RU2121364C1 - Method of preparing a recombinant alfa-2-interferon-base lyophilized preparation against viral diseases in carnivore animals - Google Patents
Method of preparing a recombinant alfa-2-interferon-base lyophilized preparation against viral diseases in carnivore animals Download PDFInfo
- Publication number
- RU2121364C1 RU2121364C1 RU95118843A RU95118843A RU2121364C1 RU 2121364 C1 RU2121364 C1 RU 2121364C1 RU 95118843 A RU95118843 A RU 95118843A RU 95118843 A RU95118843 A RU 95118843A RU 2121364 C1 RU2121364 C1 RU 2121364C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interferon
- drug
- immunoglobulins
- serum
- recombinant
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при получении лечебно-профилактических иммунобиологических препаратов против вирусных болезней плотоядных. The invention relates to the field of virology and biotechnology and can be used to obtain therapeutic and prophylactic immunobiological preparations against viral diseases of carnivores.
Для лечения и профилактики вирусных заболеваний в настоящее время применяют препараты как специфического, так и неспецифического действия. Среди препаратов, обладающих неспецифической противовирусной активностью, широкое распространение получили лекарственные формы на основе α-, β- и γ-интерферонов, представляющие собой композиции интерферона с дополнительными веществами, которые могут иметь разное функциональное назначение и применяться для стабилизации активности при хранении, усиления противовирусных свойств, повышения специфичности против конкретных инфекционных агентов. For the treatment and prevention of viral diseases, drugs of both specific and non-specific effects are currently used. Among drugs with non-specific antiviral activity, dosage forms based on α-, β- and γ-interferons are widely used, which are compositions of interferon with additional substances that can have different functional purpose and can be used to stabilize activity during storage, enhance antiviral properties increasing specificity against specific infectious agents.
Известны способы получения жидких композиций и препаратов, основанных на сочетании интерферона с веществами, стабилизирующими его активность или усиливающими противовирусное действие. Так, предложен способ получения препарата на основе рекомбинантного β-интерферона, который дополнительно содержит в качестве стабилизирующих добавок глицерин и додецилсульфат натрия [1]. Known methods for producing liquid compositions and preparations based on the combination of interferon with substances that stabilize its activity or enhance the antiviral effect. So, a method for producing a preparation based on recombinant β-interferon, which additionally contains glycerol and sodium dodecyl sulfate as stabilizing additives, has been proposed [1].
Другим примером композиции интерферона с веществами, обладающими дополнительным противовирусным действием, может служить способ получения комплексов интерферона с бактерицидными и антитоксичными веществами, основанный на получении сывороток от животных доноров, которым предварительно, в строго заданные сроки, инъекционно вводят вещество - индуктор интерферона и антиген (или токсин), индуцирующий образование специфических антител [2]. Полученный препарат представляет собой лечебную сыворотку, обладающую кроме неспецифического, обусловленного наличием интерферона, специфическим действием по отношению к тем возбудителям инфекционных заболеваний, включая вирусные, антигены которых использовали на стадии иммунизации. Another example of a composition of interferon with substances that have an additional antiviral effect can be a method for producing complexes of interferon with bactericidal and antitoxic substances, based on obtaining sera from animal donors, which are injected with a substance - an interferon inducer and antigen (or toxin), inducing the formation of specific antibodies [2]. The resulting preparation is a therapeutic serum, which, in addition to non-specific, due to the presence of interferon, has a specific effect in relation to those pathogens of infectious diseases, including viral, whose antigens were used at the stage of immunization.
Основной недостаток данных способов [1, 2] приготовления препаратов обусловлен их жидкой формой, которая не способствует длительному сохранению биологической активности интерферонов, что особенно актуально для интерферонов, полученных по рекомбинантной технологии. The main disadvantage of these methods [1, 2] of preparation of preparations is due to their liquid form, which does not contribute to the long-term preservation of the biological activity of interferons, which is especially important for interferons obtained by recombinant technology.
Проблема стабильности при хранении имеет прямое отношение к лекарственным средствам на основе рекомбинантного α-2-интерферона. Для повышения стабильности высокоочищенного от балластных белков субстрата культивирования α-2-интерферона широко используют лиофильное высушивание в присутствии наполнителя, обеспечивающего сохранение биологической активности в течение срока годности, составляющего до 2-х и более лет. В качестве наполнителя используют вещества белковой природы, биополимеры или композиции веществ, разрешенных для применения в иммунобиологических препаратах. Без наполнителя, обеспечивающего на стадии лиофилизации необходимые условия для получения объемной таблетки и служащего в качестве стабилизатора, очищенный интерферон нестабилен и в ходе хранения теряет свою биологическую активность. В настоящее время имеются примеры приготовления сухих лекарственных форм как в виде композиции α-2-интерферона с веществами, усиливающими противовирусное действие препарата, так и с веществами - стабилизаторами. The problem of storage stability is directly related to drugs based on recombinant α-2-interferon. To increase the stability of the α-2-interferon cultivation substrate highly purified from ballast proteins, freeze drying is widely used in the presence of a filler, which ensures the preservation of biological activity for a shelf life of up to 2 years or more. As a filler, substances of a protein nature, biopolymers or compositions of substances approved for use in immunobiological preparations are used. Without a filler, which provides the necessary conditions at the lyophilization stage for obtaining a bulk tablet and serves as a stabilizer, purified interferon is unstable and loses its biological activity during storage. Currently, there are examples of the preparation of dry dosage forms both in the form of a composition of α-2-interferon with substances that enhance the antiviral effect of the drug, and with stabilizer substances.
Известен способ приготовления сухого, лиофилизированного, препарата, включающий внесение полиглюкина в раствор очищенного α-2-интерферона, который служит наполнителем и стабилизатором при последующем высушивании [3] (препарат "Реальдирон", выпускаемый в г. Вильнюсе). A known method of preparing a dry, lyophilized, preparation, comprising introducing polyglucin into a solution of purified α-2-interferon, which serves as a filler and stabilizer during subsequent drying [3] (preparation "Realdiron" manufactured in Vilnius).
