannose.
Ферментом, превращающим GDP-маннозу, является GDP-маннозопирофосфорлаза (GDP-ManPP), которую получают из дрожжей. Большую часть GDP-ManPP из дрожжей выделяют, осаждая сульфатом аммония (около 80% по сравнению с неочищенным, не содержащем клеток экстрактом), со специфической активностью около 0,1 ед/мл раствора фермента. The GDP mannose converting enzyme is the GDP mannose pyrophosphorlase (GDP-ManPP), which is obtained from yeast. Most of the GDP-ManPP from yeast is isolated by precipitation with ammonium sulfate (about 80% compared to the crude, cell-free extract), with a specific activity of about 0.1 u / ml of the enzyme solution.
Дрожжи Saccharomyces cerrevisiae выращивают на среде (г/л): экстракт дрожжей - 5, пептон - 10, pH 6.0. Культуру растят при 30oC в течение ночи. Клетки собирают центрифугированием и промывают 50 мМ трис-буфером (pH 7.5), содержащим 2 мМ MgCl2 и 0.5 мМ DTT. Клетки (около 10 г) разбивают стеклянными шариками, используя шаровую мельницу (Bioseptic Products, ОК) импульсами с одноминутными интервалами пять раз. Затем раствор центрифугируют при 4oC при 23000 g в течение часа. Надосадочную жидкость (экстракт без клеток) собирают и используют для очистки фермента. Для частичной очистки фермента 40 - 80% (при 0oC) осажденного аммонийсульфатом собирают, медленно добавляя порошок сульфата аммония к не содержащему клеток экстракту до 40%-ного насыщения, и центрифугируют при 4oC при 15000 g в течение 30 мин, а затем к надосадочной жидкости добавляют еще сульфат аммония до 80%-ного насыщения. После центрифугирования осадок собирают и снова растворяют в 20 мл 50 мМ tris (pH 7.5) буфера, содержащего 2 мМ MgCl2 и 0.5 мМ DTT, и диализуют в 4 л того же буфера в течение ночи (около 18 ч) при 4oC. Активность этого препарата - около 0.1 ед/мл, по данным анализа активности с помощью ВЖЭХ.Saccharomyces cerrevisiae yeast is grown on medium (g / l):
(b) Получение GDP-фукозных синтетических энзимов для превращения GDP-маннозы в GDP-фукозу. (b) Obtaining GDP-fucose synthetic enzymes for converting GDP-mannose to GDP-fucose.
Первоначальные попытки использовать частично очищенный GDP-фукозный синтетический фермент (собранный после осаждения сульфатом аммония) для превращения GDP-маннозы в GDP-фукозу не увенчались успехом из-за сильного внутреннего окисления NADPH. Дальнейшая очистка фермента за счет пропускания через DEAD-Сефарозную CL-6B колонку привела к более высокой активности фермента, а также к снижению MADPH окислительной активности. Раствор фермента на этой стадии оценивают как около 0.05 ед/мл, по данным NADPH окислительного анализа. Initial attempts to use a partially purified GDP-fucose synthetic enzyme (collected after ammonium sulfate precipitation) to convert GDP mannose to GDP-fucose were unsuccessful due to the strong internal oxidation of NADPH. Further purification of the enzyme by passing through a DEAD-Sepharose CL-6B column led to a higher enzyme activity, as well as a decrease in MADPH oxidative activity. The enzyme solution at this stage is estimated at about 0.05 U / ml, according to NADPH oxidative analysis.
Увеличение образования GDP-фукозы наблюдают, используя ВЖЭХ. Спустя шесть часов протекания реакции выход GDP-фукозы оценивают около 9% в расчете на добавленный маннозо-1-фосфат. Ожидается, что более высокого выхода можно достичь, если удастся получить ферментные растворы с более высокими активностями. Во время этой реакции наблюдается разложение GDP-маннозы. Это разложение можно предотвратить, добавляя фторид калия. Это связано с примесями других ферментов в препарате фермента. Если использовать чистый фермент, отпадает необходимость добавлять фторидную соль. An increase in the formation of GDP-fucose is observed using HPLC. After six hours of the reaction, the yield of GDP-fucose was estimated at about 9% based on the added mannose-1-phosphate. It is expected that a higher yield can be achieved if it is possible to obtain enzyme solutions with higher activities. During this reaction, the decomposition of GDP mannose is observed. This decomposition can be prevented by adding potassium fluoride. This is due to impurities of other enzymes in the enzyme preparation. If you use a pure enzyme, there is no need to add fluoride salt.
Бактерию Klebsiella pneumonia АТСС 12658 выращивают на 2 л среды, содержащей 10 г казаминовой кислоты (Difco), 5 г экстракта дрожжей, 3 г K2HPO4, 1 г KH2PO4 и 5 г D-глюкозы на литр (pH 7.0). После инкубирования при 37oC в течение 18 ч клетки собирают центрифугированием (10000 х g, 50 мин, 4oC) и снова суспендируют в 50 мМ трис-буфера, содержащего 0.5 мМ DTT (pH 7.5). Клетки разрушают во французской ячейке под давлением 16000 фунт/дюйм (1125 кг/см2). Осколки клеток удаляют центрифугированием при 23000 x g в течение 60 мин, и надосадочную жидкость (экстракт без клеток) используют для очистки фермента. Не содержащий клеток экстракт (50 мл) из 2 л культуры обрабатывают 60 мг сульфата калия, и полученный осадок удаляют после центрифугирования. Затем медленно добавляют сульфат аммония при перемешивании до достижения 70%-ного насыщения (0.436 г/мл) при 0oC. После центрифугировании осадок собирают и повторно суспендируют в 20 мл буфера (50 мМ tris, содержащего 0.5 мМ DTT, pH 7.5), и диализуют в течение ночи (около 18 ч) при 4oC в 4 л того же самого буфера. Полученный раствор (20 мл) пропускают затем через DEAE-Сефарозу CL-6B (колонка Pharmacia) (3х30 см), которую предварительно уравновешивают тем же самым буфером. Фермент элюируют с линейным градиентом от 0 до 1 мМ NaCl в том же буфере (всего 400 мл). Активную фракцию собирают и диализуют в 2 л 50 мМ tris буфера, содержащего 0.5 мМ DTT (pH 7.5). Этот препарат фермента используют в синтезе непосредственно. Активность оценивают около 0.5 ед/мл по данным хроматографии с обращенной фазой и NADH окислительного анализа.The bacterium Klebsiella pneumonia ATCC 12658 is grown on 2 l of medium containing 10 g of casamic acid (Difco), 5 g of yeast extract, 3 g of K 2 HPO 4 , 1 g of KH 2 PO 4 and 5 g of D-glucose per liter (pH 7.0) . After incubation at 37 ° C for 18 h, cells were harvested by centrifugation (10,000 x g, 50 min, 4 ° C) and resuspended in 50 mM Tris buffer containing 0.5 mM DTT (pH 7.5). Cells are destroyed in a French cell under a pressure of 16,000 psi (1125 kg / cm 2 ). Cell debris was removed by centrifugation at 23,000 xg for 60 min, and the supernatant (cell-free extract) was used to purify the enzyme. A cell-free extract (50 ml) from 2 L of culture was treated with 60 mg of potassium sulfate, and the resulting precipitate was removed after centrifugation. Then, ammonium sulfate is slowly added with stirring until it reaches 70% saturation (0.436 g / ml) at 0 ° C. After centrifugation, the precipitate is collected and resuspended in 20 ml of buffer (50 mM tris containing 0.5 mM DTT, pH 7.5), and dialyzed overnight (about 18 hours) at 4 ° C. in 4 L of the same buffer. The resulting solution (20 ml) was then passed through a DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia column) (3x30 cm), which was previously equilibrated with the same buffer. The enzyme is eluted with a linear gradient from 0 to 1 mM NaCl in the same buffer (400 ml total). The active fraction is collected and dialyzed in 2 L of 50 mM tris buffer containing 0.5 mM DTT (pH 7.5). This enzyme preparation is used directly in the synthesis. Activity is estimated at about 0.5 U / ml according to reverse phase chromatography and NADH oxidative analysis.
(c) Анализ ферментной активности. (c) Analysis of enzyme activity.
ВЖЭХ систему используют для определения образования GDP-маннозы и GDP-фукозы. Используют колонки партисил 5 SAX (Whatman Co.), 4.6х12.5 см с размером части насадки 5 мкм. Подвижный буфер; 0.1 М фосфатный буфер (pH 3.5) со скоростью потока 0.5 мл/мин (давление 600 пси, 42.19 кг/см2). Соединение детектируют с помощью УФ детектора на 254 нм. Время удерживания для GDP-маннозы составляет около 8.9 мин, а для GDP-фукозы около 13 мин. Активность GDP-маннозопирофосфурилазы оценивают, следя за образованием GDP-маннозы из α- маннозо-1-фосфата и GTP по данным ВЖЭХ анализа. Реакционная среда содержит 10 мкмоль tris-HC1, 1 мкмоль L-маннозо-1-фосфата, 1 мкмоль GTP и частично очищенный фермент в полном объеме 0.5 мл. После инкубирования при 30oC в течение времени, зависящего от активности фермента, реагент (100 мкл) сливают и центрифугируют через фильтр "Ультрафри" (отсекает 100000 МВ, Millipore). Полученный фильтрат (5 мкм) вводят затем в ВЖЭХ для определения образования GDP-маннозы. Количество GDP-маннозы оценивают по GDP-маннозному стандартному раствору, приготовляемому из очищенной GDP-маннозы (Сигма). Одна единица равна 1 мкмоль GDP-маннозы, образующейся в минуту в исследуемых условиях.The HPLC system is used to determine the formation of GDP mannose and GDP fucose.
После измерения активности превращения GDP-маннозы в GDP-L-фукозу, можно либо провести спектрофотометрическое определение NADPH окисления, либо непосредственно измерить образование GDP-L-фукозы методом ВЖЭХ. Так как ферментные препараты содержат NADPH оксидазную активность, необходимо определить одновременно скорость NADPH окисления в отсутствии субстрата. В двух кюветах, помещается 1 мл 50 мМ tris буфер (pH 7.5), содержащий 0.2 мкмоль NADPH и раствор фермента, а в другую кювету добавляют 0.1 мкмоль GDP-маннозы. Скорость снижения оптической плотности для двух кювет определяют на длине волны 340 нм. Разница в скоростях NADPH окисления и является мерой конверсии. На фиг. 1 представлен типичный анализ, где линия A поглощения соответствует контрольной кювете без GDP-маннозы, а линия B соответствует поглощению того же раствора, содержащего 1 мкмоль GDP-маннозы. Одна единица равна 1 мкмоль NADPH окисления в минуту в условиях анализа. After measuring the activity of converting GDP-mannose to GDP-L-fucose, one can either spectrophotometrically determine NADPH oxidation or directly measure the formation of GDP-L-fucose by HPLC. Since enzyme preparations contain NADPH oxidase activity, it is necessary to simultaneously determine the rate of NADPH oxidation in the absence of substrate. In two cuvettes, 1 ml of 50 mM tris buffer (pH 7.5) containing 0.2 μmol of NADPH and an enzyme solution is placed, and 0.1 μmol of GDP mannose is added to the other cuvette. The rate of decrease in optical density for two cuvettes is determined at a wavelength of 340 nm. The difference in the rates of NADPH oxidation is a measure of conversion. In FIG. Figure 1 shows a typical analysis, where absorption line A corresponds to a control cell without GDP mannose, and line B corresponds to the absorption of the same solution containing 1 μmol of GDP mannose. One unit is equal to 1 μmol of NADPH oxidation per minute under assay conditions.
Для ВЖЭХ анализа в качестве реакционной среды берут 1 мл tris буфера (pH 7.5), содержащего 1 мкмоль GDP-D-маннозы, 0.2 мкмоль NADPH, 2 мкмоль KF, 2 ед. T. brokii алкоголь-дегидрогеназы, 10 мкл изопропанола и соответствующий раствор фермента. После инкубирования в течение определенного промежутка времени (1 ч), 100 мкл реакционного раствора сливают и центрифугируют через Ultrafree фильтр (отсекает 100000 МВ, Millipore). Полученный фильтрат (5 мкл) вводят затем в ВЖЭХ для определения образования GDP-фукозы. Количество GDP-фукозы оценивают по GDP-фукозному стандарту, полученному из очищенной GDP-фукозы (Сигма). Одна единица равна 1 мкмоль GDP-фукозы, образующемуся в минуту в условиях анализа. На фиг. 2 представлены три хроматограммы ВЖЭХ в момент времени 0 (А), спустя три часа (B) и спустя шесть часов (C) после начала реакции. Как было указано ранее, GDP-манноза элюируется около 8.9 мин, тогда как GDP-фукоза выходит примерно через 15 мин. For HPLC analysis, 1 ml of tris buffer (pH 7.5) containing 1 μmol of GDP-D-mannose, 0.2 μmol of NADPH, 2 μmol of KF, 2 units was taken as the reaction medium. T. brokii alcohol dehydrogenase, 10 μl of isopropanol and the corresponding enzyme solution. After incubation for a certain period of time (1 h), 100 μl of the reaction solution is drained and centrifuged through an Ultrafree filter (cuts off 100,000 MB, Millipore). The resulting filtrate (5 μl) was then introduced into HPLC to determine the formation of GDP-fucose. The amount of GDP-fucose is estimated by the GDP-fucose standard obtained from purified GDP-fucose (Sigma). One unit is equal to 1 μmol of GDP-fucose, formed per minute under analysis conditions. In FIG. Figure 2 shows three HPLC chromatograms at time 0 (A), three hours (B) and six hours (C) after the start of the reaction. As mentioned earlier, GDP mannose elutes around 8.9 minutes, while GDP fucose emerges after about 15 minutes.
Пример 4. Ферментативный синтез GDP-фукозы из маннозо-1-фосфата. Example 4. Enzymatic synthesis of GDP-fucose from mannose-1-phosphate.
К 5 мл реакционного раствора, 5 мкмоль Man-1-фосфата, 1 мкмоль NADPH, 5 мкмоль GTP, 5 мкмоль PEP, 100 ед пируваткиназы, 50 мкл изопропанола, 5 ед. T. brokii алкоголь-дегидрогеназы, 1 мкмоль MgCl2, 100 ед. неорганической фосфатазы, 5 мкмоль KF, 0.1 ед. GDP-маннозопирофосфатазы раствор и 0.05 ед GDP-фукозных-синтетических ферментов добавляют и инкубируют при 30oC в течение 6 ч, а образование GDP-фукозы определяют по данным ВЖЭХ.To 5 ml of the reaction solution, 5 μmol of Man-1-phosphate, 1 μmol of NADPH, 5 μmol of GTP, 5 μmol of PEP, 100 units of pyruvate kinase, 50 μl of isopropanol, 5 units T. brokii alcohol dehydrogenase, 1 μmol MgCl 2 , 100 units. inorganic phosphatase, 5 μmol KF, 0.1 units GDP-mannose pyrophosphatase solution and 0.05 units of GDP-fucose-synthetic enzymes are added and incubated at 30 ° C. for 6 hours, and the formation of GDP-fucose is determined by HPLC.
Пример 5. Получение Gal β-1.3(Fuc α-1,4) GlcNAc, используя образование GDP-Fuc
Смесь GTP Na соли (6.0 мг, 10 мкмоль), Man-I-P К соли (3.5 мг, 10 мкмоль), Gal β-1,3 GlcNAc (3.8 мг, 10 мкмоль), NaF (0.42 мг, 10 мкмоль), NADPH (9.4 мг, 10 мкмоль), PEP K соли (4.1 мг, 20 мкмоль), MgCl2-6H2O (2.6 мг, 10 мкмоль), MnCl2-4H2O (2 мг, 10 мкмоль), 2-пропанола (50 мкл), ADH (12 ед), PK (200 ед), PPазы (100 ед), неочищенного ферментативного препарата GDP-пирофосфорилазы (1.0 мл) и неочищенный ферментативный препарат GDP-Fuc продуцирующего фермента (1.0 мл) в 100 мМ tris буфера (pH 7.5) и разбавленную до 3 мл α- 1,3/4-фукозилтрансферазу (0.01 ед) добавляют к смеси, и полученную смесь перемешивают в атмосфере аргона в течение трех дней при комнатной температуре. Полученную смесь отфильтровывают, и полученный фильтрат вводят в колонку Dowex 1-X8 (OH-), а затем в колонку Dowex 50W-X8 (H+) и элюируют водой. Собирают фракции и лиофилизируют. Оставшийся материал очищают на колонке Сефадекс G-25 (суперфайн) с водой. Соответствующие фракции собирают и лиофилизируют до получения Gal β-1,3(Fuc α-1,4)GlcNAc. Его 1H-ЯМР спектр находится в хорошем соответствии с литературными данными (Dumas et al., Biomed. Chem. Lett., I: 425 (1991)).Example 5. Obtaining Gal β-1.3 (Fuc α-1,4) GlcNAc using the formation of GDP-Fuc
A mixture of GTP Na salt (6.0 mg, 10 μmol), Man-IP K salt (3.5 mg, 10 μmol), Gal β-1,3 GlcNAc (3.8 mg, 10 μmol), NaF (0.42 mg, 10 μmol), NADPH (9.4 mg, 10 μmol), PEP K salts (4.1 mg, 20 μmol), MgCl 2 -6H 2 O (2.6 mg, 10 μmol), MnCl 2 -4H 2 O (2 mg, 10 μmol), 2-propanol (50 μl), ADH (12 units), PK (200 units), PPases (100 units), crude enzyme preparation GDP-pyrophosphorylase (1.0 ml) and crude enzyme preparation GDP-Fuc producing enzyme (1.0 ml) in 100 mM tris buffer (pH 7.5) and diluted to 3 ml α-1,3 / 4-fucosyltransferase (0.01 u) was added to the mixture, and the resulting mixture was stirred in argon atmosphere for three days. and room temperature. The resulting mixture was filtered, and the obtained filtrate was introduced into a Dowex 1-X8 (OH - ) column, and then into a Dowex 50W-X8 (H + ) column and was eluted with water. Collect fractions and lyophilize. The remaining material is purified on a Sephadex G-25 column (superfine) with water. The appropriate fractions were collected and lyophilized to obtain Gal β-1,3 (Fuc α-1,4) GlcNAc. Its 1 H-NMR spectrum is in good agreement with published data (Dumas et al., Biomed. Chem. Lett., I: 425 (1991)).
Пример 6. Химический синтез маннозо-1-фосфата (соединение 19 или 93, схема 9). Example 6. Chemical synthesis of mannose-1-phosphate (
(a) 1,2,3,4,6-пента-0-ацетил-D-манноза (соединение 14 или 65). (a) 1,2,3,4,6-penta-0-acetyl-D-mannose (
D-маннозу (соединение 13, 5.0 г, 27.8 ммоль) растворяют в безводном пиридине (30 мл) и охлаждают до 0 - 5oC в ледяной бане. Медленно добавляют уксусный ангидрид, и полученную смесь оставляют при перемешивании при комнатной температуре на 8 ч. Полученную смесь выливают в ледяную воду и экстрагируют этилацетатом. Полученный экстракт последовательно промывают холодной соляной кислотой, водой, холодным насыщенным бикарбонатом натрия, водой, насыщенным хлоридом натрия, водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Органический слой концентрируют в вакууме и используют на следующей стадии без дальнейшей очистки. Соединение 14 или 65; 10.6 г выход 98% чистого α- изомера.D-mannose (
(b) 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-D-манноза (соединение 15 или 72). (b) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-mannose (
Пентаацетат (соединение 14 или 65; 10.0 г, 25.6 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране и добавляют 1.5 эквивалентов бензиламина (4.6 мл). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение дня. Затем ее экстрагируют этилацетатом и промывают последовательно холодной соляной кислотой, водой, холодным насыщенным бикарбонатом натрия, водой, холодным насыщенным хлоридом натрия, водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель удаляют в вакууме, а оставшийся сироп обрабатывают на хроматографической колонке с силикагелем, элюируя смесью этилацетат:гексан (2:3 объем/объем) до получения соединения 15 или 72 (7.8 г, 87%-ный выход чистого α- изомера). Pentaacetate (
1H-NMR (CDCl3) δ : 2.00, 2.05, 2.11, 2.17 (3H, s, 4 x CH3CO), 4.01-4.15, (1H, m, 5-H), 4.21-4.29 (2H, m, 6-H), 5.24 (1H, d, 1-H), 5.26-5.27 (1H, m, 2-H), 5.30-5.34 (1H, d, J=12.03 Hz, 4-H), 5.41-5.45 (1H, dd, J 3.36, 9.99 Hz, 3-H). 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 2.00, 2.05, 2.11, 2.17 (3H, s, 4 x CH 3 CO), 4.01-4.15, (1H, m, 5-H), 4.21-4.29 (2H, m , 6-H), 5.24 (1H, d, 1-H), 5.26-5.27 (1H, m, 2-H), 5.30-5.34 (1H, d, J = 12.03 Hz, 4-H), 5.41- 5.45 (1H, dd, J 3.36, 9.99 Hz, 3-H).
