RU2115125C1 - Method of protection of human blood lymphoid cells from hiv - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine, virology. SUBSTANCE: human blood cells are treated with preparation that blocks binding HIV with cell-target during culturing. Human fetal alpha-fetoprotein at concentration 2-15 mcg/ml culturing medium is used as a preparation. EFFECT: simplified method, decreased cost.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии. Может найти применение при профилактике СПИДа, а также при терапии пациентов, инфицированных ВИЧ. The invention relates to medicine, in particular to virology. May find application in the prevention of AIDS, as well as in the treatment of patients infected with HIV.

Одной из актуальных проблем современной медицины является создание эффективных препаратов, способных предотвращать развитие симптомов иммунодефицита у инфицированных ВИЧ пациентов. В этом направлении достигнуты определенные результаты. Созданные препараты во многих случаях позволяют предотвратить развитие заболевания у инфицированных пациентов. Наиболее ярким тому примером служит создание лекарственных препаратов на основе глицирризиновой кислоты, которые препятствуют связыванию ВИЧ с клеткой-мишенью (Ito M. et al. , Ibid, 1988, 10, 289 - 298). Однако подавляющее большинство лекарств, обладающих подобной активностью, эффективны только при применении в высоких дозах (для глицирама, например, она составляет более 0,5 г ежедневно), что сопряжено с возникновением ряда побочных токсических эффектов. One of the urgent problems of modern medicine is the creation of effective drugs that can prevent the development of symptoms of immunodeficiency in HIV-infected patients. In this direction, certain results have been achieved. Created drugs in many cases can prevent the development of the disease in infected patients. The most striking example of this is the creation of drugs based on glycyrrhizic acid, which interfere with the binding of HIV to the target cell (Ito M. et al., Ibid, 1988, 10, 289-298). However, the vast majority of drugs with such activity are effective only when used in high doses (for glycyram, for example, it is more than 0.5 g daily), which is associated with a number of toxic side effects.

Для предотвращения инфицирования здоровых клеток крови ВИЧ нами предлагается использование фетального альфа-фетопротеина (АФП) человека. Обнаружено, что этот онкофетальный белок (Abelev G.I., Tuvor Biol., 1989, 10, 63 - 74; Tatarinov Y.S. et al., Tumor Biol., 1991, 12, 125 - 130; Deutsch H.F., Adv. Cancer Res., 1989, 56, 253 - 315) способен эффективно взаимодействовать с гликопротеином gp120, входящим в состав ВИЧ и ответственным за связывание вируса с клетками-мишенями (Pharmacol Res., 1992, 26, 64 - 65; Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1992, 15, 9434 - 9438). Таким образом, АФП препятствует этому взаимодействию и, следовательно, предотвращает инфицирование здоровых клеток. To prevent infection of healthy blood cells with HIV, we propose the use of human fetal alpha-fetoprotein (AFP). This oncofetal protein was found (Abelev GI, Tuvor Biol., 1989, 10, 63 - 74; Tatarinov YS et al., Tumor Biol., 1991, 12, 125 - 130; Deutsch HF, Adv. Cancer Res., 1989 56, 253–315) is able to interact effectively with the gp120 glycoprotein, which is part of HIV and is responsible for binding the virus to target cells (Pharmacol Res., 1992, 26, 64–65; Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1992 15, 9434 - 9438). Thus, AFP prevents this interaction and, therefore, prevents the infection of healthy cells.

Наиболее близким аналогом предложенному нами способу защиты нормальных клеток крови от ВИЧ следует рассматривать работу Плясуновой О.А. с соавторами (Вопр. Вирусологии, 1992, 37, 5 - 6, 120 - 125). В этой работе показано, что бета-глицирризиловая кислота in vitro обладает выраженной противовирусной активностью по отношению к штаммам ВИЧ-1 (ЭВК) и ВИЧ-2 (rot) d в культурах лимфоидных клеток МТ-4 и Н9. Эффективная противовирусная активность наблюдалась при концентрации препарата 100 - 200 мкг/мл среды. The closest analogue to our proposed method of protecting normal blood cells from HIV should be considered the work of Plyasunova O.A. with co-authors (Vopr. Virology, 1992, 37, 5-6, 120-125). In this work, it was shown that in vitro beta-glycyrrhizilic acid has a pronounced antiviral activity against HIV-1 (EVA) and HIV-2 (rot) d strains in MT-4 and H9 lymphoid cell cultures. Effective antiviral activity was observed at a drug concentration of 100-200 μg / ml of medium.