Недостатком данного способа является то, что внесение данного компонента в препарат не приводит к усилению его противовирусного действия. The disadvantage of this method is that the introduction of this component into the drug does not lead to an increase in its antiviral effect.
Для лечения вирусных заболеваний, злокачественных новообразований и сахарного диабета предложена композиция из двух препаратов, первый из которых состоит из порошка, представляющего собой α-интерферон с активностью 2•107 МЕ, высушенный в присутствии наполнителя, включающего (в мг/мл): 2,27 NaHPO4, 0,55 NaH2PO4, 20 глицина и 1 альбумина, а второй представляет собой раствор, содержащий (в мг/мл): 4 (AcO)2Zn, 2,5 протаминсульфата и 0,6 NaOH. Перед применением порошок первого препарата растворяют в растворе второго и полученное средство используют путем инъекций [4].For the treatment of viral diseases, malignant neoplasms and diabetes mellitus, a composition of two preparations is proposed, the first of which consists of a powder, which is α-interferon with an activity of 2 • 10 7 IU, dried in the presence of an excipient, including (in mg / ml): 2 , 27 NaHPO 4 , 0.55 NaH 2 PO 4 , 20 glycine and 1 albumin, and the second is a solution containing (in mg / ml): 4 (AcO) 2 Zn, 2.5 protamine sulfate and 0.6 NaOH. Before use, the powder of the first drug is dissolved in a solution of the second and the resulting product is used by injection [4].
Данный способ позволяет получить композицию с повышенной противовирусной активностью и высокой стабильностью компонента на основе интерферона, однако при этом обладает рядом недостатков. Так, стабильность достигается за счет раздельного приготовления компонентов. Наполнитель-стабилизатор, состоящий из глицина и альбумина, не обладает дополнительными противовирусными или лечебными свойствами. Неудобной является и подготовка к применению препарата путем объединения компонентов, растворения одного в другом для получения конечной инъекционной формы. This method allows to obtain a composition with increased antiviral activity and high stability of the component based on interferon, however, it has several disadvantages. Thus, stability is achieved through separate preparation of the components. The stabilizing filler, consisting of glycine and albumin, does not have additional antiviral or therapeutic properties. The preparation for the use of the drug by combining the components, dissolving one in the other to obtain the final injection form is also inconvenient.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ получения препарата "Реаферон", Россия [5], представляющего собой лиофильно высушенную композицию высокоочищенного рекомбинантного α-2-интерферона с активностью 106 МЕ с наполнителем, в качестве которого используют человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в концентрации 0,5%. Препарат используют при комплексном лечении инфекционных болезней собак. При лечении аденовироза, чумы плотоядных и вирусного энтерита, а также смешанных инфекциях используют инъекции реаферона в первые два-три дня болезни собаки 1 раз в день в дозе 1 млн. МЕ в комплексе с антибиотиками и витаминами.The closest technical solution, selected as a prototype, is a method of obtaining the preparation "Reaferon", Russia [5], which is a lyophilized composition of highly purified recombinant α-2-interferon with an activity of 10 6 IU with a filler, which is used as human serum albumin (HSA) at a concentration of 0.5%. The drug is used in the complex treatment of infectious diseases of dogs. In the treatment of adenovirus, plague of carnivores and viral enteritis, as well as mixed infections, Reaferon injections are used in the first two to three days of a dog’s illness once a day at a dose of 1 million IU in combination with antibiotics and vitamins.
Отличие и преимущество прототипа от аналогов состоит в использовании в качестве стабилизатора единственного компонента, сывороточного белка - ЧСА, который обеспечивает повышенную устойчивость интерферона к инактивирующим факторам высушивания и температурным воздействиям при последующем хранении препарата. The difference and advantage of the prototype from analogues is the use of a single component as a stabilizer, whey protein - HSA, which provides increased resistance of interferon to inactivating drying factors and temperature effects during subsequent storage of the drug.
Недостаток данного способа получения препарата - высокая стойкость ЧСА, который получают из крови доноров, а также отсутствие дополнительного лечебного или профилактического противовирусного действия, обусловленного за счет его введения в состав препарата в вышеуказанной концентрации. The disadvantage of this method of obtaining the drug is the high resistance of HSA, which is obtained from the blood of donors, as well as the lack of additional therapeutic or prophylactic antiviral action, due to its introduction into the composition of the drug in the above concentration.
Задачей предлагаемого изобретения является создание такого способа получения препарата на основе α-2-интерферона, который обеспечивал бы препарату более высокую противовирусную активность и стабильность при хранении. The objective of the invention is the creation of such a method of producing a preparation based on α-2-interferon, which would provide the drug with higher antiviral activity and storage stability.
Поставленная цель достигается тем, что в способе получения лиофилизированного противовирусного препарата на основе рекомбинантного α-2-интерферона, включающем очистку рекомбинантного α-2-интерферона, смешивание его с наполнителем-стабилизатором и высушивание, согласно изобретению в качестве наполнителя-стабилизатора используют иммунную сыворотку или иммуноглобулины, содержащие специфические антитела к одному или нескольким вирусным агентам. This goal is achieved by the fact that in the method for producing a lyophilized antiviral preparation based on recombinant α-2 interferon, comprising purifying recombinant α-2 interferon, mixing it with a stabilizing excipient, and drying, according to the invention, immune serum is used as a stabilizing excipient or immunoglobulins containing specific antibodies to one or more viral agents.
Смешивание α-2-интерферона с иммунной сывороткой (иммуноглобулинами) проводят в соотношении, обеспечивающем количество α-2-интерферона в одной дозе препарата, равное 1•106 - 1•107 МЕ, и конечную концентрацию сыворотки (иммуноглобулинов) по общему белку, равную 0,5-10,0%.Mixing of α-2-interferon with immune serum (immunoglobulins) is carried out in a ratio that ensures the amount of α-2-interferon in one dose of the drug, equal to 1 • 10 6 - 1 • 10 7 IU, and the final concentration of serum (immunoglobulins) in total protein equal to 0.5-10.0%.