(c) Дибензилфосфитил-2,3,4,6-тетра-O-ацетил-D-маннозид (соединение 16 или 79). (c) Dibenzylphosphityl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-mannoside (
Маннозотетраацетат (соединение 15 или 72) (1.5 г, мл) и перемешивают в атмосфере азота при комнатной температуре. 1,2,4-триазол (1.5 г, 21.7 ммоль) добавляют к раствору и перемешивают до растворения. К этому раствору добавляют дибензил-N,N-диэтил-фосфориламидит (10.0 г, 31 ммоль) и полученную смесь перемешивают в течение часа. К раствору добавляют 50 мл эфира, и реакционную смесь последовательно экстрагируют холодным насыщенным бикарбонатом натрия, водой, холодным насыщенным натрий хлоридом и водой, сушат над безводным сульфатом натрия. Затем органический экстракт концентрируют в вакууме, а оставшийся сироп очищают на колонке с силикагелем, элюируя смесью ETOAc-гексан (1:4 объем/объем) (чистый α- изомер) до получения соединения 16 или 79. Mannosotetraacetate (
1H-NMR (CDCl3) δ : 2.0 - 2.3 (12H, 4s, 4 x CH3CO) 3.92-3.98 (1H, dd, 6-Ha), 4.05-4.1 (1H, m, 5-H), 4.18-4.24 (1H, dd, 6-Hb), 4.85-5.12 (4H m, CH2Ph), 5.22-5.24 (11H, m, 2-H), 5.28-5-32 (1H, t, 4-H), 5.38-5.42 (1H, dd, 3-H), 5.48-5.52 (1H, dd, 1-H). 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 2.0 - 2.3 (12H, 4s, 4 x CH 3 CO) 3.92-3.98 (1H, dd, 6-Ha), 4.05-4.1 (1H, m, 5-H), 4.18-4.24 (1H, dd, 6-Hb), 4.85-5.12 (4H m, CH 2 Ph), 5.22-5.24 (11H, m, 2-H), 5.28-5-32 (1H, t, 4- H), 5.38-5.42 (1H, dd, 3-H), 5.48-5.52 (1H, dd, 1-H).
(d) Дибензилфосфорид-2,3,4,6-тетра-O-ацетил-D-маннозид (соединение 17 или 86). (d) Dibenzylphosphoride-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-mannoside (
Соединение 16 или 79 растворяют в безводном тетрагидрофуране и охлаждают до -76oC в бане со смесью сухой лед/ацетон, и к раствору добавляют сразу 7 мл 30% перекиси водорода. Полученному раствору дают нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение 90 мин. Избыток перекиси водорода гасят, добавляя охлажденный льдом тиосульфат натрия. Затем добавляют 100 мл эфира, и экстракцию ведут как указано ранее до получения соединения 17 или 86, которые используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
(e) D-маннозо-1-фосфат (соединение 18 или 93). (e) D-mannose-1-phosphate (
Соединение 17 или 86 гидрируют над 5% Pd/C (400 мг) в 30 мл этанола и 10 мл бикарбоната натрия в атмосфере водорода в течение двух часов. Катализатор отфильтровывают, и полученный фильтрат концентрируют. Прикапывают гидроксид натрия к остатку при 0 - 5oC до тех пор, пока pH смеси не превышает 12. Полученную смесь перемешивают в течение трех часов при 4oC, а затем нейтрализуют, добавляя холодную уксусную кислоту до pH 7.2. Полученную смесь фильтруют, разбавляют до 400 мл, вводят в колонну Dowex 1-XB (HCOO-форма, 2х28 см), и элюируют с линейным градиентом бикарбоната аммония (0-0.6 М). Фракции, содержащие D-маннозо-1-фосфат, собирают и лиофилизируют. Избыток бикарбоната аммония удаляют, промывая лиофилизированный порошок Dowex 50W-XB (водородная форма) до получения соединения 18 или 93 в виде динатриевой соли.
Пример 7. Ферментативное галоидгидратирование. Example 7. Enzymatic halogenated.
А. Общий способ для галоидгидратирования, катализируемого хлорпероксидазой (схемы 3, 4 и 4а)
К реакционной смеси, содержащей 20 мл лимонно/фосфатного буфера (pH 3), 1 ммоль гликаля, 5 ммоль галида калия и 1170 ед. фермента, добавляют 600 мкл H2O2 (30%). Реакцию ведут в течение 30 мин (иодгидратация), трех часов (бромогдиратация) или трех дней (хлоргидратация) при комнатной температуре. Растворитель удаляют при пониженном давлении, и к остатку добавляют метанол. Нерастворимый материал отфильтровывают, а растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток очищают на хроматографической колонке с силикагелем с C8 обращенной фазой до получения 2-деокси-2-галоидсахаров. Полученные продукты превращают в перацетаты стандартными способами (пиридин, каталитическое количество 4-диметиламинопиридина, уксусной ангидрид, один день) и очищают на хроматографической колонке с силикагелем для характеризации.A. General Method for Chloroperoxidase Catalyzed Halohydration (
To the reaction mixture containing 20 ml of lemon / phosphate buffer (pH 3), 1 mmol of glycal, 5 mmol of potassium halide and 1170 units. enzyme, add 600 μl of H 2 O 2 (30%). The reaction is carried out for 30 minutes (iodine hydration), three hours (bromohydration), or three days (chlorohydration) at room temperature. The solvent was removed under reduced pressure, and methanol was added to the residue. Insoluble material is filtered off and the solvent is removed under reduced pressure. The residue was purified on a C8 reverse phase silica gel column chromatography to give 2-deoxy-2-halo sugars. The resulting products are converted into peracetates by standard methods (pyridine, a catalytic amount of 4-dimethylaminopyridine, acetic anhydride, one day) and purified on a silica gel chromatography column for characterization.
(1) Перацетат соединения 20:
1H-NMR (CDCl3) δ : α -изомер: 2.04 (3H, s), 2.08 (3H, s), 2.10 (3H, s), 2.21 (3H, s), 4.05 (1H, dd, J = 2.5, 12.5 Hz, H-6), 4.08 (1H, dd, J = 3.5, dd, J = 3.5, 11 Hz, H-2), 4.28 (1H, ddd, J = 2, 4, 10 Hz, H-5), 4.31 (1H, dd, J = 4, 12.5 Hz, H-6), 5.09 (1H, dd, J=9, 10 Hz, H-3), 5.52 (1H, dd, J=9, 11 Hz, H-4), 6.36 (1H, d, J=3.5 Hz, H-1) ppm.(1) Peracetate compound 20:
1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: α-isomer: 2.04 (3H, s), 2.08 (3H, s), 2.10 (3H, s), 2.21 (3H, s), 4.05 (1H, dd, J = 2.5, 12.5 Hz, H-6), 4.08 (1H, dd, J = 3.5, dd, J = 3.5, 11 Hz, H-2), 4.28 (1H, ddd, J = 2, 4, 10 Hz, H -5), 4.31 (1H, dd, J = 4, 12.5 Hz, H-6), 5.09 (1H, dd, J = 9, 10 Hz, H-3), 5.52 (1H, dd, J = 9, 11 Hz, H-4), 6.36 (1H, d, J = 3.5 Hz, H-1) ppm.
β- изомер: 2.03 (3H, s), 2.09 (3H, s), 2.11 (3H, s), 2.18 (3H, s), 33.88 (1H, ddd, J=2.4, 4.5, 10.5 Hz, H-5), 3.90 (1H, dd, J=9, 10.5 Hz, H-2), 4.11 (1H, dd, J=2.5, 12.5 Hz, H-6), 4.32 (1H, dd, J=4.5, 12.5 Hz, H-6), 5.03 (1H, dd, J=9, 10 Hz, H-3), 5.34 (1H, dd, J=9, 10.5 Hz), 5.81 (1H, d, J=9 Hz, H-1) ppm. 13C-NMR (CDCl3) d: 20.52-20.67 (4 x C), 47.50, 62.10, 68.46, 72.85, 74.36, 93.11, 167.91-172.10 (4 x C) ppm. HRMS (M+Na+): calcd 433.0110/435, found 433.0112/435.β-isomer: 2.03 (3H, s), 2.09 (3H, s), 2.11 (3H, s), 2.18 (3H, s), 33.88 (1H, ddd, J = 2.4, 4.5, 10.5 Hz, H-5 ), 3.90 (1H, dd, J = 9, 10.5 Hz, H-2), 4.11 (1H, dd, J = 2.5, 12.5 Hz, H-6), 4.32 (1H, dd, J = 4.5, 12.5 Hz , H-6), 5.03 (1H, dd, J = 9, 10 Hz, H-3), 5.34 (1H, dd, J = 9, 10.5 Hz), 5.81 (1H, d, J = 9 Hz, H -1) ppm. 13 C-NMR (CDCl 3 ) d: 20.52-20.67 (4 x C), 47.50, 62.10, 68.46, 72.85, 74.36, 93.11, 167.91-172.10 (4 x C) ppm. HRMS (M + Na + ): calcd 433.0110 / 435, found 433.0112 / 435.
(2) Перацетат соединения 21. (2)
1H-NMR (CDCl3) δ : α -изомер: 2.07 (3H, s), 2.10 (3H, s), 2.11 (3H, s), 2.17 (3H, s), 4.19 (1H, ddd, J=2.5, 4.5, 10.5 Hz, H-5), 4.17 (1H, dd, J=2.5, 10.5 Hz, H-6), 4.23 (1H, dd, J= 4.5, 12.5 Hz, H-6), 4.43 (1H, dd, J=2, 4 Hz, H-2), 5.21 (1H, dd, J= 4, 9.5 Hz, H-4), 5.45 (1H, t, J=10 Hz, H-4), 6.32 (1H, d, J= 2 Hz, H-1) ppm. 13C-NMR (CDCl3) δ : 20.60, 20.66, 20.75, 20.86, 47.77, 61.82, 65.54, 68.75, 71.25, 93.11, 167.20-171.90 (4 x C) ppm. 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: α-isomer: 2.07 (3H, s), 2.10 (3H, s), 2.11 (3H, s), 2.17 (3H, s), 4.19 (1H, ddd, J = 2.5, 4.5, 10.5 Hz, H-5), 4.17 (1H, dd, J = 2.5, 10.5 Hz, H-6), 4.23 (1H, dd, J = 4.5, 12.5 Hz, H-6), 4.43 ( 1H, dd, J = 2, 4 Hz, H-2), 5.21 (1H, dd, J = 4, 9.5 Hz, H-4), 5.45 (1H, t, J = 10 Hz, H-4), 6.32 (1H, d, J = 2 Hz, H-1) ppm. 13 C-NMR (CDCl 3 ) δ: 20.60, 20.66, 20.75, 20.86, 47.77, 61.82, 65.54, 68.75, 71.25, 93.11, 167.20-171.90 (4 x C) ppm.
β- изомер: 2.07 (3H, s), 2.10 (3H, s), 2.12 (3H, s), 2.18 (3H, s), 3.82 (1H, ddd, J=2.5, 5, 9.5 Hz, H-5), 4.13 (1H, dd, J=2.5, 12.5 Hz, H-6), 4.27 (1H, dd, J= 5, 10.5 Hz, H-6), 4.60 (1H, dd, J=3.5, 1.5 Hz, H-2), 5.00 (1H, dd, J= 4, 9.5 Hz, H-3), 5.43 (1H, t, J=9.5 Hz, H-4), 5.74 (1H, d, J=1.5 Hz, H-1) ppm. 13C-NMR (CDCl3) δ : 20.60-20.85 (4 x C), 51.05, 61.82, 65.27, 71.01, 73.04, 90.01, 167.20-171.90 (4 x C) ppm. HRMS (M+Na+): calcd 433.0110/435, found 433.0115/435.β-isomer: 2.07 (3H, s), 2.10 (3H, s), 2.12 (3H, s), 2.18 (3H, s), 3.82 (1H, ddd, J = 2.5, 5, 9.5 Hz, H-5 ), 4.13 (1H, dd, J = 2.5, 12.5 Hz, H-6), 4.27 (1H, dd, J = 5, 10.5 Hz, H-6), 4.60 (1H, dd, J = 3.5, 1.5 Hz , H-2), 5.00 (1H, dd, J = 4, 9.5 Hz, H-3), 5.43 (1H, t, J = 9.5 Hz, H-4), 5.74 (1H, d, J = 1.5 Hz , H-1) ppm. 13 C-NMR (CDCl 3 ) δ: 20.60-20.85 (4 x C), 51.05, 61.82, 65.27, 71.01, 73.04, 90.01, 167.20-171.90 (4 x C) ppm. HRMS (M + Na + ): calcd 433.0110 / 435, found 433.0115 / 435.
(3) Перацетат соединения 22. (3)
1H-NMR (CDCl3) δ: β- изомер: 2.04 (3H, s), 2.07 (3H, s), 2.16 (3H, s), 2.19 (3H, s), 4.08 (1H, dd, J=9, 11.5 Hz, H-2), 4.10-4.15 (3H, m, 2 x H-6 & H-5), 5.15 (1H, dd, J=3, 11.5 Hz, H-3), 5.35 (1H, d, J=3 Hz, H-4), 5.84 (1H, d, J=9 Hz, H-1) ppm. 13C-NMR (CDCl3) δ : 20.42, 20.52, 20.61, 20.66, 46.35, 60.89, 67.03, 71.94, 72.78, 93.43, 168.31-170.90 (4 x C) ppm. α- изомер: 13C-NMR (CDCl3) δ : 20.42-20.66 (4 xC), 44.39, 67.04, 67.69, 68.64, 69.39, 91.05, 167.01-170.86 (4 x C) ppm. HRMS (M+Na+): calcd 433.0110/435, found 433.0119/435. 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: β-isomer: 2.04 (3H, s), 2.07 (3H, s), 2.16 (3H, s), 2.19 (3H, s), 4.08 (1H, dd, J = 9, 11.5 Hz, H-2), 4.10-4.15 (3H, m, 2 x H-6 & H-5), 5.15 (1H, dd, J = 3, 11.5 Hz, H-3), 5.35 (1H , d, J = 3 Hz, H-4), 5.84 (1H, d, J = 9 Hz, H-1) ppm. 13 C-NMR (CDCl 3 ) δ: 20.42, 20.52, 20.61, 20.66, 46.35, 60.89, 67.03, 71.94, 72.78, 93.43, 168.31-170.90 (4 x C) ppm. α-isomer: 13 C-NMR (CDCl 3 ) δ: 20.42-20.66 (4 xC), 44.39, 67.04, 67.69, 68.64, 69.39, 91.05, 167.01-170.86 (4 x C) ppm. HRMS (M + Na + ): calcd 433.0110 / 435, found 433.0119 / 435.
(4) Соединение 23. (4)
1H-NMR (CDCl3), β- изомер: 1.12 (3H, d, J=6.5, CH3), 3.45 (1H, dd, J=1, 3 Hz, H-4), 3.52 (1H, dd, J=3, 10.5 Hz, H-3), 3.58 (1H, qd, J=1, 6.5 Hz, H-5), 3.69 (1H, dd, J= 8.5, 10.5 Hz, H-2), 4.45 (1H, d, J=8.5 Hz, H-1). 13C-NMR (CDCl3), β- изомер: 16.71, 58.04, 72.13, 73.56, 76.03, 98.78 ppm. β- изомер: 16.71, 54.71. 67.25, 71.13, 74.55, 94.20 ppm. HRMS (M+Na+): calcd 248.9738/251, found 248.9730/251. 1 H-NMR (CDCl 3 ), β-isomer: 1.12 (3H, d, J = 6.5, CH 3 ), 3.45 (1H, dd, J = 1, 3 Hz, H-4), 3.52 (1H, dd , J = 3, 10.5 Hz, H-3), 3.58 (1H, qd, J = 1, 6.5 Hz, H-5), 3.69 (1H, dd, J = 8.5, 10.5 Hz, H-2), 4.45 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-1). 13 C-NMR (CDCl 3 ), β-isomer: 16.71, 58.04, 72.13, 73.56, 76.03, 98.78 ppm. β-isomer: 16.71, 54.71. 67.25, 71.13, 74.55, 94.20 ppm. HRMS (M + Na + ): calcd 248.9738 / 251, found 248.9730 / 251.
(5) Перацетат соединения 25. (5)
1H-NMR (CDCl3) δ: β--изомер: 2.05 (3H, s), 2.08 (3H, s), 2.16 (3H, s), 2.18 (3H, s), 4.06 (1H, dd, J=9, 11.5 Hz, H-2), 4.07-4.15 (3H, m, 2 x H-6 & H-5), 5.09 (1H, dd, J=3, 11.5 Hz), 5.39 (1H, d, J=3 Hz, H-4), 5.75 (1H, d, J= 9 Hz, H-1) ppm. 13C-NMR (CDCl3), β- изомер: 20.21-22.55 (4 x C), 55.30, 60.87, 66.84, 71.86, 72.74, 93.53, 168.20-180.21 (4 x C) ppm. α- изомер: 20.1-22.55 (4 x C), 53.46, 61.04, 67.44, 68.67, 69.51, 90.94, 168.20-180.21 (4 x C) ppm. HRMS (M+Na+): calcd 389.0615/391, found 389.0610/391. 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: β - isomer: 2.05 (3H, s), 2.08 (3H, s), 2.16 (3H, s), 2.18 (3H, s), 4.06 (1H, dd, J = 9, 11.5 Hz, H-2), 4.07-4.15 (3H, m, 2 x H-6 & H-5), 5.09 (1H, dd, J = 3, 11.5 Hz), 5.39 (1H, d, J = 3 Hz, H-4), 5.75 (1H, d, J = 9 Hz, H-1) ppm. 13 C-NMR (CDCl 3 ), β-isomer: 20.21-22.55 (4 x C), 55.30, 60.87, 66.84, 71.86, 72.74, 93.53, 168.20-180.21 (4 x C) ppm. α-isomer: 20.1-22.55 (4 x C), 53.46, 61.04, 67.44, 68.67, 69.51, 90.94, 168.20-180.21 (4 x C) ppm. HRMS (M + Na + ): calcd 389.0615 / 391, found 389.0610 / 391.
