RU2113478C1

RU2113478C1 - Method of superoxide dismutase preparing

Info

Publication number: RU2113478C1
Application number: RU92009231A
Authority: RU
Inventors: Анна Вангелова Куюмджиева-Савова; Валентин Александров Савов; Е.Р. Давидов; Траяна Спасова Недева; Мария Василева Морфова; Ю.И. Соколов
Original assignee: Совместное Российско-Германское предприятие "ИНБИО"; Совместное болгаро-российское предприятие "Ромб-Ооф"
Priority date: 1992-12-01
Filing date: 1992-12-01
Publication date: 1998-06-20

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: method involves the use of culture Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus as a producer of superoxide dismutase. Culture is grown on milk-processing industry waste - milk whey filtrate enriched with nicotinic acid. Strain-producer is cultured at 35 C. EFFECT: improved method of enzyme production. 5 cl, 3 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения фермента супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1) с помощью микробных культур. The invention relates to biotechnology and for the production of the superoxide dismutase enzyme (EC 1.15.1.1) using microbial cultures.

Супероксиддисмутаза катализирует разложение активных радикалов супероксида до перекиси водорода и кислорода, осуществляя тем самым защитные функции в отношении аэробных микроорганизмов. Superoxide dismutase catalyzes the decomposition of superoxide active radicals to hydrogen peroxide and oxygen, thereby protecting the body against aerobic microorganisms.

Этот эффект представляет практический интерес в связи с возможностью его использования, как противовоспалительного средства в медицине и как консерванта в пищевой промышленности. This effect is of practical interest in connection with the possibility of its use as an anti-inflammatory agent in medicine and as a preservative in the food industry.

Первоначально источником супероксидисмутазы служили эритроциты крови и такие животные ткани, как печень, почки, легкие, сердце, мозг и некоторые другие, из которых фермент получали сложными и многостадийными методами. Initially, the source of superoxide dismutase was red blood cells and animal tissues such as the liver, kidneys, lungs, heart, brain, and some others, from which the enzyme was obtained by complex and multistage methods.

Затем были разработаны методы получения супероксиддисмутазы с помощью микроорганизмов, в частности таких, как Pseudomonas putida, Nocardopsis, Gluconobacter, рекомбинантные штаммы E. coli. Then, methods were developed for producing superoxide dismutase using microorganisms, in particular, such as Pseudomonas putida, Nocardopsis, Gluconobacter, and recombinant E. coli strains.

Для получения фермента микроорганизмы выращивали на подходящих питательных средах в традиционных для этих микроорганизмов условиях и выделяли целевой продукт из клеточной биомассы. To obtain the enzyme, microorganisms were grown on suitable nutrient media under conditions traditional for these microorganisms and the target product was isolated from cell biomass.

Наиболее близким к предложенному по технической сущности является способ получения супероксиддисмутазы при использовании дрожжевой культуры Saccharomyces cerevisiae. Closest to the proposed technical essence is a method for producing superoxide dismutase using the yeast culture Saccharomyces cerevisiae.

Относительным недостатком этого способа является то, что может использоваться только богатая витаминами ферментационная среда и уровень аэрации должен быть очень высоким. A relative disadvantage of this method is that only a vitamin-rich fermentation medium can be used and the aeration level must be very high.

Цель изобретения - разработка способа, позволяющего получать супероксиддисмутазу микробиологическим методом в промышленных масштабах, используя продуценты, утилизирующие отходы существующих производств. The purpose of the invention is the development of a method that allows you to get superoxide dismutase microbiological method on an industrial scale, using producers that utilize waste from existing industries.

Поставленная цель была достигнута в результате использования в качестве продуцента супероксиддисмутазы представителей вида дрожжей Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, способных расти и образовывать значительные количества фермента на отходах молочного производства. This goal was achieved as a result of the use of representatives of the yeast species Kluyveromyces marxianus var. As a producer of superoxide dismutase. bulgaricus, able to grow and form significant amounts of the enzyme on waste from dairy production.