Для лечения и профилактики у животных семейства псовых чумы плотоядных и/или парвовирусного энтерита, и/или инфекционного гепатита смешивание сыворотки или иммуноглобулина с α-2-интерфероном проводят из расчета получения конечной концентрации специфических антител в препарате, выражающейся в титре: не менее 1:100 против вируса чумы плотоядных в реакции нейтрализации; не менее 1:128 против вируса энтерита в реакции торможения гемагглютинации; не менее 1:4 против вируса инфекционного гепатита в реакции диффузной преципитации. For the treatment and prophylaxis in animals of the family of canine distemper, carnivores and / or parvovirus enteritis, and / or infectious hepatitis, mixing of serum or immunoglobulin with α-2-interferon is carried out based on the calculation of the final concentration of specific antibodies in the drug, expressed in titer: not less than 1: 100 against carnivore plague virus in a neutralization reaction; not less than 1: 128 against enteritis virus in hemagglutination inhibition reaction; at least 1: 4 against the infectious hepatitis virus in a diffuse precipitation reaction.
Новыми, отличительными от прототипа, являются следующие признаки способа получения препарата. В качестве дополнительного вещества, обеспечивающего стабилизацию α-2-интерферона и одновременно обладающего противовирусной активностью, используют иммунные сыворотки или иммуноглобулины, содержащие специфические антитела к одному или нескольким вирусным агентам. Конечная концентрация данного сывороточного компонента по общему белку составляет 0,5-10,0% и определяется, исходя из необходимости достижения требуемого количества специфических антител в одной дозе препарата. New, distinctive from the prototype, are the following features of the method of obtaining the drug. As an additional substance that ensures the stabilization of α-2-interferon and at the same time possesses antiviral activity, immune serums or immunoglobulins containing specific antibodies to one or more viral agents are used. The final concentration of this serum component for the total protein is 0.5-10.0% and is determined based on the need to achieve the required number of specific antibodies in one dose of the drug.
Сравнение заявляемого способа получения противовирусного препарата с известными показывает, что отличительные от прототипа признаки проявляют новые, неизвестные ранее свойства, а именно: 1) полученный препарат обладает одновременно специфической и неспецифической противовирусной активностью, причем объединение α-2-интерферона с сывороточным белковым компонентом, содержащим антитела к одному или нескольким вирусам, не сказывается на биологической активности каждого из них; 2) использование в качестве такого компонента иммуноглобулина из сывороток человека и животных или иммунных противовирусных сывороток человека и животных позволяет не вводить в препарат дополнительных веществ для стабилизации α-2-интерферона, так как введение их в препарат до конечных концентраций 0,5-10,0% обеспечивает эффект стабилизации, равный или превышающий таковой для других наполнителей на основе сывороточных альбуминов и полимеров. A comparison of the proposed method for producing an antiviral drug with the known ones shows that distinctive features of the prototype show new, previously unknown properties, namely: 1) the obtained drug has both specific and non-specific antiviral activity, and the combination of α-2-interferon with a whey protein component containing antibodies to one or more viruses do not affect the biological activity of each of them; 2) the use of such an immunoglobulin component from human and animal sera or human and animal immune antiviral sera allows not to introduce additional substances into the preparation to stabilize α-2-interferon, since their introduction into the preparation to final concentrations of 0.5-10, 0% provides a stabilization effect equal to or greater than that for other excipients based on serum albumin and polymers.
Снижение содержания компонента сывороточной природы до концентрации менее 0,5% нецелесообразно, так как ниже этой концентрации, во-первых, сложно достичь уровня специфических антител, обеспечивающего лечебное и профилактическое действие, во-вторых, наблюдается снижение стабилизирующих свойств по отношению к α-2-интерферону при высушивании препарата. Превышение концентрации по белку выше 10% также нецелесообразно, так как это значение соответствует верхнему оптимальному пределу для сывороточных иммунобиологических препаратов, предназначенных для инъекций. A decrease in the content of a serum component to a concentration of less than 0.5% is impractical, since below this concentration, firstly, it is difficult to achieve the level of specific antibodies providing a therapeutic and prophylactic effect, and secondly, a decrease in stabilizing properties with respect to α-2 interferon while drying the drug. Exceeding the concentration of the protein above 10% is also impractical, since this value corresponds to the upper optimal limit for serum immunobiological preparations intended for injection.
В отличие от аналога [2] комплекс интерферона со специфическими антителами по заявляемому способу получают в результате смешивания отдельных, заранее полученных компонентов: очищенного рекомбинантного α-2-интерферона и иммунной сыворотки (иммуноглобулинов). Способ позволяет получать препарат с заданными показателями по содержанию специфических антител и α-2-интерферона, что практически невозможно достичь, используя технологию иммунизации животных, ввиду имеющихся у них индивидуальных отличий в характере иммунного ответа на введение антигенов и индукторов интерферона. In contrast to the analogue [2], the complex of interferon with specific antibodies according to the claimed method is obtained by mixing separate, previously obtained components: purified recombinant α-2-interferon and immune serum (immunoglobulins). The method allows to obtain a drug with specified parameters for the content of specific antibodies and α-2-interferon, which is almost impossible to achieve using animal immunization technology, due to their individual differences in the nature of the immune response to the introduction of antigens and inducers of interferon.
В связи с изложенным техническое решение соответствует критерию "изобретательский уровень". In connection with the above, the technical solution meets the criterion of "inventive step".
Сущность изобретения поясняется графиками, где на чертеже (а, б, в) приведены результаты теста хранения α-интерферона в течение 1 года при температуре 4±2oC, лиофилизированного в присутствии наполнителей, различающихся по концентрации белка (а - α-2-интерферон, высушенный в присутствии ЧСА; б - то же при использовании в качестве наполнителя иммуноглобулина против парвовирусного энтерита; в - то же, при использовании в качестве наполнителя сыворотки против парвовирусного энтерита).The invention is illustrated by graphs, where in the drawing (a, b, c) shows the results of the test storage α-interferon for 1 year at a temperature of 4 ± 2 o C, lyophilized in the presence of fillers that differ in protein concentration (a - α-2- interferon dried in the presence of HSA; b - the same when used as filler immunoglobulin against parvovirus enteritis; c - the same when used as filler serum against parvovirus enteritis).
