RU2107072C1 - Method of preparing amino acid or nucleotide sequences on substrate, method of screening large number of amino acid sequences, and screening substrate - Google Patents

Abstract

FIELD: biochemical investigations. SUBSTANCE: when biochemically studying biological systems to reveal interrelation between molecular structure and molecular activity, amino acid or nucleotide sequences on substrate are obtained by affecting the first region of substrate (selected from the group including polymerized Langmuir-Blodgett film, glass with functional groups, germanium, silicon, polytetrafluoroethylene, polystyrene, arsenide, gallium, and their combinations) with activator to remove protection groups and affecting the first region with first amino acid or nucleotide monomer. Provided is also method of screening large number of amino acid sequences for their binding with receptor. Biological activity screening substrate contains at least 1000 different peptide and nucleotide ligands in predetermined regions. EFFECT: facilitated investigation of biological systems. 32 cl, 17 dwg, 5 tbl

Description

Изобретение относится к синтезу и размещению материалов в определенном месте. В частности, одним из аспектов изобретения являются способ получения различных химических последовательностей в определенных местах на поверхности одного субстрата и устройство для его осуществления. Эти способ и устройство могут использоваться, например, для получения олигомеров, пептидов, нуклеиновых кислот, олигосахаридов, фосфолипидов, полимеров или обладающих лекарственными свойствами препаратов, в частности, для возможности получения большого количества различных химических соединений для использования их при скрининге на биологическую активность. The invention relates to the synthesis and placement of materials in a specific place. In particular, one of the aspects of the invention is a method for producing various chemical sequences in certain places on the surface of one substrate and a device for its implementation. This method and device can be used, for example, to obtain oligomers, peptides, nucleic acids, oligosaccharides, phospholipids, polymers or drugs with medicinal properties, in particular, to obtain a large number of different chemical compounds for use in screening for biological activity.

Выяснение взаимосвязи между строением молекул и их активностью является главной задачей при изучении биологических систем. Знание такой зависимости имеет важное значение, например, для понимания механизма функционирования ферментов, путей взаимодействия клеток друг с другом, а также для клеточного контроля и действия систем обратной связи. Clarification of the relationship between the structure of molecules and their activity is the main task in the study of biological systems. Knowledge of this relationship is important, for example, to understand the mechanism of the functioning of enzymes, the ways in which cells interact with each other, as well as for cell control and feedback systems.

Известно, что некоторые молекулы взаимодействуют и связываются с другими молекулами, имеющими весьма специфическое трехмерное пространственное и электронное распределение. Любую большую молекулу, обладающую такой специфичностью, можно рассматривать как рецептор независимо от того, является ли она ферментом, катализирующим гидролиз метаболического промежуточного соединения, белком поверхности клетки, служащим промежуточным звеном при мембранном транспорте ионов, гликопротеином, служащим для идентификации конкретной клетки по отношению к ее соседним клеткам, антителом ИгГ-класса, циркулирующим в плазме, олигонуклеотидной последовательностью ДНК в ядре и т.п. Различные молекулы, селективно связывающие рецепторы, известны под названием лиганды. It is known that some molecules interact and bind with other molecules having a very specific three-dimensional spatial and electronic distribution. Any large molecule with such specificity can be regarded as a receptor, regardless of whether it is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of a metabolic intermediate, a cell surface protein, serves as an intermediate in the membrane transport of ions, a glycoprotein that serves to identify a specific cell in relation to its neighboring cells, an IgG-class antibody circulating in the plasma, an oligonucleotide DNA sequence in the nucleus, and the like. Various molecules selectively binding receptors are known as ligands.

Существуют многочисленные методы анализа для определения степени сродства известных рецепторов и лигандов, однако информация, которая может быть получена из такого рода экспериментов, часто ограничивается числом и типом известных лигандов. Новые лиганды открываются иногда случайно или благодаря использованию новых методов для изучения строения молекул, включая рентгеновский кристаллографический анализ и рекомбинантные генетические методы исследования белков. There are numerous analytical methods for determining the degree of affinity of known receptors and ligands, however, the information that can be obtained from such experiments is often limited by the number and type of known ligands. New ligands are sometimes discovered randomly or through the use of new methods to study the structure of molecules, including x-ray crystallographic analysis and recombinant genetic methods for the study of proteins.

Пептиды небольших размеров являются типичной системой для выяснения взаимосвязи между их строением и биологической активностью. Пептиды представляют собой последовательности аминокислот. При конденсации двадцати природных аминокислот в полимерные молекулы возникает огромное количество трехмерных конфигураций, структура которых зависит от конкретной последовательности аминокислот и природы растворителя. Так, например, из 20 природных аминокислот в принципе может быть получено 20⁵ или 3,2 миллиона различных пентапептидов. Вероятность того, что молекулы такого размера могут оказаться полезными при изучении образования рецепторных связей, подтверждается данными эпитопного анализа, из которых следует, что некоторые антитела распознают с высокой специфичностью последовательности, состоящие из нескольких аминокислот. Кроме того, средний молекулярный вес аминокислот ставит пептиды с небольшими размерами молекул в один ряд со многими использующимися в настоящее время фармацевтическими препаратами.Small peptides are a typical system for elucidating the relationship between their structure and biological activity. Peptides are amino acid sequences. When twenty natural amino acids are condensed into polymer molecules, a huge number of three-dimensional configurations arise, the structure of which depends on the specific amino acid sequence and the nature of the solvent. So, for example, from 20 natural amino acids, in principle, 20 ⁵ or 3.2 million different pentapeptides can be obtained. The likelihood that molecules of this size may be useful in studying the formation of receptor bonds is confirmed by epitope analysis, from which it follows that some antibodies recognize sequences consisting of several amino acids with high specificity. In addition, the average molecular weight of amino acids puts peptides with small molecular sizes on a par with many of the currently used pharmaceuticals.

Одной из задач поиска, основанного на таком изучении взаимосвязи между строением молекул и их активностью, является обнаружение соединений, обладающих лекарственными свойствами. В большинстве случаев современный поиск лекарственных препаратов можно рассматривать как поиск новых лигандов с нужным характером специфичности к биологически важным рецепторам. One of the tasks of the search, based on such a study of the relationship between the structure of molecules and their activity, is the discovery of compounds with medicinal properties. In most cases, the modern search for drugs can be considered as a search for new ligands with the desired character of specificity for biologically important receptors.

Другим примером является поиск новых соединений для использования в сельском хозяйстве, например, в качестве пестицидов и гербицидов. Another example is the search for new compounds for use in agriculture, for example, as pesticides and herbicides.

Иногда попытки создания рациональных подходов к конструированию лигандов оказываются трудными или непродуктивными. Известные способы получения большого количества различных полимеров при попытке использования их в масштабах, достаточных для эффективного рационального или случайного скрининга, оказались весьма непродуктивными. Так, например, метод Merrifield (J. Am. chem. Soc. , 1963, 85, 2149-2154), на который мы все время ссылаемся в настоящей заявке использовался для синтеза пептидов на твердой подложке. По этому способу аминокислота ковалентно связывается с подложкой из нерастворимого полимера. Другая аминокислота с защищенной альфа-группой подвергается взаимодействию с вышеуказанной ковалентно-связанной кислотой с образованием в результате дипептида. После промывки защитную группу удаляют и добавляют к дипептиду третью кислоту с защищенной альфа-группой. Этот процесс продолжают до получения пептида нужной длины и с нужной последовательностью. Использование метода Merrifield экономически неоправданно для синтеза более, чем нескольких пептидных последовательностей в день. Sometimes attempts to create rational approaches to the design of ligands are difficult or unproductive. Known methods for producing a large number of different polymers when trying to use them on a scale sufficient for effective rational or random screening have proven to be very unproductive. For example, the Merrifield method (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154), to which we all the time refer in this application, was used for the synthesis of peptides on a solid support. In this method, an amino acid is covalently bound to an insoluble polymer support. Another amino acid with a protected alpha group is reacted with the above covalently bound acid to form a dipeptide. After washing, the protective group is removed and a protected alpha-group third acid is added to the dipeptide. This process is continued until a peptide of the desired length and sequence is obtained. Using the Merrifield method is not economically justified for the synthesis of more than a few peptide sequences per day.

Для синтеза большого количества полимерных последовательностей было предложено также использовать несколько реакторов для синтеза полимеров. Так, например, для синтеза линейного полимера на твердофазной подложке можно использовать трубчатый реактор с автоматическим последовательным добавлением реагентов. Этот способ, однако, не позволяет синтезировать достаточно большое количество полимерных последовательностей для эффективного и экономически оправданного скрининга. For the synthesis of a large number of polymer sequences, it has also been proposed to use several reactors for the synthesis of polymers. So, for example, for the synthesis of a linear polymer on a solid-phase substrate, a tubular reactor with automatic sequential addition of reagents can be used. This method, however, does not allow the synthesis of a sufficiently large number of polymer sequences for effective and economically viable screening.

Известны также способы получения большого количества полимерных последовательностей, по которым в перфорированную емкость помещают заданное количество реакционноспособных частиц, размер которых больше размера отверстий. Такие емкости могут быть подвергнуты селективному взаимодействию с нужными материалами для получения целевых молекул с нужными последовательностями. Как и в случае других известных способов, этот способ нельзя, в частности, использовать для синтеза достаточно большого количества различных полипептидов для эффективного скрининга. There are also known methods for producing a large number of polymer sequences, in which a predetermined number of reactive particles are placed in a perforated container, the size of which is larger than the size of the holes. Such containers can be subjected to selective interaction with the right materials to obtain the target molecules with the desired sequences. As in the case of other known methods, this method cannot, in particular, be used to synthesize a sufficiently large number of different polypeptides for effective screening.

В литературе описаны также другие способы и среди них синтез пептидов на 96 пластиковых штифтах, соответствующих формату стандартного титрационного микропланшета. К сожалению, несмотря на определенный прогресс этих способов, они не позволяют решить главных проблем. Так, например, с их помощью нельзя экономично синтезировать и исследовать большое количество различных последовательностей. Other methods are also described in the literature, among them peptide synthesis on 96 plastic pins corresponding to the format of a standard microtiter plate. Unfortunately, despite some progress in these methods, they do not allow to solve the main problems. So, for example, with their help it is impossible to synthesize and study a large number of different sequences economically.

Из всего вышесказанного следует, что существует необходимость в разработке усовершенствованного способа и устройства для синтеза большого количества различных химических последовательностей в определенном месте. From the foregoing, it follows that there is a need to develop an improved method and device for the synthesis of a large number of different chemical sequences in a specific place.

Описаны усовершенствованные способ и устройство для получения различных полимеров. Improved method and apparatus for producing various polymers are described.

По предпочтительному варианту осуществления изобретения на субстрате иммобилизируются сшивающие молекулы, концевые реакционноспособные функциональные группы которых защищены фотоотщепляемыми защитными группами. С помощью литографических способов фотоотщепляемая защитная группа подвергается воздействию света и удаляется из сшивающих молекул в первых выбранных областях. Субстрат затем промывают или другим образом подвергают контактированию с первым мономером, который реагирует со свободными функциональными группами сшивающих молекул. По предпочтительному варианту осуществления изобретения указанным мономером является аминокислота, имеющая фотоотщепляемую защитную группу у аминного или карбоксильного конца, и сшивающая молекула связывается с аминной или карбоксильной группой, защищенной фотоотщепляемой защитной группой. According to a preferred embodiment of the invention, crosslinking molecules are immobilized on the substrate, the terminal reactive functional groups of which are protected by photodetachable protective groups. Using lithographic methods, the photodisorbed protective group is exposed to light and removed from the crosslinking molecules in the first selected regions. The substrate is then washed or otherwise contacted with a first monomer that reacts with the free functional groups of the crosslinking molecules. According to a preferred embodiment of the invention, said monomer is an amino acid having a photodetectable protecting group at the amine or carboxyl end, and the crosslinking molecule binds to an amine or carboxyl group protected by a photodetachable protecting group.

После этого воздействию света подвергаются вторые выбранные области, в результате чего в этих областях удаляется фотоотщепляемая защитная группа из комплекса сшивающая молекула - защищенная аминокислота. Субстрат затем подвергают контактированию с вторым мономером, имеющим фотоотщепляемую защитную группу, в результате чего происходит взаимодействие его со свободными функциональными группами. Этот процесс повторяют, используя соответствующим образом подобранные мономеры, до тех пор, пока не получают полимеры нужной длины с нужной химической последовательностью. Фотолабильные группы затем при желании удаляют и последовательность при желании обрывают. Защитные группы боковой цепи при наличии их в молекуле также удаляют. After this, the second selected regions are exposed to light, as a result of which a photodisorbed protective group is removed from the complex of the crosslinking molecule - protected amino acid in these regions. The substrate is then contacted with a second monomer having a photodetachable protecting group, as a result of which it interacts with free functional groups. This process is repeated using appropriately selected monomers until the polymers of the desired length with the desired chemical sequence are obtained. The photolabile groups are then removed, if desired, and the sequence is terminated if desired. Side chain protecting groups, if present in the molecule, are also removed.

Благодаря использованию литографической техники, описанной в настоящей заявке, становится возможным направлять свет на относительно небольшие и точно определенные участки субстрата. В результате обеспечивается возможность синтезировать определенные химические последовательности с определенным местоположением на субстрате. Through the use of the lithographic technique described in this application, it becomes possible to direct light to relatively small and well-defined areas of the substrate. As a result, it is possible to synthesize certain chemical sequences with a specific location on the substrate.

Полученный в результате субстрат может использоваться для различных целей, в том числе, например, для скрининга большого количества полимеров, направленного на определение их биологической активности. Для определения биологической активности субстрат подвергают выдержке с одним или несколькими рецепторами, такими как полные клеточные антитела, рецепторы на пузырьках, липиды, или любыми другими рецепторами. Выбранные рецепторы предпочтительно метят, например, флуоресцентной или радиоактивной меткой, или меченным антителом, способным взаимодействовать с рецептором. Положение метки на субстрате определяют с помощью, например, фотонного детектора или авторадиографии. Зная последовательность материала в месте ее связи, определенном путем детектирования, можно быстро определить, какая последовательность связана с рецептором. Поэтому такой способ может использоваться для скрининга большого количества пептидов. Другие возможные области применения настоящего изобретения включают диагностические определения, при которых различные антитела против конкретных рецепторов размещают на субстрате, например, скрининг сыворотки крови на иммунодефицит. Другими областями применения являются, например, селективное "легирование" органических материалов в полупроводниковых устройствах и т.п. The resulting substrate can be used for various purposes, including, for example, for screening a large number of polymers aimed at determining their biological activity. To determine the biological activity, the substrate is exposed to one or more receptors, such as full cell antibodies, receptors on the vesicles, lipids, or any other receptors. The selected receptors are preferably labeled, for example, with a fluorescent or radioactive label, or with a labeled antibody capable of interacting with the receptor. The position of the label on the substrate is determined using, for example, a photon detector or autoradiography. Knowing the sequence of the material in the place of its connection, determined by detection, you can quickly determine which sequence is associated with the receptor. Therefore, such a method can be used to screen a large number of peptides. Other possible applications of the present invention include diagnostic determinations in which various antibodies against specific receptors are placed on a substrate, for example, serum screening for immunodeficiency. Other applications are, for example, selective doping of organic materials in semiconductor devices and the like.

Одним из предметов настоящего изобретения является усовершенствованная реакторная система для синтеза полимеров. Такая реакторная система включает держатель субстрата, расположенный вокруг него таким образом, что между субстратом и держателем образуется реакционное пространство, через которое или в которое подаются насосом или протекают жидкие реагенты. На субстрате размещается или фокусируется маска и освещается таким образом, чтобы удалить защитные группы в определенных областях субстрата в реакционном пространстве. Мономер прокачивают через реакционное пространство или другим образом подвергают контактированию с субстратом, в результате чего происходит взаимодействие его с областями с удаленными защитными группами. Путем создания на субстрате областей с селективно удаленными защитными группами и пропускания через реакционное пространство определенных мономеров можно синтезировать нужные полимеры с известным расположением. One of the objects of the present invention is an improved polymer synthesis reactor system. Such a reactor system includes a substrate holder located around it so that between the substrate and the holder a reaction space is formed through which or into which liquid reactants are pumped or flow. A mask is placed or focused on the substrate and illuminated in such a way as to remove protective groups in certain areas of the substrate in the reaction space. The monomer is pumped through the reaction space or otherwise subjected to contact with the substrate, as a result of which it interacts with regions with removed protective groups. By creating regions with selectively removed protective groups on a substrate and passing certain monomers through the reaction space, the desired polymers can be synthesized with a known location.

Предметом изобретения являются также усовершенствованные способы детектирования и устройство для их осуществления. В предлагаемых способе и устройстве для детектирования используется субстрат с большим количеством полимерных последовательностей, расположенных в определенных точках его поверхности. Такой субстрат подвергается взаимодействию с имеющим флуоресцентную метку рецептором, который связывается с одной или несколькими полимерными последовательностями. Субстрат затем помещают в детекторный микроскоп для идентификации локаций, в которых произошло связывание. Микроскопное детектирующее устройство включает монохроматический или полихроматический источник света для облучения субстрата, средства для детектирования флуоресцентного излучения субстрата и средства для определения места, из которого исходит флуоресцирующее излучение. В некоторых вариантах осуществления средства для детектирования флуоресцентного излучения могут включать счетчик фотонов. Средства для определения места, из которого исходит флуоресцентное излучение, могут включать координатный стол для субстрата. Передвижение каретки и сбор данных осуществляются с помощью цифрового компьютера по специальной программе. The subject of the invention are also improved detection methods and apparatus for their implementation. In the proposed method and device for detection, a substrate is used with a large number of polymer sequences located at specific points on its surface. Such a substrate is reacted with a fluorescently labeled receptor that binds to one or more polymer sequences. The substrate is then placed in a detection microscope to identify locations where binding has occurred. The microscopic detecting device includes a monochromatic or polychromatic light source for irradiating the substrate, means for detecting the fluorescent radiation of the substrate, and means for determining the place from which the fluorescent radiation emits. In some embodiments, fluorescence detection means may include a photon counter. Means for determining the location from which the fluorescence emanates may include a coordinate table for the substrate. Carriage movement and data collection are carried out using a digital computer according to a special program.

Более подробно суть настоящего изобретения и его преимущества излагаются в других частях описания и на прилагаемых чертежах. The essence of the present invention and its advantages are described in more detail in other parts of the description and in the accompanying drawings.