Было установлено, что целый ряд штаммов дрожжей Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus способны внутриклеточно накапливать супероксиддисмутазу при выращивании на отходах производства сухого молока, концентрированного молока и других молочных продуктов, что видно из данных табл. 1
Из представленных данных видно, что свойство биосинтезировать супероксиддисмутазу присуще исследуемому виду в целом хотя уровень биосинтеза значительно колеблется у отдельных штаммов.It has been found that a number of strains of the yeast Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus is able to accumulate superoxide dismutase intracellularly when grown on the waste products of powdered milk, concentrated milk and other dairy products, as can be seen from the data in table. 1
From the presented data it is seen that the property of biosynthesis of superoxide dismutase is inherent in the studied species as a whole, although the level of biosynthesis varies significantly in individual strains.

Дальнейшие экспериментальные исследования позволили выявить среди представителей вида Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus умеренно термофильные штаммы, оптимум роста у которых лежит в пределах 40-45^o. Некоторые сведения о них приведены в табл. 2.Further experimental studies revealed among representatives of the species Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus moderately thermophilic strains, the optimum growth of which lies in the range of 40-45 ^o . Some information about them is given in table. 2.

Можно заключить, что штаммы Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus различаются по чувствительности к температуре и среди них имеются умеренно термофильные штаммы. It can be concluded that the strains of Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus differ in sensitivity to temperature and among them there are moderately thermophilic strains.

Сущность предложенного способа состоит в том, что штаммы-продуценты супероксиддисмутазы вида Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus выращивают на питательных средах на основе отходов производства молочных продуктов и обеспечивают тем самым накопление в дрожжевых клетках искомого фермента. The essence of the proposed method lies in the fact that the producer strains of superoxide dismutase species Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus is grown on nutrient media based on dairy waste and thereby ensures the accumulation of the desired enzyme in yeast cells.

В качестве отходов производства молочных продуктов могут быть названы фильтрат молочной сыворотки - отход производства масла, брынзы, сыра, ультрафильтрат молока - отход производства сухого молока и др. As waste products for the production of dairy products, whey filtrate - the waste product of butter, feta cheese, cheese, ultrafiltrate of milk - product waste milk powder, etc.

Отходы молочного производства могут являться или единственным питательным субстратом или могут быть обогащены дополнительными источниками питания и/или ростовыми факторами. Waste from dairy production can be either the only nutrient substrate or can be enriched with additional food sources and / or growth factors.

Полученная предложенным способом супероксиддисмутаза по своим характеристикам несколько отличается от этого же фермента, полученного из других источников, и это показано в табл. 3
Пример 1. Культуру дрожжей Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus штамм T₃ заселили в ферментер "Biostat" с рабочим объемом 8,5 л. Выращивание проводили на среде, содержащей стерильный фильтрат молочной сыворотки, обогащенной 10% фильтрата дрожжевого гомогената и 0,3 мг/л никотиновой кислоты. Фильтрат дрожжевого гомогената является производственным отходом при выделении из дрожжевых клеток супероксиддисмутазы или сопутствующих ферментов.Obtained by the proposed method, superoxide dismutase in its characteristics is somewhat different from the same enzyme obtained from other sources, and this is shown in table. 3
Example 1. Culture of the yeast Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus strain T _{3 was} colonized in a Biostat fermenter with a working volume of 8.5 liters. Cultivation was carried out on a medium containing sterile whey filtrate enriched with 10% yeast homogenate filtrate and 0.3 mg / l nicotinic acid. The yeast homogenate filtrate is a production waste when superoxide dismutase or related enzymes are isolated from yeast cells.

Фильтрат молочной сыворотки содержал 3,28% сахаров. Доза посевного материала составляла 1%. Whey filtrate contained 3.28% sugars. The dose of seed was 1%.

Культуральная среда имела значение pH 4,5 и это значение поддерживалось в процессе культивирования 12%-ным раствором аммиака. The culture medium had a pH value of 4.5 and this value was maintained during cultivation with a 12% ammonia solution.

Процесс культивирования проводился при 35^oC и продолжался 30 ч.The cultivation process was carried out at 35 ^o C and lasted 30 hours

После прекращения процесса выход дрожжевой биомассы составлял 13 г абсолютно сухого вещества с 1 л среды или 40% от содержания в ней сахаров. After termination of the process, the yeast biomass yield was 13 g of absolutely dry matter with 1 liter of medium or 40% of the sugar content in it.