Таким образом, результатом предложения является создание нового анти-ВИЧ препарата. Thus, the result of the proposal is the creation of a new anti-HIV drug.

Реализация способ защиты нормальных клеток крови от ВИЧ. Для оценки противовирусной активности АФП использовали модель первично-инфицированных ВИЧ лимфоидных клеток МТ-4. Контрольные и инфицированные клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 15% фетальной сыворотки, 300 мкг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина в 96-луночных культуральных планшетках при температуре 37^oC и 5% двуокиси углерода. Штамм ВИЧ-1 (ЭВК) получен из института Вирусологии им. Д.И.Ивановского (г. Москва). Инфицирование клеток МТ-4 ВИЧ-1 проводили добавлением вируса к клеточной суспензии с концентрацией 3 • 10,6 клеток/мл и множественностью заражения 0,4 - 0,6 с с последующей адсорбцией вируса в течение 40 мин при 37^oC. Инфицированные клетки культивировали с посевной концентрацией 6 • 10,5 клеток/мл в 96-луночных планшетах.Implementing a way to protect normal blood cells from HIV. To assess the antiviral activity of AFP, a model of primary HIV-infected MT-4 lymphoid cells was used. Control and infected cells were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 15% fetal serum, 300 μg / ml L-glutamine, 100 μg / ml gentamicin in 96-well culture plates at 37 ^° C and 5% carbon dioxide. Strain HIV-1 (EVK) obtained from the Institute of Virology. D.I. Ivanovsky (Moscow). MT-4 HIV-1 cells were infected by adding the virus to a cell suspension with a concentration of 3 • 10.6 cells / ml and a multiplicity of infection of 0.4 - 0.6 s, followed by adsorption of the virus for 40 min at 37 ^o C. Infected cells cultured at a seed concentration of 6 x 10.5 cells / ml in 96-well plates.