По оси ординат слева - содержание интерферона в одной дозе препарата в МЕ, справа - титр специфических антител в исходном разведении препарата в реакции торможения гемагглютинации;
по оси ординат - процентное содержание сывороточного компонента по общему белку.On the ordinate axis, on the left is the interferon content in one dose of the drug in IU, on the right is the titer of specific antibodies in the initial dilution of the drug in the hemagglutination inhibition reaction;
along the ordinate axis is the percentage of serum component for the total protein.
На графиках приведены следующие условные обозначения:
- 0 - - уровень исходного содержания интерферона;
- * - - содержание интерферона через 2 года хранения;
- x - - титр противовирусных антител;
- . - - то же через год хранения.The following symbols are shown in the graphs:
- 0 - - level of the initial content of interferon;
- * - - interferon content after 2 years of storage;
- x - - titer of antiviral antibodies;
-. - - the same after a year of storage.
Способ получения препарата реализуется следующим образом. The method of obtaining the drug is as follows.
Пример 1. Получение препарата для профилактики и лечения чумы плотоядных у животных семейства псовых. Example 1. Obtaining a drug for the prevention and treatment of carnivore plague in animals of the canine family.
Для приготовления препарата используют полуфабрикат α-2-интерферона рекомбинантного по ВФС 42-227ВС-89, представляющего собой стерильный раствор с pH 7,0-7,6, с концентрацией белка 0,1-0,2 мг/мл и специфической активностью (1-2) • 107 МЕ/мл. Данный полуфабрикат смешивают 1:5-1:9 с сывороткой против чумы плотоядных по ТУ 10-07-03-92 или специфическими иммуноглобулинами против чумы плотоядных по ТУ 10-07-04-92, доводят pH до значений 7,2-7,4. Полученную смесь разливают по 3,0 или 5,0 мл в ампулы (пенфлаконы), замораживают в холодильной камере при температуре не выше -30oC, после чего лиофилизируют. Время высушивания на установке типа TG-50 составляет 48 час при остаточном давлении в камере лиофилизатора 10-50 мкм рт.ст. и температуре подогрева полок не выше 20oC.For the preparation of the drug, a semi-finished product of α-2-interferon recombinant according to VFS 42-227BC-89 is used, which is a sterile solution with a pH of 7.0-7.6, with a protein concentration of 0.1-0.2 mg / ml and specific activity ( 1-2) • 10 7 IU / ml. This semi-finished product is mixed 1: 5-1: 9 with serum against carnivore plague according to TU 10-07-03-92 or specific immunoglobulins against plague of carnivores according to TU 10-07-04-92, the pH is adjusted to 7.2-7, 4. The resulting mixture is poured into 3.0 or 5.0 ml into ampoules (penflasks), frozen in a refrigerator at a temperature not exceeding -30 o C, and then lyophilized. The drying time for the installation of the type TG-50 is 48 hours at a residual pressure in the chamber of the lyophilizer 10-50 μm Hg and shelf heating temperature not higher than 20 o C.
Противовирусную активность сывороточного компонента определяют в реакции нейтрализации до смешивания с α-2-интерфероном в соответствии с ТУ 10-07-04-92, она должна составлять не менее 2,3 lg. Противовирусную активность α-2-интерферона определяют на культуре клеток Л-68 вируса везикулярного стоматита (ВВС). ВВС предварительно пассируют на куриных эмбрионах по ТУ 42-14-99-77, проводят не менее 3-х пассажей при заражающей дозе 100-1000 ТЦД50/0,1 мл. Инфекционная активность материала должна составлять 1•106-1•107 ТЦД50/мл. Монослой клеток Л-68 выращивают на матраце вместимостью 1000 мл в присутствии ростовой среды (среда Игла МЕМ с двойным набором ингредиентов - 90% по ФС 42-7ВС-90, сыворотка плодов коровы по ФС 42-7ВС-90 - 10%) с антибиотиками (канамицина 100000 Ед/мл, гентамицина 16 Ед/мл), после чего клетки снимают со стекла, суспендируют в 40 мл ростовой среды и подсчитывают их количество в счетной камере Горяева. После этого клеточную взвесь разводят ростовой средой из расчета, чтобы в 1,0 мл содержалось 200 тыс/мл. В лунки микропланшетов вносят по 0,1 мл клеточной взвеси и через 2-3 суток инкубации при 37oC получают монослойную культуру. Содержание активного α-2-интерферона определяют в готовом, сухом, препарате, для чего его растворяют, используя воду для инъекций, до исходного объема. Затем готовят двукратные разведения (выше и ниже предполагаемого титра) испытуемого препарата и отраслевого стандартного образца (ОСО) активности в среде 199 или Игла с 2% сыворотки плодов коровы и антибиотиками (пенициллин, стрептомицин). На каждое разведение используют не менее 4-х лунок с культурой клеток. Из лунок удаляют среду и вносят по 0,1 мл каждого разведения интерферона, 16 лунок оставляют для контроля инфицирующей дозы и 4 лунки - для контроля клеточной культуры. Инкубацию проводят в течение суток при 37oC в атмосфере с 5,0±0,5% CO2, после чего в каждую лунку, включая контрольные, вносят дозу ВВС, равную 100 ТЦД50 в 0,1 мл. После внесения индикаторного вируса культуру клеток инкубируют в течение 2-3 суток. Учет проводят, если нет признаков дегенерации в контрольной культуре. За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок оказалась полностью защищенной от цитопатического действия вируса. Пересчет активности в МЕ осуществляют во формуле