На фиг. 1 изображены маскирование и облучение субстрата в первой области, поперечный разрез субстрата; на фиг. 2 - субстрат после взаимодействия с мономером "A"; на фиг. 3 - облучение субстрата во второй области; на фиг. 4 - субстрат после взаимодействия с мономером "B"; на фиг. 5 - облучение мономера "A"; на фиг. 6 - субстрат после второго взаимодействия с "B"; на фиг. 7 - субстрат после окончания обработки; на фиг. 8 и 9 - два варианта реакторной системы для формирования на субстрате большого количества полимеров; на фиг. 10 - детекторное устройство для определения местоположения флуоресцентных меток на субстрате; на фиг. 11 - иллюстрация способа получения тримеров мономеров "A" и "B"; на фиг. 12 и 13 - флуоресцентные следы для стандартных флуоресцентных бусин; на фиг. 14 - флуоресцентные кривые для NVOC соответственно без облучения светом и после облучения; на фиг. 15 и 16 - формирование предметного стекла с контрольной структурой YGGFL и GGFL, подвергнутого взаимодействию с антителом Герца; на фиг. 17 - картирование шестнадцати последовательностей, синтезированных на двух разных стеклянных предметных стеклах. In FIG. 1 shows masking and irradiation of the substrate in the first region, a cross section of the substrate; in FIG. 2 - substrate after interaction with monomer "A"; in FIG. 3 - irradiation of the substrate in the second region; in FIG. 4 - substrate after interaction with monomer "B"; in FIG. 5 - irradiation of monomer "A"; in FIG. 6 - substrate after the second interaction with "B"; in FIG. 7 - substrate after the end of processing; in FIG. 8 and 9 are two versions of a reactor system for forming a large number of polymers on a substrate; in FIG. 10 is a detector device for determining the location of fluorescent labels on a substrate; in FIG. 11 is an illustration of a method for producing trimers of monomers "A" and "B"; in FIG. 12 and 13 - fluorescent traces for standard fluorescent beads; in FIG. 14 - fluorescence curves for NVOC, respectively, without exposure to light and after exposure; in FIG. 15 and 16 - the formation of a glass slide with a control structure of YGGFL and GGFL, subjected to interaction with Hertz's antibody; in FIG. 17 is a mapping of sixteen sequences synthesized on two different glass slides.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления. Detailed Description of Preferred Embodiments

Содержание
1. Словарь.Content
1. Dictionary.

2. Общие положения. 2. General provisions.

3. Синтез полимеров. 3. Synthesis of polymers.

4. Подробное описание одного из вариантов осуществления реакторной системы. 4. A detailed description of one embodiment of a reactor system.

5. Подробное описание одного из вариантов осуществления флуоресцентного детекторного устройства. 5. A detailed description of one embodiment of a fluorescent detector device.

6. Определение прочности связывания рецепторов. 6. Determination of the binding strength of receptors.

7. Примеры. 7. Examples.

A. Подготовка предметных стекол. A. Preparation of slides.

B. Синтез восьми тримеров "A" и "B". B. Synthesis of eight trimers "A" and "B".

C. Синтез димера аминопропиловой и флуоресцентной групп. C. Synthesis of a dimer of aminopropyl and fluorescent groups.

D. Определение величины сигнала. D. Determination of signal magnitude.

E. Определение числа молекул на единицу поверхности. E. Determination of the number of molecules per unit surface.

F. Удаление NVOC и введение флуоресцентной метки. F. Removal of NVOC and the introduction of a fluorescent label.

C. Использование маски при удалении NVOC. C. Using a mask to remove NVOC.

H. Введение YGGFL и последующее взаимодействие с антителом Герца и козьим антимышиным антителом. H. Administration of YGGFL and subsequent interaction with Hertz antibody and goat anti-mouse antibody.

I. Мономер-мономерное формирование YGGFL и последующее взаимодействие его с меченым антителом. I. Monomer-monomeric formation of YGGFL and its subsequent interaction with a labeled antibody.

J. Мономер-мономерный синтез PGGFL и YGGFL. J. Monomer-monomer synthesis of PGGFL and YGGFL.

K. Мономер-мономерный синтез YGGFL и YPGGFL. K. Monomer-monomer synthesis of YGGFL and YPGGFL.

L. Синтез шестнадцати различных аминокислотных последовательностей и определение их сродства с антителом Герца. L. Synthesis of sixteen different amino acid sequences and determination of their affinity for the Hertz antibody.

8. Другой вариант осуществления изобретения. 8. Another embodiment of the invention.

9. Выводы. 9. Conclusions.

Словарь
Нижеперечисленные термины, использующиеся в настоящем описании, имеют следующие значения:
1. Комплементарный - употребляется для обозначения топологической совместимости или совместимости взаимодействующих поверхностей молекулы лиганда и ее рецептора, т. е. рецептор и его лиганд могут быть названы комплементарными, кроме того, комплементарными являются характеристики контактирующих поверхностей.Vocabulary
The following terms used in the present description have the following meanings:
1. Complementary — used to indicate the topological compatibility or compatibility of the interacting surfaces of a ligand molecule and its receptor, that is, the receptor and its ligand can be called complementary, in addition, the characteristics of the contacting surfaces are complementary.

2. Эпитоп - часть молекулы антигена, трансдифференцированная областью взаимодействия с подклассом рецепторов, известных под названием антитела. 2. An epitope is a part of an antigen molecule transdifferentiated by a region of interaction with a subclass of receptors known as antibodies.

3. Лиганд - лигандом называется молекула, узнаваемая определенным рецептором, примерами лигандов, которые могут быть исследованы с помощью заявляемого изобретения, являются (этими примерами число таких лигандов однако не ограничивается) агонисты и антагонисты клеточных мембранных рецепторов, токсины и яды, вирусные эпитопы, гормоны (например, наркотики, стероиды и т. д. ), гормонные рецепторы, пептиды, ферменты, субстраты ферменты, лекарства, лектины, сахара, одигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты, одигосахариды, белки и моноклональные антитела. 3. Ligand - a ligand is a molecule recognized by a particular receptor, examples of ligands that can be studied using the claimed invention are (however, the number of such ligands is not limited to these examples) agonists and antagonists of cell membrane receptors, toxins and poisons, viral epitopes, hormones (e.g. drugs, steroids, etc.), hormone receptors, peptides, enzymes, substrates enzymes, drugs, lectins, sugars, odigonucleotides, nucleic acids, odigosaccharides, proteins and monoclonal antibodies la

4. Мономер - элемент набора небольших молекул, которые могут соединяться друг с другом, образуя полимер, такой набор мономеров включает, не ограничиваясь, однако, приведенными примерами, в частности, набор природных L - аминокислот, набор D - аминокислот, набор синтетических аминокислот, набор нуклеотидов и набор пентоз и гексоз, в используемом в настоящем описании значения под мономерами имеется в виду любой член базисного набора для синтеза полимера, например, димеры L-аминокислот образуют базисный набор 400 мономеров для синтеза полипетидов, на отдельных стадиях синтеза полимера могут использоваться различные наборы мономеров. 4. A monomer is an element of a set of small molecules that can combine with each other to form a polymer, such a set of monomers includes, but is not limited to, the examples given, in particular, a set of natural L - amino acids, a set of D - amino acids, a set of synthetic amino acids, a set of nucleotides and a set of pentoses and hexoses, in the meaning used in the present description, monomers mean any member of the basic set for the synthesis of the polymer, for example, L-amino acid dimers form a basic set of 400 monomers for the synthesis of polypetides, At individual stages of polymer synthesis, different sets of monomers can be used.

5. Пептиды - полипер, образованный альфа-аминокислотами в качестве мономеров, связанными между собой амидными связями, другое название - полипептиды, в тексте настоящей заявки, когда речь идет об аминокислотах, имеются в виду как L - оптические, так и D - оптические изомеры, молекулы пептидов состоят из более, чем двух, а часто из более, чем двадцати аминокислот, для обозначения аминокислот используются стандартные аббревиатуры (например, P обозначает пролин), эти аббревиатуры приведены в руководстве Stryer, Biochemistry 3-е изд., 1988, которое включено в перечень ссылок. 5. Peptides - a polyper formed by alpha-amino acids as monomers linked by amide bonds, another name is polypeptides, in the text of this application, when it comes to amino acids, we mean both L - optical and D - optical isomers , peptide molecules consist of more than two, and often more than twenty amino acids, standard abbreviations are used for amino acids (for example, P stands for proline), these abbreviations are given in the manual Stryer, Biochemistry 3rd ed., 1988, which included in per ry links.

6. Излучение - энергия, которая может селективно излучаться, включает энергию с длиной волны 10^-14 - 10⁴ м, это может быть, например, излучение электронного пучка, гамма-излучение, рентгеновское излучение, ультрафиолетовое излучение, излучение энергии видимого света, инфракрасное излучение, микроволновое излучение и радиоволновое излучение, под "облучением" имеется в виду обработка поверхности излучением.6. Radiation - energy that can be selectively radiated includes energy with a wavelength of ^10-14 - 10 ⁴ m, it can be, for example, electron beam radiation, gamma radiation, x-ray radiation, ultraviolet radiation, visible light energy radiation, infrared radiation, microwave radiation and radio wave radiation, by "irradiation" is meant surface treatment by radiation.

7. Рецептор - молекула, имеющая сродство к определенному лиганду, рецепторы могут быть природными и искусственными, они могут использоваться как сами по себе, так и в виде агрегатов с другими частицами, рецепторы могут быть связаны с помощью ковалентных или нековалентных связей со связующим элементом или непосредственно, или через специфическое связующее вещество, примеры рецепторов, которые могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения, включают (этими примерами однако не ограничивается число возможных для использования рецепторов) антитела, клеточные мембранные рецепторы, моноклональные антитела и антисыворотки, связанные со специфическими антигенными детерминантами (например, на вирусах, клетках или других материалах), лекарства, полинуклеотиды, нуклеиновые кислоты, пептиды, кофакторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны и органеллы, иногда рецепторы называют в литературе антилигандами, в настоящей заявке между обоими терминами не делаются различия, "пара лиганды - рецептор" образуется при объединении двух макромолекул в результате молекулярного узнавания и представляет собой комплекс, другими примерами рецепторов, которые могут быть исследованы с помощью настоящего изобретения (этими примерами число таких рецепторов, однако, не ограничивается), являются: а) рецепторы микроорганизмов: обнаружение лигандов, которые могут связываться с рецепторами, например, специфический транспорт белков или ферментов, имеющий важное значение для выживания микроорганизмов, представляет интерес для получения нового класса антибиотиков. В частности, интерес представляет антибиотики против opportunistic fungi, protozoa и бактерий, стойких к существующим антибиотикам,
b) ферменты: например, место связывания ферментов, таких как ферментов, ответственных за расщепление нейтротрансмиттеров, обнаружение лигандов, связывающихся с определенными рецепторами с целью модулирования действия ферментов, расщепляющих различные нейротрансмиттеры, представляет интерес для получения лекарств для лечения нарушений нейротрансмиссии,
c) антитела: настоящее изобретение может, например, представлять интерес для определения места связывания лиганда в молекуле антитела, связанный с эпитопом исследуемого антигена, определение последовательности, имитирующей антигенный эпитоп, может привести к разработке вакцин, основой иммуногена которых является одна или несколько таких последовательностей, диагностические агенты или соединения, которые могут оказаться пригодными для лечения, например, аутоиммунных заболеваний (например, за счет блокирования аутоантител),
d) нуклеиновые кислоты: для получения последовательностей, связывающих ДНК или РНК, могут быть синтезированы последовательности нуклеиновых кислот,
e) каталитические полипептиды: полимеры, предпочтительно полипептиды, способствующие протеканию химических реакций, включая конверсию одного или нескольких реагентов с образованием одного или нескольких продуктов. В таких полипептидах обычно имеется рецепторная зона, специфичная по меньшей мере к одному реагенту или реакционноспособному промежуточному соединению, и реакционноспособная функциональная группа, расположенная рядом с этой рецепторной зоной, которая может химически модифицировать связанный реагент. Каталитические пептиды описаны, например, в заявке США N 404920, включенной в перечень ссылок к настоящей заявке.7. Receptor - a molecule that has an affinity for a specific ligand, receptors can be natural and artificial, they can be used both on their own and in the form of aggregates with other particles, the receptors can be connected via covalent or non-covalent bonds with a binding element or directly, or through a specific binding agent, examples of receptors that can be used in the practice of the present invention include (however, these examples do not limit the number of possible I receptors) antibodies, cell membrane receptors, monoclonal antibodies and antisera associated with specific antigenic determinants (for example, viruses, cells or other materials), drugs, polynucleotides, nucleic acids, peptides, cofactors, lectins, sugars, polysaccharides, cells, cell membranes and organelles, sometimes receptors are called antiligands in the literature, in this application no distinction is made between the two terms, a “ligand – receptor pair” is formed by combining two macromolecules into a result It is molecular recognition and is a complex, other examples of receptors that can be investigated using the present invention (these examples, however, the number of such receptors is not limited) are: a) microorganism receptors: detection of ligands that can bind to receptors, for example , specific transport of proteins or enzymes, which is important for the survival of microorganisms, is of interest for obtaining a new class of antibiotics. Of particular interest are antibiotics against opportunistic fungi, protozoa and bacteria resistant to existing antibiotics,
b) enzymes: for example, the binding site of enzymes, such as enzymes responsible for the cleavage of neutrotransmitters, the detection of ligands that bind to specific receptors to modulate the action of enzymes that cleave various neurotransmitters, is of interest for the preparation of drugs for the treatment of neurotransmission disorders,
c) antibodies: the present invention may, for example, be of interest for determining the ligand binding site in an antibody molecule associated with an epitope of a test antigen, the determination of a sequence that mimics an antigenic epitope can lead to the development of vaccines based on one or more of these sequences, diagnostic agents or compounds that may be suitable for the treatment of, for example, autoimmune diseases (for example, by blocking autoantibodies),
d) nucleic acids: to obtain sequences that bind DNA or RNA, nucleic acid sequences can be synthesized,
e) catalytic polypeptides: polymers, preferably polypeptides, that facilitate chemical reactions, including the conversion of one or more reagents to form one or more products. Such polypeptides typically have a receptor region specific for at least one reagent or a reactive intermediate, and a reactive functional group adjacent to that receptor zone that can chemically modify the bound reagent. Catalytic peptides are described, for example, in US application N 404920, included in the list of references to this application.

f) рецепторы гормонов: например, рецепторы инсулина и гормонов роста. Обнаружение лигандов, прочно связывающихся с такими рецепторами, может представлять интерес, например, для получения оральных препаратов взамен ежедневных инъекций, которые необходимо делать больным диабетом для снятия симптомов болезни, а также для замены редкого человеческого гормона роста, который может быть получен только из трупов или с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Другим примером являются рецепторы сосудосуживающих гормонов. Обнаружение лигандов, которые связываются с такими гормонами, может позволить создавать лекарства, контролирующие давление крови,
g) рецепторы наркотиков: обнаружение лигандов, которые связываются с рецепторами наркотиков в мозгу, может помочь создавать заменители морфина и других аналогичных лекарств, обладающие менее сильным наркотическим действием.f) hormone receptors: for example, insulin and growth hormone receptors. The discovery of ligands that bind strongly to such receptors may be of interest, for example, for receiving oral preparations instead of the daily injections that diabetes patients need to take to relieve the symptoms of the disease, and also to replace the rare human growth hormone that can only be obtained from corpses or using recombinant DNA technology. Another example is vasoconstrictor hormone receptors. Detection of ligands that bind to such hormones may allow the creation of drugs that control blood pressure,
g) drug receptors: detecting ligands that bind to drug receptors in the brain can help create substitutes for morphine and other similar drugs that have less potent drugs.

8. Субстрат - материал с жесткой или полужесткой поверхностью. В большинстве случаев по меньшей мере одна поверхность субстрата является практически плоской, хотя в отдельных случаях может оказаться необходимым физически разделить области синтезов различных полимеров с помощью, например, лунок, выступающих областей, канавок травления и т.п. По другому варианту на поверхности могут быть сформированы маленькие бисеринки, облегающие процесс синтеза. 8. Substrate - a material with a rigid or semi-rigid surface. In most cases, at least one surface of the substrate is almost flat, although in some cases it may be necessary to physically separate the synthesis regions of various polymers using, for example, holes, protruding regions, etching grooves, etc. In another embodiment, small beads may be formed on the surface to facilitate the synthesis process.

9. Защитная группа - материал, связанный с мономерным звеном, который может быть пространственно удален путем селективного воздействия активатора, например, электромагнитного излучения. Примерами защитных групп, которые могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения, являются нитровератрилоксикарбонил, нитробензилоксикарбонил, диметилдиметоксибензилоксикарбонил, 5-бром-7- нитроиндолинил, o-окси, α - метилциннамоил и 2-оксиметиленантрахинон. Другими примерами активаторов являются ионные пучки, магнитные поля, пучки электронов, рентгеновское излучение и т.п. 9. A protective group is a material associated with a monomer unit, which can be spatially removed by the selective action of an activator, for example, electromagnetic radiation. Examples of protecting groups that can be used in the practice of the present invention are nitroveratryloxycarbonyl, nitrobenzyloxycarbonyl, dimethyldimethoxybenzyloxycarbonyl, 5-bromo-7-nitroindolinyl, o-hydroxy, α-methylcinnamoyl and 2-hydroxymethylene anthraquinone. Other examples of activators are ion beams, magnetic fields, electron beams, x-rays, and the like.

10. Предетерминированная область - предетерминированной областью называется локализованная поверхность, активирующаяся, проактивированная или предназначенная для активации для образования полимера. Предетерминированная область может иметь любую форму. Она может быть, например, круглой, прямоугольной, эллиптической, клиновидной и т.д. Для кратности в дальнейшем предетерминированные области иногда будут называться просто "областями". 10. Pre-determined area - a pre-determined area is a localized surface that is activated, proactivated, or intended to be activated to form a polymer. The predetermined region can be of any shape. It can be, for example, round, rectangular, elliptical, wedge-shaped, etc. For brevity, hereinafter, the predetermined regions will sometimes be called simply “regions”.

11. Практически чистый - полимер, считается практически чистым в пределах предетерминированной области субстрата, если он имеет характеристики, отличающие его от других предетрминированных областей. Обычно чистоты характеризуют биологической активностью ил функцией однородности последовательности. Как правило, эти характеристики определяют, изучая связанные с определенным лигандом или рецептором. 11. Almost pure - a polymer is considered to be practically pure within the predetermined region of the substrate, if it has characteristics that distinguish it from other predetermined regions. Purities are usually characterized by biological activity or a function of sequence uniformity. Typically, these characteristics are determined by studying those associated with a particular ligand or receptor.

2. Общие положения
Предметами настоящего изобретения являются способ и устройство для получения и использования субстрата с большим количеством полимерных последовательностей, расположенных в определенных, заранее заданных областях. Изобретение описано, в первую очередь, на примере получения молекул, содержащих последовательности аминокислот, однако его можно легко использовать для получения и других полимеров. Такими полимерами могут быть, например, линейные и циклические полимеры нуклеиновых кислот, полисахариды, фосфолипиды и пептиды, содержащие α , β - или ω -аминокислоты, гетерополимеры, в которых известное лекарство ковалентно связано с любым из вышеперечисленных полимеров, полиуретаны, полиэфиры, поликарбонаты, полимочевины, поиламиды, полиэтиленимины, полиариленсульфиды, полисилоксаны, полиимиды, полиацетаты или другие полимеры, упоминающиеся в настоящем описании. По предпочтительному варианту настоящее изобретение используется для синтеза пептидов.2. General Provisions
The objects of the present invention are a method and apparatus for producing and using a substrate with a large number of polymer sequences located in specific, predetermined areas. The invention is described, first of all, on the example of obtaining molecules containing amino acid sequences, however, it can be easily used to obtain other polymers. Such polymers can be, for example, linear and cyclic polymers of nucleic acids, polysaccharides, phospholipids and peptides containing α, β or ω amino acids, heteropolymers in which a known drug is covalently bound to any of the above polymers, polyurethanes, polyesters, polycarbonates, polyurea, poilamides, polyethyleneimines, polyarylene sulfides, polysiloxanes, polyimides, polyacetates or other polymers referred to in the present description. In a preferred embodiment, the present invention is used to synthesize peptides.