В осветленном гомогенате дрожжевых клеток содержание супероксиддисмутазы составило 87 Е/мг белка. In the clarified yeast cell homogenate, the content of superoxide dismutase was 87 U / mg protein.

Пример 2. Штамм Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus T₁ выращивали на ультрафильтрате молочной сыворотки с 10% фильтрата гомогенизированных дрожжей. Культивирование проводили при 28^oC в течение 30 ч, поддерживая pH на уровне 4,3 - 4,5. Ультрафильтрат сыворотки содержал 3,9% сахаров. Фильтрат гомогенизированных дрожжей был получен как отход производства при выделении из клеток супероксиддисмутазы.Example 2. The strain Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus T _{1 was} grown on whey ultrafiltrate with 10% homogenized yeast filtrate. The cultivation was carried out at 28 ^o C for 30 h, maintaining the pH at the level of 4.3 - 4.5. Serum ultrafiltrate contained 3.9% sugars. Homogenized yeast filtrate was obtained as a waste product from the isolation of superoxide dismutase from cells.

Выход дрожжевой биомассы составил 40,2% от исходного содержания сахаров. The yeast biomass yield was 40.2% of the initial sugar content.

Накопленную биомассу отделили, промыли фосфатным буфером pH 7,8 и механическим путем разрушили. Активность супероксиддисмутазы в фильтрате бесклеточного гомогената составила 57 E/мг белка. The accumulated biomass was separated, washed with pH 7.8 phosphate buffer and destroyed mechanically. The activity of superoxide dismutase in the filtrate of cell-free homogenate was 57 E / mg protein.

Заявитель полагает, что предложенный способ получения супероксиддисмутазы отвечает требованиям, предъявленным к изобретению, так как аналогичных способов, предполагающих использование продуцентов из вида Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, способных расти на отходах переработки молока, в доступной литературе не описано. The applicant believes that the proposed method for producing superoxide dismutase meets the requirements of the invention, since similar methods involving the use of producers from the species Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, capable of growing on the waste of milk processing, is not described in the available literature.

Источники информации, принятые во внимание
1. Заявка Франции 85 17078, кл. C 12 N 9/02, 1987.Sources of information taken into account
1. Application of France 85 17078, cl. C 12 N 9/02, 1987.

2. Авт. свид. СССР 1413133, кл. C 12 N 9/02, 1986. 2. Auth. testimonial. USSR 1413133, class C 12 N 9/02, 1986.

3. Патент ГДР 252615, кл. C 12 N 9/02, 1987. 3. Patent GDR 252615, cl. C 12 N 9/02, 1987.

4. Европейский патент 0 218 480, кл. C 12 N 9/02, 1987. 4. European patent 0 218 480, cl. C 12 N 9/02, 1987.

5. Патент Японии 63-48514, кл. C 12 N 9/02, 1988. 5. Japan Patent 63-48514, CL C 12 N 9/02, 1988.

6. Патент Японии 63-209584, кл. C 12 N 9/02, 1988. 6. Japan Patent 63-209584, cl. C 12 N 9/02, 1988.

7. Famg-Jeu. et ak. "Appl. Microbiol. Biotechnol", 1987,26,531. 7. Famg-Jeu. et ak. "Appl. Microbiol. Biotechnol", 1987,26,531.

Claims

1. Способ получения супероксиддисмутазы путем выращивания продуцента на среде, содержащей источник углерода и азота, с последующим выделением фермента из клеточной биомассы, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют культуру Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus. 1. A method of producing superoxide dismutase by growing a producer on a medium containing a carbon and nitrogen source, followed by isolation of the enzyme from cell biomass, characterized in that the culture Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выращивание осуществляют на среде на основе фильтрата молочной сыворотки. 2. The method according to p. 1, characterized in that the cultivation is carried out on a medium based on whey filtrate.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выращивание осуществляют на среде, обогащенной никотиновой кислотой. 3. The method according to p. 1, characterized in that the cultivation is carried out on a medium enriched in nicotinic acid.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве источника никотиновой кислоты используют отходы, образующиеся в процессе выделения фермента. 4. The method according to claim 3, characterized in that the waste generated in the process of isolation of the enzyme is used as the source of nicotinic acid.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что выращивание продукта осуществляют при 35^oC.5. The method according to claim 1, characterized in that the cultivation of the product is carried out at 35 ^o C.