Данный способ приготовления обеспечивает получение препарата, одна доза которого содержит одну лечебную дозу сыворотки или иммуноглобулинов с нейтрализующей активностью не менее 1:100 и интерферон в количестве не менее 1•106 МЕ.The antiviral activity of the serum component is determined in the neutralization reaction before mixing with α-2-interferon in accordance with TU 10-07-04-92, it should be at least 2.3 lg. The antiviral activity of α-2-interferon is determined on a culture of L-68 cells of vesicular stomatitis virus (BBC). The Air Force is pre-passaged on chicken embryos according to TU 42-14-99-77, at least 3 passages are performed at an infectious dose of 100-1000 TCD 50 / 0.1 ml. Infectious activity of the material should be 1 • 10 6 -1 • 10 7 TCD 50 / ml. A monolayer of L-68 cells is grown on a mattress with a capacity of 1000 ml in the presence of a growth medium (Igla MEM medium with a double set of ingredients - 90% FS 42-7BC-90, serum of cow fruit FS 42-7BC-90 - 10%) with antibiotics (kanamycin 100000 U / ml, gentamicin 16 U / ml), after which the cells are removed from the glass, suspended in 40 ml of growth medium and their number is counted in the counting chamber of Goryaev. After this, the cell suspension is diluted with growth medium so that 1.0 ml contains 200 thousand / ml. 0.1 ml of cell suspension is added to the wells of the microplates and after 2-3 days of incubation at 37 ° C, a monolayer culture is obtained. The content of active α-2-interferon is determined in the finished, dry preparation, for which it is dissolved using water for injection to the original volume. Then, two dilutions (above and below the expected titer) of the test preparation and the industry standard sample (CCA) of activity in medium 199 or Eagle with 2% serum of cow fruit and antibiotics (penicillin, streptomycin) are prepared. At least 4 wells with cell culture are used for each dilution. The medium is removed from the wells and 0.1 ml of each dilution of interferon is added, 16 holes are left to control the infectious dose and 4 holes to control the cell culture. Incubation is carried out during the day at 37 o C in an atmosphere with 5.0 ± 0.5% CO 2 , after which a dose of VVS equal to 100 TCD 50 in 0.1 ml is added to each well, including control. After the introduction of the indicator virus, the cell culture is incubated for 2-3 days. Accounting is carried out if there are no signs of degeneration in the control culture. For the titer of interferon, take the value inverse to the dilution of the drug, in which the cell culture in 50% of the holes was completely protected from the cytopathic effect of the virus. Recalculation of activity in ME is carried out in the formula
This method of preparation provides a preparation, one dose of which contains one therapeutic dose of serum or immunoglobulins with a neutralizing activity of at least 1: 100 and interferon in an amount of at least 1 • 10 6 IU.
Пример 2. Получение препарата для профилактики и лечения парвовирусного энтерита у животных семейства псовых. Example 2. Obtaining a drug for the prevention and treatment of parvovirus enteritis in animals of the canine family.
Полуфабрикат α-2-интерферона рекомбинантного по ВФС 42-227ВС-89, представляющего собой стерильный раствор с pH 7,0-7,6, с концентрацией белка 0,1-0,2 мг/мл и специфической активностью (1-2)•107 МЕ/мл, смешивают 1:5-1:9 с сывороткой против парвовирусного энтерита плотоядных по ТУ 10-07-01-92 или специфическими иммуноглобулинами против парвовирусного энтерита плотоядных по ТУ 10-07-02-92, доводят pH до значений 7,2-7,4. Полученную смесь разливают по 3,0 или 5,0 мл в ампулы (пенфлаконы), замораживают в холодильной камере при температуре не выше -30oC, после чего лиофилизируют и определяют содержание α-2-интерферона в сухом препарате аналогично примеру 1. Определение противовирусной активности сывороточного компонента в готовом препарате проводят после его растворения в исходном объеме физраствора (раствора для инъекций) путем постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в соответствии с ТУ 10-07-92-02. Титр спефицических антител должен быть не менее 1: 128. Содержание интерферона в одной дозе препарата должно быть не менее 1•106 МЕ.Semi-finished product of α-2-interferon recombinant according to VFS 42-227BC-89, which is a sterile solution with a pH of 7.0-7.6, with a protein concentration of 0.1-0.2 mg / ml and specific activity (1-2) • 10 7 IU / ml, mix 1: 5-1: 9 with serum against parvovirus enteritis carnivores according to TU 10-07-01-92 or specific immunoglobulins against parvovirus enteritis carnivores according to TU 10-07-02-92, adjust the pH to values of 7.2-7.4. The resulting mixture is poured into 3.0 or 5.0 ml into ampoules (penflasks), frozen in a refrigerator at a temperature not higher than -30 o C, then lyophilized and the content of α-2-interferon in a dry preparation is determined analogously to example 1. Definition the antiviral activity of the serum component in the finished product is carried out after it is dissolved in the initial volume of saline solution (injection) by setting the hemagglutination inhibition reaction (RTGA) in accordance with TU 10-07-92-02. The titer of specific antibodies should be at least 1: 128. The content of interferon in one dose of the drug should be at least 1 • 10 6 IU.
Пример 3. Получение препарата для профилактики и лечения вирусных болезней плотоядных (чумы плотоядных, парвовирусного энтерита, инфекционного гепатита). Example 3. Obtaining a drug for the prevention and treatment of viral diseases of carnivores (plague of carnivores, parvovirus enteritis, infectious hepatitis).