(6) Перацетат соединения 27. (6)
1H-NMR (CDCl3) δ: β- изомер: 2.04 (3H, s), 2.07 (3H, s), 2.12 (3H, s), 2.17 (3H, s), 4.06-4.17 (4H, m, H-2, 2 x H-6 & H-5), 5.13 (1H, dd, J=3.5, 10 Hz, H-3), 5.25 (1H, d, J=3.5 Hz, H-4), 5.91 (1H, d, J=9.5 Hz, H-1) ppm. 13C-NMR (CDCl3), β- изомер: 20.5-22.50 (4 x C), 24.98, 60.94, 67.10, 72.16, 74.10, 94.15, 168.20-179.36 (4 x C) ppm; α- изомер: 20.5-22.50 (4 x C), 29.87, 60.63, 67.68, 68.31, 69.42, 92.16, 168.20-179.36 (4 x C) ppm. HRMS (M+Na+): calcd 480.9972, found 480.9999. 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: β-isomer: 2.04 (3H, s), 2.07 (3H, s), 2.12 (3H, s), 2.17 (3H, s), 4.06-4.17 (4H, m, H-2, 2 x H-6 & H-5), 5.13 (1H, dd, J = 3.5, 10 Hz, H-3), 5.25 (1H, d, J = 3.5 Hz, H-4), 5.91 (1H, d, J = 9.5 Hz, H-1) ppm. 13 C-NMR (CDCl 3 ), β-isomer: 20.5-22.50 (4 x C), 24.98, 60.94, 67.10, 72.16, 74.10, 94.15, 168.20-179.36 (4 x C) ppm; α-isomer: 20.5-22.50 (4 x C), 29.87, 60.63, 67.68, 68.31, 69.42, 92.16, 168.20-179.36 (4 x C) ppm. HRMS (M + Na + ): calcd 480.9972, found 480.9999.
B. Галоидгидратирование, катализируемое хлорпероксидазой, дисахаридгликалей и сиалаля. B. Halohydration catalyzed by chloroperoxidase, disaccharide glycals and sialal.
(1) Галоидгидратирование соединения 28 (схема 4). (1) Halogenated compounds 28 (Scheme 4).
40 мкл 30% H2O2 добавляют к смеси соединения 28 (20 мг, 0,065 ммоль), KBr (38,6 мг, 0,32 ммоль) и хлорпероксидазы (76 ед), в цитратном буфере (1,4 мл, pH, 3), и реакционную смесь осторожно перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляют при пониженном давлении, и MeOH добавляют к остатку. Нерастворившийся материал отфильтровывают, а полученный фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают на хроматографической колонке и силикагелем с C8-обращенной фазой до получения смеси D-галактопиранозио-(1,3)-2-бром-2-деокси-D-глюкопиранозы, соединения 29 (10 мг) и D-галактогпиранозил -β- (1,3)-2-бром-2-дезокси-D-маннопиранозы, соединение 30 (10 мг) с 76%-ным выходом. Полученные продукты ацилируют Ac2O и пиридином в присутствии каталитического количества DMAP для характеризации.40 μl of 30% H 2 O 2 was added to a mixture of compound 28 (20 mg, 0.065 mmol), KBr (38.6 mg, 0.32 mmol) and chloroperoxidase (76 units), in citrate buffer (1.4 ml, pH , 3), and the reaction mixture was gently stirred for 3 hours at room temperature. The solvent was removed under reduced pressure, and MeOH was added to the residue. Insoluble material is filtered off, and the resulting filtrate is concentrated under reduced pressure. The residue was purified by chromatography on a column and C8 reverse phase silica gel to obtain a mixture of D-galactopyranosio- (1,3) -2-bromo-2-deoxy-D-glucopyranose, compound 29 (10 mg) and D-galactogopyranosyl-β- (1,3) -2-bromo-2-deoxy-D-mannopyranose, compound 30 (10 mg) in 76% yield. The resulting products are acylated with Ac 2 O and pyridine in the presence of a catalytic amount of DMAP for characterization.
(2) Галоидгидратирование 2,3-дегидро-N-ацетилнейраминовой кислоты катализируемое хлорпероксидазой (соединение 35, схема 3). (2) Chloroperoxidase catalyzed 2,3-dehydro-N-acetylneuraminic acid halide hydration (
100 мкл 30% H2O2 добавляют к смеси соединения 34 (Meindl, Hoppe Seyler's Physiol. Chem. , 1350: 1088 (1969); 50 мг, 0.17 ммоль), KBr (102 мг, 0,857 ммоль) и хлорпероксидазы (200 ед), в цитратном буфере (3,5 мл, pH 3), и реакционную смесь осторожно перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Растворитель удаляют при пониженном давлении, и к остатку добавляют MeOH. Нерастворимый материал отфильтровывают, и полученный фильтрат концентрируют при пониженном давлении, а остаток очищают на BioGel P-2 колонке, и затем очищают на колонке с силикагелем с C8-обращенной фазой, элюируя CH3CN/H2O (5 : 1) до получения 2-бром-2-дезокси-N-ацетилнейраминовой кислоты (соединение 35) (43 мг, 65%). Полученный продукт переацилируют Ac2O и пиридином в присутствии каталитического количества DMAP с последующим метилированием Mel и Cs2CO3 для характеризации.100 μl of 30% H 2 O 2 was added to a mixture of compound 34 (Meindl, Hoppe Seyler's Physiol. Chem., 1350: 1088 (1969); 50 mg, 0.17 mmol), KBr (102 mg, 0.857 mmol) and chloroperoxidase (200 u ), in citrate buffer (3.5 ml, pH 3), and the reaction mixture was carefully stirred for 30 minutes at room temperature. The solvent was removed under reduced pressure, and MeOH was added to the residue. The insoluble material was filtered off, and the obtained filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified on a BioGel P-2 column, and then purified on a C8 reverse phase silica gel column, eluting with CH 3 CN / H 2 O (5: 1) to obtain 2-bromo-2-deoxy-N-acetylneuraminic acid (compound 35) (43 mg, 65%). The resulting product was re-acylated with Ac 2 O and pyridine in the presence of a catalytic amount of DMAP, followed by methylation of Mel and Cs 2 CO 3 for characterization.
1H-ЯМР (CDCl3) δ : 1.95, 2.04, 2.05, 2.10, 2.19, 2.20, (3H, s, каждый, OAc и NHAC), 3.83 (3H, s, COOCH3), 4.11 (1H, ddd, J=8.7, 10.6, 10.7 Hz, H-5), 4.22 (1H, dd, J=6.4, 12.5 Hz, H-9), 4.32 91H, dd, J-1.8, 10.6 Hz, H-6), 4.57 (1H, dd, J=5/15 (1H, ddd, J=2.4, 5.5, 6.4 Hz, H-8), 5.31 (1H, dd, J= 1.8, 5.5 Hz, H-7), 5.43 (1H, d, J=8.7 Hz, NH), 5.67 (1H, dd, J=3.8, 10.7 Hz, H-4). HRMS: рассчитано для C22H30NO14NrCs (M+Cs+) 743.9904/746, найдено 743.9900/746. 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 1.95, 2.04, 2.05, 2.10, 2.19, 2.20, (3H, s, each, OAc and NHAC), 3.83 (3H, s, COOCH 3 ), 4.11 (1H, ddd, J = 8.7, 10.6, 10.7 Hz, H-5), 4.22 (1H, dd, J = 6.4, 12.5 Hz, H-9), 4.32 91H, dd, J-1.8, 10.6 Hz, H-6), 4.57 (1H, dd, J = 5/15 (1H, ddd, J = 2.4, 5.5, 6.4 Hz, H-8), 5.31 (1H, dd, J = 1.8, 5.5 Hz, H-7), 5.43 (1H , d, J = 8.7 Hz, NH), 5.67 (1H, dd, J = 3.8, 10.7 Hz, H-4). HRMS: calculated for C 22 H 30 NO 14 NrCs (M + Cs + ) 743.9904 / 746, found 743.9900 / 746.
(3) 1,3,6,2', 3',4',6-гептаацетил-D-галактопиранозил- β -(1,4)-2-бром-2-дезоксигликопираноза (соединение 32) и -2-дезоксиманнопираноза (соединение 33)
В соответствии с общей процедурой смесь 1 : 1 соединения 32 и 33 (155 мг, 71%) получают из Gal β (1,4)глюкаля (соединение 31) (96.5 мг). Отношение соединений 32 и 33 определяют из интегрального отношения аномерных протонов соединений 32 и 33. Соединения 32 и 33 получают в виде α:β аномерных смесей: соединение 32 (α:β = 1 : 3), соединение 33 (α:β = 2 : 1).(3) 1,3,6,2 ', 3', 4 ', 6-heptaacetyl-D-galactopyranosyl-β - (1,4) -2-bromo-2-deoxyglycopyranose (compound 32) and -2-deoxymannopyranose (compound 33)
According to the general procedure, a 1: 1 mixture of
Масс-спектр высокого разрешения соединений 32 и 33: рассчитано для C26H35O17BrCs (M + C+) 831.0113/833, найдено 831.0112/833.High resolution mass spectrum of
1H-NMR (CDCl3 ) δ 1.96, 1.97, 1.98, 1.981, 2.03, 2.04, 2.05, 2.06, 2.070, 2.074, 2.075, 2.08, 2.12, 2.13, 2.132, 2.15, 2.16, 2.166 (-OCH3), 3.84 (dd, J=1.6, 9.0, Hz, H-2 Glu ββ- аномер соединения 32), 3.73-4.22 (m), 4.40 (dd, J=2.2, 3.8 Hz. H-2 α- аномер соединения 33), 4.43-4.47 (m), 4.46 (dd, J= 1.0, 7.6 Hz), 4.55 (d, J=8.0 Hz), 4.57 (dd, J=1.6, 4.0 Hz, H-2 α -аномер соединения 33), 4.59 (d, J=8.0 OHz), 4.93 (dd, J=3.5, 5.1 Hz), 4.96 (dd, J=3.5, 4.96 Hz), 4.99 (dd, J=3.5, 10.5 Hz, H-3' β-аномер соединения 32, 5.03 (dd, J=3.8, 8.8 Hz), 4.07-5.12 (m), 5.16 (dd, J=8.0, 10.5 Hz), 5.20-5.26 (m), 5.35-5.38 (m), 5.70 (d, J=1.6, H-1 β-аномер соединения 33), 5.76 (d, J= 9.0 Hz, H-1 β-аномер соединения 32), 6.26 (d, J=2.2 Hz, H-1 α-аномер соединения 33), 6.30 (d, J=3.4 Hz, Р-1 α/ -аномер соединения 32). 13C-NMR (CDCl3) 20.52, 20.61, 20.65, 20.75, 20.80, 20.84, 20.88, 20.93, 46.27, 47.95, 48.13, 51.26, 60.77, 60.91, 61.08, 61.49, 61.67, 61.79, 62.04, 66.56, 66.62, 66.71, 66.75, 68.97, 69.03, 69.09, 69.14, 69.30, 70.68, 70.72, 70.75, 70.78, 70.82, 70.86, 70.91, 70.94, 70.98, 71.16, 71.73, 73.44, 73.68, 73.80, 74.13, 74.29, 76.32, 76.61, 89.77, 90.34, 92.98, 93.13, 100.84, 101.19, 101.45, 168.42, 168.45, 168.53, 168.92, 169.14, 169.22, 169.36, 169.59, 169.65, 170.08, 170.13, 170.16, 170.29, 170.36, 170.46. 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ 1.96, 1.97, 1.98, 1.981, 2.03, 2.04, 2.05, 2.06, 2.070, 2.074, 2.075, 2.08, 2.12, 2.13, 2.132, 2.15, 2.16, 2.166 (-OCH 3 ), 3.84 (dd, J = 1.6, 9.0, Hz, H-2 Glu ββ- anomer of compound 32), 3.73-4.22 (m), 4.40 (dd, J = 2.2, 3.8 Hz. H-2 α- anomer of compound 33) , 4.43-4.47 (m), 4.46 (dd, J = 1.0, 7.6 Hz), 4.55 (d, J = 8.0 Hz), 4.57 (dd, J = 1.6, 4.0 Hz, H-2 α-anomer of compound 33) , 4.59 (d, J = 8.0 OHz), 4.93 (dd, J = 3.5, 5.1 Hz), 4.96 (dd, J = 3.5, 4.96 Hz), 4.99 (dd, J = 3.5, 10.5 Hz, H-3 ' β-anomer of compound 32, 5.03 (dd, J = 3.8, 8.8 Hz), 4.07-5.12 (m), 5.16 (dd, J = 8.0, 10.5 Hz), 5.20-5.26 (m), 5.35-5.38 (m) 5.70 (d, J = 1.6, H-1 β-anomer of compound 33), 5.76 (d, J = 9.0 Hz, H-1 β-anomer of compound 32), 6.26 (d, J = 2.2 Hz, H-1 α-anomer of compound 33), 6.30 (d, J = 3.4 Hz, P-1 α / anomer of compound 32). 13 C-NMR (CDCl 3) 20.52, 20.61, 20.65, 20.75, 20. 80, 20.84, 20.88, 20.93, 46.27, 47.95, 48.13, 51.26, 60.77, 60.91, 61.08, 61.49, 61.67, 61.79, 62.04, 66.56, 66.62, 66.71, 66.75, 68.97, 69.03, 69.09, 69.14, 69.30, 70.68, 70.72, 70.75, 70.78, 70.82, 70.86, 70.91, 70.94, 70.98, 71.16, 71.73, 73.44, 73.68, 73.80, 74.13, 74.29, 76.32, 76.61, 89.77, 90.34, 92.98, 93.13, 100.84, 101.19, 101.45, 168.42, 168.45, 168.53, 168.92, 169.14, 169.22, 169.36, 169.59, 169.65, 170.08, 170.13, 170.16, 170.29, 170.36, 170.46.
(4) 1,3,6,2', 3',4',6'-гептаацетил-D-галактопиранозил β -(1,3)-2-бром-2-дезоксиглюкопираноза (соединение 29) и -2-дезоксиманнопираноза (соединение 30). (4) 1,3,6,2 ', 3', 4 ', 6'-heptaacetyl-D-galactopyranosyl β - (1,3) -2-bromo-2-deoxyglucopyranose (compound 29) and -2-deoxymannopyranose (compound 30).
В соответствии с общей процедурой смесь 1 : 1 (соединения 29 и 30) (66 мг, 76%) получают из Gal β- (1,3)глюкаля (соединение 28) (38,6 мг). Соединения 29 и 30 выделяют на хроматографической колонке с силикагелем (AcOEt/н-гексан, 5 - 2) в виде α:β- аномерных смесей: соединение 29 (α:β = 1 : 10), соединение 30 (α:β = 12 : 5). According to the general procedure, a 1: 1 mixture (compounds 29 and 30) (66 mg, 76%) was obtained from Gal β- (1,3) glucal (compound 28) (38.6 mg).
β-аномер соединения 29: 1H-NMR (CDCl3) δ 1.98, 2.04, 2.07, 2.08, 2.09, 2.15, 2.17 (3H, каждый, s, OAc x 7), 3.78 (1H, ddd, J=1.8, 4.6, 9.7 Hz, H-5 Glu), 3.85 (1H, t, J=9.5 Hz, H-2 Glu), 3.89 (1H, t, J=7 Hz, H-5 Gal), 3.96, (1H, t, J=10.0 Hz, H-3 Glu), 4.07 (1H, m, H-6 Gal), 4.09 (1H, dd, J = 1.8, 12.4 Hz, H-6 Glu), 4.13 (1H, dd, J = 7.0, 11.1 Hz. H-6 gal), 4.25 (1H, dd, J = 4.6, 12.4 Hz, H-6 Glu), 4.89 (1H, dd, J = 7.7 Hz, H-1 Gal), 4.97 (1H, t, J = 9.6 Hz, H-4 Glu), 5.03 (1H, dd, J = 3.4, 10.0 Hz, H-3 Gal), 5.13 (1H, dd, J = 7.7, 10.0 Hz, H-2 Gal), 5.36 (1H, d, J = 3.4 Hz, H-4 Gal), 5.75 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-1 of Glu).β-anomer of compound 29: 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ 1.98, 2.04, 2.07, 2.08, 2.09, 2.15, 2.17 (3H, each, s, OAc x 7), 3.78 (1H, ddd, J = 1.8, 4.6, 9.7 Hz, H-5 Glu), 3.85 (1H, t, J = 9.5 Hz, H-2 Glu), 3.89 (1H, t, J = 7 Hz, H-5 Gal), 3.96, (1H, t, J = 10.0 Hz, H-3 Glu), 4.07 (1H, m, H-6 Gal), 4.09 (1H, dd, J = 1.8, 12.4 Hz, H-6 Glu), 4.13 (1H, dd, J = 7.0, 11.1 Hz. H-6 gal), 4.25 (1H, dd, J = 4.6, 12.4 Hz, H-6 Glu), 4.89 (1H, dd, J = 7.7 Hz, H-1 Gal), 4.97 (1H, t, J = 9.6 Hz, H-4 Glu), 5.03 (1H, dd, J = 3.4, 10.0 Hz, H-3 Gal), 5.13 (1H, dd, J = 7.7, 10.0 Hz, H- 2 Gal), 5.36 (1H, d, J = 3.4 Hz, H-4 Gal), 5.75 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-1 of Glu).
HRMS: рассчитано для C26H35O17BrCs (M+Cs+)
831.0112/833, найдено 831.0112/833.HRMS: calculated for C 26 H 35 O 17 BrCs (M + Cs + )
831.0112 / 833, found 831.0112 / 833.
13C-NMR (CDCl3) δ 20.55, 20.64, 20.68, 20.71, 20.75, 20.963 50.11, 60.93, 61.62, 66.73, 68.53, 68.96, 70.62, 70.82, 72.87, 77.21, 81.30, 92.86, 101.61, 168.77, 169.03, 169.35, 170.13, 170.20, 170.36, 170.67. 13 C-NMR (CDCl 3 ) δ 20.55, 20.64, 20.68, 20.71, 20.75, 20.963 50.11, 60.93, 61.62, 66.73, 68.53, 68.96, 70.62, 70.82, 72.87, 77.21, 81.30, 92.86, 101.61, 168.77, 169.03, 169.35, 170.13, 170.20, 170.36, 170.67.
α- аномер соединения 30: 1H-NMR (CDCl3) δ : 4.24 (1H, bd, J = 3.0 Hz, H-2 Man), 4.55 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1 Gal), 5.01 (1H, dd, J = 3.4, 10.5 Hz, H-3 Gal), 5.18 (1H, dd, J = 7.8, 10.5 Hz, H-2 Gal), 5.32 (1H, t, J = 8.7 Hz, H-4 Man), 5.39 (1H, dd, J = 1.0, 3.4 Hz, H-4 Gal), 6.30 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-1 Man).α- anomer of compound 30: 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 4.24 (1H, bd, J = 3.0 Hz, H-2 Man), 4.55 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1 Gal), 5.01 (1H, dd, J = 3.4, 10.5 Hz, H-3 Gal), 5.18 (1H, dd, J = 7.8, 10.5 Hz, H-2 Gal), 5.32 (1H, t, J = 8.7 Hz, H -4 Man), 5.39 (1H, dd, J = 1.0, 3.4 Hz, H-4 Gal), 6.30 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-1 Man).
ββ- аномер соединения 30: 1H-NMR (CDCl3) δ : 4.45 (1H, dd, J = 2.0, 3.5 Hz, H-2 Man), 4.55 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1 Gal), 5.01 (1H, dd, J = 3.4, 10.5 Hz, H-3 Gal), 5.20 (1H, dd, J = 7.8, 10.5 Hz, H-2 Gal), 5.30 (1H, t, J = 7.4 Hz, H-4 Man), 5.39 (1H, dd, J = 1.0, 3.4 Hz, H-4 Gal), 5.80 (1H, d, J = 2.0, 3.4 Hz, H-1 Man).ββ- anomer of compound 30: 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 4.45 (1H, dd, J = 2.0, 3.5 Hz, H-2 Man), 4.55 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1 Gal ), 5.01 (1H, dd, J = 3.4, 10.5 Hz, H-3 Gal), 5.20 (1H, dd, J = 7.8, 10.5 Hz, H-2 Gal), 5.30 (1H, t, J = 7.4 Hz , H-4 Man), 5.39 (1H, dd, J = 1.0, 3.4 Hz, H-4 Gal), 5.80 (1H, d, J = 2.0, 3.4 Hz, H-1 Man).