Полученный предлагаемым способом субстрат может использоваться, например, для скрининга большого количества различных полимеров на предмет использования их в качестве лигандов для связывания с рецептором, хотя, разумеется, изобретение может использоваться и для синтеза рецепторов для связывания с лигандом. Являющийся предметом настоящего изобретения субстрат может использоваться и для других различных целей, к примеру, для определения пептидов и последовательностей нуклеиновых кислот, связанных с белками, для обнаружения последовательностей, специфически связывающихся с лекарствами, идентификации эпитопов, распознаваемых антителами, для разработки лекарств для клинических и диагностических целей, а также для решения комбинаций вышеперечисленных задач. The substrate obtained by the proposed method can be used, for example, to screen a large number of different polymers for their use as ligands for binding to a receptor, although, of course, the invention can also be used to synthesize receptors for binding to a ligand. The substrate of the present invention can be used for various other purposes, for example, to determine peptides and nucleic acid sequences associated with proteins, to detect sequences that specifically bind to drugs, to identify epitopes recognized by antibodies, to develop drugs for clinical and diagnostic goals, as well as to solve combinations of the above tasks.

По предпочтительному варианту предметом настоящего изобретения является использование субстрата S с поверхностью. На поверхности такого субстрата при необходимости могут быть сформированы мостиковые молекулы L, которые в некоторых случаях служат для облегчения распознавания рецептором синтезированных полимеров. In a preferred embodiment, the subject of the present invention is the use of a substrate S with a surface. If necessary, bridge molecules L can be formed on the surface of such a substrate, which in some cases serve to facilitate the recognition of synthesized polymers by the receptor.

При желании мостиковые молекулы могут быть химически защищены. Назначением такой защиты является возможность хранения. В некоторых случаях в качестве такой защитной группы, защищающей молекулу от химических изменений, можно использовать, например, t-BOC (третбутоксикарбонил). Такие химические защитные группы могут быть химически удалены путем взаимодействия защищенной молекулы, например, - с кислым раствором. Они служат для защиты поверхности в процессе хранения. Bridging molecules can be chemically protected if desired. The purpose of such protection is the ability to store. In some cases, for example, t-BOC (tert-butoxycarbonyl) can be used as such a protective group protecting the molecule from chemical changes. Such chemical protecting groups can be chemically removed by reacting a protected molecule, for example, with an acidic solution. They serve to protect the surface during storage.

На субстрате или периферийном конце мостиковой молекулы формируется функциональная группа с защитной группой P_o. Защитная группа P_o может быть удалена путем воздействия на молекулу излучения, электрических полей, электрического тока или других активаторов.A functional group with a protective group P _o is formed on the substrate or the peripheral end of the bridging molecule. The protective group P _o can be removed by exposing the molecule to radiation, electric fields, electric current, or other activators.

По предпочтительному варианту осуществления изобретения в качестве источника излучения используют ультрафиолетовый (УФ), инфракрасный (ИК) или видимый свет. Как будет видно из дальнейшего, защитная группа может быть электрохимически чувствительной и может быть удалена под воздействием электрического поля. Для удаления защитных групп можно использовать также ионные и электронные пучки. In a preferred embodiment, ultraviolet (UV), infrared (IR), or visible light is used as the radiation source. As will be seen from what follows, the protective group can be electrochemically sensitive and can be removed under the influence of an electric field. To remove the protective groups, ion and electron beams can also be used.

В некоторых случаях подвергаемые воздействию области и таким образом площади, занимаемые отдельными синтезированными полимерными последовательностями меньше примерно 1 см² или 1 мм². Предпочтительно подвергаемая воздействию область меньше примерно 100 мкм², а в некоторых случаях центр связывания состоит из одной молекулы. В этих областях каждый полимер синтезирован практически в чистом виде.In some cases, the exposed areas and thus the areas occupied by the individual synthesized polymer sequences are less than about 1 cm ² or 1 mm ² . Preferably, the exposed region is less than about 100 μm ² , and in some cases, the binding center consists of one molecule. In these areas, each polymer is synthesized in almost pure form.

Непосредственно в процессе или после облучения определенной области субстрата светом осуществляют контактирование его поверхности с первым мономерным звеном M₁, которое взаимодействует с функциональной группой, которая подвергалась воздействию на стадии защитной группы P₁. P₁ может быть такой же, как и P₀, но может и отличаться от нее.Directly during or after irradiation of a certain region of the substrate with light, its surface is contacted with the first monomer unit M ₁ , which interacts with the functional group that was exposed at the stage of the protective group P ₁ . P ₁ may be the same as P ₀ , but may differ from it.

В результате после первого цикла определенные первые области поверхности могут включать последовательность:
S-L-M₁-P₁,
а остальные ее области включают последовательность:
S-L-P₀.As a result, after the first cycle, certain first surface areas may include the sequence:
SLM ₁ -P ₁ ,
and its remaining areas include the sequence:
SLP ₀ .

После этого действию света подвергают вторые области поверхности (они могут включать и первую область) и осуществлять контактирование их с вторым мономером M₂ (это может быть тот же мономер, что и M₁ или другой мономер), имеющим защитные группы P₂. P₂ может быть такой же, как и P₀ или P₁, но может и отличаться от них. После второго цикла области субстрата могут включать одну или более из следующих последовательностей:
S-L-M₁-M₂-P₂
S-L-M₂-P₂
S-L-M₁-P₁ и/или
S-L-P₀
Описанный процесс повторяют до тех пор, пока на субстрате не будут синтезированы нужные полимеры нужной длины. Контролируя локализации на субстрате, подвергаемые воздействию света, и реагенты, контактируемые с ним после такого воздействия, можно знать локализацию каждой последовательности.After this, the second surface regions are exposed to light (they can include the first region) and they are contacted with the second monomer M ₂ (this may be the same monomer as M ₁ or another monomer) having protective groups P ₂ . P ₂ may be the same as P ₀ or P ₁ , but may differ from them. After the second cycle, substrate regions may include one or more of the following sequences:
SLM ₁ -M ₂ -P ₂
SLM ₂ -P ₂
SLM ₁ -P ₁ and / or
SLP ₀
The described process is repeated until the desired polymers of the desired length are synthesized on the substrate. By controlling the localization on the substrate, exposed to light, and the reagents in contact with it after such exposure, you can know the localization of each sequence.

После этого защитные группы удаляют со всего субстрата или его части и последовательности при желании копируют звеном C. В результате получают субстрат с размещенным на его поверхности большим количеством полимеров общей формулы:
S-[L]-(M_i-(M_j)-(M_k)...(M_x)-[C],
в которой квадратные скобки означают возможные группы, а M_i... M_x-последовательности полимеров. Количество мономеров может варьироваться в широких пределах. По предпочтительному варианту осуществления оно находится в пределах 2-100.After that, the protective groups are removed from the entire substrate or its part and the sequences are copied by link C if desired. As a result, a substrate is obtained with a large number of polymers of the general formula placed on its surface:
S- [L] - (M _i - (M _j ) - (M _k ) ... (M _x ) - [C],
in which square brackets denote possible groups, and M _i ... M _{x are} sequences of polymers. The amount of monomers can vary widely. In a preferred embodiment, it is in the range of 2-100.

В некоторых случаях в нескольких локализациях субстрата полимеры должны содержать обычную последовательность мономеров. К примеру, хотят синтезировать последовательность S-M₁-M₂-M₃ в первых и последовательность S-M₄-M₂-M₃ во вторых локализациях. Процесс начинают с облучения первых локализаций и контактирования затем субстрата с M₁-P, в результате чего в первой локализации получают последовательность S-M₁-P. После этого облучают вторые локализации и осуществляют контактирование с M₄-P, получая в результате во вторых локализациях последовательность S-M₄-P. После этого первую и вторую локализации подвергают облучению и осуществляют контактирование с димером M₂-M₃ с образованием в результате последовательности S-M₁-M₂-M₃ в первых и S-M₄-M₂-M₃ во вторых локализациях. Для описанного синтеза, естественно, можно использовать обычные последовательности любой длины, в частности, состояние из 2 или более, 2-100, 2-20, наиболее предпочтительно 2-3 мономеров.In some cases, in several locations of the substrate, the polymers must contain the usual sequence of monomers. For example, they want to synthesize the sequence SM ₁ -M ₂ -M ₃ in the first and the sequence SM ₄ -M ₂ -M ₃ in the second locations. The process begins by irradiating the first localizations and then contacting the substrate with M ₁ -P, as a result of which the sequence SM ₁ -P is obtained in the first localization. After this, the second localizations are irradiated and contacted with M ₄ -P, resulting in the second localization sequence SM ₄ -P. After that, the first and second localizations are irradiated and contacted with the dimer M ₂ -M ₃ with the formation of the sequence SM ₁ -M ₂ -M ₃ in the first and SM ₄ -M ₂ -M ₃ in the second locations. For the described synthesis, naturally, you can use the usual sequence of any length, in particular, a state of 2 or more, 2-100, 2-20, most preferably 2-3 monomers.

По другому варианту осуществления изобретения для получения первого мономерного слоя используют набор масок, после чего проводят селективное удаление защитных групп, облучая субстрат светом различной длины волны. Так, например, для получения субстрата с вышеизложенными последовательностями вначале выделяют первые области с помощью маски и осуществляют взаимодействие их с первым мономером, имеющим первую защитную группу P₁, которая может быть удалена путем облучения светом первой длины волны (например, ИК). После этого выделяют с помощью маски вторые области и осуществляют защитную группу P₂, которая может быть удалена путем облучения светом второй длины волны (например, УФ). Далее необходимость в масках уже отпадает, поскольку для удаления защитных групп весь субстрат может быть попеременно подвергнут воздействию света первой и второй длин волн.According to another embodiment of the invention, a set of masks is used to obtain the first monomer layer, after which the protective groups are selectively removed by irradiating the substrate with light of different wavelengths. So, for example, to obtain a substrate with the above sequences, first select the first area using a mask and interact with the first monomer having a first protective group P ₁ , which can be removed by irradiation with light of the first wavelength (for example, IR). After that, the second regions are isolated with a mask and a protective group P _{2 is} carried out, which can be removed by irradiation with light of a second wavelength (for example, UV). Further, the need for masks already disappears, because to remove the protective groups the entire substrate can be alternately exposed to light of the first and second wavelengths.

Полученные на субстрате вышеописанными способами полимеры могут использоваться для различных целей, например, при скрининге на биологическую активность. При таком скрининге субстрат с имеющимися на нем последовательностями подвергают взаимодействию с меченным или немеченным рецептором, например антителом, рецептором на клетке, фосфолипидным пузырьком или любым другим рецептором. По предпочтительному варианту полимеры подвергают взаимодействию с первым немеченным излучаемым рецептором, после чего подвергают взаимодействию с меченным, специфично распознающим указанный рецептор элементом, например антителом. При этом на стадии детектирования будет появляться усиленный сигнал. The polymers obtained on the substrate by the above-described methods can be used for various purposes, for example, when screening for biological activity. In such a screening, the substrate with the sequences on it is reacted with a labeled or unlabeled receptor, for example, an antibody, a cell receptor, a phospholipid vesicle, or any other receptor. In a preferred embodiment, the polymers are reacted with a first unlabelled radiated receptor, and then reacted with a labeled element that specifically recognizes the indicated receptor, for example, an antibody. In this case, an amplified signal will appear at the detection stage.

Молекулы рецептора могут связываться с одним или несколькими полимерами на субстрате. Присутствие меченного рецептора, а следовательно, и присутствие связанной с этим рецептором последовательности по предпочтительному варианту определяют с помощью авторадиографии, детектирования флуоресценции связывающим заряды устройством, флуоресцентной микроскопии и т.п. Последовательность полимера в локализациях, в которых обнаружена рецепторная связь, может использоваться для определения всей или части последовательности, комплементарной к этому рецептору. Receptor molecules may bind to one or more polymers on the substrate. The presence of a labeled receptor, and therefore the presence of a sequence associated with this receptor, is preferably determined by autoradiography, detection of fluorescence by a charge-binding device, fluorescence microscopy, and the like. The sequence of the polymer in the locations in which a receptor bond is found can be used to determine all or part of the sequence complementary to this receptor.

Использование заявляемого изобретения иллюстрируется, в первую очередь, примерами скрининга на биологическую активность. Оно однако может найти и другие области применения. Так, например, оно может использоваться для хранения информации (например, на оптических данных), для получения молекулярных электронных устройств, стационарных фаз, в процессах разделения, для получения красителей и осветлителей, в фотографии и для иммобилизации клеток, белков, лектинов, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т.п. на поверхности образцов через молекулярное распознавание специфических полимерных последовательностей. Синтезируя в соседних локализациях одно и тоже соединение в различных прогрессивно меняющихся концентрациях, можно определить градиент для контроля хемотаксиса или для получения dipsticks, которые можно использовать, например, для титрования антитела против возрастающего количества антигена. Синтезируя несколько каталитических молекул, близких по строению, можно путем "координатной иммобилизации" добиться более эффективной многостадийной конверсии. Координатную иммобилизацию можно также использовать в системах с переносом электронов и для придания материалам структурной целостности и других нужных свойств, например смачиваемости, способности оказывать смазывающее действие и т.д. The use of the claimed invention is illustrated, first of all, by examples of screening for biological activity. However, it may find other applications. For example, it can be used to store information (for example, on optical data), to obtain molecular electronic devices, stationary phases, in separation processes, to obtain dyes and brighteners, in photography and to immobilize cells, proteins, lectins, nucleic acids polysaccharides, etc. on the surface of samples through molecular recognition of specific polymer sequences. By synthesizing the same compound in different progressively varying concentrations in neighboring locations, a gradient can be determined to control chemotaxis or to obtain dipsticks that can be used, for example, to titrate antibodies against an increasing amount of antigen. By synthesizing several catalytic molecules close in structure, one can achieve a more efficient multi-stage conversion by “coordinate immobilization”. Coordinate immobilization can also be used in electron transfer systems and to impart structural integrity and other necessary properties to materials, for example, wettability, ability to exert a lubricating effect, etc.

Кроме того, настоящее изобретение позволяет исследовать биораспределение или фармакокинетические свойства. Так, в частности, для определения стойкости к кишечным или сывороточным протеазам полимеры могут быть копированы флуоресцентной меткой и потом подвергнуты взаимодействию с исследуемой биологической жидкостью. In addition, the present invention allows the study of biodistribution or pharmacokinetic properties. So, in particular, to determine the resistance to intestinal or serum proteases, the polymers can be copied with a fluorescent label and then subjected to interaction with the studied biological fluid.

3. Синтез полимеров. 3. Synthesis of polymers.

На фиг. 1 изображен поперечный разрез субстрата 2 в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения. В принципе для осуществления изобретения может использоваться любой субстрат. Он может быть биологическим, небиологическим, органическим, неорганическим или представлять собой комбинацию любых перечисленных субстратов и находиться в форме частиц, нитей, осадков, гелей, листов, трубок, сфер, контейнеров, капилляров, подложек, срезов, пленок, пластин, предметных стекол и т.п. Субстрат может иметь любую форму, например форму диска, квадрата, сферы, круга и т.д. предпочтительно, чтобы субстрат был плоским, однако он может иметь возвышенные или пониженные участки поверхности, на которых протекает синтез. Предпочтительно субстрат вместе с поверхностью образует жесткую подложку, на которой протекает описание реакции. Субстрат и поверхность выбирают таким образом, чтобы обеспечить соответствующие характеристики в отношении абсорбции им света. Например, в качестве субстрата можно использовать полимерную пленку Лангмюра-Блоджетта, стекло с функциональными группами, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO₂, SiN₄, модифицированный кремний или любой другой из широкого круга гелей или полимеров, например, (поли)тетрафторэтилен, (поли)винилидендифторид, полистирол, поликарбонат или их комбинации.In FIG. 1 is a cross-sectional view of a substrate 2 in accordance with one embodiment of the present invention. In principle, any substrate can be used to carry out the invention. It can be biological, non-biological, organic, inorganic, or a combination of any of these substrates and can be in the form of particles, filaments, sediments, gels, sheets, tubes, spheres, containers, capillaries, substrates, sections, films, plates, slides and etc. The substrate may be of any shape, for example, the shape of a disk, square, sphere, circle, etc. it is preferable that the substrate is flat, but it may have elevated or lowered portions of the surface on which the synthesis proceeds. Preferably, the substrate together with the surface forms a rigid substrate on which the description of the reaction proceeds. The substrate and surface are selected so as to provide appropriate characteristics with respect to their absorption of light. For example, a Langmuir-Blodgett polymer film, glass with functional groups, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO ₂ , SiN ₄ , modified silicon, or any other from a wide range of gels or polymers, for example, (poly) tetrafluoroethylene, can be used as a substrate , (poly) vinylidene difluoride, polystyrene, polycarbonate, or combinations thereof.

Представление о других возможных для использования в качестве субстрата материалах специалист в данной области получит при ознакомлении с описанием настоящей заявки. Предпочтительным субстратом для осуществления изобретения является плоское стекло или монокристалл кремния с микрообъектами рельефа менее 10 ангстрем. A specialist in this field will get an idea of other materials that can be used as a substrate when reading the description of this application. A preferred substrate for carrying out the invention is flat glass or a single crystal of silicon with microobjects of relief less than 10 angstroms.

По другому варианту осуществления изобретения поверхность субстрата травят известными способами для получения нужной ее структуры. Например, путем образования на ней канавок, V-образных канавок, мезаструктур и т.п. области синтеза могут быть приближены к фокусной точке падающего света, им может быть придана структура отражательного зеркала для оптимального собирания света от флуоресцентных источников и т.д. According to another embodiment of the invention, the surface of the substrate is etched by known methods to obtain its desired structure. For example, by forming grooves on it, V-shaped grooves, mesastructures, etc. synthesis regions can be close to the focal point of the incident light, they can be given the structure of a reflective mirror for optimal collection of light from fluorescent sources, etc.

Поверхность на субстрате обычно, хотя и не всегда, выполнена из того же материала, что и сам субстрат. Так, поверхность может быть выполнена из любого из широкого круга материалов, например из полимеров, пластиков, смол, полисахаридов, диоксида кремния или из материалов на его основе, углерода, металлов, неорганических стекол, мембран или любых других вышеперечисленных материалов субстрата. В некоторых случаях поверхности может быть придана форма, позволяющая использовать ее для ребристых связующих элементов, которые жестко соединяются с поверхностью субстрата по способу в соответствии с одновременно рассматриваемой заявкой N 404920, на которую мы уже ссылались ранее. Предпочтительно, чтобы на поверхности присутствовали реакционно-способные группы, которыми могут быть карбоксильная, аминогидроксильная или другие группы. Наиболее предпочтительно, чтобы поверхность была оптически прозрачной и имела функциональные группы Si - OH, как это имеет место на поверхности из диоксида кремния. The surface on the substrate is usually, although not always, made of the same material as the substrate itself. So, the surface can be made of any of a wide range of materials, for example, polymers, plastics, resins, polysaccharides, silicon dioxide or materials based on it, carbon, metals, inorganic glasses, membranes, or any other substrate materials listed above. In some cases, the surface can be shaped to allow it to be used for ribbed bonding elements that are rigidly connected to the surface of the substrate by the method in accordance with the concurrently pending application N 404920, to which we have already referred. It is preferred that reactive groups are present on the surface, which may be carboxyl, aminohydroxyl or other groups. Most preferably, the surface is optically transparent and has Si - OH functional groups, as is the case on a silicon dioxide surface.