Препарат готовят, смешивая 1:1 - 1:9 полуфабрикат α-2-интерферона рекомбинантного с активностью 106 - 107 МЕ/мл с полуфабрикатом специфических поливалентных иммуноглобулинов для профилактики и лечения чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита по ТУ 10-07-008-92. Концентрация иммуноглобулина в препарате перед высушиванием должна быть не менее 0,5%, pH 7,2-7,4. Иммуноглобулины перед смешиванием с интерфероном можно разводить физраствором с учетом предельной минимальной концентрации по белку (0,5%) и с учетом сохранения необходимого уровня специфической активности в соответствии с ТУ 10-07-008-92. Полученную смесь разливают в ампулы (пенфлаконы) по 2, 3 или 5 мл и лиофилизируют с последующим определением содержания интерферона в одной дозе препарата аналогично примеру 1. Одна доза препарата должна содержать α-2-интеферон в количестве не менее 106 МЕ.The drug is prepared by mixing 1: 1 - 1: 9 semi-finished product of recombinant α-2 interferon with an activity of 10 6 - 10 7 IU / ml with a semi-finished product of specific polyvalent immunoglobulins for the prevention and treatment of plague, infectious hepatitis and parvovirus enteritis according to TU 10-07- 008-92. The concentration of immunoglobulin in the preparation before drying should be at least 0.5%, pH 7.2-7.4. Immunoglobulins before mixing with interferon can be diluted with saline, taking into account the maximum minimum protein concentration (0.5%) and taking into account the preservation of the required level of specific activity in accordance with TU 10-07-008-92. The resulting mixture is poured into ampoules (penflasks) of 2, 3 or 5 ml and lyophilized, followed by determination of the content of interferon in one dose of the drug as in example 1. One dose of the drug should contain α-2-interferon in an amount of at least 10 6 IU.
Для определения специфической активности препарата против вируса энтерита используют РТГА, при этом титр специфических антител должен быть не менее 1: 128. Активность антител к возбудителю инфекционного гепатита определяют в реакции диффузной преципитации (РДП), она должна наблюдаться в разведении не менее 1:4. Активность специфических антител к вирусу чумы плотоядных определяют в исходном растворе иммуноглобулинов, до смешивания с интерфероном, в реакции нейтрализации. Она должна составлять не менее 2,3 lg. To determine the specific activity of the drug against enteritis virus, rtga is used, and the titer of specific antibodies should be at least 1: 128. The activity of antibodies to the causative agent of infectious hepatitis is determined in the reaction of diffuse precipitation (RDP), it must be observed in a dilution of at least 1: 4. The activity of specific antibodies to the carnivorous plague virus is determined in the initial solution of immunoglobulins, before mixing with interferon, in the neutralization reaction. It should be at least 2.3 lg.
Пример 4. Исследование эффективности действия препарата, изготовленного по предлагаемому способу. Example 4. The study of the effectiveness of the drug manufactured by the proposed method.
Эффективность препаратов, приготовленных согласно примерам 1, 2 и 3, была исследована при лечении вирусных заболеваний у собак. На первом этапе изучали возможность совместного применения для профилактики чумы плотоядных и парвовирусного энтерита препаратов "Кинорон" и "Реаферон" с иммуноглобулинами против чумы плотоядных и парвовирусного энтерита соответственно согласно наставлениям по применению этих лечебных средств. Препараты вводились в профилактических целях здоровым собакам, и при этом было отмечено отсутствие побочных явлений, выходящих за рамки, оговоренные для каждого препарата в отдельности. The effectiveness of the preparations prepared according to examples 1, 2 and 3, was investigated in the treatment of viral diseases in dogs. At the first stage, the possibility of joint use for the prevention of plague of carnivorous and parvovirus enteritis drugs Kinoron and Reaferon with immunoglobulins against plague of carnivorous and parvovirus enteritis, respectively, according to the instructions for the use of these therapeutic agents, was studied. The drugs were administered prophylactically to healthy dogs, and at the same time, there were no side effects that went beyond the limits agreed for each drug separately.
Второй этап работы по исследованию свойств препаратов, приготовленных согласно заявляемому способу, заключается в постановке экспериментов по сравнению их эффективности при лечении чумы плотоядных с эффективностью ранее применявшихся средств на фоне общей комплексной терапии (введение антибиотиков, анальгин с димедролом, комплекс витаминов, сердечные средства). Схема применения всех противовирусных препаратов ("Кинорон", "Реаферон"; специфические иммуноглобулины против чумы плотоядных; препарат, приготовленный по заявляемому способу) была единой, соответствовала наставлениям и заключалась в 3-кратном введении лечебной дозы с интервалом 12-24 час в первые 2-3 дня болезни. В таблице 1 приведены результаты сравнения вышеназванных вариантов лечения. На основании этих результатов можно сделать вывод с более высокой эффективности заявляемого препарата, проявляющейся в снижении продолжительности лечения и уменьшения числа рецидивов. The second stage of the study of the properties of drugs prepared according to the claimed method consists in setting up experiments comparing their effectiveness in treating carnivore plague with the effectiveness of previously used drugs against the background of general complex therapy (administration of antibiotics, analgin with diphenhydramine, a complex of vitamins, cardiac drugs). The application schedule of all antiviral drugs (Kinoron, Reaferon; specific immunoglobulins against carnivore plague; the drug prepared by the present method) was uniform, consistent with the instructions and consisted of a 3-fold administration of a therapeutic dose with an interval of 12-24 hours in the first 2 -3 days of illness. Table 1 shows the comparison results of the above treatment options. Based on these results, it can be concluded with a higher efficiency of the claimed drug, which is manifested in a decrease in the duration of treatment and a decrease in the number of relapses.
Аналогичная схема применения препарата, приготовленного по заявляемому способу (пример 2), давала хороший результат при лечении энтерита у собак в ранние сроки заболевания. Сравнивали его эффективность по сравнению с иммуноглобулинами. Обработка статистических данных по лечению 36 животных показала, что применение комплексного препарата на основе интерферона и специфических антител давало большее число выздоровлений (на 17%) в течение первых трех дней лечения по сравнению с иммуноглобулинами. A similar pattern of use of the drug prepared by the present method (example 2), gave a good result in the treatment of enteritis in dogs in the early stages of the disease. Its effectiveness was compared with immunoglobulins. Processing statistics on the treatment of 36 animals showed that the use of a complex preparation based on interferon and specific antibodies yielded a greater number of recoveries (by 17%) during the first three days of treatment compared with immunoglobulins.