HRMS: рассчитано для C26H35O17BrCs (M+Cs+) 831.0112/833, найдено 831.0110/833.HRMS: calculated for C 26 H 35 O 17 BrCs (M + Cs + ) 831.0112 / 833, found 831.0110 / 833.
13C-NMR 20.57, 20.65, 20.76, 20.87, 20.95, 21.01, 21.04, 48.21, 60.98, 61.19, 62.01, 62.61, 66.75, 66.82, 68.43, 68.52, 70.71, 70.88, 71.05, 72.03, 73.36, 74.74, 75.93, 77.23, 90.08, 92.80, 100.10, 100.24, 168.23, 169.13, 169.22, 169.73, 170.18, 170.40. 13 C-NMR 20.57, 20.65, 20.76, 20.87, 20.95, 21.01, 21.04, 48.21, 60.98, 61.19, 62.01, 62.61, 66.75, 66.82, 68.43, 68.52, 70.71, 70.88, 71.05, 72.03, 73.36, 74.74, 75.93, 77.23, 90.08, 92.80, 100.10, 100.24, 168.23, 169.13, 169.22, 169.73, 170.18, 170.40.
(5) Сиалил α(1,3)Galβ(1,4)Fucα (1,3)-2-бром-2-дезоксиглюкопираноза (соединение 37a) и -2-бром-2-дезоксиманнопираноза (соединение 37b). (5) Sialyl α (1,3) Galβ (1,4) Fucα (1,3) -2-bromo-2-deoxyglucopyranose (
В соответствии с общей процедурой смесь 1 : 1 соединений 37a и 38b (3.5 мг, 56%) получают из NeuAc (2,3)-Gal β-(1,4)Fuc α-(1,3) глюкаля соединение 36 (5.5 мг). Отношение соединений 37a и 37b определяют по отношению интегралов метильных протонов фукозы. According to the general procedure, a 1: 1 mixture of
Cмеси соединений 37a и 37b: 1H-NMR (D2O) δ 1.17 (d, J = 6.0 Hz, CH3 Fuc), 1.18 (d, J = 6.0 Hz, CH3 Fuc), 1.80 (t, J = 12.7 Hz, H-3ax NeuAc), 2.02 (dd, J = 5.0, 12.7 Hz, H-3 eq NeuAc), 3.45 - 4.13 (m), 4.48 (d, J = 8.0 Hz, H-1 Gal), 4,49 (d, J = 8.0 Hz, H-1 of Gal), 5.0 - 5.04 (m), 5.18 - 5.22 (m), 5.38 - 4.42 (m).Mixtures of
Пример 8. Общий способ бромгидратирования с помощью NBS. Example 8. General method for bromination using NBS.
К раствору 1 ммоль глюкаля в смеси 3.6 мл CH3CN - 1.5 мл H2O добавляют 1 ммоль N-бромсукцинимида (NBS) при комнатной температуре. Реакцию ведут в течение трех часов при той же температуре. Растворитель удаляют при пониженном давлении, а остаток обрабатывают на хроматографической колонке с силикагелем. Полученные продукты превращают в перацетаты с помощью пиридина и уксусного ангидрида в присутствии каталитических количеств 4-диметиламинопиридина, и очищают на хроматогафической колонке с силикагелем для характеризации.To a solution of 1 mmol of glucal in a mixture of 3.6 ml of CH 3 CN - 1.5 ml of H 2 O was added 1 mmol of N-bromosuccinimide (NBS) at room temperature. The reaction is carried out for three hours at the same temperature. The solvent was removed under reduced pressure, and the residue was subjected to silica gel column chromatography. The resulting products are converted into peracetates with pyridine and acetic anhydride in the presence of catalytic amounts of 4-dimethylaminopyridine, and purified on a chromatographic column with silica gel for characterization.
(a) 1,3,6,2', 3',4',6'-гептаацетил-D-галактопиранозил- β (1,4)-2-бром-2-дезоксиглюкопираноза (соединение 32) и -2-дезоксиманнопираноза (соединение 33). (a) 1,3,6,2 ', 3', 4 ', 6'-heptaacetyl-D-galactopyranosyl-β (1,4) -2-bromo-2-deoxyglucopyranose (compound 32) and -2-deoxymannopyranose (compound 33).
В соответствии с общим способом смесь 1 : 2.5 соединений 32 и 33 (30 мг, 78%) получают из Gal β (1,4)глюкаля (соединение 31) (17 мг). Отношение соединений 32 и 33 определяют из отношения интегралов аномерных протонов. Соединения 32 и 33 получают в виде смеси α:β аномерных смесей: соединение 32 (α:β = 3 : 5), соединение 33 (α:β = 5 : 2). According to the general method, a 1: 2.5 mixture of
(b) Метил-5-ацетамидо-2,4,7,8,9-пента-O-ацетил-3-бром-3,5- дидезокси β D-эритро-L-манно-2-нонулопиранозонат (метилперацетил соединения 35, соединение 35a) и метил-5 ацетамидо-2,4,7,8,9-пента-O- ацетил-3-бром-3,5-дидезокси -α- D-эритро-L-глюко-2-нонулопироназонат (соединение 35b). (b) Methyl 5-acetamido-2,4,7,8,9-penta-O-acetyl-3-bromo-3,5-dideoxy β D-erythro-L-manno-2-nonulopyranosonate (methyl peracetyl of
Химическое бромгидратирование проводят в соответствии с общей процедурой, и полученные продукты превращают в перацетаты с последующей этерификацией метилиодидом в присутствии эквимолярного количества карбоната цезия до получения смеси соединений 35a и 35b (155 мг, 74%). Отношение соединений 35a и 35b определяют из отношения интегралов метильных протонов сложного эфира. Chemical bromohydration is carried out in accordance with the general procedure, and the resulting products are converted into peracetates, followed by esterification with methyl iodide in the presence of an equimolar amount of cesium carbonate to obtain a mixture of compounds 35a and 35b (155 mg, 74%). The ratio of compounds 35a and 35b is determined from the ratio of the integrals of the methyl protons of the ester.
1H-ЯМР спектры соединений 35a и 35b находятся в хорошем соответствии с литературными данными. 1 H-NMR spectra of compounds 35a and 35b are in good agreement with published data.
Cоединение 35b: 1H-NMR (CDCl3) δ: 1.90, 2.03, 2.08, 2.10, 2.12, 2.15 (3H, s, каждый OAc и NHAc), 3.78 (3H, s, COOCH3), 4.04 (1H, dd, J = 6.0, 12.4 Hz, H-9), 4.09 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-3ax), 4.33 (1H, ddd, J = 10.0, 10.6, 10.7 Hz, H-5), 4.36 (1H, dd, J = 2.4, 12.4 Hz, H-9'), 5.10 (1H, ddd, J = 2.4, 6.0, 6.1 Hz, H-8), 5.25 (1H, dd, J = 2.5, 10.7 Hz, H-6), 5.30 (1H, dd, J = 10.0, 10.6 Hz, H-4), 5.38 (1H, dd, J = 2.5, 6.1 Hz, H-7), 5.90 (1H, d, J = 10.0 Hz, NH).Compound 35b: 1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 1.90, 2.03, 2.08, 2.10, 2.12, 2.15 (3H, s, each OAc and NHAc), 3.78 (3H, s, COOCH 3 ), 4.04 (1H, dd , J = 6.0, 12.4 Hz, H-9), 4.09 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-3ax), 4.33 (1H, ddd, J = 10.0, 10.6, 10.7 Hz, H-5), 4.36 (1H, dd, J = 2.4, 12.4 Hz, H-9 '), 5.10 (1H, ddd, J = 2.4, 6.0, 6.1 Hz, H-8), 5.25 (1H, dd, J = 2.5, 10.7 Hz , H-6), 5.30 (1H, dd, J = 10.0, 10.6 Hz, H-4), 5.38 (1H, dd, J = 2.5, 6.1 Hz, H-7), 5.90 (1H, d, J = 10.0 Hz, NH).
Пример 9. Выделение Galβ1,3/4 GlcNAcα2,3- сиалилтрансферазы. Example 9. Isolation of Galβ1,3 / 4 GlcNAcα2,3-sialyltransferase.
Высокий выход при выделении растворимой Galβ1,3/4- GlcNAcα2,3- сиалилтрансферазы осуществляют в бакуловирусной системе выделения, используя кДНК, кодирующую протеин слияния преинсулинового сигнального пептида и каталитический домен сиалилтрансферазы. кДНК, кодирующую протеин слияния, конструируют по способу Wen. et al. в плазмидном векторе pGlP199 (Huseh et al., J. Biol. Chem. , 261: 4940 (1986)). Для выделения ДНК-фрагмента, содержащего полную кодирующую последовательность, уникальный Eco RI сайт с 3'-конца chimera вначале переваривают, свисающую часть затупляют, и лигируют синтетические связи, содержащие Nhe сайт. Полученную плазмиду переваривают с Nhe I для высвобождения кДНК протеина слияния, и этот фрагмент клонируют по уникальному Nhe I сайту в pBlueBac, вектор переноса системы выделения бакуловируса, под контролем бакуловирусного полиэдринового промотора (Invitrogen; San Diego, CA). Все манипуляции с рекомбинантным ДНК осуществляют в условиях, рекомендуемых в инструкциях поставщиков ферментов, используя стандартные протоколы (Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (1989)). High yield upon isolation of soluble Galβ1,3 / 4-GlcNAcα2,3-sialyltransferases is carried out in a baculovirus isolation system using cDNA encoding the fusion protein of the pre-insulin signal peptide and the catalytic domain of sialyltransferase. cDNA encoding a fusion protein is constructed by the Wen method. et al. in plasmid vector pGlP199 (Huseh et al., J. Biol. Chem., 261: 4940 (1986)). To isolate the DNA fragment containing the complete coding sequence, the unique Eco RI site from the 3'-end of chimera is first digested, the dangling portion is dull, and synthetic bonds containing the Nhe site are ligated. The resulting plasmid is digested with Nhe I to release the fusion protein cDNA, and this fragment is cloned into a unique Nhe I site in pBlueBac, a transfer vector of the baculovirus isolation system, under the control of a baculovirus polyhedrin promoter (Invitrogen; San Diego, CA). All recombinant DNA manipulations are performed under the conditions recommended in the instructions of the enzyme suppliers using standard protocols (Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (1989)).
Создание рекомбинантных бакуловирусов осуществляют, используя MaxBac выделительной системы (Invitrogen) точно в соответствии с протоколами, рекомендуемыми изготовителем. Короче, плазмиду и дикого типа вирусную ДНК смешивают и используют для трансфектации Sf-9 клеток кальцийфосфатным методом. Рекомбинантные вирусы получают за счет переноса клеток в культуральную среду, и бляшки очищают повторным лимитирующим разбавлением. Некоторые клональные выделенные бляшки анализируют на их способность вызывать секрецию α-2,3 NeuT в инфицированную клеточную среду, тестируя аликвоты среды непосредственно на α-2,3 NeuT активность в сиалилтрансферазном анализе. Изолят, который приводит к наиболее высоким уровням α-2,3 NeuT секреции обозначают rBv 2,3 ST, и доводят до 500 мл, инфицируя свежие Sf-9 клетки. α-2,3 NeuT активность анализируют, используя модификации опубликованного анализа 0.9 мМ. Эти манипуляции проиллюстрированы схематически далее на схеме 24. The creation of recombinant baculoviruses is carried out using MaxBac excretory system (Invitrogen) exactly in accordance with the protocols recommended by the manufacturer. In short, a plasmid and wild-type viral DNA are mixed and used to transfect Sf-9 cells with a calcium phosphate method. Recombinant viruses are obtained by transferring cells to the culture medium, and plaques are purified by repeated limiting dilution. Some clonal isolated plaques are analyzed for their ability to induce secretion of α-2,3 NeuT into the infected cell medium by testing aliquots of the medium directly for α-2,3 NeuT activity in sialyltransferase assay. The isolate that leads to the highest levels of α-2,3 NeuT secretion is designated
Пример 10. Galβ1,3 GlcNAcα1,3 Galβ1,4Glc в качестве акцептора. Example 10. Galβ1,3 GlcNAcα1,3 Galβ1,4Glc as an acceptor.
Для получения больших количеств α-2,3NeuT, rBv 2,3-ST используют для инфицирования Sf-9 клеток в культуре моносоля, и обычно получают 2 - 3 единицы α- 2,3NeuT активности, секретируемой на 108 инфицированных клеток при выращивании их на среде Excell-400 (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Единицы активности (ммоль/мин) определяют, умножая результаты анализа на коэффициент 1,6 для получения активности при Vмакс.. Кондиционную среду из rBv 2,3ST-инфицированных клеток собирают через 72 ч после инфицирования, и рекомбинантные α-2,3NeuT частично очищают на одной стадии хроматографической очистки. 3 л среды, содержащей α-2,3NeuT, фильтруют и кондиционируют до приблизительно 250 мл в Amicon CH2PRS спиральной картриджной системе, снабженной S1Y10 картриджем. Эту установку используют для обессоливания концентрированной надосадочной жидкости тремя объемами 10 мМ какодиловой кислоты, 25 мМ NaCl, 25% глицерина, pH 5,3 (буфер А). Затем образцы вводят в колонку (2,5 х 17 см) S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) уравновешенную буфером А со скоростью 2 мл/мин. После того как все образцы загружены, колонку промывают буфером А до тех пор, пока OD280 не достигает значения базовой линии (1,6 объема колонки).To obtain large quantities of α-2,3NeuT,
Затем α-2,3NeuT элюируют из колонки 50 мМ какодиловой кислоты, 1 М NaCl, 25% глицерина, pH 6,5, фракции, содержащие α-2,3NeuT собирают и деализируют в течение в ночи (около 18 ч) против 1 л 50 мМ какодиловой кислоты, 0,5 М NaCl, 50% глицерина, pH 6,0, а затем хранят при -20oC.Then, α-2,3NeuT was eluted from a column of 50 mM cacodilic acid, 1 M NaCl, 25% glycerol, pH 6.5; fractions containing α-2,3NeuT were collected and dealized overnight (about 18 hours) versus 1
Пример 11. Галактозилирование. Example 11. Galactosylation.
(a) LacNac β-O-аллил (схема 14, соединение 41). (a) LacNac β-O-allyl (
Смесь соединения 40 (Lee et al, Carbohydr. Res., 37 (1974) (2,0 г, 7,65 ммоль), Glc-1-Р (2,74 г, 7,65 ммоль), PEP (К соль), (1,6 г, 7,65 мкмоль), NAD+ ( 193 мг, 0,25 ммоль), MnCl2 • 4H2O (79,2 мг, 0,4 ммоль), MgCl2 • 6H2O (162,6 мг, 0,8 ммоль), DTT (306 мг, 2 ммоль), KCl (1,04 г, 15 ммоль) NaN3 (20 мг, 0,31 ммоль) и UDP (90 мг, 0,19 ммоль) в HEPES буфере (100 мМ, pH 7,5; 200 мл) доводят до pH 7,5 с помощью 10 н и н NaOH, и к раствору добавляют энзимы, UDPGE (10 ед), UDPGE ( 20 ед), PK (100 ед), GalT (5 ед) и PPазу (100 ед). Полученную смесь осторожно перемешивают в атмосфере аргона при комнатной температуре (25oC) в течение 5 дней. Полученную смесь концентрируют и хроматографируют на силикагеле, элюируя CHCl3 - EtOAc-MeOH ( 5: 2: 2 до 5: 2:3) до получения дисахарида, который далее очищают на Sephadex G25, элюируя водой, до получения LacNac β-O-аллила (соединение 41) (1.7 г, 50%).A mixture of compound 40 (Lee et al, Carbohydr. Res., 37 (1974) (2.0 g, 7.65 mmol), Glc-1-P (2.74 g, 7.65 mmol), PEP (K salt ), (1.6 g, 7.65 mmol), NAD + (193 mg, 0.25 mmol), MnCl 2 • 4H 2 O (79.2 mg, 0.4 mmol), MgCl 2 • 6H 2 O (162.6 mg, 0.8 mmol), DTT (306 mg, 2 mmol), KCl (1.04 g, 15 mmol) NaN 3 (20 mg, 0.31 mmol) and UDP (90 mg, 0, 19 mmol) in HEPES buffer (100 mM, pH 7.5; 200 ml) was adjusted to pH 7.5 with 10 N and NaOH, and enzymes, UDPGE (10 units), UDPGE (20 units) were added to the solution. PK (100 U), GalT (5 U) and PPase (100 U). The resulting mixture was carefully stirred under argon at room temperature (25 ° C.) for 5 days. The resulting mixture was concentrated and chromatographed on silica gel, eluting with CHCl 3 - EtOAc-MeOH (5: 2: 2 to 5: 2: 3) to obtain a disaccharide, which is further purified on Sephadex G25, eluting with water, to obtain LacNac β-O-allyl (compound 41) (1.7 g, 50%).
1H-ЯМР (D2O) δ : 2.0 (3H, s, NHAc), 3.49 (1H, dd, J 7.84, 9.97 Hx, H-2 of Gal), 3.52-5.57 (1H, m, H-5 of GlcNAc), 3.63 (1H, dd, J 3.31, 10.04 Hz, H-3 of Gal), 3.65 - 3.75 (8H, m), 3.79 (1H, dd, J 5.10, 12.27 Hz, H-6a of GlcNAc), 3.88 (1H, br d, J 3.22 Hz, H-4 of Gal), 3.95 (1H, dd, J 2.14, 12.27 Hz, H-6b of GlcNAc), 4.43 (1H, d, J 7.81 Hz, H-1 of Gal), 4.55 (1H, d, J 8.28 Hz, H-1 of GlcNAc), 5.21-5.29 (2H, m, allylic), 5.83-5.90 (1H, m, allylic), 13C NMR (D2O) δ : 22.6, 55.5, 60.5, 61,5 69.0, 70.9, 71.4, 72.9, 75.2, 75.8, 78.8, 100.4, 103.3, 118.6, 133.7. 1 H-NMR (D 2 O) δ: 2.0 (3H, s, NHAc), 3.49 (1H, dd, J 7.84, 9.97 Hx, H-2 of Gal), 3.52-5.57 (1H, m, H-5 of GlcNAc), 3.63 (1H, dd, J 3.31, 10.04 Hz, H-3 of Gal), 3.65 - 3.75 (8H, m), 3.79 (1H, dd, J 5.10, 12.27 Hz, H-6a of GlcNAc) , 3.88 (1H, br d, J 3.22 Hz, H-4 of Gal), 3.95 (1H, dd, J 2.14, 12.27 Hz, H-6b of GlcNAc), 4.43 (1H, d, J 7.81 Hz, H- 1 of Gal), 4.55 (1H, d, J 8.28 Hz, H-1 of GlcNAc), 5.21-5.29 (2H, m, allylic), 5.83-5.90 (1H, m, allylic), 13 C NMR (D 2 O) δ: 22.6, 55.5, 60.5, 61.5 69.0, 70.9, 71.4, 72.9, 75.2, 75.8, 78.8, 100.4, 103.3, 118.6, 133.7.