На поверхность субстрата 4 предпочтительно наносят слой мостиковых молекул 6, хотя такие мостиковые молекулы не являются обязательным элементом настоящего изобретения. Предпочтительно, чтобы мостиковые молекулы имели длину, достаточную для того, чтобы позволить полимерам на сформированном субстрате свободно взаимодействовать с молекулами, приводимыми в контакт с ним. Для обеспечения хорошего контактирования мостиковые молекулы должны иметь длину в 6 - 50 атомов. В качестве мостиковых молекул можно использовать, например, арилацетилен, этиленгликолевые олигомеры, содержащие 2 - 10 мономерных звеньев, диамины, диациды, аминокислоты или комбинации перечисленных соединений. Как будет видно из дальнейшего, возможно использование и других мостиковых молекул. A layer of bridging molecules 6 is preferably applied to the surface of the substrate 4, although such bridging molecules are not an essential element of the present invention. Preferably, the bridging molecules are long enough to allow the polymers on the formed substrate to freely interact with the molecules brought into contact with it. To ensure good contact, the bridge molecules should have a length of 6 to 50 atoms. As bridging molecules, for example, aryl acetylene, ethylene glycol oligomers containing 2 to 10 monomer units, diamines, diacides, amino acids or combinations of these compounds can be used. As will be seen from what follows, other bridge molecules can also be used.

По другому варианту осуществления изобретения мостиковые молекулы выбирают, исходя из их гидрофильно-гидрофобных свойств с целью повышения доступности синтезированных полимеров к определенным рецепторам. Так, например, в случае гидрофильного рецептора целесообразно, чтобы и мостиковые молекулы имели гидрофильный характер, чтобы позволить рецептору как можно больше приблизиться к синтезированному полимеру. In another embodiment, the bridging molecules are selected based on their hydrophilic-hydrophobic properties in order to increase the availability of synthesized polymers to specific receptors. So, for example, in the case of a hydrophilic receptor, it is advisable that the bridging molecules have a hydrophilic character in order to allow the receptor as close as possible to the synthesized polymer.

По другому варианту осуществления изобретения в мостиковые молекулы вводят фотоотщепляемые группы в промежуточном положении. Предпочтительно, чтобы отщепление такой группы происходило при другой длине волны света, чем в случае защитной группы. Это позволяет удалять различные полимеры после завершения синтеза путем облучения субстрата светом рзличной длины волн. According to another embodiment of the invention, photodissociated groups are introduced into the bridge molecules in an intermediate position. It is preferred that the cleavage of such a group occurs at a different wavelength of light than in the case of the protective group. This allows you to remove various polymers after completion of the synthesis by irradiating the substrate with light of different wavelengths.

Мостиковые молекулы могут связываться с субстратом через углерод - углеродную связь с использованием, например, (поли)трифторхлорэтиленовых поверхностей или, что более предпочтительно, с помощью силоксановых связей (с использованием, например, поверхностей из стекла или диоксида кремния). По одному из вариантов осуществления силоксановые связи с поверхностью субстрата могут быть образованы за счет взаимодействия мостиковых молекул, имеющих трихлорсилиловые группы. Мостиковые молекулы могут быть связаны с поверхностью в заданном положении, а именно в качестве частей головных групп в полимеризованной пленке Ленгмюра-Блоджетта. По другому варианту осуществления мостиковые молекулы адсорбируют на поверхности субстрата. Bridging molecules can bind to the substrate via a carbon-carbon bond using, for example, (poly) trifluorochlorethylene surfaces or, more preferably, siloxane bonds (using, for example, glass or silicon dioxide surfaces). In one embodiment, siloxane bonds to the surface of the substrate can be formed by the interaction of bridging molecules having trichlorosilyl groups. Bridged molecules can be bound to the surface in a predetermined position, namely, as parts of head groups in a polymerized Langmuir-Blodgett film. In another embodiment, the bridging molecules adsorb onto the surface of the substrate.

Мостиковые молекулы и мономеры, использующиеся при осуществлении настоящего изобретения, имеют функциональные группы, с которыми связываются защитные группы. Предпочтительно защитная группа находится на отдаленном по отношению к субстрату конце мостиковой молекулы. Защитная группа может быть отрицательной (т.е. снижающей реакционную способность мостиковой молекулы по отношению к контактирующему с субстратом мономеру) или положительной (т.е. повышающей реакционную способность мостиковой молекулы по отношению к контактирующему с субстратом мономеру). В случае отрицательных защитных групп необходима дополнительная стадия реактивации. В некоторых случаях такая реактивация осуществляется путем нагревания. Bridging molecules and monomers used in the practice of the present invention have functional groups to which protecting groups bind. Preferably, the protective group is located at the end of the bridging molecule remote from the substrate. The protecting group may be negative (i.e., reducing the reactivity of the bridging molecule with respect to the monomer in contact with the substrate) or positive (i.e., increasing the reactivity of the bridging molecule with respect to the monomer in contact with the substrate). In the case of negative protecting groups, an additional reactivation step is necessary. In some cases, such reactivation is carried out by heating.

Защитные группы для мостиковых молекул могут быть выбраны из большого числа положительно реагирующих на действие света групп. Предпочтительно сюда относятся нитроароматические соединения, такие как o-нитробензильные или бензилсульфонильные производные. По предпочтительному варианту осуществления в качестве защитных групп используются 6-нитровератрилоксикарбонил (NVOC), 2-нитробензилоксикарбонил (NBOC) или α,α -диметилдиметоксибензилоксикарбонил (DDZ). По одному из вариантов осуществления в качестве защитной группы используют нитроароматическое соединение, содержащее бензильный водород в ортоположении по отношению к нитрогруппе, а именно соединение формулы:

в которой
R₁ означает алкоксигруппу, алкил, атом галогена, арил, алкенил или атом водорода, R₂ - алкоксигруппу, алкил, атом галогена, арил, нитрогруппу или атом галогена, R₃ - алкоксигруппу, алкил, атом галогена, нитрогрупп, арил или атом водорода, R₄ - алкоксигруппу, алкил, атом водорода, арил, атом галогена или нитрогруппу, а R₅-алкил, алкинил, цианогруппу, алкоксигруппу, атом водорода, атом галогена, арил или алкенил. Другими подходящими материалами являются o-окси- α -метилциннамоильные производные. Фотоотщепляемые защитные группы описаны, например, Patchornik в j.Am.Chem> Soc. (1970) 92: 6333 и Amit и др. в J. Org. Chem. (1974) 39:192. Обе эти работы включены в перечень ссылок к настоящей заявке.Protective groups for bridging molecules can be selected from a large number of light-responding groups. Preferred are nitroaromatic compounds such as o-nitrobenzyl or benzylsulfonyl derivatives. In a preferred embodiment, 6-nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), 2-nitrobenzyloxycarbonyl (NBOC) or α, α-dimethyldimethoxybenzyloxycarbonyl (DDZ) are used as protective groups. In one embodiment, a nitroaromatic compound containing benzyl hydrogen in ortho position with respect to the nitro group is used as a protective group, namely a compound of the formula:

wherein
R ₁ means an alkoxy group, alkyl, halogen atom, aryl, alkenyl or a hydrogen atom, R ₂ - alkoxy group, alkyl, halogen atom, aryl, nitro group or halogen atom, R ₃ - alkoxy group, alkyl, halogen atom, nitro group, aryl or hydrogen atom R ₄ is an alkoxy group, alkyl, a hydrogen atom, aryl, a halogen atom or a nitro group, and R _{5 is an} alkyl, alkynyl, cyano group, alkoxy group, a hydrogen atom, a halogen atom, aryl or alkenyl. Other suitable materials are o-hydroxy-α-methylcinnamoyl derivatives. Photocouplable protecting groups are described, for example, by Patchornik in j.Am.Chem> Soc. (1970) 92: 6333 and Amit et al. In J. Org. Chem. (1974) 39: 192. Both of these works are included in the list of references to this application.

По другому варианту осуществления изобретения положительные реакционноспособные группы активируют для взаимодействия с реагентами в растворе. Так, например, 5-бром-7-нитроиндолиновую группу, связанную с карбонилом, подвергают взаимодействию путем облучения светом длиной волны 420 нм. In another embodiment, positive reactive groups are activated to react with the reagents in solution. Thus, for example, a 5-bromo-7-nitroindoline group bonded to a carbonyl is reacted by irradiating with light at a wavelength of 420 nm.

По другому варианту осуществления реакционноспособную группу в мостиковой молекуле выбирают из большого числа отрицательно реагирующих на действие света групп, включая цинамматную группу. In another embodiment, the reactive group in the bridging molecule is selected from a large number of light-reacting groups, including a cinnamate group.

По другому варианту осуществления реакционноспособную группу активируют или дезактивируют с помощью электронно-лучевой литографии, рентгеновской литографии или любого иного источника излучения. Подходящие для электронно-лучевой литографии реакционноспособные группы включают сульфонил. Другие подходящие для использования способы включают, например, воздействие тока. Для осуществления изобретения могут использоваться и другие реакционноспособные группы и способы активации. In another embodiment, the reactive group is activated or deactivated by electron beam lithography, X-ray lithography, or any other radiation source. Reactive groups suitable for electron beam lithography include sulfonyl. Other suitable methods for use include, for example, exposure to current. Other reactive groups and activation methods may be used to carry out the invention.

Как видно из фиг. 1, мостиковые молекулы предпочтительно подвергаются воздействию света, например, через маску 8, создаваемую литографическими способами, типа используемых в полупроводниковой технологии и описанных, например, SZE в VLSI Technology, McGraw-Hill (1983) и Mead и др. в Jntroduction to VLSI Systems, Addison-Wesley (1980), включенных в перечень ссылок к настоящей заявке. Свет может быть направлен или на поверхность, содержащую защитные группы, или на заднюю сторону субстрата, если он прозрачен для длин волн света, необходимых для удаления защитных групп. В случае варианта осуществления, изображенного на фиг. 1, свет направляется на поверхность субстрата, содержащую защитные группы. Фиг. 1 иллюстрирует использование такой техники маскирования в отношении положительных реакционноспособных групп для активирования мостиковых молекул и экспонирования функциональных групп на участках 10a и 10b. As can be seen from FIG. 1, the bridging molecules are preferably exposed to light, for example through a mask 8 created by lithographic methods, such as those used in semiconductor technology and described, for example, by SZE in VLSI Technology, McGraw-Hill (1983) and Mead et al. In Jntroduction to VLSI Systems , Addison-Wesley (1980), included in the list of references to this application. The light can be directed either to the surface containing the protective groups, or to the back side of the substrate, if it is transparent to the wavelengths of light necessary to remove the protective groups. In the case of the embodiment of FIG. 1, light is directed onto a surface of a substrate containing protective groups. FIG. 1 illustrates the use of such a masking technique for positive reactive groups to activate bridging molecules and expose functional groups at sites 10a and 10b.

Маска 8 по одному из вариантов осуществления представляет собой основу из прозрачного материала, покрытую слоем непрозрачного материала. Часть непрозрачного материала удаляют, оставляя его в определенных местах поверхности субстрата. Маску располагают в непосредственной близости с изображением или непосредственно наносят на поверхность субстрата, как это показано на фиг. 1. Отверстия в маске соответствуют локализациям на субстрате, в которых с него необходимо удалить защитные группы. Совмещение может быть осуществлено с помощью обычных способов с использованием меток (не показаны) для точного нанесения маски на предварительно полученное изображение. Можно однако использовать для этого и более сложные, например, интерферометрические способы, в частности, описанные Flanders и др. в "A New Jnterferometric Alignment Technique", App. Phys. Zett (1977) 31:426-428, включенной в перечень ссылок к настоящей заявке. The mask 8 according to one of the embodiments is a transparent material base coated with a layer of opaque material. Part of the opaque material is removed, leaving it in certain places on the surface of the substrate. The mask is placed in close proximity to the image or directly applied to the surface of the substrate, as shown in FIG. 1. The holes in the mask correspond to the localization on the substrate, in which it is necessary to remove the protective groups from it. Alignment can be accomplished using conventional methods using labels (not shown) to accurately apply a mask to a previously acquired image. However, you can use for this and more complex, for example, interferometric methods, in particular, described by Flanders and others in "A New Jnterferometric Alignment Technique", App. Phys. Zett (1977) 31: 426-428, included in the list of references to this application.

Для увеличения контрастности света, которым облучается субстрат, желательно между маской и субстратом размещать повышающие контрастность материалы, как это делается по некоторым вариантам осуществления изобретения. Такой повышающий контрастность слой может включать молекулы, разлагающиеся под действием света, например хинондиазид или материал, нестационарно обесцвечивающийся под действием света нужной длины волны. Нестационарное обесцвечивание материалов способствует проникновению света в месте его прохождения, увеличивая тем самым контрастность. По другому варианту осуществления повышения контрастности можно добиться с помощью плакированного пучка оптоволокна. To increase the contrast of light that irradiates the substrate, it is desirable to place contrast-enhancing materials between the mask and the substrate, as is done in some embodiments of the invention. Such a contrast-enhancing layer may include molecules that decompose under the influence of light, for example quinondiazide or a material that non-stationary decolourates under the influence of light of the desired wavelength. Unsteady discoloration of materials facilitates the penetration of light at the point of its passage, thereby increasing contrast. In another embodiment, an increase in contrast can be achieved with a clad fiber bundle.

Источником света может быть обычная лампа накаливания, лазер, лазерный диод и т.п. При использовании неколимированных источников света желательно применять толстую или многослойную маску для предотвращения рассеивания света на субстрате. В некоторых случаях целесообразно далее для контроля синтеза использовать группы, чувствительные к различным длинам волн. Так, например, при использовании групп, чувствительных к различным длинам волн, можно выбирать различные положения при синтезе полимеров или отказываться от отдельных стадий маскирования. Некоторое реакционноспособные группы и соответствующие длины волн, при которых происходит их отщепление, приведены в табл. 1. The light source may be a conventional incandescent lamp, a laser, a laser diode, etc. When using non-collimated light sources, it is desirable to use a thick or multi-layer mask to prevent light scattering on the substrate. In some cases, it is further advisable to use groups that are sensitive to different wavelengths to control synthesis. So, for example, when using groups that are sensitive to different wavelengths, you can choose different positions in the synthesis of polymers or refuse individual stages of masking. Some reactive groups and the corresponding wavelengths at which they are cleaved are given in table. one.

Хотя изобретение и иллюстрируется, в первую очередь, примерами использования техники маскирования для облучения определенных участков субстрата, однако для этой цели можно использовать и другие способы. Так, например, для обучения субстрата можно использовать модулированный лазер или светодиод. Такие способы описаны, например, в патенте США 4719615 (Feyrer и др.), который включен в список цитируемых источников. По другому варианту осуществления для этой цели используется лазерное гальванометрическое сканирующее устройство. По другому варианту синтез может осуществляться в контакте с обычным жидким кристаллом (в дальнейшем называемым "световым модулятором") или оптоволоконными источниками света. С помощью соответствующим образом модулированных жидких кристаллов можно осуществлять селективный контроль света таким образом, чтобы обеспечить контактирование его с определенными участками субстрата. По другому варианту осуществления синтез может происходить на конце ряда оптических волокон, через которые пропускается свет определенной длины волны. Для специалиста в данной области очевидно, что для контроля локализации экспонирования светом можно использовать и другие средства. Although the invention is illustrated primarily by examples of the use of masking techniques to irradiate certain areas of the substrate, other methods can be used for this purpose. So, for example, to train the substrate, you can use a modulated laser or LED. Such methods are described, for example, in US patent 4719615 (Feyrer and others), which is included in the list of cited sources. In another embodiment, a laser galvanometric scanning device is used for this purpose. In another embodiment, the synthesis may be carried out in contact with a conventional liquid crystal (hereinafter referred to as the “light modulator”) or fiber optic light sources. Using appropriately modulated liquid crystals, it is possible to selectively control the light in such a way as to ensure that it is in contact with certain areas of the substrate. In another embodiment, synthesis may occur at the end of a series of optical fibers through which light of a specific wavelength is transmitted. For a person skilled in the art it is obvious that other means can be used to control the localization of exposure to light.

Облучаемый субстрат может контактировать или не контактировать с раствором (не показан). Предпочтительно облучать субстрат, контактирующий с раствором. Для того, чтобы элиминировать мешающее действие образующихся при облучении побочных продуктов на синтез полимера, раствор в случае некоторых вариантов осуществления может содержать определенные реагенты. Такими побочными продуктами могут быть, например, диоксид углерода, нитрозокарбонильные соединения, производные стирола, производные индола и продукты их фотохимических реакций. По другому варианту раствор может содержать реагенты, используемые для обеспечения согласования с показателем преломления субстрата. Реагенты, добавляемые к раствору, могут включать далее кислые или основные буферы, тиолы, замещенные гидразины и гидроксиламины, могут взаимодействовать с определенным функциональными группами (например, арилнитрозо + глиоксиловая кислота _→ арилформгидроксамат + CO). The irradiated substrate may or may not be in contact with a solution (not shown). It is preferable to irradiate the substrate in contact with the solution. In order to eliminate the interfering effect of the by-products formed during irradiation on the synthesis of the polymer, the solution in the case of some embodiments may contain certain reagents. Such by-products may be, for example, carbon dioxide, nitrosocarbonyl compounds, styrene derivatives, indole derivatives and products of their photochemical reactions. Alternatively, the solution may contain reagents used to ensure consistency with the refractive index of the substrate. The reagents added to the solution may further include acidic or basic buffers, thiols, substituted hydrazines and hydroxylamines, can interact with certain functional groups (for example, arylnitroso + glyoxylic acid _ → aryl form hydroxamate + CO).

Одновременно или после облучения мостиковые молекулы промывают или иным образом осуществляют контактирование с первым мономером, как это изображено символом "A" на участках 12a и 12b на фиг. 2. Первый мономер взаимодействует с активированными функциональными группами мостиковых молекул, которые были подвергнуты действию света. Первый мономер, которым предпочтительно является аминокислота, также имеет фотозащитную группу. Эта фотозащитная группа в мономере может быть такой же, как и в мостиковых молекулах, или отличаться от нее. По своей природе это может быть любая из вышеперечисленных защитных групп. По одному из вариантов осуществления защитные группы для мономера A выбирают из групп NBOC и NVOC. Simultaneously or after irradiation, the bridge molecules are washed or otherwise contacted with the first monomer, as shown by the symbol “A” in sections 12a and 12b in FIG. 2. The first monomer interacts with the activated functional groups of the bridge molecules that have been exposed to light. The first monomer, which is preferably an amino acid, also has a photoprotective group. This photoprotective group in the monomer may be the same as or different from the bridging molecules. By nature, it can be any of the above protecting groups. In one embodiment, the protecting groups for monomer A are selected from the NBOC and NVOC groups.

Как видно из фиг. 3, процесс облучения затем повторяется при новом положении маски, а именно при таком, при котором происходит удаление связанных защитных групп и экспонирование функциональных групп на участках 14a и 14b, которые, как это показано на фиг. 3, были защищены на предыдущей стадии маскирования. Вместо перемещения первой маски в новое положение можно, как это делается в ряде случаев, использовать вторую маску. По другому варианту осуществления некоторые стадии можно осуществлять для облучения общей области на последующих стадиях. Как показано на фиг. 3, может оказаться нецелесообразным осуществлять разделение облучаемых областей. Так, например, расстояние примерно в 1 - 5 мкм может оказаться достаточным для допустимого совмещения. As can be seen from FIG. 3, the irradiation process is then repeated at the new position of the mask, namely, at which the removal of the associated protective groups and exposure of the functional groups in sections 14a and 14b, which, as shown in FIG. 3, were protected at the previous stage of masking. Instead of moving the first mask to a new position, you can use the second mask, as is done in some cases. In another embodiment, some steps may be performed to irradiate a common area in subsequent steps. As shown in FIG. 3, it may not be practical to separate the irradiated areas. So, for example, a distance of about 1 - 5 microns may be sufficient for acceptable alignment.