Эффективность препарата, приготовленного по заявляемому способу на основе α-2-интерферона и поливалентных иммуноглобулинов (пример 3), была показана при лечении заболеваний предположительно вирусной природы в их начальной стадии. Лечению подвергали собак в возврате 6-12 мес, клинические признаки заболевания которых выражались в угнетенном состоянии, незначительном повышении температуры, рвоте, энтеритных явлениях. Данные по сравнению эффективности препаратов при лечении собак с неустановленным окончательным диагнозом приведены в таблице 2. The effectiveness of the drug prepared by the present method based on α-2-interferon and polyvalent immunoglobulins (example 3) was shown in the treatment of diseases of presumably viral nature in their initial stage. Dogs were treated at a return of 6-12 months, the clinical signs of the disease of which were expressed in a depressed state, a slight increase in temperature, vomiting, enteric phenomena. Data on the comparison of the effectiveness of drugs in the treatment of dogs with an unknown final diagnosis are shown in table 2.
Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой эффективности заявляемого препарата в случае его применения в начальной стадии заболеваний предположительно вирусной природы. При этом не было отмечено рецидивов (появление вновь признаков заболевания в течение месяца после завершения лечения). Отсутствие терапевтического эффекта наблюдали в каждой группе животных (по 3 случая), однако все они были связаны с бактериальной или гельминтной природой заболевания, что требовало изменения схемы лечения с использованием антибиотиков и противопаразитарных средств. The results are shown in table 2, indicate the high efficiency of the claimed drug in case of its use in the initial stage of diseases of a presumably viral nature. In this case, no relapse was noted (the appearance of signs of the disease again within a month after completion of treatment). The absence of a therapeutic effect was observed in each group of animals (3 cases each), however, all of them were associated with the bacterial or helminth nature of the disease, which required a change in the treatment regimen using antibiotics and antiparasitic agents.
Данный способ приготовления препаратов может быть использован для получения противовирусных средств для профилактики и лечения разных вирусных заболеваний человека и животных при условии, если в каждом отдельном случае будет экспериментально показан терапевтический эффект при совместном введении α-2-интерферона со специфическими противовирусными антителами. В настоящее время нами экспериментально установлено, что сывороточный компонент в пределах указанных концентраций и содержащий специфические АТ, в равной степени обладает протективным действием в отношении интерферона на стадиях высушивания и хранения независимо от специфики и вида вирусных агентов, для которых получали иммунные сыворотки. Так, например, не было отмечено различий по термоустойчивости при применении в качестве стабилизатора иммуноглобулина человека нормально по ФС-42-79ВС-87, иммуноглобулина противогриппозного человека по ФС 42-74ВС-87, иммуноглобулина человека против гепатита B по ФС 42-330ВС-90, иммуноглобулина против клещевого энцефалита по ФС 42-119ВС-93, а также противокоревой, противопаратитной сывороток человека, иммунных сывороток и иммуноглобулинов от различных животных. This method of preparation of drugs can be used to obtain antiviral agents for the prevention and treatment of various viral diseases of humans and animals, provided that in each case the therapeutic effect is experimentally shown with the joint administration of α-2-interferon with specific antiviral antibodies. At present, we have experimentally established that the serum component within the indicated concentrations and containing specific antibodies equally has a protective effect on interferon at the stages of drying and storage, regardless of the specificity and type of viral agents for which immune sera were obtained. So, for example, there were no differences in thermal stability when used as a stabilizer of a human immunoglobulin normally according to FS-42-79BC-87, human immunoglobulin according to FS 42-74BC-87, human immunoglobulin against hepatitis B according to FS 42-330BC-90 , immunoglobulin against tick-borne encephalitis according to FS 42-119BC-93, as well as measles, antiparasitic human sera, immune sera and immunoglobulins from various animals.
Технико-экономические преимущества способа
Экономический эффект при использовании препарата, приготовленного по заявляемому способу, обусловлен сокращением сроков лечения, а также отсутствием дополнительных затрат, связанных с необходимостью внесения в состав препарата наполнителей для стабилизации интерферона. В таблице 3 приведены данные по стоимости реагентов, используемых для стабилизации интерферона в составе выпускаемых в настоящее время препаратов. Цены приведены в долларах по каталогу фирмы "Sigma" (1994 г.).Technical appraisal and economic advantages of the method
The economic effect when using the drug prepared by the present method is due to the reduction of treatment time, as well as the absence of additional costs associated with the need to add excipients to the composition of the drug to stabilize interferon. Table 3 shows data on the cost of the reagents used to stabilize interferon in the composition of currently manufactured drugs. Prices are in dollars according to the catalog of Sigma (1994).
Таким образом, при использовании препаратов, приготовленных по заявляемому способу и совмещающих α-2-интерферон с противовирусными иммуноглобулинами или сыворотками, экономия, за счет неприменения дополнительных веществ-стабилизаторов α-2-интерферона, может составлять в расчете на 1000 доз не менее 2 $ для ветеринарных средств и до 70 $ (в случае неприменения ЧСА) для медицинских препаратов. Thus, when using drugs prepared by the present method and combining α-2-interferon with antiviral immunoglobulins or serums, the savings due to the non-use of additional stabilizing substances α-2-interferon can be calculated for 1000 doses of at least $ 2 for veterinary products and up to $ 70 (in case of non-use of HSA) for medical preparations.
Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и медицине. Industrial applicability. The invention can be used in veterinary medicine.
Источники информации
1. Заявка ЕПВ N 270799, A 61 K 45/02, 47/00, опубл. 15.06.88.Sources of information
1. Application EPO N 270799, A 61 K 45/02, 47/00, publ. 06/15/88.
2. Заявка РСТ (WO) N 82/03012, A 61 K 45/02, 37/10, опубл., 16.09.82 (аналог). 2. Application PCT (WO) N 82/03012, A 61 K 45/02, 37/10, publ., 09.16.82 (analogue).
3. Методические основы применения реаферона - человеческого рекомбинантного интерферона α-2B-белка. // Сборник материалов научной конференции для врачей-практиков, Кольцово, 25-29 января 1993 г., - Кольцово, 1993, - с. 15-19, 22-23 (аналог). 3. The methodological basis for the use of reaferon - human recombinant interferon α-2B protein. // Collection of materials of a scientific conference for medical practitioners, Koltsovo, January 25-29, 1993, - Koltsovo, 1993, - p. 15-19, 22-23 (analogue).