(b) Соединение 1-13C-41 со схемы 15.(b) Compound 1- 13 C-41 from the
Раствор соединения 40 (1.15 г 4.4 ммоль) 1-13C-Gal (99 атомных %, Isotec. Inc. , Miamisburg; 800 мг, 4.4 ммоль), PEP K соль (1.82 г, 8.8 ммоль, 95%), UDP (90 мг, 0.19 ммоль), ATP (100 мг, 0.18 ммоль), цистеина (116 мг, 0.96 ммоль), DTT (183 мг, 1.2 моль) MgCl2 • H2O (244 мг, 1.2 ммоль) MnCl2 • 4H2O (118 мг, 0.6 ммоль), KCl(179 мг, 2.4 ммоль) и Glc-1-Р (77 мг, 0.22 ммоль) в HEPES буфере (100 мМ, pH 7.5; 120 мл) доводят до pH 7.5 с помощью 10 н и н NaOH, и ферменты, GK (10 ед), PK (200 ед), РРазу (10 ед), Gal-1-Р UT (10 ед), UDPGP (10 ед) и GalT (10 ед) добавляют к раствору. Полученную смесь осторожно перемешивают в атмосфере аргона при комнатной температуре (примерно 25oC) в течение 3 дней. Полученную смесь концентрируют в вакууме, а остаток хроматографируют на силикагеле смесью EtOAc-MeOH (2:1) до получения дисахарида, который далее очищают на хроматографической колонке Sephadex G25, элюируя водой, до получения соединения 1-13C-41 (106 г, 57%).A solution of compound 40 (1.15 g 4.4 mmol) of 1- 13 C-Gal (99 atomic%, Isotec Inc., Miamisburg;. 800 mg, 4.4 mmol), PEP K salt (1.82 g, 8.8 mmol, 95%), UDP ( 90 mg, 0.19 mmol), ATP (100 mg, 0.18 mmol), cysteine (116 mg, 0.96 mmol), DTT (183 mg, 1.2 mol) MgCl 2 • H 2 O (244 mg, 1.2 mmol) MnCl 2 • 4H 2 O (118 mg, 0.6 mmol), KCl (179 mg, 2.4 mmol) and Glc-1-P (77 mg, 0.22 mmol) in HEPES buffer (100 mM, pH 7.5; 120 ml) were adjusted to pH 7.5 using 10 n and NaOH, and enzymes, GK (10 units), PK (200 units), PPase (10 units), Gal-1-P UT (10 units), UDPGP (10 units) and GalT (10 units) are added to the solution. The resulting mixture was carefully stirred in argon atmosphere at room temperature (approximately 25 o C) for 3 days. The resulting mixture was concentrated in vacuo and the residue chromatographed on silica gel using EtOAc-MeOH (2: 1) to give a disaccharide, which was further purified by column chromatography on Sephadex G25, eluting with water, to obtain the compound 1- 13 C-41 (106 g, 57 %).
1H-ЯМР (D2O) δ : 2.00 (3H, с, NHAc), 3.48-3.52 (1H, м, H-2 Gal), 4.43 (1H, дд, Jн-1,н-2 8.32, Jн-1,13с-1 162.33 Гц, H-1 Gal), 4.54 (1H, д, J = 8.32 Гц, H-1 GlcNAc). BPCM рассчитано для 12C1613CH29NO11Na (M+Na+) 447.1672, найдено 447.1681. 1 H-NMR (D 2 O) δ: 2.00 (3H, s, NHAc), 3.48-3.52 (1H, m, H-2 Gal), 4.43 (1H, dd, J n-1, n-2 8.32, J n-1.13 s-1 162.33 Hz, H-1 Gal), 4.54 (1H, d, J = 8.32 Hz, H-1 GlcNAc). BPCM calculated for 12C 16 13CH 29 NO 11 Na (M + Na + ) 447.1672, found 447.1681.
(c) 2-дезокси-D-галактопиранозил -β (1.4)-2-ацетамидо-2-дезокси-глюкопираноза, соединение 41b. (c) 2-deoxy-D-galactopyranosyl-β (1.4) -2-acetamido-2-deoxy-glucopyranose, compound 41b.
(36%): Оба спектра 1H-ЯМР: его гептаацетата 13C ЯМР спектр соединения 41a находятся в хорошем соответствии с литературными данными (Thiem el al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30: 1163 (1991)).(36%): Both 1 H-NMR spectra: its heptaacetate 13 C NMR spectrum of
(d) 2-амино-2-дезокси-D-галактопиранозил -β-(1,4)-2-ацетамидо-2-дезокси-глюкопираноза (соединение 41b). (d) 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranosyl-β- (1,4) -2-acetamido-2-deoxy-glucopyranose (compound 41b).
(12%): 1H-ЯМР для HCl соли (D2O) δ : 2.022, 2.024 (с, NHAc α и β аномеры GlcNAc), 3.17 - 3.23 (1H, м, H-2 GalN), 4.67 (д. J = 7.53 Гц, H-ib GlcNAc), 5.13 (д. J = 1.54 Гц, H-1a GlcNAc). BPMC рассчитано для C14H26N2O10Na (M+Na+) 405.1485, найдено 405.489,
1H ЯМР его ацетатной формы находится в хорошем соответствии в литературными данными (Palcic et al., Glycobioljgy, 1:205 (1991)).(12%): 1 H-NMR for HCl salt (D 2 O) δ: 2.022, 2.024 (s, NHAc α and β anomers GlcNAc), 3.17 - 3.23 (1H, m, H-2 GalN), 4.67 (d J = 7.53 Hz, H-ib GlcNAc), 5.13 (d. J = 1.54 Hz, H-1a GlcNAc). BPMC calculated for C 14 H 26 N 2 O 10 Na (M + Na + ) 405.1485, found 405.489,
1 H NMR of its acetate form is in good agreement with published data (Palcic et al., Glycobioljgy, 1: 205 (1991)).
(e) Этил-D-галактопиранозил -β-(1,4)-2-азидо-2-дезокси-D-глюкопиранозид (соединение 41c). (e) Ethyl-D-galactopyranosyl-β- (1,4) -2-azido-2-deoxy-D-glucopyranoside (
В этом случае DTT исключается, так как 2-азидогруппа восстанавливается до соответствующего амина за счет DTT. In this case, DTT is excluded, since the 2-azido group is reduced to the corresponding amine due to DTT.
(15%): 1H ЯМР β-аномер (D2O) δ : 1.22 (1H, т, J = 7.80 Гц, OCH2CH3), 3.27 (1H, J = 8.33, 9.64 Гц, H-2 GlcN3), 4.40 (1H, д, J - 7.81 Гц, H-1 Gal), 4.55 (1H, 8.24 Гц, H-1 GlcN3). BPMC рассчитано для C14H25N3O10Na (M+Na+) 418.1438, найдено 418.1438.(15%): 1 H NMR β-anomer (D 2 O) δ: 1.22 (1H, t, J = 7.80 Hz, OCH 2 CH 3 ), 3.27 (1H, J = 8.33, 9.64 Hz, H-2 GlcN 3 ), 4.40 (1H, d, J - 7.81 Hz, H-1 Gal), 4.55 (1H, 8.24 Hz, H-1 GlcN 3 ). BPMC calculated for C 14 H 25 N 3 O 10 Na (M + Na + ) 418.1438, found 418.1438.
Акцептор, этил-2-азидо-2-дезокси-D-глюкопиранозид, получают следующим образом. Триацетил-D-глюкаль азидонитрируют (Lemieux et al., Can. J. Chem., 57: 1244 (1979)) (NaN3 и Ce(NH4)2 (NO3)6 в CH3CN) и ацетолизируют (NaOAc в AcOH) до получения 2-азидо-1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-дезокси -D-глюкопиранозы, которую обрабатывают TiBr4 в CH2Cl2 и EtOAc, получая гликозилбромид, затем гликозилируют EtOH в присутствии AgOTf и МС 4 
1H-ЯМР (D2O) δ : 1.21 (т, J=7.80 Гц OCH2CH3 β аномера), 1.22 (т,J = 7.80 Гц, OCH2CH3), 2.99 (дд, J=7.43, 9.83 Гц, H-2 β- аномера), 5.11 (g, J=3.58 Гц, H-1 α-/ аномера). ВРМС рассчитано для C8H15N3O5Cs (M+Cs) 366.0066, найдено 366.066. 1 H-NMR (D 2 O) δ: 1.21 (t, J = 7.80 Hz OCH 2 CH 3 β anomer), 1.22 (t, J = 7.80 Hz, OCH 2 CH 3 ), 2.99 (dd, J = 7.43, 9.83 Hz, H-2 β-anomers), 5.11 (g, J = 3.58 Hz, H-1 α- / anomers). HRMS calculated for C 8 H 15 N 3 O 5 Cs (M + Cs) 366.0066, found 366.066.
Пример 12. Сиалилирование (схема 16). Example 12. Sialylation (Scheme 16).
(a) соединение 42. (a)
Раствор соединения 1-13C-41 (210 мг, 0.50 мкмоль), NeuAc (160 мг, 0.52 мкмоль), PEP Na3 соль (120 мг, 0.51 ммоль), MgCl2•6H2O (20 мг, 0.10 ммоль), MnCl2•4H2O (4.9 мг, 0.025 ммоль), KCl (7.5 мг, 0.10 ммоль), CMP (16 мг, 0.05 ммоль), ATP (2.7 мг, 0.005 мкмоль) и меркаптоэтанола (0.34 мл) в буфере HEPES (200 мМ, pH 7.5; 3.5 мл) доводят до pH 7.5 с помощью NaOH, и к полученному раствору добавляют NMK (5 ед), PK (100 ед), PPазу (10 ед), CMP-NeuAc синтетазу (0.4 ед) и α 2,3 SiaT (0.1 ед). Полученную смесь осторожно перемешивают при комнатной температуре (25oC) в течение 3 дней. Полученную смесь концентрируют, и остаток обрабатывают хроматографически на силикагеле, элюируя EtOAc-изо PrOH-H2O (2:2:1) до получения трисахарида, который далее очищают BioGel P-2 с водой до получения соединения 42 (88 мг, 24%).A solution of Compound 1- 13 C-41 (210 mg, 0.50 mmol), NeuAc (160 mg, 0.52 mmol), PEP Na salt of 3 (120 mg, 0.51 mmol), MgCl 2 • 6H 2 O (20 mg, 0.10 mmol) , MnCl 2 • 4H 2 O (4.9 mg, 0.025 mmol), KCl (7.5 mg, 0.10 mmol), CMP (16 mg, 0.05 mmol), ATP (2.7 mg, 0.005 mmol) and mercaptoethanol (0.34 ml) in HEPES buffer (200 mM, pH 7.5; 3.5 ml) was adjusted to pH 7.5 with NaOH, and NMK (5 units), PK (100 units), PPase (10 units), CMP-NeuAc synthetase (0.4 units) were added to the resulting solution.
1H NMP (D2O) d 1.81 (1H, br t, J 12.02 Hz, H-3ax NeuAc), 2.04 (6H, s, NHAc GlcNAc и NeuAc), 2.76 (1H, dd, J 4.57, 12.33 Hz, H-1eq NeuAc), 3.96 (1H, br d, J 3.10 Hz, H-4 Gal), 4.13 (1H, dd, J 3.09, 9.94 Hz, H-3 Gal), 4.56 (1H, dd, Jн-1,н-2 7.83, Jн-1,13с 162.78 Hz, H-1 Gal), 4.58 (1H, d, J 8.32 Hz, H-1 GlcNAc). HRMS рассчитано для C27H44N2O19Cs2 (M-H++2Cs+) 980.0759, найдено 980.0720. 1 H NMP (D 2 O) d 1.81 (1H, br t, J 12.02 Hz, H-3ax NeuAc), 2.04 (6H, s, NHAc GlcNAc and NeuAc), 2.76 (1H, dd, J 4.57, 12.33 Hz, H-1eq NeuAc), 3.96 (1H, br d, J 3.10 Hz, H-4 Gal), 4.13 (1H, dd, J 3.09, 9.94 Hz, H-3 Gal), 4.56 (1H, dd, J n- 1, n-2 7.83, J n-1.13 s 162.78 Hz, H-1 Gal), 4.58 (1H, d, J 8.32 Hz, H-1 GlcNAc). HRMS calculated for C 27 H 44 N 2 O 19 Cs 2 (MH + + 2Cs + ) 980.0759, found 980.0720.
(b) NeuAca a2,3'Lactal соединение 43 (82 mg). (b) NeuAca a2,3'Lactal Compound 43 (82 mg).
1H NMR (D2O, 320oK) δ : 1.84 (1H, br t, J 12.18 Hz, H-3eq NeuAc), 2.08 (3H, s, NHAc NeuAc), 2.82 (1H, dd, J 4.46, 12.32 Hz, H-3eq NeuAc), 4.01 (1H, br d, J 2.50 Hz, H-4 Gal), 4.16 (1H, dd, J 2.50, 9.50 Hz, H-3 Gal), 4.43 (1H, dt, J 1.18, 6.46 Hz, H-3 Glucal), 4.65 (1H, d, J 7.86 Hz, H-1 Gal), 4.88 (1H, dd, J 2.63, 6.07 Hz, H-2 Glucal) и 6.51 (1H, dd, J 1.45, 6.08 Hz, H-1 Glucal). HRMS рассчитано для C23H35NO17NaCs2 (M-H++2Cs+) 864.0092, найдено 864.0066. 1 H NMR (D 2 O, 320 o K) δ: 1.84 (1H, br t, J 12.18 Hz, H-3eq NeuAc), 2.08 (3H, s, NHAc NeuAc), 2.82 (1H, dd, J 4.46, 12.32 Hz, H-3eq NeuAc), 4.01 (1H, br d, J 2.50 Hz, H-4 Gal), 4.16 (1H, dd, J 2.50, 9.50 Hz, H-3 Gal), 4.43 (1H, dt, J 1.18, 6.46 Hz, H-3 Glucal), 4.65 (1H, d, J 7.86 Hz, H-1 Gal), 4.88 (1H, dd, J 2.63, 6.07 Hz, H-2 Glucal) and 6.51 (1H, dd, J 1.45, 6.08 Hz, H-1 Glucal). HRMS calculated for C 23 H 35 NO 17 NaCs 2 (MH + + 2Cs + ) 864.0092, found 864.0066.
Пример 13. Фукозилирование (схема 17). Example 13. Fucosylation (Scheme 17).
(a) соединения 44, 45 и 46. (a) compounds 44, 45 and 46.
Раствор FucT (0.02 ед., 2 мл) добавляют к раствору соединения 42 (23 мг, 0.031 ммоль) и GDP-Fuc (Ichikawa et al., J. Org. Chem., в печати) (24 мг, 0.036 ммоль) в буфере HEPES (3 мл, 200 мМ, pH 7.5), содержащем 5 мМ АРТ, 20 мМ Mn2+. Полученную смесь осторожно перемешивают в атмосфере аргона в течение 5 дней при комнатной температуре (25oC). Аналогичный результат получают, используя раствор, содержащий соединение 42 (23 мг, 0.031 ммоль) и GDP-Fuc (70 мг, 0.105 ммоль) в буфере HEPES (1 мл, 200 мМ, pH 7.4), содержащем Mn2+ (25 мМ) и α-1,3 FucT раствор (0.01 ед), который обрабатывают аналогичным образом. Полученную смесь концентрируют и хроматографируют на силикагеле, элюируя EtOAc-изо PrOH-H2O (2:2:1), до получения тетрасахарида, который далее очищают BiOGel P-2 с водой. Элюат пропускают через колонку Dowex 50W-XB [H+] , элюируют водой до удаления Mn2+ катионов, нейтрализуют н NaOH и диофилизируют до получения соединения 44 (18 мг), аналогично, соединения 45 (42 мг) и 46 (51 мг) получают таким же способом.A solution of FucT (0.02 units, 2 ml) was added to a solution of compound 42 (23 mg, 0.031 mmol) and GDP-Fuc (Ichikawa et al., J. Org. Chem., In press) (24 mg, 0.036 mmol) in HEPES buffer (3 ml, 200 mM, pH 7.5) containing 5 mM ART, 20 mM Mn 2+ . The resulting mixture was carefully stirred in argon atmosphere for 5 days at room temperature (25 o C). A similar result is obtained using a solution containing compound 42 (23 mg, 0.031 mmol) and GDP-Fuc (70 mg, 0.105 mmol) in HEPES buffer (1 ml, 200 mm, pH 7.4) containing Mn 2+ (25 mm) and α-1,3 FucT solution (0.01 u), which is treated in a similar manner. The resulting mixture was concentrated and chromatographed on silica gel, eluting with EtOAc-iso PrOH-H 2 O (2: 2: 1) to obtain a tetrasaccharide, which was further purified by BiOGel P-2 with water. The eluate was passed through a Dowex 50W-XB [H + ] column, eluted with water until Mn 2+ cations were removed, neutralized with NaOH and diophilized to give compound 44 (18 mg), similarly, compound 45 (42 mg) and 46 (51 mg) get in the same way.
Соединение 44: 1H-NMR (D2O) δ : 1.11 (3H, d, J 6.61 Hz, 6-CH3 Fuc), 1.73 (1H, br t, J 12.04 Hz, H-3ax NeuAc), 1.96 (3H, s, NHAc GlcNAc), 1.97 (3H, s, NHAc NeuAc), 2.69 (1H, dd, J 4.52, 12.38 Hz, H-2eq NeuAc), 3.46 (1H, dt, J 7.00, 9.68 Hz, H-2 Gal), 3.71 (1H br d, J 3.00 Hz, H-4 Fuc), 4.02 (1H, dd, J 2.94, 9.78 Hz, H-3 Gal), 4.46 (1H, dd, J1,2 7.90, J13C,H 162.13 Hz, H-1 Gal), 4.52 (1H, d, J 8.41 Hz, H-1 GlcNAc), 5.04 (1H, d, J 3.98 Hz, H-1 Fuc).Compound 44: 1 H-NMR (D 2 O) δ: 1.11 (3H, d, J 6.61 Hz, 6-CH 3 Fuc), 1.73 (1H, br t, J 12.04 Hz, H-3ax NeuAc), 1.96 ( 3H, s, NHAc GlcNAc), 1.97 (3H, s, NHAc NeuAc), 2.69 (1H, dd, J 4.52, 12.38 Hz, H-2eq NeuAc), 3.46 (1H, dt, J 7.00, 9.68 Hz, H- 2 Gal), 3.71 (1H br d, J 3.00 Hz, H-4 Fuc), 4.02 (1H, dd, J 2.94, 9.78 Hz, H-3 Gal), 4.46 (1H, dd, J 1.2 7.90, J 13C, H 162.13 Hz, H-1 Gal), 4.52 (1H, d, J 8.41 Hz, H-1 GlcNAc), 5.04 (1H, d, J 3.98 Hz, H-1 Fuc).
Соединение 45: 1H-NMR (D2O) δ : 1.17 (3H, d, J 6.61 Hz, 6-CH3 Fuc), 2.03 (3H, s, NHAc GlcNAc), 3.50 (1H, ddd, J 6.47, 7.86, 9.86 Hz, H-2 Gal), 3.80 (1H, br d, J 2.88 Hz, H-4 Fuc), 4.46 (1H, dd, J1,2 7.79, J13C,H 161.45 Hz, Hz H-1 Gal), 4.59 (1H, d, J 8.44 Hz, H-1 GlcNAc), 4.84 (1H, br q, J 7.50 Hz, H-5 Fuc), 5.11 (1H, d, J 3.90 Hz, H-1 Fuc).Compound 45: 1 H-NMR (D 2 O) δ: 1.17 (3H, d, J 6.61 Hz, 6-CH 3 Fuc), 2.03 (3H, s, NHAc GlcNAc), 3.50 (1H, ddd, J 6.47, 7.86, 9.86 Hz, H-2 Gal), 3.80 (1H, br d, J 2.88 Hz, H-4 Fuc), 4.46 (1H, dd, J 1.2 7.79, J 13C, H 161.45 Hz, Hz H- 1 Gal), 4.59 (1H, d, J 8.44 Hz, H-1 GlcNAc), 4.84 (1H, br q, J 7.50 Hz, H-5 Fuc), 5.11 (1H, d, J 3.90 Hz, H-1 Fuc).