Как видно из фиг. 4, субстрат затем подвергают взаимодействию с вторым защищенным мономером "B", в результате чего образуются B-области 16a и 16b. После этого на субстрат снова наносят маску для удаления защитных групп и экспонирования реакционноспособных групп A на участке 12a и B на участке 16b. Субстрат снова подвергают взаимодействию с мономером B в результате чего образуется структура, показанная на фиг. 6. На субстрате при этом образуются димеры B-A и B-B. As can be seen from FIG. 4, the substrate is then reacted with the second protected monomer “B”, whereby B regions 16a and 16b are formed. After that, the mask is again applied to the substrate to remove the protective groups and expose the reactive groups A in section 12a and B in section 16b. The substrate is reacted again with monomer B to form the structure shown in FIG. 6. In this case, B-A and B-B dimers are formed on the substrate.

Последующая серия нанесения масок и стадии контролирования с A, осуществляемые вышеописанным образом (не показаны), приводит к получению структуры, изображенной на фиг. 7. Описанный процесс позволяет получить все возможные димеры B и A, а именно: B-A, A-B, A-A и B-B. A subsequent series of masking and control steps with A carried out in the manner described above (not shown) leads to the structure depicted in FIG. 7. The described process allows you to get all the possible dimers B and A, namely: B-A, A-B, A-A and B-B.

Субстрат, участок синтеза и участки синтеза каждого из полимеров могут быть любого размера и иметь любую форму. Так, например, они могут иметь форму квадрата, эллипса, прямоугольника, треугольника, окружности или их частей, а также иметь неправильную форму. Для запаса на одном субстрате можно проводить по два синтеза какой-либо одной последовательности. The substrate, the synthesis site and the synthesis sites of each of the polymers can be of any size and have any shape. So, for example, they can have the shape of a square, ellipse, rectangle, triangle, circle or parts thereof, and also have an irregular shape. For stock on one substrate, two syntheses of any one sequence can be performed.

По одному из вариантов осуществления площадь участков 12 и 16 на субстрате находится в пределах примерно от 1 до 10^-10 см². В некоторых случаях площади участков 12 и 16 составляют примерно менее 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 10^-7, 10^-8 или 10^-10 см². По предпочтительному варианту осуществления участки 12 и 16 имеют размеры примерно 10х10 и 500х500 мкм.In one embodiment, the area of the plots 12 and 16 on the substrate is in the range of about 1 to 10 ⁻¹⁰ cm ² . In some cases, the areas of sections 12 and 16 are approximately less than 10 ^-1 , 10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 , 10 ^-5 , 10 ^-6 10 ^-7 , 10 ^-8 or 10 ^-10 cm ² . In a preferred embodiment, sections 12 and 16 are approximately 10x10 and 500x500 microns.

В некоторых случаях на одном субстрате синтезируется примерно более 10, предпочтительно примерно более 100 различных полимерных последовательностей, хотя возможны варианты, когда на одном субстрате создается примерно более 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷ или 10⁸ различных последовательностей. Естественно, что в пределах области субстрата, в которой синтезируется полимерная последовательность, предпочтительно, чтобы такая последовательность была практически чистой. В соответствии с отдельными вариантами осуществления области субстрата содержат полимерные последовательности, имеющие степень чистоты по меньшей мере примерно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.In some cases, approximately more than 10, preferably approximately more than 100 different polymer sequences are synthesized on a single substrate, although it is possible that approximately 10 ³ , 10 ⁴ , 10 ⁵ , 10 ⁶ , 10 ^7, or 10 ⁸ different sequences are created on a single substrate. Naturally, within the region of the substrate in which the polymer sequence is synthesized, it is preferable that such a sequence is practically pure. In accordance with certain embodiments, the substrate regions comprise polymer sequences having a purity of at least about 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 96, 97, 98 or 99%.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления в одной области специально синтезируют несколько последовательностей для возможности осуществления начального скрининга на биологическую активность, после которого проводят дальнейшее изучение материалов в областях, в которых было обнаружено существенное связывание. In accordance with some embodiments, several sequences are specifically synthesized in one area to enable initial screening for biological activity, after which further study of materials in areas in which significant binding has been detected is carried out.

4. Подробное описание одного из вариантов осуществления реакторной системы. 4. A detailed description of one embodiment of a reactor system.

На фиг. 8 приведено схематическое изображение предпочтительного варианта осуществления реакторной системы 100 для синтеза полимеров на подготовленном субстрате в соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения. Реакторная система включает корпус 102 с полостью 104 на его поверхности. По предпочтительному варианту осуществления глубина полости равна примерно 50 - 1000, наиболее предпочтительно примерно 500 мкм. In FIG. 8 is a schematic representation of a preferred embodiment of a polymer synthesis reactor system 100 on a prepared substrate in accordance with one aspect of the present invention. The reactor system includes a housing 102 with a cavity 104 on its surface. In a preferred embodiment, the depth of the cavity is about 50-1000, most preferably about 500 microns.

На дне полости по предпочтительному варианту осуществления имеется ряд выступов 106, проходящих в направлении, перпендикулярном плоскости рисунка, и направлении, параллельном ей. Выступы предпочтительно имеют высоту 50 - 200 мкм и расположены на расстоянии примерно 2 - 3 мм друг от друга. Назначение этих выступов состоит в турбулизации потока для улучшения перемешивания. Для предупреждения отражения падающего света предпочтительно, чтобы поверхность дна полости отражала свет. At the bottom of the cavity according to the preferred embodiment, there are a number of protrusions 106 extending in a direction perpendicular to the plane of the pattern and in a direction parallel to it. The protrusions preferably have a height of 50-200 microns and are located at a distance of about 2 to 3 mm from each other. The purpose of these protrusions is to turbulize the flow to improve mixing. To prevent reflection of incident light, it is preferred that the bottom surface of the cavity reflects light.

Субстрат 112 располагается над полостью 104. На нижней поверхности 114 субстрата имеются фотоотщепляющие защитные группы, например NVOC, с расположенными между ними и поверхностью мостиковыми молекулами или без них. Предпочтительно, чтобы субстрат был прозрачным для широкого спектра длин волн облучающего света. Однако в случае некоторых вариантов осуществления он прозрачен лишь для той длины волны света, при которой может быть удалена защитная группа (например, УФ для NBOC). В случае некоторых вариантов осуществления субстратом служит обычное стеклянное предметное стекло для микроскопа или покровное стекло. Предпочтительно, чтобы субстрат был как можно тоньше. Обеспечивая в то же время надежную физическую опору. Предпочтительно, чтобы толщина его была меньше примерно 1, предпочтительнее меньше 0,5, более предпочтительно меньше 0,1, наиболее предпочтительно меньше 0,05 мм. В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления субстрат выполняется из кварца или кремния. The substrate 112 is located above the cavity 104. On the lower surface 114 of the substrate there are photocoupling protective groups, for example NVOC, with or without bridging molecules located between them and the surface. Preferably, the substrate is transparent to a wide range of wavelengths of the irradiating light. However, in the case of some embodiments, it is transparent only to the wavelength of light at which the protective group can be removed (e.g., UV for NBOC). In some embodiments, the substrate is a conventional microscope glass slide or a coverslip. Preferably, the substrate is as thin as possible. Providing at the same time reliable physical support. Preferably, its thickness is less than about 1, more preferably less than 0.5, more preferably less than 0.1, most preferably less than 0.05 mm. In accordance with other preferred embodiments, the substrate is made of quartz or silicon.

Субстрат и корпус служат для герметизации полости за исключением ее входной 108 и выходной 110 частей. В случае некоторых вариантов осуществления корпус и субстрат могут соединяться через одну или несколько прокладок. По предпочтительному варианту осуществления в корпусе имеется две концентрические прокладки, а в промежуточном пространстве для обеспечения соединения субстрата с прокладками создается вакуум. The substrate and the housing serve to seal the cavity with the exception of its input 108 and output 110 parts. In the case of some embodiments, the housing and substrate can be connected through one or more gaskets. According to a preferred embodiment, there are two concentric gaskets in the housing, and a vacuum is created in the intermediate space to allow the substrate to connect to the gaskets.

Жидкость подается в полость через входное отверстие с помощью насоса 116, например, модели B-120-S (Eldex Laboratories). Подаваемые этим насосом в полость определенные жидкости проходят через нее и выходят через выходное отверстие, после чего возвращаются для циркуляции или удаляются. В случае некоторых вариантов осуществления для улучшения перемешивания реактор подвергают воздействию ультразвуковой обработки и/или нагревают. The fluid is supplied into the cavity through the inlet using a pump 116, for example, model B-120-S (Eldex Laboratories). Certain liquids supplied by this pump into the cavity pass through it and exit through the outlet, after which they are returned for circulation or removed. In some embodiments, the reactor is sonicated and / or heated to improve mixing.

Над субстратом 112 смонтирована линза 120, например двухдюймовая сплавная линза, из диоксида кремния с фокусным расстоянием 100 мм. Для компактности в состав устройства может входить отражательное зеркало 122 для направления света от источника света 124 на субстрат. В качестве источника 124 может использоваться, например, Xe(Hg), модель N 66024, выпускаемая Oriel. В комбинации с линзой 120 может быть смонтирована вторая линза 126, предназначенная для проектирования изображения маски на субстрат. Такая разновидность литографии в дальнейшем будет называться проекционной литографией. Как будет видно из дальнейшего, в некоторых случаях возможно также использование фотолитографии с микрозазорами др. способов. A lens 120 is mounted above the substrate 112, for example a two-inch alloy lens, made of silicon dioxide with a focal length of 100 mm. For compactness, the device may include a reflective mirror 122 to direct light from the light source 124 onto the substrate. As source 124, for example, Xe (Hg), model N 66024, manufactured by Oriel, can be used. In combination with lens 120, a second lens 126 can be mounted to project the mask image onto the substrate. This kind of lithography will hereinafter be called projection lithography. As will be seen from what follows, in some cases it is also possible to use photolithography with micro-gaps of other methods.

Излучаемый свет, благодаря наличию маски 128, попадает только на определенные участки субстрата. Маской 128 может служить, например, стеклянное предметное стекло с хромированным фотошаблоном на нем. По одному из вариантов осуществления на маске имеется сетка из прозрачных и непрозрачных участков. Такого типа маски изготавливает, например, фирма Photo Science, Inc. Свет свободно проходит через прозрачные участки маски, но отражается или поглощается в других областях. Поэтому действию света подвергаются только определенные участки субстрата. The emitted light, due to the presence of mask 128, enters only certain areas of the substrate. Mask 128 may be, for example, a glass slide with a chrome mask on it. In one embodiment, the mask has a grid of transparent and opaque areas. This type of mask is made, for example, by Photo Science, Inc. Light passes freely through the transparent areas of the mask, but is reflected or absorbed in other areas. Therefore, only certain sections of the substrate are exposed to light.

Как уже отмечалось, помимо обычных масок для селективного экспонирования определенных участков субстрата можно использовать световые модуляторы (LCD'S) 7. По другому варианту для увеличения контрастности маски или в качестве собственно средства для ограничения области, подвергаемой воздействию света, можно использовать оптоволоконные планшайбы, например, выпускаемые фирмой Schott Glass, Inc. Такие план-шайбы размещают непосредственно над или на субстрате в реакторе, изображенном на фиг. 8. Помимо перечисленных устройств для увеличения контрастности можно использовать также фасеточные объективы, конусные оптоволоконные план-шайбы и т.п. As already noted, in addition to conventional masks, light modulators (LCD'S) 7 can also be used to selectively expose specific areas of the substrate. 7. Alternatively, to increase the contrast of the mask or, as a means of limiting the area exposed to light, you can use fiber optic faceplates, for example, manufactured Schott Glass, Inc. Such washers are placed directly above or on the substrate in the reactor of FIG. 8. In addition to the listed devices, facet lenses, conical fiber optic washers, etc. can also be used to increase contrast.

Для облучения участков, меньших по размеру, чем длина волны света, можно использовать более сложные устройства. Например, по одному из предпочтительных вариантов осуществления свет на субстрат направляют с помощью молекулярных микрокристаллов на кончик, например, микропипетки. Такие устройства описаны в работе Lieberman и др. "A Light Source smaller han the Optical wavelength: Science (1990) 247: 59-61, включенной в перечень ссылок к настоящей заявке. More complex devices can be used to irradiate areas smaller than the wavelength of light. For example, in one preferred embodiment, light is directed onto the substrate by molecular microcrystals at the tip of, for example, a micropipette. Such devices are described in the work of Lieberman et al. "A Light Source smaller han the Optical wavelength: Science (1990) 247: 59-61, which is included in the list of links to this application.

В процессе работы субстрат помещают на полость и осуществляют герметизацию. Все операции, связанные с получением субстрата, выполняются при освещении помещения (главным образом или полностью) светом, длина волны которого находится вне интервала длин волн, при которых удаляются защитные группы. Так, например, в случае NVOC помещение необходимо освещать обычным светом камеры-обскуры, не содержащим или содержащим в небольшом количестве УФ-излучение. Все операции предпочтительно проводить при комнатной температуре. In the process, the substrate is placed on the cavity and carry out the sealing. All operations associated with obtaining the substrate are performed when the room is illuminated (mainly or completely) with light whose wavelength is outside the wavelength range at which the protective groups are removed. So, for example, in the case of NVOC, the room must be illuminated with ordinary pinhole camera light, which does not contain or contains a small amount of UV radiation. All operations are preferably carried out at room temperature.

Вначале осуществляют циркуляцию через полость жидкости для отщепления защитных групп (без мономера). В качестве такой жидкости предпочтительно используют 5 мМ раствор серной кислоты в диоксане, благодаря контактированию с которым аминные группы продолжают оставаться в протонированном состоянии и который снижает их реакционную способность, не давая им тем самым взаимодействовать с побочными продуктами фотолиза. Используемая для отщепления защитных групп жидкость может, кроме того, содержать материалы, обладающие абсорбционной способностью, например N,N-диметиламино-2,4-динитробензол-, служащие для поглощения света и для предотвращения его отражения и нежелательного фотолиза. First, they circulate through the fluid cavity to remove the protective groups (without monomer). As such a liquid, a 5 mM solution of sulfuric acid in dioxane is preferably used, due to contact with which the amine groups remain in the protonated state and which reduces their reactivity, thereby preventing them from interacting with photolysis by-products. The liquid used to remove the protective groups may also contain materials with absorption capacity, for example N, N-dimethylamino-2,4-dinitrobenzene-, which are used to absorb light and to prevent its reflection and undesired photolysis.

После этого предметное стекло помещают в пучок света после прохождения последнего через маску таким образом, чтобы облучению светом подвергались первые локализации и в результате происходило отщепление защитных групп. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления субстрат облучают в течение примерно 1-15 мин, наиболее предпочтительно в течение примерно 10 мин потоком света 10-20 мВт/см² с длиной волны 365 нм. После фотолиза предметные стекла нейтрализуют (а именно, доводят pH примерно до 7) с помощью, например, раствора диизопропилэтиламина (DIEA) в метиленхлориде в течение примерно 5 мин.After that, a glass slide is placed in a beam of light after the latter passes through the mask so that the first localizations are exposed to light and, as a result, the protective groups are cleaved. In accordance with preferred embodiments, the substrate is irradiated for about 1-15 minutes, most preferably for about 10 minutes, with a light stream of 10-20 mW / cm ² with a wavelength of 365 nm. After photolysis, the slides are neutralized (namely, the pH is adjusted to about 7) using, for example, a solution of diisopropylethylamine (DIEA) in methylene chloride for about 5 minutes.

Затем первый мономер размещают в первых локализациях субстрата. После облучения предметное стекло удаляют, обрабатывают в объеме и снова помещают в проточную ячейку. По другому варианту осуществляют циркуляцию жидкости, содержащей первый мономер (предпочтительно также защищенный защитной группой), через полость с помощью насоса 116. Если например, хотят ввести аминокислоту Y в первые локализации субстрата, то осуществляют циркуляцию этой кислоты ( α -азот которой защищен защитной группой) вместе с реагентами, используемыми для поддержания мономера в реакционноспособном состоянии и/или с носителем с помощью насоса из емкости 118 через полость. Then the first monomer is placed in the first localization of the substrate. After irradiation, the slide is removed, processed in volume and again placed in the flow cell. In another embodiment, the liquid containing the first monomer (preferably also protected by a protective group) is circulated through the cavity using a pump 116. If, for example, you want to introduce the amino acid Y into the first locations of the substrate, then circulate this acid (whose α-nitrogen is protected by a protective group) ) together with reagents used to maintain the monomer in a reactive state and / or with a carrier by means of a pump from tank 118 through the cavity.

Раствор носителя мономера по предпочтительному варианту осуществления получают путем смещения первого раствора (обозначаемого далее раствор "A") и второго раствора (обозначаемого далее раствор "B"). The monomer support solution of the preferred embodiment is prepared by displacing the first solution (hereinafter referred to as “A” solution) and the second solution (hereinafter referred to as “B” solution).

Ниже приведен состав смеси, которая может использоваться в качестве раствора "A". The following is the composition of the mixture, which can be used as solution "A".

Пример раствора носителя мономера "A":
100 мг аминокислоты, амино-группа которой защищена NVOC;
37 мг HOBT (1-оксибензотриазола);
250 мкл ДМФ (диметилформамида);
86 DIEA (диизопропилэтиламина).An example of a solution of a carrier of monomer "A":
100 mg of an amino acid whose amino group is protected by NVOC;
37 mg HOBT (1-hydroxybenzotriazole);
250 μl DMF (dimethylformamide);
86 DIEA (diisopropylethylamine).

Пример раствора носителя мономера "B":
111 мг BOP (бензотриазолил-н-окси-трис(диметиламино)-фосфоний- гексафторфосфата)
Растворы A и B смешивают и осуществляют их взаимодействие при комнатной температуре в течение примерно 8 мин, после чего разбавляют 2 мл ДМФ и 500 мкл смеси наносят на поверхность предметного стекла или осуществляют циркуляцию раствора через реакторную систему для взаимодействия в течение примерно 2 ч при комнатной температуре. Предметное стекло промывают затем ДМФ, метиленхлоридом и этанолом.An example of a solution of a carrier of monomer "B":
111 mg BOP (benzotriazolyl-n-hydroxy-tris (dimethylamino) -phosphonium-hexafluorophosphate)
Solutions A and B are mixed and reacted at room temperature for about 8 minutes, then diluted with 2 ml of DMF and 500 μl of the mixture are applied to the surface of a glass slide or the solution is circulated through the reactor system for interaction for about 2 hours at room temperature . The slide is then washed with DMF, methylene chloride and ethanol.

При циркуляции раствора, содержащего подлежащий соединению с субстратом мономер, через полость аминокислота или другой мономер реагирует своими концевыми карбоксильными группами с аминогруппами в тех областях субстрата, в которых были удалены защитные группы. В данном случае настоящее изобретение иллюстрируется примером циркуляции мономера через полость. Само собой разумеется однако, что такой же результат может быть достигнут и при удалении предметного стекла из реактора и погружении его в соответствующий раствор мономера. When a solution containing a monomer to be connected to a substrate is circulated, an amino acid or other monomer reacts with its terminal carboxyl groups with amino groups through the cavity in those regions of the substrate in which the protective groups have been removed. In this case, the present invention is illustrated by the example of circulation of the monomer through the cavity. It goes without saying, however, that the same result can be achieved by removing a glass slide from the reactor and immersing it in an appropriate monomer solution.