Препарат АФП получен последовательным применением ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе, аффинной хроматографии на BrCN-сефарозе и гельфильтрации на колонке с AcA-34. Аффинная хроматография включает в себя иммуносорбцию на поликлональных антителах кролика против АФП человека, на антителах кролика против белков нормальной сыворотки человека и на антителах крысы против иммуноглобулинов кролика. Предварительную очистку проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,04 М калий-фосфатным буфером, pH 6,2. Сыворотку, содержащую альфа-фетопротеин в концентрации не менее 50 мкг/мл перед нанесением на колонку разводили в три раза стартовым буфером. После нанесения сыворотки колонку промывали стартовым буферным раствором, содержащим 0,05 М хлорида натрия. Сорбировавшийся на колонке белок снимали 0,04 М калий-фосфатным буфером, содержащим 0,2 М хлористого натрия. Фракцию, содержащую АФП, концентрировали до объема 150 мл, добавляли в нее концентрированный раствор Трис-HCl (pH 8,0) до конечной концентрации 0,05 М и концентрированный раствор хлористого натрия до конечной концентрации 0,5 М. Затем эту фракцию наносили на иммуноаффинную колонку 2,6 • 6,0 см с ковалентно связанным с BrCN-активированной сефарозой CL-4B поликлональными антителами кролика против АФП человека. Перед нанесением колонку промывали сначала 0,01 М раствором HCl, затем уравновешивали буферным раствором 0,05 М Трис-HCl, pH 8,0. Скорость нанесения составляла 400 мл в час. После нанесения содержащей АФП фракции колонку промывали стартовым буфером до тех пор, пока оптическая плотность выходящего с колонки раствора не снижалась до 0,005 оптических единиц. Затем АФП снимали, пропуская через колонку 0,01 М раствор HCl. Профиль элюции контролировали спектрофотометрически, по поглощению при 280 нм. Практически весь белок сходил с колонки в интервале pH от 6 до 5. Сразу после снятия белка с колонки pH раствора поднимали до pH 8,0, добавляя концентрированный Трис-HCl буфер. Объем снятой с аффинной колонки фракции АФП составлял около 100 мл, концентрация приблизительно 1 мг/мл. The AFP preparation was obtained by sequential use of ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose, affinity chromatography on BrCN-Sepharose and gel filtration on an AcA-34 column. Affinity chromatography involves immunosorption on rabbit polyclonal antibodies against human AFP, on rabbit antibodies against normal human serum proteins, and on rat antibodies against rabbit immunoglobulins. Preliminary purification was performed using ion-exchange chromatography on a column with DEAE-Sepharose, equilibrated with 0.04 M potassium phosphate buffer, pH 6.2. Serum containing alpha-fetoprotein at a concentration of at least 50 μg / ml was diluted three times with the start buffer before application to the column. After applying the serum, the column was washed with a starting buffer solution containing 0.05 M sodium chloride. The protein adsorbed on the column was removed with 0.04 M potassium phosphate buffer containing 0.2 M sodium chloride. The fraction containing AFP was concentrated to a volume of 150 ml, a concentrated Tris-HCl solution (pH 8.0) was added to it to a final concentration of 0.05 M and a concentrated sodium chloride solution to a final concentration of 0.5 M. Then this fraction was applied to immunoaffinity column 2.6 x 6.0 cm covalently linked to BrCN-activated sepharose CL-4B polyclonal rabbit antibodies against human AFP. Before application, the column was washed first with a 0.01 M HCl solution, then was balanced with a buffer solution of 0.05 M Tris-HCl, pH 8.0. The application rate was 400 ml per hour. After applying the AFP-containing fraction, the column was washed with the start buffer until the optical density of the solution leaving the column decreased to 0.005 optical units. Then the AFP was removed by passing through a column of 0.01 M HCl solution. The elution profile was monitored spectrophotometrically by absorbance at 280 nm. Almost all of the protein left the column in the pH range from 6 to 5. Immediately after removing the protein from the column, the pH of the solution was raised to pH 8.0 by adding concentrated Tris-HCl buffer. The volume of the AFP fraction removed from the affinity column was about 100 ml, and the concentration was about 1 mg / ml.

Дополнительная хроматографическая очистка. Для того, чтобы очистить выделенный АФП от возможных следовых количеств белков сыворотки или фрагментов иммуноглобулинов кролика, которые могли быть внесены на стадии аффинной хроматографии, полученная фракция наносилась последовательно на аффинную колонку с антителами кролика против белков нормальной сыворотки человека и аффинную колонку с антителами крысы против иммуноглобулинов кролика. Полученный после аффинной хроматографии белок концентрировали на концентрирующей ячейке с мембраной YM 30 до объема 5 мл и наносили на гельхроматографическую колонку с биогелем AcA-34, уравновешенную 0,005 М натрий фосфатным буфером, pH 7,5. Фракции 7 - 12 содержат незначительное количество олигомерных форм АФП. В качестве конечного продукта берут только фракции 13 - 16. Сразу после стадии гельфильтрации белок был сконцентрирован в концентрирующей ячейке с мембраной YM 30 до конечной концентрации 45 мг/мл и лиофильно высушен. Все операции производились при температуре не выше +8^oC.Additional chromatographic purification. In order to purify the isolated AFP of possible trace amounts of serum proteins or fragments of rabbit immunoglobulins that could be introduced at the affinity chromatography stage, the obtained fraction was applied sequentially to an affinity column with rabbit antibodies against normal human serum proteins and an affinity column with rat antibodies against immunoglobulins a rabbit. The protein obtained after affinity chromatography was concentrated on a concentrating cell with a YM 30 membrane to a volume of 5 ml and applied onto an AcA-34 biogel gel chromatography column balanced with 0.005 M sodium phosphate buffer, pH 7.5. Fractions 7-12 contain a small amount of oligomeric forms of AFP. Only fractions 13 - 16 were taken as the final product. Immediately after the gel filtration step, the protein was concentrated in a concentration cell with a YM 30 membrane to a final concentration of 45 mg / ml and lyophilized. All operations were performed at a temperature not exceeding +8 ^o C.