Соединение 46: 1H-NMR (D2O, 320 K) δ : 1.11 (3H, d, J 6.61 Hz, 6-CH3 Fuc), 1.84 (1H, br t, J 12.00 Hz, H-2ax NeuAc), 2.08 (3H, s, NHAc NeuAc), 2.80 (1H, dd, J 4.52, 12.38 Hz, H-3eq NeuAc), 4.49 (1H, br q, J 7.50 Hz, H-5 Fuc), 4.64 (1H, d, J 8.0 Hz, H-1 Gal), 5.02 (1H, dd, J 2.5, 6.0 Hz, Glucal), 5.09 (1H, d, J 3.98 Hz, H-1 Fuc), 6.51 (1H, dd, J 1.5, 6.0 Hz, H-1 Glucal).Compound 46: 1 H-NMR (D 2 O, 320 K) δ: 1.11 (3H, d, J 6.61 Hz, 6-CH 3 Fuc), 1.84 (1H, br t, J 12.00 Hz, H-2ax NeuAc) , 2.08 (3H, s, NHAc NeuAc), 2.80 (1H, dd, J 4.52, 12.38 Hz, H-3eq NeuAc), 4.49 (1H, br q, J 7.50 Hz, H-5 Fuc), 4.64 (1H, d, J 8.0 Hz, H-1 Gal), 5.02 (1H, dd, J 2.5, 6.0 Hz, Glucal), 5.09 (1H, d, J 3.98 Hz, H-1 Fuc), 6.51 (1H, dd, J 1.5, 6.0 Hz, H-1 Glucal).
(b) Gal β-1,4Fuc α-1,3/-(5-тио)Glc
Раствор Gal β-1,4/5-тио/Glc (30 мг, 84 ммоль), GDP-Fuc (60 мг, 84 ммоль) и α-1,3/4FucT (0.5 ед.) в Na-кокадилатном буфере (5.4 мл, 50 мМ, pH 6.2), содержащем 5 мМ ATP и 20 мМ MnCl2, перемешивают в течение двух дней при комнатной температуре. Rf значения исходного материала и продукта составляют 0.39 и 0.31, соответственно в EtOAc / AcOH / H2O 3 : 2 : 1 на ТСХ на двуокиси кремния. Реакционную смесь вводят непосредственно в колонку Sephadex G25 Superfine (1.5 x 30 см), и элюируют водой. Фракции, содержащие продукт, собирают и последовательно пропускают через колонки QAE - Sephadeх и Dowex 50-XB [H+] с водой. Элюат собирают и лиофилизируют (21 мг).(b) Gal β-1,4Fuc α-1,3 / - (5-thio) Glc
A solution of Gal β-1,4 / 5-thio / Glc (30 mg, 84 mmol), GDP-Fuc (60 mg, 84 mmol) and α-1,3 / 4FucT (0.5 units) in Na-cadylate buffer ( 5.4 ml, 50 mM, pH 6.2) containing 5 mM ATP and 20 mM MnCl 2 was stirred for two days at room temperature. R f the values of the starting material and product are 0.39 and 0.31, respectively, in EtOAc / AcOH / H 2 O 3: 2: 1 on TLC on silica. The reaction mixture was injected directly into a Sephadex G25 Superfine column (1.5 x 30 cm) and eluted with water. The fractions containing the product are collected and sequentially passed through QAE — Sephadex and Dowex 50-XB [H + ] columns with water. The eluate was collected and lyophilized (21 mg).
1H ЯМР (D2O, 20oC) δ : 1.13 (3H, д, J = 6.7 Гц, 6-CH3 Fuc), 3.40 (1H, дд, J = 6.4 и 11.7 Гц), 3.60 (1H, дд, J = 3.6 и 11.7 Гц), 4.52 (1H, д, J = 7.9 Гц), 4.95 (1H, J = 2.6 Гц), 5.34 (1H, д. J = 3.8 Гц). 1 H NMR (D 2 O, 20 o C) δ: 1.13 (3H, d, J = 6.7 Hz, 6-CH 3 Fuc), 3.40 (1H, dd, J = 6.4 and 11.7 Hz), 3.60 (1H, dd, J = 3.6 and 11.7 Hz), 4.52 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.95 (1H, J = 2.6 Hz), 5.34 (1H, d. J = 3.8 Hz).
Пример 14. Кинетические исследования ферментов. Example 14. Kinetic studies of enzymes.
(a) Для FucT. (a) For FucT.
Процедура анализа практически та же, что описана ранее (Fukowska - Latallo et al., Gene and Development, 4: 1288 (1990)) с некоторыми модификациями. Приготавливают свежую исходную смесь, состоящую из 0.25 мМ GDP-13C-Fuc (5000 срм/мл), 6.25 мМ ATP, 25 мМ MnCl2 и 62.5 мМ буфера-какодилата натрия, pH 6.2, и хранят на льду. К этому раствору добавляют FucT непосредственно перед использованием, и реакцию начинают, соединяя 16 мкл этой смеси и 4 мкл 100 мМ акцептора (полный объем инкубируемого раствора 20 мкл). Инкубирование ведут при 37oC в течение 30 - 240 мин в зависимости от исследуемого акцептора. Отдельные анализы без акцептора проводят для внесения поправки на фоновый гидролиз GDP-Fuc. После завершения инкубирования добавляют 400 мкл 25% (объем/объем) суспензии QAE-Sephadex. Эти суспензии осторожно перемешивают при комнатной температуре в течение 10 минут перед центрифугированием при 13 000 об/мин в течение 1 мин. Из надосадочной жидкости экстрагируют 200 мкл, и смешивают с 10 мл сцинтилляционной смеси. Радиоактивность определяют на сцинтилляционном счетчике. Принимают предосторожность, чтобы убедиться, что 10% ферментативной реакции прошло за период инкубирования. Этот анализ можно вести в отсутствии ATP.The analysis procedure is almost the same as described previously (Fukowska - Latallo et al., Gene and Development, 4: 1288 (1990)) with some modifications. Prepare a fresh stock mixture consisting of 0.25 mM GDP- 13 C-Fuc (5000 cpm / ml), 6.25 mM ATP, 25 mM MnCl 2 and 62.5 mM sodium cacodylate buffer, pH 6.2, and stored on ice. FucT was added to this solution immediately before use, and the reaction was started by combining 16 μl of this mixture and 4 μl of a 100 mM acceptor (total incubated solution volume of 20 μl). Incubation is carried out at 37 o C for 30 to 240 minutes, depending on the acceptor under study. Separate analyzes without an acceptor are performed to adjust for background hydrolysis of GDP-Fuc. After incubation is complete, 400 μl of a 25% (v / v) QAE-Sephadex suspension is added. These suspensions are carefully mixed at room temperature for 10 minutes before centrifugation at 13,000 rpm for 1 minute. 200 μl was extracted from the supernatant and mixed with 10 ml of scintillation mixture. Radioactivity is determined on a scintillation counter. Take care to ensure that 10% of the enzymatic reaction has passed during the incubation period. This analysis can be performed in the absence of ATP.
(b) для GalT. (b) for GalT.
Начальные скорости ферментативной реакции определяют, измеряя скорость образования LacNAc с небольшой модификацией Pierce et al. (Pierce et al., Anal. Biochem. , 102: 441 (1980)). Все реакции ведут в 100 мМ какодилатном буфере (pH 7.5), с фиксированной концентрацией Mn2+ (9.3 мМ) и UDP-Gal (0.1 мМ; 58.5 срм/пмоль UDP-14C-Gal) в 100 мл раствора. Реакцию инициируют, добавляя GalT (0.05 ед., 120 мг протеина; от Сигмы) и оставляют выстаиваться при 20oC в течение 30 мин. Неспецифический гидролиз UDP-Gal определяют с помощью контрольной реакции без GalT. Реакцию останавливают, пропуская через колонку QAE-Sephadex (700 мл) и элюируя при небольшом давлении воздуха для удаления непрореагировавшего UDP-Ga1. Реакционную ампулу дважды промывают 400 мл воды каждый раз, и реакционную смесь пропускают через колонку со смолой. Полученные фильтраты собирают и непосредственно переносят в сцинтилляционную ампулу. В ампулу добавляют сцинтилляционную жидкость, а затем определяют радиоактивность с помощью счетчика. Полученные данные анализируют методом двойного обратного приближения до получения Km (1.5 мМ для GlcNAc) (величина 1.3 ± 1 мМ сообщалась Palcic et al., Carbohydr. Rev. 159: 315 (1987)), а Ki (0.46 ± 0.06 мМ) для UDP. Аналогично ИК50 величина для GalT была определена с использованием различных концентраций UDP.Initial enzymatic reaction rates are determined by measuring the rate of formation of LacNAc with a slight modification of Pierce et al. (Pierce et al., Anal. Biochem., 102: 441 (1980)). All reactions are carried out in 100 mM cacodylate buffer (pH 7.5), with a fixed concentration of Mn 2+ (9.3 mM) and UDP-Gal (0.1 mM; 58.5 cpm / pmol UDP- 14 C-Gal) in 100 ml of solution. The reaction is initiated by adding GalT (0.05 units, 120 mg of protein; from Sigma) and allowed to stand at 20 o C for 30 minutes Non-specific hydrolysis of UDP-Gal is determined using a control reaction without GalT. The reaction is stopped by passing through a QAE-Sephadex column (700 ml) and eluting at low air pressure to remove unreacted UDP-Ga1. The reaction vial was washed twice with 400 ml of water each time, and the reaction mixture was passed through a resin column. The resulting filtrates are collected and directly transferred to a scintillation vial. Scintillation fluid is added to the ampoule, and then radioactivity is determined using a counter. The data obtained are analyzed by the double inverse approximation method to obtain K m (1.5 mM for GlcNAc) (1.3 ± 1 mM reported by Palcic et al., Carbohydr. Rev. 159: 315 (1987)), and K i (0.46 ± 0.06 mM) for UDP. Similarly, the IR 50 value for GalT was determined using various concentrations of UDP.
Пример 15. GDP-Fuc образующий фермент, используемый в схеме 19. Example 15. GDP-Fuc-forming enzyme used in
(a) Получение энзима (GDP-FucS). (a) Production of an enzyme (GDP-FucS).
Бактерию Klebsiella pneumonia, ATCC 12 658 выращивают в 2 л среды, содержащей 10 г казаминовой кислоты (Дифко), 5 г экстракта дрожжей, 3 г K2HPO4 1 г KH2PO4 и 5 г D-глюкозы на литр (pH 7.0). После инкубирования при 37oC в течение 18 ч клетки собирают центрифугированием (10000 g, 50 мин, 4oC) и снова суспендируют в 50 мМ tris буфера, содержащего 0.5 мМ DTT. Клетки разрушают во французском прессе при 16000 фунт/дюйм (1125 кг/см2). Клеточные осколки удаляют центрифугированием при 23000 g в течение 60 мин, и надосадочную жидкость (экстракт без клеток) используют для очистки фермента. Не содержащий клеток экстракт (50 мл) для 2 л культуры обрабатывают 50 мг протаминсульфата, и образовавшийся осадок удаляют после центрифугирования. Твердый сульфат аммония добавляют при медленном перемешивании до тех пор, пока не достигают 70% насыщения (0.436 г/мл при 0oC). После центрифугирования осадок собирают и снова суспендируют в 20 мл буфера (50 мМ tris, содержащего 0.5 мМ DTT, pH 7.5) и диализуют в течение ночи при 4oC в 4 л того же буфера.The bacterium Klebsiella pneumonia,
Оставшийся раствор (2 мл) пропускают затем через DEAE-Sepharose CL-6B колонку (Pharmacia) (3 • 30 см), предварительно уравновешенную тем же буфером. Фермент элюируют с линейным градиентом NaCl от 0 до 1 мМ в том же самом буфере (всего 400 мл). Активные фракции собирают и диализуют в 2 л 50 мМ tris буфера, содержащего 0.5 мМ DTT (pH 7.5). Этот препарат GDP-FucS фермента используют для получения GDP-Fuc Активность оценивают в около 0.05 ед/мл на основании см обращенной фазой и NADH окислительного анализа
(b) Ферментативное получение и регенерация GDP-Fuc из Man-I-P, схема 19.The remaining solution (2 ml) was then passed through a DEAE-Sepharose CL-6B column (Pharmacia) (3 x 30 cm), previously equilibrated with the same buffer. The enzyme is eluted with a linear NaCl gradient from 0 to 1 mM in the same buffer (400 ml total). Active fractions are collected and dialyzed in 2 L of 50 mM tris buffer containing 0.5 mM DTT (pH 7.5). This GDP-FucS enzyme preparation is used to produce GDP-Fuc. Activity is estimated at about 0.05 U / ml based on see reverse phase and NADH oxidative analysis.
(b) Enzymatic production and regeneration of GDP-Fuc from Man-IP,
Раствор имидазола (10 мМ), Man-I-P (10 мМ), GDP (10 мМ), PEP (10 мМ), KF (5 мМ), Mg2+ (10 мМ), KC1 (20 мМ), NADP (2 мМ), EDTA (6 мМ), iPrOH (2%), PK (80 ед. ), TBDH (32 ед.), дрожжевые клетки (S, cerevisae 52 мг) высушенного замораживанием из 50 мМ Tris буфера, pH 7.5, GDP-Fuc S вырабатывающий фермент (400 мл) в HEPES буфере (pH 7.5) (полный объем раствора 2 мл) инкубируют при 37oC в атмосфере аргона в течение 18 ч.Imidazole solution (10 mM), Man-IP (10 mM), GDP (10 mM), PEP (10 mM), KF (5 mM), Mg 2+ (10 mM), KC1 (20 mM), NADP (2 mM), EDTA (6 mM), iPrOH (2%), PK (80 units), TBDH (32 units), yeast cells (S, cerevisae 52 mg), freeze-dried from 50 mM Tris buffer, pH 7.5, GDP -Fuc S producing enzyme (400 ml) in HEPES buffer (pH 7.5) (
ВЖЭХ колонка партисил 5 SAX (Watman Co.), 0.46 • 12,5 см с размером частиц 5 мм была использована. Подвижная фаза представляет собой 0.1 М фосфатный буфер (pH 3.5) со скоростью потока 0.5 мл/мин (давление 600 пси). Соединения определяют с помощью УФ детектора при 254 нм. Время удерживания для GDP-Man и GDP-Fuc составляет 9.92 и 13.4 мин соответственно. GDP-Fuc (5%) и GDP-Man (30%) образуются по данным ВЖЭХ анализа. An
Раствор соединения 41 или 42 (10 мМ в 2 мл HEPES буфера, pH 7.5, содержащий 5 мМ ATP и 20 мМ MnCl2) добавляют и полученную смесь перемешивают в течение 5 дней. ТСХ на пластине силикагеля: Rf = 0.28 для соединения 45 и 0.50 для соединения 41 с EtOAc : AcOH : H2O = 4 : 2 : 1 (объем/объем) и 0.56 для соединения 44, и 0.63 для соединения 42 с 1 М NH4OH : iPrOH = 1 : 2 : 4 (объем/объем).A solution of
Соединения 45 и 44 (8 и 4 мг каждый) выделяют и очищают как указано ранее.
Пример 16. Очищение GDP-фукозопирофосфорилазы для использования в схеме 20
(a) Получение фермента.Example 16. Purification of GDP-fucose pyrophosphorylase for use in
(a) Obtaining an enzyme.
Свиную печень (4 кг) гомогенизируют в охлажденном льдом 10 мМ MOPS, pH 7.5, с 1 мг/мл каждого антипаина, апротинина, химостатина, леупептина и пепстатина в смесителе Уоринга (пять 15-секундных циклов с высокой скоростью). Осколки клеток удаляют центрифугированием при 8000 g в течение 20 мин при 4oC. К надосадочной жидкости добавляют 1 л 2% раствора протаминсульфата. Смесь перемешивают в течение 5 мин, и осадок удаляют центрифугированием, как указано ранее. Твердый сульфат аммония медленно добавляют к надосадочной фракции до 50%-ного насыщения (0.291 г/мл при 0oC). После центрифугирования как указано ранее, осадок собирают и снова суспендируют в 1600 мл 1.2 M сульфата аммония.Pork liver (4 kg) was homogenized in ice-cold 10 mM MOPS, pH 7.5, with 1 mg / ml of each antipain, aprotinin, chymostatin, leupeptin and pepstatin in a Waring mixer (five 15-second high-speed cycles). Cell fragments are removed by centrifugation at 8000 g for 20 minutes at 4 ° C. 1 L of a 2% protamine sulfate solution is added to the supernatant. The mixture was stirred for 5 minutes and the precipitate was removed by centrifugation as previously indicated. Solid ammonium sulfate is slowly added to the supernatant fraction to 50% saturation (0.291 g / ml at 0 o C). After centrifugation as previously indicated, the precipitate was collected and resuspended in 1600 ml of 1.2 M ammonium sulfate.
Образец смешивают с суспензией фенилсефарозы (250 мл), которую уравновешивают в 1.2 M сульфата аммония. Смолу со связанным ферментом промывают 1.2 M сульфатом аммония (1.5 л), и ферментную активность элюируют 0.4 M сульфатом аммония (750 мл). Этот процесс повторяют в потоке до тех пор, пока основная часть ферментной активности не удается из образца. Часть фенилсефарозного элюата (200 мл) диализуют против 10 мМ MOPS, pH 7.5 и пропускают через колонку DEAE 5PW (15 см x 21.5 мм) уравновешенную в том же самом буфере. Ферментативную активность наблюдают в материале, который протекает через колонку, и концентрируют с помощью Amicon ультрафильтрационного устройства. The sample is mixed with a suspension of phenylsepharose (250 ml), which is balanced in 1.2 M ammonium sulfate. The resin with the bound enzyme is washed with 1.2 M ammonium sulfate (1.5 L), and the enzyme activity is eluted with 0.4 M ammonium sulfate (750 ml). This process is repeated in a stream until the bulk of the enzymatic activity fails from the sample. A portion of the phenylsepharose eluate (200 ml) was dialyzed against 10 mM MOPS, pH 7.5, and passed through a DEAE 5PW column (15 cm x 21.5 mm) balanced in the same buffer. Enzymatic activity is observed in the material that flows through the column and concentrated using an Amicon ultrafiltration device.
Затем образец подвергают гель-фильтрации на колонке TSK Gel 3000 SW9 (30 см x 21.5 мм), уравновешенной и промытой 50 мМ MOPS, pH 7.5 со 150 мМ KCl. Активные фракции собирают и хранят в виде 50%-ной суспензии сульфата аммония. Во время очистки GDP-Fuc пирофосфорилазу оценивают в соответствии со способом Ishihara и Health. (Ishihara et al., J. Biol. Chem., 243: 1110 (1968)). Одну единицу активности определяют как включение 1 ммоль неорганического 32P-пирофосфата в GTP в минуту.The sample was then subjected to gel filtration on a TSK Gel 3000 SW9 column (30 cm x 21.5 mm), balanced and washed with 50 mM MOPS, pH 7.5 with 150 mM KCl. Active fractions are collected and stored as a 50% suspension of ammonium sulfate. During purification of GDP-Fuc, pyrophosphorylase was evaluated according to the Ishihara and Health method. (Ishihara et al., J. Biol. Chem., 243: 1110 (1968)). One unit of activity is defined as the inclusion of 1 mmol of inorganic 32 P-pyrophosphate in GTP per minute.