После добавления первого мономера раствор, содержащий первую аминокислоту, удаляют из системы. После циркуляции ДМФ/метиленхлорида в количестве, достаточном для надежного удаления аминокислоты (например в количестве, равном примерно 50-кратному объему полости и соединительных трубопроводов), маску или субстрат устанавливают в новое положение (или используют новую маску) таким образом, чтобы экспонировались вторые области субстрата, и включают источник света 124 для второго облучения. В результате происходит отщепление защитных групп во вторых областях субстрата, процесс повторяют до тех пор, пока не будут синтезированы нужные полимерные последовательности. After adding the first monomer, the solution containing the first amino acid is removed from the system. After circulating DMF / methylene chloride in an amount sufficient to reliably remove the amino acid (for example, in an amount approximately equal to 50 times the volume of the cavity and connecting conduits), the mask or substrate is set to a new position (or a new mask is used) so that the second areas are exposed substrate, and include a light source 124 for a second exposure. As a result, the protective groups are cleaved in the second regions of the substrate, the process is repeated until the desired polymer sequences are synthesized.

После этого осуществляют контактирование всего дериватизированного субстрата с исследуемым рецептором, предпочтительно меченным, например, флуоресцентной меткой, путем циркуляции раствора или суспензии рецептора через полость или путем контактирования поверхности предметного стекла в объеме. Рецептор преимущественно связывается с теми областями субстрата, в которых содержатся комплементарные последовательности. After that, the entire derivatized substrate is contacted with the studied receptor, preferably labeled with, for example, a fluorescent label, by circulating the solution or suspension of the receptor through the cavity or by contacting the surface of a glass slide in volume. The receptor preferentially binds to those regions of the substrate that contain complementary sequences.

Антитела, как правило, суспендируют в жидкости, обычно называемой "суперсыворотка", которой может быть, например, раствор примерно 1% BSA (альбумин бычьей сыворотки), 0,5% Tween в PBS (буферированный фосфатным буфером раствор соли). Антитела разбавляют в буферной суперсыворотке до конечной концентрации, например, примерно 0,1-4 мкг/мл. Antibodies are typically suspended in a liquid commonly referred to as “super serum,” which may be, for example, a solution of approximately 1% BSA (bovine serum albumin), 0.5% Tween in PBS (phosphate buffered buffered saline). Antibodies are diluted in buffer super serum to a final concentration of, for example, about 0.1-4 μg / ml.

На фиг. 9 показан другой предпочтительный вариант осуществления реактора, изображенного на фиг. 8. В соответствии с этим вариантом осуществления маска 128 непосредственно контактирует с субстратом. Предпочтительно она помещается на субстрат травленной стороной для того, чтобы уменьшить эффект рассеивания света. При таком варианте осуществления в линзах 120 и 126 нет необходимости, поскольку маска находится в непосредственной близости от субстрата. In FIG. 9 shows another preferred embodiment of the reactor of FIG. 8. In accordance with this embodiment, the mask 128 is in direct contact with the substrate. Preferably, it is placed on the substrate with the etched side in order to reduce the effect of light scattering. With this embodiment, lenses 120 and 126 are not necessary, since the mask is in close proximity to the substrate.

Для увеличения соотношения сигнал-шум в случае некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения осуществляют контактирование субстрата с первым меченым или немеченым рецептором, а затем контактирование его с меченым вторым рецептором (например, антителом), который связывается с многочисленными центрами первого рецептора. Если, например, первым рецептором является антитело, полученное из животного первого вида, то вторым рецептором является антитело, полученное из животного второго вида и являющееся эпитопом, ассоциирующимся с антителом первого вида. В случае мышиного антитела для связывания на его многочисленных центрах можно использовать, например, козье антитело или сыворотку с флуоресцентной меткой, являющиеся антимышиными. В результате флуоресценция возрастает в несколько раз по сравнению с тем случаем, когда с каждым центром связывания соединяется лишь одно мышиное антитело. Этот процесс может быть повторен еще раз с дополнительными антителами (например, козьими-мышиными - козьими и т.п.) для еще большего усиления сигнала. To increase the signal-to-noise ratio, in the case of some embodiments of the present invention, the substrate is contacted with a first labeled or unlabeled receptor, and then contacted with a labeled second receptor (e.g., an antibody) that binds to the numerous centers of the first receptor. If, for example, the first receptor is an antibody derived from an animal of the first species, then the second receptor is an antibody derived from an animal of the second species and which is an epitope associated with an antibody of the first type. In the case of a murine antibody, for binding at its numerous centers, for example, a goat antibody or serum with a fluorescent label, which are anti-mouse, can be used. As a result, fluorescence increases several times in comparison with the case when only one murine antibody binds to each binding center. This process can be repeated once more with additional antibodies (for example, goat-mouse-goat-goat, etc.) to further enhance the signal.

По предпочтительным вариантам осуществления используется определенная последовательность масок. В некоторых случаях для синтеза всех возможных полимеров из определенного набора мономеров оказывается возможным использовать одну единственную маску. In preferred embodiments, a specific sequence of masks is used. In some cases, it is possible to use one single mask for the synthesis of all possible polymers from a particular set of monomers.

Если, например, хотят синтезировать все 16 динулесьидов из четырех исходных блоков, площадь синтеза в 1 см² условно разделяют на 16 камер шириной 0,25 см каждая. Обозначим четыре мономерных блока буквами A, B, C и D. Первые реакции проводят в четырех вертикальных колонках шириной 0,25 см каждая. С помощью первой маски экспонируется крайняя левая колонка камер, где происходит связывание A. С помощью второй маски экспонируется следующая колонка, где происходит связывание B. Ее сменяет третья маска для колонки C и, наконец, с помощью последней маски экспонируется крайняя правая колонка для D. Функцию первой, второй, третьей и четвертой масок может выполнять одна единственная маска, перемещаемая в разные локализации.If, for example, they want to synthesize all 16 dinulesides from four source blocks, the synthesis area of 1 cm ^{2 is} conventionally divided into 16 chambers 0.25 cm wide each. Denote the four monomer units by the letters A, B, C and D. The first reactions are carried out in four vertical columns 0.25 cm wide each. Using the first mask, the leftmost column of the cameras is exposed, where A. is linked. Using the second mask, the next column is displayed, where B. is linked. It is replaced by the third mask for column C and, finally, with the last mask, the rightmost column is displayed for D. The function of the first, second, third and fourth masks can be performed by one single mask, moved to different locations.

Описанный процесс повторяют в горизонтальном направлении для второго блока димера. На этот раз с помощью масок осуществляют экспонирование по рядам, также шириной 0,25 см A, B, C и D последовательно связывают с помощью масок, которыми экспонируются четвертые части реакционной площади. Получаемый в результате субстрат содержит все 16 динуклеотидов, синтезированных из четырех исходных блоков. The described process is repeated in the horizontal direction for the second block of the dimer. This time, using masks, exposure is carried out in rows, also 0.25 cm wide A, B, C and D are sequentially connected using masks that expose the fourth parts of the reaction area. The resulting substrate contains all 16 dinucleotides synthesized from four source blocks.

Восемь масок, используемых для синтеза вышеуказанных динуклеотидов, могут быть заменены одной маской со смещением или вращением последней. Действительно, одну маску можно использовать на всех восьми стадиях при соответствующих ее поворотах и смещении. Так, например, в случае вышеописанного процесса маску с одной прозрачной областью можно поочередно использовать для экспонирования каждой из четырех вертикальных колонок, затем сместить ее на 90^o и провести последовательное экспонирование по горизонтальным рядам.Eight masks used for the synthesis of the above dinucleotides can be replaced with one mask with the displacement or rotation of the latter. Indeed, one mask can be used at all eight stages with its corresponding rotations and displacement. So, for example, in the case of the above process, a mask with one transparent region can be used to expose each of the four vertical columns, then shift it by 90 ^o and conduct sequential exposure in horizontal rows.

В табл. 2 представлена простая компьютерная программа на быстром бейсике для планирования программы маскирования и дан пример выходных данных соответственно для синтеза полимерного звена из трех мономеров (остатков) с тремя разными мономерами на первом, четырьмя разными мономерами на втором и пятью разными мономерами на третьем уровнях с полосчатым изображением. Выходными данными программы являются количество ячеек, количество полос (светлых областей) в каждой маске и количество смещений, необходимых для каждого экспонирования маски. In the table. Figure 2 shows a simple computer program on a quick base for planning a masking program and gives an example of output data for the synthesis of a polymer unit from three monomers (residues) with three different monomers on the first, four different monomers on the second and five different monomers on the third level with a striped image . The output of the program is the number of cells, the number of stripes (bright areas) in each mask, and the number of offsets needed for each exposure of the mask.

Выходные данные для программы маскирования
Количество остатков - 3
Остаток 1 - 3 исходных блока.Output for masking program
The number of residues - 3
The remainder of 1 - 3 source blocks.

Остаток 2 - 4 исходных блока. The remainder of 2 - 4 source blocks.

Остаток 3 - 5 исходных блоков. The remainder of 3 - 5 source blocks.

Количество ячеек 60. The number of cells is 60.

Маска для остатка 1. Mask for the remainder 1.

Количество полос 1. Number of bands 1.

Ширина каждой полосы 20. The width of each strip is 20.

Полоса 1 начинается в локализации 1 и заканчивается в локализации 20. Lane 1 begins at location 1 and ends at location 20.

Для каждого из 3 исходных блоков смещать маску на 20 ячеек. For each of the 3 source blocks, shift the mask by 20 cells.

Маска для остатка 2. Mask for residue 2.

Количество полос 3. Number of bands 3.

Ширина каждой полосы 5. The width of each strip is 5.

Полоса 1 начинается в локализации 1 и заканчивается в локализации 5. Lane 1 starts at location 1 and ends at location 5.

Полоса 2 начинается в локализации 21 и заканчивается в локализации 25. Lane 2 begins at location 21 and ends at location 25.

Полоса 3 начинается в локализации 41 и заканчивается в локализации 45. Lane 3 begins at location 41 and ends at location 45.

Для каждого из 4 исходных блоков смешать маску на 5 ячеек. For each of the 4 source blocks mix a mask of 5 cells.

Маска для остатка 3. Mask for the remainder 3.

Количество полос 12. Number of stripes 12.

Ширина каждой полосы 1. Width of each strip 1.

Полоса 1 начинается в локализации 1 и заканчивается в локализации 1. Lane 1 starts at location 1 and ends at location 1.

Полоса 2 начинается в локализации 6 и заканчивается в локализации 6. Lane 2 starts at location 6 and ends at location 6.

Полоса 3 начинается в локализации 11 и заканчивается в локализации 11. Lane 3 begins at location 11 and ends at location 11.

Полоса 4 начинается в локализации 16 и заканчивается в локализации 16. Lane 4 begins at location 16 and ends at location 16.

Полоса 5 начинается в локализации 21 и заканчивается в локализации 21. Lane 5 begins at location 21 and ends at location 21.

Полоса 6 начинается в локализации 26 и заканчивается в локализации 26. Lane 6 begins at location 26 and ends at location 26.

Полоса 7 начинается в локализации 31 и заканчивается в локализации 31. Lane 7 begins at location 31 and ends at location 31.

Полоса 8 начинается в локализации 36 и заканчивается в локализации 36. Lane 8 begins at location 36 and ends at location 36.

Полоса 9 начинается в локализации 41 и заканчивается в локализации 41. Lane 9 begins at location 41 and ends at location 41.

Полоса 10 начинается в локализации 46 и заканчивается в локализации 46. Lane 10 begins at location 46 and ends at location 46.

Полоса 11 начинается в локализации 51 и заканчивается в локализации 51. Lane 11 begins at location 51 and ends at location 51.

Полоса 12 начинается в локализации 56 и заканчивается в локализации 56. Lane 12 begins at location 56 and ends at location 56.

Для каждого из 5 исходных блоков смещать маску на 1 ячейку Copyright 1990, Affymax
5. Подробное описание одного из вариантов осуществления флуоресцентного детекторного устройства.For each of the 5 source blocks, shift the mask by 1 cell Copyright 1990, Affymax
5. A detailed description of one embodiment of a fluorescent detector device.

На фиг. 10 показано детекторное устройство для детектирования рецепторов с флуоресцентной меткой на субстрате. Субстрат 112 помещают на трансляционный координантный стол 202. По предпочтительному варианту осуществления в качестве такого стола используют модель N PM500-A1, выпускаемую фирмой Newport Corporation. Этот координантный стол управляется по соответствующей программе, соединенной с ним и соответствующим образом запрограммированной ЭВМ, в качестве которой может использоваться, например, IBM PC/AT или AT-совместимый компьютер. Естественно, что вместо AT-компьютера, приведенного в настоящей заявке в качестве примера, можно использовать и другие компьютерные системы, аппаратные средства специального назначения и т.п. Нижеописанное программное обеспечение для трансляции и первичной обработки информации может быть создано на основе существующего программного обеспечения, включая, например, "Zab Windows", выпускаемое по лицензии National Jnstruments и включенное в перечень ссылок к настоящей заявке. In FIG. 10 shows a detector device for detecting receptors with a fluorescent label on a substrate. The substrate 112 is placed on the translational coordinate table 202. In a preferred embodiment, model N PM500-A1 manufactured by Newport Corporation is used as such a table. This coordinate table is controlled by the corresponding program connected to it and the correspondingly programmed computer, which can be used, for example, IBM PC / AT or AT-compatible computer. Naturally, instead of the AT-computer shown in this application as an example, you can use other computer systems, special-purpose hardware, etc. The following software for translation and primary processing of information can be created on the basis of existing software, including, for example, "Zab Windows", released under license from National Jnstruments and included in the list of links to this application.

Субстрат и координатный стол помещают под микроскоп 206 с одним или несколькими объективами 208. Свет (с длиной волны примерно 488 нм) от лазера 210, в качестве которого в случае некоторых вариантов осуществления используется аргонный ионный лазер модели N 2020-06, выпускаемой фирмой Spectraphysics, направляется на субстрат с помощью дихроичного зеркала 207, пропускающего свет длин волн более 520 нм, но отражающее свет с длиной волны 488 нм. Дихроичным зеркалом 207 может быть, например, модель N FT510, выпускаемая фирмой Carl Zeiss. Свет, отраженный зеркалом, попадает в микроскоп 206, в качестве которого можно, например, использовать модель Axioscop 20, выпускаемую фирмой Carl Zeiss. Меченные флуоресцеином материалы на субстрате генерируют флуоресцирующее излучение с длиной волны более 488 нм, которое собирается микроскопом и проходит через зеркало. Флуоресцентное излучение субстрата проходит затем через волновой фильтр 209 и диафрагму 211. В качестве волнового фильтра 209 можно, например, использовать модель N OG530, выпускаемую фирмой Melles Griot, а в качестве диафрагмы 211, например, модель N 477352/477380, выпускаемую фирмой Carl Zeiss. The substrate and the coordinate table are placed under a microscope 206 with one or more lenses 208. The light (with a wavelength of about 488 nm) from a laser 210, which, in some embodiments, uses an N 2020-06 model argon ion laser manufactured by Spectraphysics, sent to the substrate using a dichroic mirror 207, transmitting light at wavelengths greater than 520 nm, but reflecting light with a wavelength of 488 nm. The dichroic mirror 207 may be, for example, Model N FT510 manufactured by Carl Zeiss. The light reflected by the mirror enters the microscope 206, for example, using the Axioscop 20 model manufactured by Carl Zeiss. Fluorescein-labeled materials on the substrate generate fluorescent radiation with a wavelength of more than 488 nm, which is collected by a microscope and passes through a mirror. The fluorescent radiation of the substrate then passes through the wave filter 209 and the diaphragm 211. As a wave filter 209, for example, model N OG530 manufactured by Melles Griot can be used, and as a diaphragm 211, for example, model N 477352/477380 manufactured by Carl Zeiss .

Флоуресцентное излучение попадает затем в фотоумножитель 212, в качестве которого в случае некоторых примеров осуществления используется модель N R943-02, выпускаемая фирмой Hamamatsu. Сигнал усиливается предусилителем 214, и число фотонов подсчитывается счетчиком фотонов 216. Подсчитанное количество фотонов фиксируется в компьютере 204 как функция локализации. В качестве предусилителя 214 можно использовать, например, модель N SR 440, выпускаемую фирмой Stanford Research Systems, а в качестве счетчика фотонов 216 - модель N SR 400, выпускаемую этой же фирмой. Субстрат затем перемещают в следующее положение и весь процесс повторяют. В соотношении с предпочтительными вариантами осуществления таким образом получают данные для каждых I-100 мкм субстрата при диаметре исследуемого участка примерно 0,8-10 мкм. В случае некоторых вариантов осуществления при достаточно интенсивной флуоресценции используются ПОС-детектор с широкой полосой облучения. The fluorescent radiation then enters the photomultiplier 212, for which, in the case of some embodiments, the model N R943-02 manufactured by Hamamatsu is used. The signal is amplified by the preamplifier 214, and the number of photons is counted by the photon counter 216. The counted number of photons is recorded in the computer 204 as a localization function. As a preamplifier 214, for example, model N SR 440 manufactured by Stanford Research Systems can be used, and as a photon counter 216, model N SR 400 manufactured by the same company can be used. The substrate is then moved to the next position and the whole process is repeated. In relation to the preferred embodiments, data is thus obtained for each I-100 μm of the substrate with a diameter of the test area of about 0.8-10 μm. In the case of some embodiments, with sufficiently intense fluorescence, a POS detector with a wide irradiation band is used.

Зная количество фотонов, генерируемых в данной области субстрата под действием лазерного излучения, можно определить местонахождение на субстрате молекул с флуоресцентной меткой. Следовательно, в случае предметного стекла, использовавшегося в качестве матрицы полипептидов, например, синтезированных на его поверхности, можно определить, какие именно полипептиды комплементарны рецептору с флоуресцентной меткой. Knowing the number of photons generated in this region of the substrate under the action of laser radiation, it is possible to determine the location of molecules with a fluorescent label on the substrate. Therefore, in the case of a glass slide used as a matrix of polypeptides, for example, synthesized on its surface, it is possible to determine which polypeptides are complementary to a fluorescent-labeled receptor.

В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления изобретения интенсивность и продолжительность облучения субстрата светом контролируется путем изменения мощности лазера и скорости сканирования, улучшение соотношения сигнал-шум - путем максимального увеличения флуоресцентного излучения и сведения к минимуму фоновых шумов. In accordance with preferred embodiments of the invention, the intensity and duration of irradiation of the substrate with light is controlled by changing the laser power and scanning speed, improving the signal-to-noise ratio by maximizing the increase in fluorescent radiation and minimizing background noise.

Хотя детекторное устройство и описано в первую очередь на примере детектирования меченых рецепторов, изобретение может найти применение и в других областях. Так, например, описанное детекторное устройство может использоваться при изучении катализа для скрининга ДНК или белковых гелей и т.п. Although the detector device is described primarily on the example of detecting labeled receptors, the invention may find application in other areas. So, for example, the described detector device can be used in the study of catalysis for screening DNA or protein gels, etc.

6. Определение относительной прочности связывания рецепторов. 6. Determination of relative binding strength of receptors.