4. Патент США N 4853218, МКИ A 61 K 45/02, опубл. 1.08.88 (аналог). 4. US patent N 4853218, MKI A 61 K 45/02, publ. 1.08.88 (analog).
5. Методические основы применения реаферона - человеческого рекомбинантного интерферона α-2B-белка. // Сборник материалов научной конференции для врачей-практиков, Кольцово, 25-29 января 1993 г., - Кольцово, 1993, - с. 115-117 (прототип). 5. The methodological basis for the use of reaferon - human recombinant interferon α-2B protein. // Collection of materials of a scientific conference for medical practitioners, Koltsovo, January 25-29, 1993, - Koltsovo, 1993, - p. 115-117 (prototype).
6. Патент США N 471461, МКИ A 61 K 45/02, опубл. 22.12.87 (аналог). 6. US patent N 471461, MKI A 61 K 45/02, publ. 12.22.87 (analogue).
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95118843A RU2121364C1 (en) | 1995-11-03 | 1995-11-03 | Method of preparing a recombinant alfa-2-interferon-base lyophilized preparation against viral diseases in carnivore animals |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95118843A RU2121364C1 (en) | 1995-11-03 | 1995-11-03 | Method of preparing a recombinant alfa-2-interferon-base lyophilized preparation against viral diseases in carnivore animals |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU95118843A RU95118843A (en) | 1997-10-20 |
| RU2121364C1 true RU2121364C1 (en) | 1998-11-10 |
Family
ID=20173514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU95118843A RU2121364C1 (en) | 1995-11-03 | 1995-11-03 | Method of preparing a recombinant alfa-2-interferon-base lyophilized preparation against viral diseases in carnivore animals |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2121364C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11604026B2 (en) | 2019-03-14 | 2023-03-14 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Lyophilization loading tray assembly and system |
| US11634257B2 (en) | 2017-10-09 | 2023-04-25 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Lyophilization container and method of using same |
-
1995
- 1995-11-03 RU RU95118843A patent/RU2121364C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Методические основы применения реаферона-человеческого рекомбинантного интерферона α-2B-белка. Сборник материалов научной конференции для врачей-практиков, Кольцово, 28-29 января 1993, г. Кольцово, 1993, с. 115-117. * |
| Соловьев В.Д., Бектемиров Т.А. Интерферон в теории и практике. - М.: Медицина, 1981. Ершов Ф.И., Новохатский А.С. Интерферон, теория и практика. XLXX сессия общего собрания АМН СССР. Тезисы докладов. - М., 1993, с. 33-34. * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11634257B2 (en) | 2017-10-09 | 2023-04-25 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Lyophilization container and method of using same |
| US11604026B2 (en) | 2019-03-14 | 2023-03-14 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Lyophilization loading tray assembly and system |
| US11609043B2 (en) | 2019-03-14 | 2023-03-21 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Lyophilization container fill fixture, system and method of use |
| US11609042B2 (en) | 2019-03-14 | 2023-03-21 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Multi-part lyophilization container and method of use |
| US11740019B2 (en) | 2019-03-14 | 2023-08-29 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Lyophilization loading tray assembly and system |
| US11747082B2 (en) | 2019-03-14 | 2023-09-05 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Multi-part lyophilization container and method of use |
| US11815311B2 (en) | 2019-03-14 | 2023-11-14 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Lyophilization container fill fixture, system and method of use |
| US11994343B2 (en) | 2019-03-14 | 2024-05-28 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Multi-part lyophilization container and method of use |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2312633T3 (en) | WATERPROOF FORMULATIONS OF SUSTAINED LIBERATION PROTEINS. | |
| EP0253887B1 (en) | Low dosage of interferon to enhance vaccine efficiency | |
| US5910304A (en) | Low-dose oral administration of interferons | |
| US4460574A (en) | Prophylaxis or treatment of interferon-sensitive diseases | |
| WO2002096457A2 (en) | Stable liquid formulations of antibodies | |
| US5997858A (en) | Stimulation of host defense mechanisms against tumors | |
| RU2121364C1 (en) | Method of preparing a recombinant alfa-2-interferon-base lyophilized preparation against viral diseases in carnivore animals | |
| FR2575655A1 (en) | Use of an interferon at low doses, in particular for regulating appetite and the efficiency of food utilisation | |
| JP3640980B2 (en) | Cat respiratory remedy and therapeutic method using the same | |
| NZ235153A (en) | Stabilised alpha-interferon compositions | |
| KR100399499B1 (en) | Interferon composition for oromucosal administration to stimulate an antineoplastic response | |
| Merigan | Various molecular species of interferon induced by viral and nonviral agents | |
| CA1336491C (en) | Antiviral pharmaceutical composition | |
| CN1695737A (en) | Freezedrying type vaccine of AIDS recombined poxvirus with Ankara gene stock carrier, and preparation method | |
| RU2077336C1 (en) | Genetic-engineering gamma-interferon preparation | |
| RU2123328C1 (en) | Liposomal antiviral drug for oral using | |
| CN108175854A (en) | A kind of lyophilized preparation of Vaccinum Encephalitidis Epidemicae | |
| RU2182830C1 (en) | Tablet form of recombinant human erythropoietin | |
| KR100399500B1 (en) | General method of shortening the duration of common colds by application of medicaments to tissues of oral cavity | |
| US5942224A (en) | Therapeutic agent for cat respiratory diseases and method of treatment using the same | |
| JPS60260523A (en) | Lyophilized drug composition of interferon | |
| JPH02304100A (en) | Interferon for use in prevention or medical treatment of pneumonia or related bacterial desease of pig | |
| EA040871B1 (en) | METHOD FOR OBTAINING HYPERIMMUNE SERUM AGAINST INFECTIOUS DISEASES OF CATTLE | |
| Mikula et al. | Stabilization of Salmonella-specific dialyzable leukocyte extracts | |
| RU95118843A (en) | METHOD FOR PRODUCING LYOPHILIZED ANTIVIRAL PRODUCT BASED ON RECOMBINANT α -2-INTERFERON |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20071104 |