(b) Регенерация GDP-фукозы с использованием GDP-фукозопирофосфорилазы, схема 20, синтез сиалил Льюис-X. (b) Regeneration of GDP-fucose using GDP-fucose pyrophosphorylase,
Раствор MOPC, pH 7,5 (50 мМ) Fuc -I-P (10 мМ), GDP (1 мМ), PEP (10 мМ), KF (5 мМ), Mg2+ (10 мМ), Mn2+ (10 мМ), PK (5 ед), сигнал-[3H]-LacNAc β- O-(CH2)6CO2Me (10 мМ) α-1,3 FucT (0,1 ед), неорганической фосфатазы (5 ед) и GDP-Fuc пирофосфорилазы (0,1 ед) смешивают в объеме 100 мл. Реакционную смесь инкубируют во вращающейся ампуле при комнатной температуре в течение 60 ч. Продукты собирают на Sep-Pac C18 колонке и элюируют 50%-ным метанолом. Образец сушат, выпаривая при пониженном давлении, снова суспендируют в воде, и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля со смесью изопропанол/IM ацетат аммония (6:1) в качестве растворителя. Сиалил Льюиса X /получают с выходом около 30%, по данным сцинцилляционного счетчика.MOPC solution, pH 7.5 (50 mm) Fuc-IP (10 mm), GDP (1 mm), PEP (10 mm), KF (5 mm), Mg 2+ (10 mm), Mn 2+ (10 mM), PK (5 u), signal- [3H] -LacNAc β- O- (CH 2 ) 6 CO 2 Me (10 mM) α-1,3 FucT (0.1 u), inorganic phosphatase (5 u ) and GDP-Fuc pyrophosphorylase (0.1 unit) are mixed in a volume of 100 ml. The reaction mixture was incubated in a rotating vial at room temperature for 60 hours. Products were collected on a Sep-Pac C18 column and eluted with 50% methanol. The sample was dried by evaporation under reduced pressure, resuspended in water, and analyzed by thin layer chromatography on silica gel plates with a mixture of isopropanol / IM ammonium acetate (6: 1) as a solvent. Cialyl Lewis X / receive with a yield of about 30%, according to a scintillation counter.
Пример 17. (2R)-метил-(5S)-гидросиметил-(3R, 4R)-дигидроксипирролидин (соединение 50). Example 17. (2R) -methyl- (5S) -hydrosimethyl- (3R, 4R) -dihydroxypyrrolidine (compound 50).
A. Цис-2,3-эпокси-1,4-бутан-диол. A. Cis-2,3-epoxy-1,4-butane-diol.
Цис-2,3-1,4-бутандиол получают из 1,4-дигидрокси-2-бутена в соответствии с процедурой, описанной Nelson et al., J. Med, Chem., 19: 153 (1976), за исключением того, что реакцию ведут при комнатной температуре в течение 36 ч. Cis-2,3-1,4-butanediol is obtained from 1,4-dihydroxy-2-butene in accordance with the procedure described by Nelson et al., J. Med, Chem., 19: 153 (1976), except that the reaction is carried out at room temperature for 36 hours
B. 2-азидо-2-дезокси-треитол. B. 2-azido-2-deoxy-threitol.
Раствор, содержащий цис-2,3-эпокси-1,4-бутан-диол (1.82 г, 17.50 ммоль), азид натрия (NaN3; 5.68 г, 5 эквивалентов) и хлорид аммония (NH4Cl, 4.68 г, 5 эквивалентов) в 100 мл метанола и 12 мл H2O нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 24 ч. Растворитель удаляют при пониженном давлении, добавляют этанол и осадок отфильтровывают. Процедуру осаждения повторяют несколько раз для удаления избытка NaN3 и NH4Cl, до получения 2-азидо-2-деокси-треитола в виде желтой жидкости (90%: Rf = 0.28), EtOAc (100%); ИК (чистый) 2109 см-1 (-N3);
1H ЯМР (COCD3) δ : 3.49 (1H, м), 3.59 (3H, м), 3.79 (5H, м), 4.03 (1H, т, J = 5.5 Гц), 4.19 (1H, д, J = 5.5 Гц), 4.30 (1H, т, J = 5.5 Гц) мд. BPMC (M + H+) рассчитано 148.0722, найдено 148.072.A solution containing cis-2,3-epoxy-1,4-butane-diol (1.82 g, 17.50 mmol), sodium azide (NaN 3 ; 5.68 g, 5 equivalents) and ammonium chloride (NH 4 Cl, 4.68 g, 5 equivalents) in 100 ml of methanol and 12 ml of H 2 O are heated under reflux for 24 hours. The solvent is removed under reduced pressure, ethanol is added and the precipitate is filtered off. The deposition procedure is repeated several times to remove excess NaN 3 and NH 4 Cl, to obtain 2-azido-2-deoxy-threitol as a yellow liquid (90%: R f = 0.28), EtOAc (100%); IR (neat) 2109 cm -1 (-N 3 );
1 H NMR (COCD 3 ) δ: 3.49 (1H, m), 3.59 (3H, m), 3.79 (5H, m), 4.03 (1H, t, J = 5.5 Hz), 4.19 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.30 (1H, t, J = 5.5 Hz) ppm. BPMC (M + H + ) calculated 148.0722, found 148.072.
C. 5-азидо-5-дезокси-L-ксило-гекслоз-1-фосфат. C. 5-azido-5-deoxy-L-xylohexlose-1-phosphate.
Раствор, содержащий 2-азидо-2-дезокси-треитол, полученный ранее (476 мг, 3.24 мл) в 10 мл H2O охлаждают до 0oC и добавляют периодат (NaIO4; 762 мг, 1.1 эквивалент). Спустя 10 мин исходный материал полностью исчезает, и новое пятно появляется в соответствии с данными тонкослойной хроматографии (Rf = 0.5, этилацетат). Хлорид бария (BaCl2 • 2H2O; 870 мг, 1.1 эквивалент) добавляют затем к раствору, и осадок отфильтровывают. Полученный раствор подкисляют до PH I Dowex 50 [H+]. Полученный таким образом рацемический 2-азидо-3-гидроксипропиональдегид не выделяют.A solution containing 2-azido-2-deoxy-threitol obtained previously (476 mg, 3.24 ml) in 10 ml of H 2 O is cooled to 0 ° C and periodate (NaIO 4 ; 762 mg, 1.1 equivalent) is added. After 10 min, the starting material completely disappears, and a new spot appears in accordance with thin layer chromatography (R f = 0.5, ethyl acetate). Barium chloride (BaCl 2 • 2H 2 O; 870 mg, 1.1 equivalent) is then added to the solution, and the precipitate is filtered off. The resulting solution was acidified to PH I Dowex 50 [H + ]. The racemic 2-azido-3-hydroxypropionaldehyde thus obtained was not isolated.
После фильтрования раствор, содержащий рацемат, доводят до pH 7 гидроксидом натрия (NaOH; 10 н). Затем добавляют дигидроксиацетонфосфат (1.5 ммоль), и полученный раствор доводят до pH 7 10 н NaOH. К этому раствору добавляют FDP альдолазу мускула кролика (500 ед), и полученный раствор медленно перемешивают в течение 2 дней. After filtering, the solution containing the racemate was adjusted to
Ферментативный анализ свидетельствует, что израсходован весь DHAP. Enzymatic analysis indicates that all DHAP has been consumed.
Указанное в заглавии соединение выделяют вначале в виде бариевой соли, добавляя два эквивалента BaCl2 • 2H2O к реакционной смеси. Температуру раствора поддерживают при -20oC в течение ночи (около 18 ч). Осадок выделяют и обрабатывают Dowex 50 [H+] в дистиллированной воде для удаления катионов бария. После фильтрования pH раствора устанавливают 7, и лиофилизируют до получения очищенного указанного в заглавии соединения (75%).The title compound was initially isolated as a barium salt by adding two equivalents of BaCl 2 · 2H 2 O to the reaction mixture. The temperature of the solution was maintained at -20 ° C. overnight (about 18 hours). The precipitate was isolated and treated with Dowex 50 [H + ] in distilled water to remove barium cations. After filtering, the pH of the solution was adjusted to 7, and lyophilized to obtain the purified title compound (75%).
1H-NMR (D2O) δ 3.13 (1H, d, J=9.5 Hz, H-3), 3.14 (1H, ddd, J=9.5, 5, 11 Hz, H-5), 3.20 (1H, t, J=11 Hz, H-6a), 3,31 (1H, t, J=9.5 Hz, H-4), 3.37 (1H, dd, J=6, 11 Hz, H-6e), 3.40-3.44 (2H, m, 2 x H-1) ppm. 13C-NMR (D2O) δ 61.78, 63.36, 67.35, 70.95, 97.67 (d, J=9.5 Hz) ppm. HRMS (M - 4H+ + 5Na+) calcd 395.9540, found 395.9538. 1 H-NMR (D 2 O) δ 3.13 (1H, d, J = 9.5 Hz, H-3), 3.14 (1H, ddd, J = 9.5, 5, 11 Hz, H-5), 3.20 (1H, t, J = 11 Hz, H-6a), 3.31 (1H, t, J = 9.5 Hz, H-4), 3.37 (1H, dd, J = 6, 11 Hz, H-6e), 3.40- 3.44 (2H, m, 2 x H-1) ppm. 13 C-NMR (D 2 O) δ 61.78, 63.36, 67.35, 70.95, 97.67 (d, J = 9.5 Hz) ppm. HRMS (M - 4H + + 5Na + ) calcd 395.9540, found 395.9538.
D. Раствор 5-азидо-5-дезокси-L-ксилогксулозо-1-фосфата (100 мг, 0.35 ммоль) в 5 л воды гидрируют 20 мг 10% палладия на угле (Pd-C) при давлении 40 фунтов/дюйм2 (2.812 кг/см2) водорода в течение одного дня. Катализатор удаляют фильтрованием, в полученный фильтрат концентрируют в вакууме. Остаток хроматографируют в колонке с силикагелем (метанол : хлороформ : H2O = 6 : 4 : 2) до получения соединения 50 (40 мг, 78% выход), 2R : 2S ≈ 6 : 1.D. A solution of 5-azido-5-deoxy-L-ksilogksulozo-1-phosphate (100 mg, 0.35 mmol) in 5 L of water was hydrogenated 20 mg of 10% palladium on carbon (Pd-C) under a pressure of 40 pounds / inch 2 ( 2.812 kg / cm 2 ) of hydrogen for one day. The catalyst was removed by filtration, and the filtrate was concentrated in vacuo. The residue was chromatographed on a silica gel column (methanol: chloroform: H 2 O = 6: 4: 2) to give compound 50 (40 mg, 78% yield), 2R: 2S ≈ 6: 1.
1H-NMR (D2O) δ 1.31 (3H, d, J=7 Hz, 2R-CH3), 1.27 (3H, d, J=6.5 Hz, 2S-CH3), 3.36 (1H, m, H-2), 3.66 (1H, m, H-5), 3.74-3.81 (2H, m, 2 x H-5), 3.85 (1H, m, H-3), 4.08 (1H, dd, J=2.5, 4.5 Hz, H-4) ppm; 13C-NMR (D20) δ 16.58 (C-2'), 57.90 (C-5'), 61.50, 63.44, 75.62, 87.09 ppm. HRMS (M + H+) calcd 148.0974, found 148.0974. 1 H-NMR (D 2 O) δ 1.31 (3H, d, J = 7 Hz, 2R-CH 3 ), 1.27 (3H, d, J = 6.5 Hz, 2S-CH 3 ), 3.36 (1H, m, H-2), 3.66 (1H, m, H-5), 3.74-3.81 (2H, m, 2 x H-5), 3.85 (1H, m, H-3), 4.08 (1H, dd, J = 2.5, 4.5 Hz, H-4) ppm; 13 C-NMR (D20) δ 16.58 (C-2 '), 57.90 (C-5'), 61.50, 63.44, 75.62, 87.09 ppm. HRMS (M + H + ) calcd 148.0974, found 148.0974.
Пример 18. Получение FucT ингибитора, соединения 51 - 53. Example 18. Obtaining a FucT inhibitor, compounds 51 to 53.
Ингибирующие соединения 51 - 53 получают обычно как показано на схеме 25 далее. Inhibitory compounds 51-53 are usually prepared as shown in
Для получения соединения 51 - 53 азидо-альдегиды (S)-54 и (R)-54 выбирают в качестве ацепторов для реакций, катализируемых альдолазой, с дигидроксиацетонфосфатом (стадия a), фукозо-1-фосфатальдолазой (стадия b), фруктозо-1,6-дифосфатальдолазой мускула кролика до получения промежуточных фосфатов, которые вначале обрабатывают кислотной фосфатазой, а затем подвергают восстановительному аминированию (стадия c), H2/Pd-C (50 пси) (3.515 кг/см2) до получения окончательных продуктов, которые содержат два хиральных центра в 3- и 4-положениях.To obtain the compound 51-53, the azido-aldehydes (S) -54 and (R) -54 are selected as acceptors for reactions catalyzed by aldolase with dihydroxyacetone phosphate (step a), fucose-1-phosphataldolase (step b), fructose-1 , 6-diphosphataldolase of the rabbit muscle to obtain intermediate phosphates, which are first treated with acid phosphatase and then subjected to reductive amination (step c), H 2 / Pd-C (50 psi) (3.515 kg / cm 2 ) to obtain final products that contain two chiral centers in 3- and 4-positions.
Соединения (S)-54 и (R)-54 получают из 2-бутил-1-ола в реакции с катализатором Линдлара с последующим эпоксидированием и раскрытием азида до получения соответствующих энантиометрных 2- и 3-азидодиолов в соотношении 6 : 1, соответственно. Разделение 2-азиддиола проводят используя липазу из Pseudomonas sp. и винилацетат в качестве ацилирующего агента (Wang et al., J. Org. Chem. , 53: 3127 (1988); Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 7200 (1980)) до получения (2R,3S)-2-азидо-3-гидрокси-4-ацетата и (2R,3S)-2-азидо-3,4-диацетата с высокой степенью оптической чистоты по данным 1H ЯМР в присутствии Eu(hfc)3. Очищенные азидогидроксиацетат и азидодиацетат отдельно гидролизуют до получения соответствующих диолов, которые затем окислительно отщепляют периодатом натрия до получения соединений (S)-54 и (R)-54. Физические характеристики соединений 51 - 53 представлены далее.Compounds (S) -54 and (R) -54 are prepared from 2-butyl-1-ol by reaction with a Lindlar catalyst, followed by epoxidation and opening of azide to obtain the corresponding enantiometric 2- and 3-azidodiols in a 6: 1 ratio, respectively. The separation of 2-azidiol is carried out using a lipase from Pseudomonas sp. and vinyl acetate as an acylating agent (Wang et al., J. Org. Chem., 53: 3127 (1988); Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 7200 (1980)) to obtain ( 2R, 3S) -2-azido-3-hydroxy-4-acetate and (2R, 3S) -2-azido-3,4-diacetate with a high degree of optical purity according to 1 H NMR in the presence of Eu (hfc) 3 . The purified azidohydroxyacetate and azidodiacetate are separately hydrolyzed to the corresponding diols, which are then oxidatively cleaved by sodium periodate to give compounds (S) -54 and (R) -54. The physical characteristics of compounds 51-53 are presented below.
53: [α]
52: [α]
51: [α]
Пример 19. Синтез и данные соединений в схемах 21 - 23. Example 19. The synthesis and data of the compounds in schemes 21 - 23.
Соединения 61 - 99 и их получение обсуждались в отношении схем 21 - 23. В табл. 6 представлены выбранные 1H ЯМР и ВРМС данные для соединений этих схем. Специфические подробности синтеза для примерных соединений в дополнений к тем, которые уже обсуждались ранее, приводятся далее.
Описываемые далее процедуры также применимы к другим гликозил-1-фосфатным соединениям 89 - 95. Единственная модификация наблюдается на стадии очистки соединений 68, 69, 75 и 76. EtOAc используют в качестве элюента для соединений 68 и 69, EtOAc : гексан (2 : 3) для соединения 75, и CHCl3 : EtOAc : MeOH (15 : 0.5 : 0.2) для соединения 76.The procedures described below are also applicable to other glycosyl-1-
A. 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-D-глюкоза (соединение 71). A. 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucose (compound 71).
Раствор пентаацетата соединения 64 (5.0 г, 12.9 ммоль) и BnNH2 (19.2 ммоль) в ТГФ (30 мл) поддерживают при комнатной температуре в течение ночи (около 18 ч). Полученную смесь разбавляют холодной водой и экстрагируют CHCl3 (3 • 50 мл). Объединенные органические экстракты последовательно промывают охлажденной льдом разбавленной соляной кислотой, насыщенным бикарбонатом натрия, насыщенным раствором NaCl и водой, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют в вакууме. Оставшийся сироп очищают хроматографически на силикагеле, элюируя смесью EtOAc/гексан (2 : 3) до получения соединения 71 (3.80 г, 85%) в виде смеси 3 : 1 (α:β) аномеров по данным 1H ЯМР.A solution of the pentaacetate of compound 64 (5.0 g, 12.9 mmol) and BnNH 2 (19.2 mmol) in THF (30 ml) was maintained at room temperature overnight (about 18 h). The resulting mixture was diluted with cold water and extracted with CHCl 3 (3 x 50 ml). The combined organic extracts were washed successively with ice-cold diluted hydrochloric acid, saturated sodium bicarbonate, saturated NaCl and water, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated in vacuo. The remaining syrup was purified by chromatography on silica gel, eluting with EtOAc / hexane (2: 3) to give compound 71 (3.80 g, 85%) as a 3: 1 (α: β) mixture of anomers according to 1 H NMR.
B. Дибензилфосфинил-2,3,4,6-тетра-O-ацетил-D-глюкозофосфит (соединение 78). B. Dibenzylphosphinyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucose phosphite (compound 78).
Дибензил-N, N-диэтилфосфороамидит (0.86, 7.3 ммоль) добавляют к раствору соединения 71 (1.0 г, 2.9 ммоль) и 1,2,4-триазола (0.8 г, 11.5 ммоль) в безводном CH2Cl2 в атмосфере азота при комнатной температуре. Полученную смесь оставляют при перемешивании при комнатной температуре на 1 - 2 ч, перед тем как разбавить эфиром. Полученную смесь последовательно промывают ледяным насыщенным бикарбонатом натрия, насыщенным NaCl и водой, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют в вакууме. Оставшийся сироп обрабатывают хроматографически на силикагеле, элюируя EtOAc/гексаном (1 : 4) до получения соединения 78 (1.73 г, 97%) в виде смеси (α:β)( 1 : 4, по данным 1H ЯМР (CDCl3).Dibenzyl-N, N-diethylphosphoroamidite (0.86, 7.3 mmol) is added to a solution of compound 71 (1.0 g, 2.9 mmol) and 1,2,4-triazole (0.8 g, 11.5 mmol) in anhydrous CH 2 Cl 2 under nitrogen at room temperature. The resulting mixture was left under stirring at room temperature for 1 to 2 hours before being diluted with ether. The resulting mixture was washed successively with ice-cold saturated sodium bicarbonate, saturated NaCl and water, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated in vacuo. The remaining syrup was chromatographed on silica gel eluting with EtOAc / Hexane (1: 4) to give compound 78 (1.73 g, 97%) as a mixture (α: β) (1: 4, according to 1 H NMR (CDCl 3 ).
C. Дибензилфосфорил-2,3,4,6-тетра-O-ацетил-D-глюкоза (соединение 25). C. Dibenzylphosphoryl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucose (compound 25).
К раствору соединения 78 (1.2 г, 2.2 ммоль) в ТГФ (50 мл), охлажденному до -78oC в бане сухой лед-ацетон, прикапывают 30% H2O2 (10 мл), и полученной смеси дают нагреться до комнатной температуры, и перемешивают в течение 1.5 ч при комнатной температуре. Полученную смесь разбавляют эфиром и последовательно промывают ледяным насыщенным Na2S2O3 насыщенным NaHCO3, насыщенным NaCl и водой. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют до получения α:β (1 : 4) смеси соединения 85 (1.36 г, 98%), по данным 1H ЯМР (CDCl3). Этот продут используют на следующей стадии без дальнейшей очистки.To a solution of compound 78 (1.2 g, 2.2 mmol) in THF (50 ml), cooled to -78 o C in a dry ice-acetone bath, 30% H 2 O 2 (10 ml) was added dropwise, and the resulting mixture was allowed to warm to room temperature temperature, and stirred for 1.5 hours at room temperature. The resulting mixture was diluted with ether and washed successively with ice-cold saturated Na 2 S 2 O 3 saturated NaHCO 3 , saturated NaCl and water. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to obtain an α: β (1: 4) mixture of compound 85 (1.36 g, 98%) according to 1 H NMR (CDCl 3 ). This product is used in the next step without further purification.