Соотношение сигнал-шум в случае настоящего изобретения является достаточно высоким, чтобы можно было не только установить наличие или отсутствие рецептора на лиганде, но и определить относительную прочность связывания рецепторов с различными последовательностями. The signal-to-noise ratio in the case of the present invention is high enough so that it is possible not only to establish the presence or absence of a receptor on the ligand, but also to determine the relative binding strength of the receptors with different sequences.

На практике было установлено, что рецептор может образовывать связи с различными пептидными последовательностями, однако прочность связывания его соседними последовательностями будет больше, чем с другими. В рамках настоящего изобретения прочность связывания характеризуется величиной флуоресцентного или радиографического сигнала, поскольку в области образования прочной связи с лигандом будет связываться большое количество молекул рецептора. И наоборот, слабое сродство будет характеризоваться слабым флуоресцентным или радиографическим сигналом, вследствие того, что в определенной области субстрат, в которой находится лиганд, обладающий слабым сродством к конкретному рецептору, с ним будет связываться небольшое количество молекул этого рецептора. Таким образом, становится возможным определять относительную прочность связывания (или сродство в случае одновалентных взаимодействий) интересующего лиганда по интенсивности флуоресцентного или радиографического сигнала в области субстрата, содержащей этот лиганд. In practice, it was found that the receptor can form bonds with various peptide sequences, however, the binding strength of its neighboring sequences will be greater than with others. In the framework of the present invention, the binding strength is characterized by the magnitude of the fluorescent or radiographic signal, since in the field of formation of strong bonds with the ligand will be associated with a large number of receptor molecules. Conversely, a weak affinity will be characterized by a weak fluorescent or radiographic signal, due to the fact that in a certain region of the substrate, in which a ligand with a weak affinity for a particular receptor is located, a small number of molecules of this receptor will bind to it. Thus, it becomes possible to determine the relative binding strength (or affinity in the case of monovalent interactions) of the ligand of interest by the intensity of the fluorescent or radiographic signal in the region of the substrate containing this ligand.

Варьируя условия промывки и концентрации рецептора, можно также получить полуколичественные данные по степени сродства. Это можно сделать путем, например, сравнения известных пар лиганд-рецептор. By varying the washing conditions and receptor concentration, semi-quantitative data on the degree of affinity can also be obtained. This can be done by, for example, comparing known ligand-receptor pairs.

8. Примеры
Эффективность описанного изобретения иллюстрируется нижеприведенными примерами. Все операции, если это не оговорено, проводились примерно при комнатной температуре и нормальном давлении.8. Examples
The effectiveness of the described invention is illustrated by the following examples. All operations, unless otherwise specified, were carried out at approximately room temperature and normal pressure.

А. Получение предметных стекол
Перед введением реакционноспособных групп субстрат, в качестве которого по предпочтительному варианту осуществления используют стеклянный материал, в частности предметные или покровные стекла для микроскопа, целесообразно очистить. В соответствии с одним из вариантов осуществления предметного стекла для этого погружают на 12 ч в щелочную ванну, состоящую, например, из 1 л 95 %-ного этанола, 120 мл воды и 120 г гидроксида натрия. После этого стекла промывают проточной водой, высушивают на воздухе и промывают 95%-ным этанолом.A. Obtaining slides
Before the introduction of reactive groups, the substrate, which, according to the preferred embodiment, is used as a glass material, in particular microscope slides or coverslips, is expediently cleaned. In accordance with one of the embodiments, the slide for this is immersed for 12 hours in an alkaline bath, consisting, for example, of 1 liter of 95% ethanol, 120 ml of water and 120 g of sodium hydroxide. After that, the glasses are washed with running water, dried in air and washed with 95% ethanol.

Для введения аминных групп, которые связываются со стеклянной поверхностью через мостиковые молекулы, промытые предметные стекла аминируют путем взаимодействия их, например, с аминопропилтриэтоксисиланом, хотя для этой цели можно использовать также любой силан с функциональной группой в омега-положении. По одному из вариантов осуществления используют 0,1 %-ный раствор аминопропилтриэтоксисилана, хотя можно использовать и растворы с концентрацией 10^-7-10%. Предпочтительно, чтобы концентрация находилась в пределах примерно 10^-3-2 %. 0,1 %-ную смесь получают путем добавления к 100 мл смеси 95 % этанола и 5 % воды, 100 мкл аминопропилтриэтоксисилана. Смесь перемешивают на вращающемся встряхивающем аппарате при температуре, близкой к температуре окружающей среды, в течение примерно 5 мин. 500 мкл этой смеси наносят затем с одной стороны на поверхность очищенных предметных стекол. Через 5 мин стекла отделяют от раствора декантацией и трижды промывают, например, 100%-ным этанолом путем окунания.To introduce amine groups that bind to the glass surface through bridging molecules, washed glass slides are aminated by reacting them, for example, with aminopropyltriethoxysilane, although any silane with a functional group in the omega position can also be used for this purpose. In one embodiment, a 0.1% solution of aminopropyltriethoxysilane is used, although solutions with a concentration of 10 ^-7 -10% can be used. Preferably, the concentration is in the range of about 10 ⁻³ −2%. A 0.1% mixture is obtained by adding to 100 ml of a mixture of 95% ethanol and 5% water, 100 μl of aminopropyltriethoxysilane. The mixture is stirred on a rotary shaker at a temperature close to ambient temperature for about 5 minutes. 500 μl of this mixture is then applied on one side to the surface of the purified slides. After 5 minutes, the glasses are separated from the solution by decantation and washed three times, for example, with 100% ethanol by dipping.

После того, как стекла высохнут, их помещают в вакуумную печь и выдерживают при 110-120^oC в течение примерно 20 мин, а затем проводят выдержку при комнатной температуре в течение примерно 12 ч в атмосфере аргона. После этого их окунают в раствор ДМФ (диметилформамида) и тщательно промывают метиленхлоридом.After the glasses have dried, they are placed in a vacuum oven and kept at 110-120 ^o C for about 20 minutes, and then held at room temperature for about 12 hours in an argon atmosphere. After that, they are dipped in a solution of DMF (dimethylformamide) and washed thoroughly with methylene chloride.

Аминированную поверхность предметных стекол подвергают затем воздействию примерно 500 мкл, например, 30 миллимолярного (мМ) раствора NVOC-CABA (гамма-аминомасляной кислоты) NHS (N-оксисукцинимида) в ДМФ, в результате чего NVOC-GABA соединяется с аминогруппами. The aminated surface of the slides is then exposed to approximately 500 μl, for example, a 30 millimolar (mM) solution of NVOC-CABA (gamma-aminobutyric acid) NHS (N-oxysuccinimide) in DMF, whereby NVOC-GABA combines with amino groups.

После этого поверхность промывают, например, ДМФ-метиленхлоридом и этанолом. After this, the surface is washed, for example, with DMF-methylene chloride and ethanol.

Находящийся на поверхности непрореагировавший аминопропилсилан, т.е. аминогруппы, не связанные с NVOC-GABA, копируют ацетильными группами (для предотвращения дальнейшего реагирования) путем контактирования со смесью уксусного ангидрида и пиридина (1:3) в течение 1 ч. Для такого кэпирования можно использовать и другие материалы, включая ангидрид трифторуксусной кислоты, смешанный ангидрид муравьиной и уксусной кислот или другие реакционноспособные ацилирующие агенты. И, наконец, обработанные вышеописанным образом предметные стекла снова промывают ДМФ, метиленхлоридом и этанолом. Unreacted aminopropylsilane located on the surface, i.e. non-NVOC-GABA-linked amino groups are copied by acetyl groups (to prevent further reaction) by contacting with a mixture of acetic anhydride and pyridine (1: 3) for 1 hour. Other materials including trifluoroacetic anhydride can be used for this capping, mixed formic anhydride and acetic acid or other reactive acylating agents. Finally, the slides treated as described above are washed again with DMF, methylene chloride and ethanol.

В. Синтез восьми тримеров "A" и "B"
На фиг. 11 приведен вариант синтеза восьми тримеров из двух наборов мономеров: gly, phe (обозначенных соответственно "A" и "B"). Готовят в качестве субстрата стеклянное предметное стекло с аминовыми группами, заканчивающимися 6-нитровератрилоксикарбоксамидными (NVOC-NH) остатками. В качестве реагентов используют активные эфиры (пентафторфениловые, OBt b n/l/) gly и phe, аминогруппы которых защищены NVOC. Следует отметить (хотя к данному примеру это и не относится), что в том случае, если в наборе мономеров необходимо защищать боковую цепь, то используемые для этой цели защитные группы не должны быть фотореакционноспособными при длине волны света, используемой для защиты главной цепи.B. Synthesis of eight trimers "A" and "B"
In FIG. Figure 11 shows a variant of the synthesis of eight trimers from two sets of monomers: gly, phe (labeled “A” and “B”, respectively). A glass slide with amine groups ending in 6-nitro-veratryloxycarboxamide (NVOC-NH) residues is prepared as a substrate. As reagents, active esters (pentafluorophenyl, OBt bn / l /) gly and phe are used, the amino groups of which are protected by NVOC. It should be noted (although this does not apply to this example) that if it is necessary to protect the side chain in the monomer set, then the protective groups used for this purpose should not be photoreactive at the wavelength of light used to protect the main chain.

В случае набора из n мономеров, чтобы синтезировать все возможные последовательности длины l, необходимо n•l циклов. In the case of a set of n monomers, n • l cycles are necessary to synthesize all possible sequences of length l.

Каждый цикл состоит из:
- облучения через соответствующую маску для экспонирования аминогрупп в тех местах, в которых должен быть введен следующий остаток, и соответствующей промывки для удаления образующихся при отщеплении защитных групп побочных продуктов и
- добавления активированного и защищенного (удаляемой фотохимически защитной группой той же природы) мономера, который будет взаимодействовать с центрами, предусмотренными для стадии I, и соответствующей промывки для удаления с поверхности избытка реагента.Each cycle consists of:
- irradiation through an appropriate mask to expose the amino groups in those places where the next residue is to be introduced, and appropriate washing to remove the by-products formed during cleavage of the protective groups and
- adding activated and protected (removable photochemically protective group of the same nature) monomer, which will interact with the centers provided for in stage I, and appropriate washing to remove excess reagent from the surface.

По одному из вариантов осуществления указанный цикл повторяют для каждого члена набора мономеров до тех пор, пока каждая локализация не будет занята одним остатком. По другим вариантам осуществления несколько остатков последовательно вводят в одну локализацию, после чего переходят к следующей локализации. Продолжительность циклов, как правило, лимитируется скоростью реакции связывания и в настоящее время в автоматизированных синтезаторах пептидов составляет 20 мин. После этой стадии для стабилизации полученного множества для последующего тестирования может быть введена защитная группа. В случае некоторых типов полимеров (например, пептидов) может оказаться необходимым удаление защитных групп со всей поверхности (удаление фотозащитных групп боковых цепей). In one embodiment, the indicated cycle is repeated for each member of the set of monomers until each localization is occupied by one residue. In other embodiments, several residues are sequentially introduced into one localization, after which they proceed to the next localization. The duration of the cycles, as a rule, is limited by the rate of the binding reaction and is currently 20 minutes in automated peptide synthesizers. After this step, a protecting group may be introduced to stabilize the resulting array for subsequent testing. In the case of certain types of polymers (for example, peptides), it may be necessary to remove the protective groups from the entire surface (remove the photoprotective groups of the side chains).

В случае конкретного варианта осуществления предметное стекло 20, как это показано на фиг. 11A, разделено на области 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 и 36. Области 30, 32, 34 и 36 закрывают маской, как это показано на фиг. 11B, и стекло облучают светом, после чего осуществляют контактирование его с реагентом, содержащим "A" (например, gly). В результате образуется структура, показанная на фиг. 11C. После этого маской закрывают области 22, 24, 26 и 28, стекло облучают (см. фиг. 11D) и осуществляют контактирование его с реагентом, содержащим "B" (например phe). В результате образуется структура, показанная на фиг. 11E. Процесс продолжают, последовательно осуществляя маскирование и экспонирование соответствующих участков до тех пор, пока не получают структуру, показанную на фиг. 11M. После этого стекло облучают и концевые группы при желании кэпируют путем ацетилирования. Как видно из рисунка, в результате получают все возможные тримеры gly и phe. In the case of a particular embodiment, the slide 20, as shown in FIG. 11A is divided into regions 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 and 36. The regions 30, 32, 34 and 36 are masked as shown in FIG. 11B and the glass is irradiated with light, after which it is contacted with a reagent containing “A” (for example, gly). As a result, the structure shown in FIG. 11C. After this, the areas 22, 24, 26 and 28 are closed with a mask, the glass is irradiated (see Fig. 11D) and it is contacted with a reagent containing “B” (for example phe). As a result, the structure shown in FIG. 11E. The process is continued by sequentially masking and exposing the respective sections until the structure shown in FIG. 11M. After that, the glass is irradiated and the end groups are capped if desired by acetylation. As can be seen from the figure, the result is all possible trimers gly and phe.

В данном случае в удалении защитных групп боковых цепей нет необходимости. В тех же случаях, когда это нужно, удаление защитных групп боковых цепей может быть осуществлено путем обработки этандитиолом и трифторуксусной кислотой. In this case, the removal of the protective groups of the side chains is not necessary. In the same cases, when necessary, the removal of the protective groups of the side chains can be carried out by treatment with ethanedithiol and trifluoroacetic acid.

Как правило, количество стадий, необходимых для получения конкретной полимерной цепи, определяется выражением:
n•l,
в котором n означает количество мономеров в исходном наборе мономеров, а l - количество мономерных звеньев в полимерной цепи.As a rule, the number of stages required to obtain a specific polymer chain is determined by the expression:
n • l,
in which n means the number of monomers in the initial set of monomers, and l is the number of monomer units in the polymer chain.

И, наоборот, количество синтезированных последовательностей длиной l будет равно:
n^l
Естественно, большее количество последовательностей может быть получено, если маскирование проводить по программе, включающей синтез полимеров с длиной менее l. Если взять крайний случай, когда хотят получить все полимеры длиной менее или равной l, то количество синтезированных полимеров будет равняться:
n^l + n^l-1 +...+ n¹ (3)
Максимальное число необходимых литографических стадий обычно равно n для каждого слоя мономеров, т.е. общее количество масок (а, следовательно, и число литографических стадий) будет равно n•l. Размер прозрачных областей маски будет меняться в зависимости от площади субстрата, на которой протекает синтез, и количества синтезируемых последовательностей. В общем случае площадь синтеза может быть определена по формуле:
Площадь синтеза = (A) / (S),
где
A-площадь (вся), а S - количество последовательностей, которые хотят синтезировать на этой площади.And, conversely, the number of synthesized sequences of length l will be equal to:
n ^l
Naturally, a larger number of sequences can be obtained if masking is carried out according to a program that includes the synthesis of polymers with a length of less than l. If we take the extreme case when they want to get all polymers with a length less than or equal to l, then the number of synthesized polymers will be equal to:
n ^l + n ^l-1 + ... + n ¹ (3)
The maximum number of lithographic steps required is usually n for each layer of monomers, i.e. the total number of masks (and, consequently, the number of lithographic stages) will be equal to n • l. The size of the transparent areas of the mask will vary depending on the area of the substrate on which the synthesis proceeds and the number of synthesized sequences. In the General case, the synthesis area can be determined by the formula:
Synthesis area = (A) / (S),
Where
A-area (all), and S - the number of sequences that want to synthesize in this area.

Для специалиста в данной области из вышесказанного ясно, что с помощью вышеуказанного способа, используя описанную технику литографии, можно без труда получать на субстрате тысячи или миллионы олигомеров. Благодаря этому предлагаемый способ представляет возможность практически испытывать большие количества ди-, три-, тетра-, пента-, гекса-, гепта-, окта-, додекапептиды или более длинные полипептиды (соответственно полинуклеотиды). For a specialist in this field from the foregoing, it is clear that using the above method, using the described lithography technique, one can easily obtain thousands or millions of oligomers on a substrate. Due to this, the proposed method provides the opportunity to practically test large amounts of di-, tri-, tetra-, penta-, hexa-, hepta-, octa-, dodecapapeptides or longer polypeptides (respectively polynucleotides).

Вышеприведенный пример иллюстрирует способ в его "ручном" варианте, однако, он может осуществляться автоматически или полуавтоматически. Для этого субстрат необходимо помесить в проточную ячейку для возможности автоматического добавления или удаления реагентов, сведения к минимуму их расхода и более строгого контроля условий протекания реакций. Смена масок может осуществляться вручную или автоматически. The above example illustrates the method in its "manual" version, however, it can be carried out automatically or semi-automatically. For this, the substrate must be placed in the flow cell to be able to automatically add or remove reagents, to minimize their consumption and to more strictly control the reaction conditions. Masks can be changed manually or automatically.

С. Синтез димера аминопропильной и флуоресцентной групп. C. Synthesis of a dimer of aminopropyl and fluorescent groups.

Для синтеза димера аминопропильной и флуоресцентной групп в качестве субстрата использовали durapore мембрану с функциональными группами. Durapore мембрана была выполнена из поливинилидин-дифторида с аминопропильными группами. Последние были защищены DDZ - группами путем взаимодействия карбонилхлорида с аминогруппами. Эта реакция хорошо известна специалистам в данной области. Субстрат с этими группами на его поверхности помещали в раствор тетрагидрофурана и осуществляли контактирование его с чередующимися в шахматном порядке прозрачными и непрозрачными областями с длиной стороны 1 мм. Маску облучали ультрафиолетовым светом с нижним пределом длины волны как минимум примерно 280 нм. Облучение проводили в течение примерно 5 мин при температуре окружающей среды, хотя для различных вариантов осуществления изобретения возможен широкий интервал времени облучения и температуры. Так, например, по одному из вариантов осуществления продолжительность облучения может находиться в пределах примерно 1-5000 c, а температура (-70)-(+50)^oC.For the synthesis of a dimer of the aminopropyl and fluorescent groups, a durapore membrane with functional groups was used as a substrate. Durapore membrane was made of polyvinylidine-difluoride with aminopropyl groups. The latter were protected by DDZ - groups through the interaction of carbonyl chloride with amino groups. This reaction is well known to those skilled in the art. A substrate with these groups on its surface was placed in a tetrahydrofuran solution and it was contacted with staggered transparent and opaque regions with a side length of 1 mm. The mask was irradiated with ultraviolet light with a lower wavelength limit of at least about 280 nm. Irradiation was carried out for about 5 minutes at ambient temperature, although a wide range of irradiation time and temperature is possible for various embodiments of the invention. So, for example, in one embodiment, the duration of irradiation can be in the range of about 1-5000 s, and the temperature (-70) - (+ 50) ^o C.

По одному из предпочтительных вариантов осуществления облучение проводят в течение примерно 1-500 c при примерно атмосферном давлении. По другим предпочтительным вариантам осуществления для предотвращения испарения процесс проводят при повышенном давлении. In one preferred embodiment, the irradiation is carried out for about 1-500 s at about atmospheric pressure. In other preferred embodiments, to prevent evaporation, the process is carried out at elevated pressure.