Препарат АФП вносили в суспензию клеток до конечной концентрации 1 - 100 мкг/мл сразу после адсорбции вируса. Эффект препарата оценивали на 5-е сутки культивирования по активности вирусспецифичного фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы, содержанию вирусного антигена иммуноферментным методом и количеству живых клеток. Активность обратной транскриптазы определили как описано в работе Lee M.H. et al. (J. Clin. Microbiol., 1987, N 25, 1717 - 1720). Количество вирусных белков определяли прямым иммуноферментным методом (Жданов В.П. и др., Вопр. Вирусологии, 1988, N 3, 294 - 296). The AFP preparation was introduced into the cell suspension to a final concentration of 1-100 μg / ml immediately after the adsorption of the virus. The effect of the drug was evaluated on the 5th day of cultivation by the activity of the virus-specific enzyme RNA-dependent DNA polymerase, the content of the viral antigen by the enzyme immunoassay and the number of living cells. Reverse transcriptase activity was determined as described by Lee M.H. et al. (J. Clin. Microbiol., 1987, N 25, 1717-1720). The number of viral proteins was determined by direct enzyme immunoassay (Zhdanov V.P. et al., Virology, 1988, N 3, 294 - 296).

Жизнеспособность инфицированных клеток резко возрастает даже при низких концентрациях АФП (около 1 мкг/мл), достигает максимума при концентрации препарата 8 - 10 мг/мл и затем монотонно снижается. При этом уровень вирусного антигена монотонно снижается при возрастании концентрации АФП. Иная закономерность наблюдается при воздействии АФП на неинфицированные клетки. В данном случае жизнеспособность клеток монотонно снижается с увеличением содержания препарата. Таким образом АФП в концентрации около 10 мкг/мл способен эффективно предотвращать инфицирование нормальных клеток вирусом ВИЧ-1. В высоких концентрациях (около 100 мкг/мл) АФП снижает жизнеспособность как инфицированных, так и нормальных клеток. Это связано, как показали наши дальнейшие исследования, с явлением индуцированного препаратом абаптозиса. Закономерности, обнаруженные при исследовании влияния АФП на жизнеспособность клеток и уровень вирусспецифичного антигена, сохранились при изучении действия препарата на количество живых инфицированных и неинфицированных клеток. The viability of infected cells increases dramatically even at low AFP concentrations (about 1 μg / ml), reaches a maximum at a drug concentration of 8-10 mg / ml, and then decreases monotonously. At the same time, the level of viral antigen monotonously decreases with increasing AFP concentration. A different pattern is observed when AFP acts on uninfected cells. In this case, cell viability monotonically decreases with increasing drug content. Thus, AFP at a concentration of about 10 μg / ml is able to effectively prevent the infection of normal cells with the HIV-1 virus. At high concentrations (about 100 μg / ml), AFP reduces the viability of both infected and normal cells. This is due, as our further studies have shown, to the phenomenon of drug-induced abaptosis. The patterns found in the study of the effect of AFP on cell viability and the level of virus-specific antigen were preserved when studying the effect of the drug on the number of living infected and uninfected cells.

Claims (1)

Способ защиты лимфоидных клеток крови человека от ВИЧ, включающий обработку клеток в процессе культивирования препаратом, препятствующим связыванию ВИЧ с клеткой-мишенью, отличающийся тем, что в качестве препарата используют фетальный альфа-фетопротеин человека в концентрации 2 - 15 мкг/мл среды культивирования. A method for protecting human blood lymphoid cells from HIV, including treating cells during cultivation with a drug that impedes the binding of HIV to the target cell, characterized in that human fetal alpha-fetoprotein is used in the preparation at a concentration of 2-15 μg / ml of culture medium.