D. Глюкозо-1-фосфат (соединение 92). D. Glucose-1-phosphate (compound 92).
Соединение 85 (1.0 г, 1.8 ммоль) гидрируют (14.7 пси, 1.0 кг/см2) над 5% Pd/C (200 мг) в EtOH (30 мл) и 10% NaHCO3 (20 мл) в течение 10 ч при комнатной температуре. Полученную смесь фильтруют, и фильтрат концентрируют. Остаток обрабатывают 1 н NaOH (10 мл) при комнатной температуре в течение 3 ч. Полученную смесь нейтрализуют ледяным 1 и AcOH до pH 7.5, а нерастворимую часть удаляют фильтрованием. В другом варианте вместо NaOH используют раствор MeOH : H2O (1 : 1) (объем/объем) в 10% Et3N, так что последующая стадия нейтрализации исключается. Полученный фильтрат концентрируют, разбавляют водой и пропускают через колонку Dowex 50W-X8 [Na+] (1 • 15 см), элюируя водой. Соответствующие фракции собирают и лиофилизируют до получения соединения 92.Compound 85 (1.0 g, 1.8 mmol) was hydrogenated (14.7 psi, 1.0 kg / cm 2 ) over 5% Pd / C (200 mg) in EtOH (30 ml) and 10% NaHCO 3 (20 ml) for 10 hours at room temperature. The resulting mixture was filtered, and the filtrate was concentrated. The residue was treated with 1 N NaOH (10 ml) at room temperature for 3 hours. The resulting mixture was neutralized with ice-cold 1 and AcOH to pH 7.5, and the insoluble part was removed by filtration. In another embodiment, instead of NaOH, a solution of MeOH: H 2 O (1: 1) (v / v) in 10% Et 3 N is used, so that the subsequent neutralization step is excluded. The filtrate obtained was concentrated, diluted with water and passed through a Dowex 50W-X8 [Na + ] column (1 x 15 cm), eluting with water. The appropriate fractions were collected and lyophilized to give
Иногда наблюдаются некоторые количества дефосфорилированного продукта. Его удаляют, пропуская разбавленный фильтрат через колонку Dowex 1W-XB [HCO2-] (1 • 30 см). Колонку вначале элюируют водой для удаления нейтрального продукта, а затем линейный градиент (NH4HCO3 (0.1 М - 0.3 М) вводят для элюирования целевого продукта. Соответствующие фракции собирают, и лиофилизируют. Лиофилизированный порошок растворяют в воде (10 мл), охлаждают до 0oC, и нейтрализуют до pH 7,0 смолой Dowex 50W-XB [H+]. Эту смолу отфильтровывают, а полученный фильтрат снова лиофилизируют до получения соединения 92 (0.30 г, 59%) в виде α:β (1 : 4) смеси по данным 1H ЯМР (D2O).Sometimes some amounts of dephosphorylated product are observed. It is removed by passing the diluted filtrate through a Dowex 1W-XB [HCO 2 -] column (1 • 30 cm). The column is first eluted with water to remove a neutral product, and then a linear gradient (NH 4 HCO 3 (0.1 M - 0.3 M) is introduced to elute the target product. The appropriate fractions are collected and lyophilized. The lyophilized powder is dissolved in water (10 ml), cooled to 0 ° C. and neutralized to pH 7.0 with Dowex 50W-XB [H + ] resin. This resin is filtered off and the filtrate obtained is again lyophilized to give compound 92 (0.30 g, 59%) as α: β (1: 4 ) a mixture according to 1 H NMR (D 2 O).
E. Метил-5-ацетамидо-4,7,8,9-тетра-O-ацетил-3,5-дидеокси -β- D-глицеро-D-галакто-2-нонулопиранозонат (соединение 96). E. Methyl 5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosonate (compound 96).
Это соединение получают по способу Marra et al., Carbohydr. Rev. 190: 317 (1989). В другом варианте, смесь метилд-2-хлор-5-ацетамидо-4,7,8,9-тетра-O-ацетил-3,5-дидеокси -β- D-глицеро-D-галакто-2-нонулопиранозоната (Kuhn et al., Chem. Ber. 99: 611 (1966)) (0.67 г, 1.3 ммоль) и карбоната серебра (0.363 г, 1.3 ммоль) в 5 мл ацетона - 0.5 мл H2O перемешивают в течение 10 ч при комнатной температуре. Полученную суспензию отфильтровывают, пропуская через целитный слой (CeliteTM 545), и полученный фильтрат выпаривают досуха. Остаток разбавляют хлороформом, промывают водой и рассолом, а затем сушат над сульфатом натрия. Растворитель выпаривают в вакууме до получения неочищенного материала, который обрабатывают хроматографически на силикагеле, элюируя смесью хлороформ/метанол 25 : 1, до получения соединения 96 (0.586 г, 88%) в виде белых иголок.This compound is prepared according to the method of Marra et al., Carbohydr. Rev. 190: 317 (1989). In another embodiment, a mixture of methyld-2-chloro-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosonate (Kuhn et al., Chem. Ber. 99: 611 (1966)) (0.67 g, 1.3 mmol) and silver carbonate (0.363 g, 1.3 mmol) in 5 ml of acetone - 0.5 ml of H 2 O is stirred for 10 hours at room temperature . The resulting suspension was filtered through a celite layer (Celite ™ 545), and the resulting filtrate was evaporated to dryness. The residue was diluted with chloroform, washed with water and brine, and then dried over sodium sulfate. The solvent was evaporated in vacuo to give a crude material, which was chromatographed on silica gel, eluting with 25: 1 chloroform / methanol, to give 96 (0.586 g, 88%) as white needles.
1HNR (CDCl3) δ : 1.90, 2.02, 2.03, 2.10, 2.14 (3H each, s, 4•OAc and NAc), 2.17 (1H dd, J 5.04, 12.72 Hz, H-3eq), 2.29 (1H dd, J 11.52, 12.72 Hz, H-3ax), 3.87 (3H, s, COOMe), 4.02 (1H, dd, J 7.04, 12.4 Hz, H-9), 4.12 (1H, dd, J 2.1, 7.8 Hz, H-6), 4.13 (1H, d, J 7.8 Hz, NH), 4.17 (1H, ddd, 7.8, 9.8, 10.28, Hz, H-5), 4.42 (1H, dd, J 1.92, 12.4 Hz, H-9'), 5.20 - 5.26 (2H, m, H-4 and H-8), 5.32 (1H, dd, J 2.1, 6.50 Hz, H-7), 5.37 (1H, bs, OH). 1 HNR (CDCl 3 ) δ: 1.90, 2.02, 2.03, 2.10, 2.14 (3H each, s, 4 • OAc and NAc), 2.17 (1H dd, J 5.04, 12.72 Hz, H-3eq), 2.29 (1H dd , J 11.52, 12.72 Hz, H-3ax), 3.87 (3H, s, COOMe), 4.02 (1H, dd, J 7.04, 12.4 Hz, H-9), 4.12 (1H, dd, J 2.1, 7.8 Hz, H-6), 4.13 (1H, d, J 7.8 Hz, NH), 4.17 (1H, ddd, 7.8, 9.8, 10.28, Hz, H-5), 4.42 (1H, dd, J 1.92, 12.4 Hz, H -9 '), 5.20 - 5.26 (2H, m, H-4 and H-8), 5.32 (1H, dd, J 2.1, 6.50 Hz, H-7), 5.37 (1H, bs, OH).
F. Метил-5-ацетамидо-4,7,8,9-тетра-O-ацетил-2-(дибензилфосфитил) -3,5-дидеокси -β- D-глицеро-D-галакто-2-нонулориганозонат (соединение 97). F. Methyl-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-2- (dibenzylphosphityl) -3,5-dideoxy-β-D-glycero-D-galacto-2-nonuloriganosonate (compound 97 )
Дибензил-N,N-диэтилфосфоамидат (0.25, 0.78 ммоль) прикапывают к раствору соединения 96 (0.166 г, 0.34 ммоль) и 1H-тетразола (0.10 г, 1.43 ммоль) в ТГФ (5 мл) в атмосфере азота, и полученную смесь выдерживают в течение 4 ч при комнатной температуре. К смеси добавляют дихлорметан (10 мл), и органическую фазу промывают ледяной разбавленной HCl, водным NaHCO3 и ледяной водой, сушат над безводным сульфатом натрия. Полученный раствор выпаривают в вакууме до получения неочищенного материала, который обрабатывают на хроматографической колонке с силикагелем, элюируя EtOAc/гексаном (5 : 1) до получения соединения 97 (0.17 г, 68%) в виде бесцветного сиропа.Dibenzyl-N, N-diethylphosphoamidate (0.25, 0.78 mmol) was added dropwise to a solution of compound 96 (0.166 g, 0.34 mmol) and 1H-tetrazole (0.10 g, 1.43 mmol) in THF (5 ml) in a nitrogen atmosphere, and the resulting mixture was kept for 4 hours at room temperature. Dichloromethane (10 ml) was added to the mixture, and the organic phase was washed with ice-cold diluted HCl, aqueous NaHCO 3 and ice-water, and dried over anhydrous sodium sulfate. The resulting solution was evaporated in vacuo to obtain a crude material, which was processed on a silica gel column chromatography, eluting with EtOAc / hexane (5: 1), to give compound 97 (0.17 g, 68%) as a colorless syrup.
13C-NMR (CDCl3) δ : 20.7, 20.8, 20.9, 21.00, 23.1, 36.0, 49.5, 53.5, 62.6, 67.3, 67.4, 67.8, 69.3, 70.8, 94.8, 128.0, 128.7, 135.5, 141.8, 153.0, 169.1, 170.2, 170.4, 170.8, 171.0. HRMS: рассчитано для C34H42NO15PCs (M+Cs+) 868.1346, найдено 8768.1346. 13 C-NMR (CDCl 3 ) δ: 20.7, 20.8, 20.9, 21.00, 23.1, 36.0, 49.5, 53.5, 62.6, 67.3, 67.4, 67.8, 69.3, 70.8, 94.8, 128.0, 128.7, 135.5, 141.8, 153.0, 169.1, 170.2, 170.4, 170.8, 171.0. HRMS: calculated for C 34 H 42 NO 15 PCs (M + Cs + ) 868.1346, found 8768.1346.
G. Метил-5-ацетамидо-4,7,8,9-тетра-O-ацетил-2- (дибензилфосфорил)-3,5-дидеокси -β- D-глицеро-D-галакто-2-нонулопиранозонат (соединение 98). G. Methyl 5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-2- (dibenzylphosphoryl) -3,5-dideoxy-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosonate (compound 98 )
К охлажденному раствору соединения 97 (0.13 г, 0.17 ммоль) в ТГФ (2 мл) добавляют трет.-BuO2H (0.4 мл) при -10oC, и полученную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры, и перемешивают в течение часа при комнатной температуре. Полученную смесь разбавляют CH2Cl2 и промывают ледяным водным бикарбонатом натрия и водой, затем сушат над безводным сульфатом натрия. Органическую фазу выпаривают в вакууме до получения неочищенного материала, который обрабатывают на хроматографической колонке с силикагелем, элюируя CHCl3/MeOH (25 : 1) до получения соединения 98 (0.126 г, 95%) в виде бесцветного сиропа. ВРМС: рассчитано для C34H42NO16PCs (M + Cs+) 884.1396; найдено 884.1305.To a cooled solution of compound 97 (0.13 g, 0.17 mmol) in THF (2 ml) was added tert-BuO 2 H (0.4 ml) at -10 ° C, and the resulting mixture was allowed to warm to room temperature, and stirred for one hour at room temperature. The resulting mixture was diluted with CH 2 Cl 2 and washed with ice-cold aqueous sodium bicarbonate and water, then dried over anhydrous sodium sulfate. The organic phase was evaporated in vacuo to give a crude material, which was processed on a silica gel column chromatography, eluting with CHCl 3 / MeOH (25: 1), to give compound 98 (0.126 g, 95%) as a colorless syrup. VRMS: calculated for C 34 H 42 NO 16 PCs (M + Cs + ) 884.1396; found 884.1305.
H. Метил-5-ацетамидо-4,7,8,9-тетра-O-ацетил-3,5-дидеокси -β- D-глицеро-D-галакто-2-нонулопиранозаонат-2-фосфорная кислота (соединение 99, водородная форма). H. Methyl-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosanoate-2-phosphoric acid (
Соединение 98 (0.22 г, 0.25 ммоль) гидрируют (14.7 пси, 1 кг/см2) над 5% Pd/C (10 мг) в атмосфере водорода в течение 7 ч при комнатной температуре. Катализатор отфильтровывают через CeliteTM 545, а полученный фильтрат концентрируют в вакууме. Неочищенный материал обрабатывают на хроматографической колонке с силикагелем с обращенной фазой, элюируя CH3CN/H2O (5 : 1) до получения соединения 99, водородной формы (0.164 г, 99%) в виде бесцветного сиропа. ВРМС: рассчитано для C20H30NO16PCs (M + Cs) 704.0356, найдено 704.0356.Compound 98 (0.22 g, 0.25 mmol) was hydrogenated (14.7 psi, 1 kg / cm 2 ) over 5% Pd / C (10 mg) in a hydrogen atmosphere for 7 h at room temperature. The catalyst was filtered through Celite ™ 545, and the resulting filtrate was concentrated in vacuo. The crude material is treated on a chromatography column with reverse phase silica gel, eluting with CH 3 CN / H 2 O (5: 1) to give
Claims (28)
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77766291A | 1991-10-15 | 1991-10-15 | |
| US777,662 | 1991-10-15 | ||
| US777662 | 1991-10-15 | ||
| US901260 | 1992-06-19 | ||
| US910612 | 1992-07-08 | ||
| US961076 | 1992-10-14 | ||
| PCT/US1992/008789 WO1993008205A1 (en) | 1991-10-15 | 1992-10-15 | Production of fucosylated carbohydrates by enzymatic fucosylation synthesis of sugar nucleotides; and in situ regeneration of gdp-fucose |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94026248A RU94026248A (en) | 1995-11-27 |
| RU2125092C1 true RU2125092C1 (en) | 1999-01-20 |
Family
ID=25110895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94026248A RU2125092C1 (en) | 1991-10-15 | 1992-10-15 | Method of synthesis of fucosylated carbohydrate, method of synthesis of fucosylated sialylated carbohydrate molecule, reaction system in vitro |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2125092C1 (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2473695C2 (en) * | 2006-03-09 | 2013-01-27 | Сентр Насьональ Де Ля Решерш Сьентифик (Снрс) | Method of producing sialylated oligosaccharides |
| RU2584599C2 (en) * | 2008-12-19 | 2016-05-20 | Дженневейн Биотехнологие Гмбх | Synthesis of fucosylated compounds |
| RU2597975C2 (en) * | 2011-03-04 | 2016-09-20 | Глитек, Инк. | Method for producing sialic acid-containing sugar chain |
| RU2628307C2 (en) * | 2011-01-20 | 2017-08-15 | Енневайн Биотехнологи Гмбх | New fucosyltransferases and applications thereof |
| RU2642307C2 (en) * | 2010-10-11 | 2018-01-24 | Енневайн Биотехнологи Гмбх | New fucosyltransferases and their application |
| RU2746739C1 (en) * | 2015-01-30 | 2021-04-20 | Йенневайн Биотехнологи Гмбх | Enzymatic method for producing monosaccharides in a free form from sugars activated with nucleotides |
-
1992
- 1992-10-15 RU RU94026248A patent/RU2125092C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Adv. Enzymology. v.52, p.44 - 56, 1981.DE 3626915, 11.02.88. Bioch. Soc. Transact, v.15, p.396, 1987. * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2473695C2 (en) * | 2006-03-09 | 2013-01-27 | Сентр Насьональ Де Ля Решерш Сьентифик (Снрс) | Method of producing sialylated oligosaccharides |
| RU2584599C2 (en) * | 2008-12-19 | 2016-05-20 | Дженневейн Биотехнологие Гмбх | Synthesis of fucosylated compounds |
| RU2642307C2 (en) * | 2010-10-11 | 2018-01-24 | Енневайн Биотехнологи Гмбх | New fucosyltransferases and their application |
| RU2628307C2 (en) * | 2011-01-20 | 2017-08-15 | Енневайн Биотехнологи Гмбх | New fucosyltransferases and applications thereof |
| RU2597975C2 (en) * | 2011-03-04 | 2016-09-20 | Глитек, Инк. | Method for producing sialic acid-containing sugar chain |
| RU2746739C1 (en) * | 2015-01-30 | 2021-04-20 | Йенневайн Биотехнологи Гмбх | Enzymatic method for producing monosaccharides in a free form from sugars activated with nucleotides |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6319695B1 (en) | Production of fucosylated carbohydrates by enzymatic fucosylation synthesis of sugar nucleotides; and in situ regeneration of GDP-fucose | |
| EP0642526B1 (en) | Production of fucosylated carbohydrates by enzymatic fucosylation synthesis of sugar nucleotides; and in situ regeneration of gdp-fucose | |
| US5759823A (en) | Ogligosaccharide enzyme substrates and inhibitors: methods and compostions | |
| US5374655A (en) | Methods for the synthesis of monofucosylated oligosaccharides terminating in di-N-acetyllactosaminyl structures | |
| David et al. | Enzymic methods in preparative carbohydrate chemistry | |
| Heidlas et al. | Nucleoside phosphate sugars: syntheses on practical scales for use as reagents in the enzymatic preparation of oligosaccharides and glycoconjugates | |
| Burkart et al. | Chemo-enzymatic synthesis of fluorinated sugar nucleotide: useful mechanistic probes for glycosyltransferases | |
| Palcic | [18] Glycosyltransferases in glycobiology | |
| Boons et al. | Recent advances in O-sialylation | |
| US5580858A (en) | Immunosuppressive and tolerogenic modified Lewisx compounds | |
| US5461143A (en) | Oligosaccharide enzyme substrates and inhibitors: methods and compositions | |
| CA2312843A1 (en) | Enzymatic synthesis of gangliosides | |
| US5952203A (en) | Oligosaccharide synthesis using activated glycoside derivative, glycosyl transferase and catalytic amount of nucleotide phosphate | |
| RU2125092C1 (en) | Method of synthesis of fucosylated carbohydrate, method of synthesis of fucosylated sialylated carbohydrate molecule, reaction system in vitro | |
| EP0591256A1 (en) | Methods for the synthesis of monofucosylated oligosaccharides terminating in di-n-acetyllactosaminyl structures | |
| EP0591254A1 (en) | Immunosuppressive and tolerogenic modified lewis?x and lewis?a compounds | |
| JP4910091B2 (en) | 4-position halogenated galactose-containing sugar chain and its application | |
| Guo | One-Pot Enzymatic Synthesis of UDP-GlcA and UDP-GalA and Chemoenzymatic Synthesis of a Library of Human Milk Oligosaccharides and Enzymatic Synthsis of O-antigen from P. aeruginosa serotype O11 | |
| Ichikawa | Enzymatic synthesis of oligosaccharides and glycopeptides | |
| EP1034294B1 (en) | Enzymatic synthesis of gangliosides | |
| Singh | Chemical-enzymatic synthesis of ligands of E-selectin | |
| Zhang | Chemical, Enzymatic and Chemo-enzymatic Synthesis of Complex Oligosaccharides as Probes of Glycan Functions | |
| Thiem et al. | Glycoscience: Synthesis of Oligosaccharides and Glycoconjugates | |
| Huang | Chemo-enzymatic synthesis of oligosaccharides and carbohydrate mimetics: Applications to the study of cell-adhesion events |