Поверхность мембраны затем промывают в течение примерно часа флуоресцентной меткой, включающей реакционноспособный эфир, связанный с хелатом лиганда. Продолжительность промывки может варьироваться в широких пределах, от примерно нескольких минут до нескольких часов. Указанные материалы флуоресцируют в красной и зеленой видимой областях. После окончания реакции реакционноспособного эфира в флуорофоре места, в которых происходит связывание флуорофора, могут быть сделаны видимыми, если облучить их ультрафиолетовым светом, и обнаружены по испускаемому или красному и зеленому свечению. Было установлено, что дериватизированные области субстрата строго соответствуют рисунку маски. The membrane surface is then washed for about an hour with a fluorescent label including a reactive ester bound to a ligand chelate. The flushing time can vary widely, from about a few minutes to several hours. These materials fluoresce in the red and green visible regions. After the completion of the reaction of the reactive ester in the fluorophore, the places where the fluorophore is bound can be made visible by irradiating it with ultraviolet light and detected by the emitted or red and green glow. It was found that the derivatized regions of the substrate strictly correspond to the pattern of the mask.

D. Демонстрация чувствительности детектирования сигнала. D. Demonstration of signal detection sensitivity.

Чувствительность детектирования сигнала была продемонстрирована с помощью стандартного набора флуоресцентного бисера с низким уровнем модели N 824, выпускаемой фирмой Flow Cytometry standard. Набор состоит из бисеринок диаметром 5,8 мкм с нанесенным на них путем пропитки известным количеством молекул флуоресцеина. The sensitivity of signal detection was demonstrated using a standard set of low-level fluorescent beads, model N 824, manufactured by Flow Cytometry standard. The kit consists of beads with a diameter of 5.8 μm deposited on them by impregnation with a known number of fluorescein molecules.

Бисеринку из такого набора помещали на координатный стол, как это показано на фиг. 10, в освещаемое поле в районе лазерного пятна, которое вначале экранировали. После этого включали устройство для детектирования фотонов, деблокировали лазерный пучок, который взаимодействовал с бисеринкой, в результате чего последняя начинала флуоресцировать. Кривые флоуресцентного излучения бисеринок, содержащих 7 и 29000 молекул флуоресцеина, приведены на фиг. 12 и 13 соответственно. На обоих рисунках приведены также кривые для бисеринок без молекул флуоресцеина. Эксперименты проводились при длине волны возбуждающего света 488 нм и выходной мощности лазера 100 мкВт. Свет фокусировали с помощью 40-кратного 0,7 NA-объектива. A bead from such a set was placed on the coordinate table, as shown in FIG. 10, into the illuminated field in the region of the laser spot, which was first screened. After that, the device for detecting photons was turned on, the laser beam that interacted with the bead was released, as a result of which the latter began to fluoresce. The fluorescence emission curves of beads containing 7 and 29,000 fluorescein molecules are shown in FIG. 12 and 13, respectively. The curves for beads without fluorescein molecules are also shown in both figures. The experiments were carried out at a wavelength of exciting light of 488 nm and a laser output of 100 μW. The light was focused using a 40x 0.7 NA lens.

Во всех случаях интенсивность флуоресценции вначале была высокой и затем уменьшалась по экспоненциальному закону. Такое снижение интенсивности объясняется фотообесцвечиванием молекул флуоресцеина. Кривые излучения бисеринок без молекул флуоресцеина использовались для вычитания фона. Интегрирование кривой, представляющей собой разность начальных участков экспоненциальных кривых спада меченных и немеченных бисеринок, давало общее количество зафиксированных фотонов, которое относили к числу молекул флуоресцеина в бисеринках. Зная эту величину, можно было определить количество фотонов, испускаемых одной молекулой флуоресцеина, которое можно было зафиксировать. В случае кривых, изображенных на фиг. 1, приведенные описанным образом расчеты свидетельствуют о том, что предлагаемое устройство позволяет фиксировать излучение интенсивностью примерно 40-50 фотонов на молекулу флуоресцеина. In all cases, the fluorescence intensity was initially high and then decreased exponentially. This decrease in intensity is due to photobleaching of fluorescein molecules. The emission curves of beads without fluorescein molecules were used to subtract the background. Integration of the curve, which is the difference between the initial sections of the exponential decay curves of labeled and unlabeled beads, gave the total number of fixed photons, which was attributed to the number of fluorescein molecules in the beads. Knowing this value, it was possible to determine the number of photons emitted by one molecule of fluorescein, which could be fixed. In the case of the curves depicted in FIG. 1, the calculations described in the described manner indicate that the proposed device allows you to record radiation with an intensity of about 40-50 photons per fluorescein molecule.

E. Определение числа молекул на единицу поверхности
Полученные вышеописанными способами аминопропилированные стеклянные предметные стекла для микроскопа использовали для определения плотности их меченности. Свободные концевые аминогруппы стекол подвергали взаимодействию с FITC (флуоресцеинизоцианат), образующим с ними ковалентные связи. После этого проводили сканирование предметных стекол для определения количества испускаемых в исследуемой области фотонов. Найденное количество фотонов (40-50), приходящееся на одну флуоресцентную молекулу, позволяет рассчитать количество молекул, приходящееся на единицу поверхности.E. Determination of the number of molecules per unit surface
Obtained by the above methods, aminopropylated glass microscope slides were used to determine their labeled density. The free terminal amino groups of the glasses were reacted with FITC (fluorescein isocyanate) to form covalent bonds with them. After that, scanning the slides was carried out to determine the number of photons emitted in the studied region. The found number of photons (40-50) per one fluorescent molecule allows us to calculate the number of molecules per unit surface.

Предметное стекло с аминопропилсиланом на поверхности погружали в 1 мМ раствор FITC в ДМФ на 1 ч при температуре, близкой к температуре окружающей среды. После окончания реакции стекло дважды промывали ДМФ, затем этанолом, водой и снова этанолом, После этого его высушивали и хранили в темноте до начала измерений. A glass slide with aminopropylsilane on the surface was immersed in a 1 mM solution of FITC in DMF for 1 h at a temperature close to ambient temperature. After the reaction was completed, the glass was washed twice with DMF, then with ethanol, water and again with ethanol. After that, it was dried and stored in the dark until measurements began.

Путем интегрирования участка экспоненциального спада кривых флуоресцентного сигнала, аналогичных кривым, изображенным на фиг. 12, определяли количество свободных аминогрупп на дериватизированной поверхности предметного стекла. Было установлено, что описанным способом можно, варьируя концентрацию аминопропилтриэтоксисилана в пределах 10^-5 - 10⁰¹%, воспроизводимо получать предметные стекла с плотностью меченности 1 молекула флуоресцеина на 10³•10³ ≈ 2•2 нм.By integrating the exponential decay portion of the fluorescent signal curves similar to those shown in FIG. 12, the amount of free amino groups on the derivatized surface of the slide was determined. It was found that by the described method it is possible, varying the concentration of aminopropyltriethoxysilane in the range of 10 ^-5 - 10 ⁰¹ %, to reproducibly obtain slides with a labeled density of 1 fluorescein molecule per 10 ³ • 10 ³ ≈ 2 • 2 nm.

F. Удаление NVOC и введение флуоресцентной метки. F. Removal of NVOC and the introduction of a fluorescent label.

NVOC-GABA-группы вводили вышеописанным образом. Всю поверхность стекла подвергали затем воздействию света для получения свободных концевых аминогрупп в гамма-аминомаслянной кислоте. Обработанные таким образом, а также необлученные предметные стекла подвергали взаимодействию с флуоресцеинизоцианатом (FITC). NVOC-GABA groups were introduced as described above. The entire surface of the glass was then exposed to light to obtain free terminal amino groups in gamma-aminobutyric acid. Treated in this way as well as unirradiated slides were reacted with fluorescein isocyanate (FITC).

На фиг. 14A показано необлученное, но находившееся в контакте с FITC предметное стекло. По оси X отложено время, а по оси y - количество зарегистрированных фотонов. In FIG. 14A shows a non-irradiated but contacted FITC glass slide. Time is plotted on the X axis, and the number of registered photons is plotted on the y axis.

Такое же предметное стекло освещали светом длиной волны 350 нм в течение примерно 1 мин (12 мВт/см²≈350 нм), промывали и подвергали воздействию FITC. Кривая флуоресценции для его стекла показана на фиг. 14B. В этом случае наблюдали большое возрастание интенсивности флуоресценции, свидетельствующее о том, что в результате фотолиза на поверхности предметного стекла образовывалось количество аминогрупп, которые связывались с флуоресцентной меткой.The same slide was illuminated with light at a wavelength of 350 nm for about 1 minute (12 mW / cm ² ≈350 nm), washed and exposed to FITC. The fluorescence curve for its glass is shown in FIG. 14B. In this case, a large increase in the fluorescence intensity was observed, indicating that, as a result of photolysis, a number of amino groups were formed on the surface of the glass slide that bound to the fluorescent label.

G. Использование маски для удаления NVOC. G. Using a mask to remove NVOC.

Для нижеописанного эксперимента использовали аминопропилированное предметное стекло с концентрацией аминопропильных групп 0,1 %. Свет от Hg - Xe дуговой лампы проектировали на субстрат через полученную хромированием на стекле маску, непосредственно контактировавшую с субстратом. For the experiment described below, an aminopropylated glass slide with an aminopropyl group concentration of 0.1% was used. The light from the Hg - Xe arc lamp was projected onto the substrate through a mask obtained by chromium plating on glass, which was in direct contact with the substrate.

Облучение проводили в течение примерно 5 мин светом длины волны 350 нм, потоком 12 мВт, после чего осуществляли контактирование субстрата с 1 мМ раствором FITC. Обработанное таким образом предметное стекло помещали на координатный стол лазерного детектора и строили график зависимости флуоресцентного излучения в виде двухмерного расположения цветных меток. Эксперимент повторяли несколько раз, используя разные маски. Флуоресцентные картины для масок 100•100, 50, 20 и 10 мкм свидетельствуют о том, что при использовании такой техники литографии рисунок маски остается различимым при размерах ячеек как минимум примерно 10 мкм².Irradiation was carried out for about 5 min with a wavelength of 350 nm, a flux of 12 mW, after which the substrate was contacted with a 1 mM FITC solution. The slide thus treated in such a way was placed on the coordinate table of the laser detector and a graph of the dependence of fluorescence radiation was constructed in the form of a two-dimensional arrangement of color marks. The experiment was repeated several times using different masks. Fluorescence patterns for masks of 100 • 100, 50, 20 and 10 μm indicate that using this technique of lithography, the mask pattern remains visible with mesh sizes of at least about 10 μm ² .

H. Введение YGGFL и последующее контактирование с антителом Герца и козьим антимышиным антителом. H. Administration of YGGFL and subsequent contact with Hertz antibody and goat anti-mouse antibody.

Для выяснения возможности связывания и детектирования рецепторов конкретной полипептидной последовательности с иммобилизированным на поверхности пептидом связывали Leu энкефалин с поверхностью и осуществляли распознавание антителом. Предметное стекло дериватизировали 0,1 % аминопропилтриэтоксисиланом и защищали NVOC. Для экспонирования предметного стекла в проточной ячейке использовали маску с шахматным рисунком с размером клеток 500 мкм, нанесенную на обратную сторону стекла методом контактной фотолитографии. Leu энкефалиновую последовательность (H₂N - тирозин, глицин, фенилаланин, лейцин- CO H, обозначается далее как YGGFL) соединяли через ее концевую карбоксигруппу с экспонированными аминогруппами на поверхности предметного стекла. После этого в проточную ячейку вводили пептид в виде раствора в ДМФ с сочетающими реагентами BOP/HOBT/DIEA, осуществляли циркуляцию раствора в течение 2 ч при комнатной температуре.To clarify the possibility of binding and detection of receptors of a particular polypeptide sequence with a surface-immobilized peptide, Leu enkephalin was bound to the surface and antibody recognition was performed. The slide was derivatized with 0.1% aminopropyltriethoxysilane and protected by NVOC. To expose a glass slide in a flow cell, a mask with a checkerboard pattern with a cell size of 500 μm was applied, applied to the back of the glass by contact photolithography. The Leu enkephalin sequence (H ₂ N - tyrosine, glycine, phenylalanine, leucine-CO H, hereinafter referred to as YGGFL) was connected via its terminal carboxy group to the exposed amino groups on the surface of the glass slide. After that, the peptide was introduced into the flow cell in the form of a solution in DMF with the combination reagents BOP / HOBT / DIEA, and the solution was circulated for 2 h at room temperature.

После этого осуществляли контактирование поверхности предметного стекла с первым антителом, известным под названием антитело Герца, при концентрации его в суперсыворотке (содержавшей 1 % B S A и 1 % яичного альбумина) 2 мкг/мл в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем добавляли второе антитело - конъюгат козьего антимышиного антитела с флуоресцеином в суперсывороточном буфере при концентрации его 2 мкг/мл и осуществляли выдержку в течение 2 ч. After that, the surface of the slide was contacted with the first antibody, known as the Hertz antibody, at a concentration of 2 μg / ml in super serum (containing 1% B S A and 1% egg albumin) for 45 min at room temperature. Then, a second antibody, a goat anti-mouse antibody conjugate with fluorescein, was added in super-serum buffer at a concentration of 2 μg / ml and the exposure was carried out for 2 hours.

Результаты этого эксперимента выражали в виде зависимости интенсивности флуоресценции от положения. Картину получали с шагом 10 мкм. Полученные результаты свидетельствуют о том, что описанный способ позволяет не только проводить отщепление защитных групп в четко определенных областях субстрата, но и (I) успешно осуществлять связывание пептидов с поверхностью субстрата, (2) получать иммобилизированные на поверхности субстрата пептиды, которые могут связываться с антителом, и (3) что чувствительность детектирующего устройства достаточна для детектирования связанного рецептора. The results of this experiment were expressed as the position of the fluorescence intensity. The picture was obtained in increments of 10 μm. The results obtained indicate that the described method allows not only the cleavage of protective groups in clearly defined areas of the substrate, but also (I) successful binding of peptides to the surface of the substrate, (2) to obtain peptides immobilized on the surface of the substrate that can bind to the antibody , and (3) that the sensitivity of the detection device is sufficient to detect the bound receptor.

i. Получение "мономер к мономеру" YGGFL и последующее контактирование его с меченным антителом. i. Obtaining "monomer to monomer" YGGFL and then contacting it with a labeled antibody.

На предметном стекле осуществляли синтез YGGFL и GGFL способом "мономер к мономеру" в шахматном порядке и полученнное в результате предметное стекло подвергали взаимодействию с антителом Герца. Результаты эксперимента представлены на фиг. 15 и 16. YGGFL and GGFL were synthesized on a glass slide using the monomer to monomer method in a checkerboard fashion and the resulting glass slide was reacted with a Hertz antibody. The experimental results are shown in FIG. 15 and 16.

На фиг. 15 показано дериватизированное аминопропильными группами, защищенными в данном случае t=BOC (тертбутоксикарбонилом), предметное стекло. Для удаления t-BOC защитных групп предметное стекло обрабатывали TFA, после чего аминопропильные группы связывали с e-аминокапроновой кислотой, аминогруппа которой была защищена t-BOC. Аминокапроновая кислота в данном случае играла роль спейсера между аминопропильной группой и синтезируемым пептидом. Защитную группу концевой аминогруппы спейсера отщепляли и осуществляли взаимодействие последнего с защищенным NVOC лейцином. Все предметное стекло облучали затем светом длиной волны 325 нм при мощности потока 12 мВт, осуществляли взаимодействие его с защищенным NVOC фенилаланином и промывали. Затем все предметное стекло снова облучали, осуществляли взаимодействие его с защищенным NVOC глицином и промывали. Стекло затем снова облучали и осуществляли взаимодействие с защищенным NVOC глицином, получая в результате последовательность, изображенную в самой нижней части фиг. 15. In FIG. 15 shows a glass slide derivatized with aminopropyl groups protected in this case t = BOC (tertbutoxycarbonyl). To remove the t-BOC protective groups, the glass slide was treated with TFA, after which the aminopropyl groups were coupled to e-aminocaproic acid, the amino group of which was protected by t-BOC. Aminocaproic acid in this case played the role of a spacer between the aminopropyl group and the synthesized peptide. The protective group of the terminal amino group of the spacer was cleaved and the latter was reacted with protected NVOC leucine. The entire slide was then irradiated with 325 nm wavelength light at a flow power of 12 mW, interacted with protected NVOC phenylalanine, and washed. Then, the entire slide was irradiated again, interacted with NVOC-protected glycine and washed. The glass was then irradiated again and reacted with NVOC-protected glycine, resulting in the sequence depicted in the lowermost part of FIG. fifteen.

Как видно из фиг. 16, чередующиеся области обработанного таким образом предметного стекла облучали через полученную с помощью проекционной литографии маску с шахматным рисунком с размером клеток 500•500 мкм. Аминогруппы глицина экспонировались только на освещенных участках. Для осуществления следующей химической стадии добавляли защищенный NVOC тирозин, который связывали только на тех участках, которые были подвергнуты облучению. Затем облучали все предметное стекло для удаления всех групп NVOC. В результате получали шахматный рисунок с YGGFL на светлых и GGFL на остальных участках. После этого осуществляли контактирование предметного стекла с антителом Герца (распознающим YGGFL, но не распознающим GGFL), а затем - с конъюгатом козьевого антимышиного антитела и флуоресцеина. As can be seen from FIG. 16, alternating regions of a glass slide thus treated were irradiated through a checkerboard mask with a cell size of 500 × 500 μm obtained by projection lithography. Amino groups of glycine were exposed only in illuminated areas. To carry out the next chemical step, protected NVOC tyrosine was added, which was bound only in those areas that were irradiated. Then, the entire slide was irradiated to remove all NVOC groups. The result was a chess pattern with YGGFL in the light and GGFL in the remaining areas. After that, the slide was contacted with a Hertz antibody (recognizing YGGFL, but not recognizing GGFL), and then with the conjugate of a goat anti-mouse antibody and fluorescein.

На полученной при сканировании флуоресцентной картине видны темные участки, содержащие тетрапептид GGFL, не распознаваемый антителом Герца (поэтому не связывающийся с конъюгатом козьего антимышиного антитела и флуоресцеина), и участки красного цвета, на которых присутствует YGGFL. Пентапептид YGGFL распознается антителом Герца, и таким образом в освещенных областях оказывается антитело для распознавания связанного с флуоресцеином козьего антимышиного антитела. The fluorescence pattern obtained by scanning shows dark regions containing the GGFL tetrapeptide not recognized by the Hertz antibody (therefore, not binding to the goat anti-mouse antibody and fluorescein conjugate), and red regions where YGGFL is present. The YGGFL pentapeptide is recognized by the Hertz antibody, and thus an antibody is detected in the lighted regions for recognition of the goat anti-mouse antibody associated with fluorescein.

При использовании масок с аналогичным рисунком (с размером клеток 50 мкм), непосредственно контактирующих с субстратом (установка фотолитографии с микрозазором), получали более четкую картину, причем края шахматного рисунка касались, что является следствием непосредственного контактирования маски с субстратом (результатом чего является увеличение при таком способе разрешения). When using masks with a similar pattern (with a cell size of 50 μm) in direct contact with the substrate (photolithography unit with a microgap), a clearer picture was obtained, and the edges of the checkerboard pattern touched, which is a consequence of direct contact of the mask with the substrate (which results in an increase in this way of resolution).

y. Синтез YGGFL и PGGFL способом "мономер к мономеру."
Синтез осуществляли с помощью маски с шахматным рисунком с размером клеток 50 мкм, аналогичной изображенной на фиг. 15. Различие состояло в том, что на дополнительной стадии в центры субстрата с GGFL вводили P. Введение P осуществляли путем облучения защищенных GGFL светом через маску и последующего контактирования субстрата с P вышеописанным образом. В результате половина поверхности субстрата содержала YGGFL, а вторая половина - PGGFL.y. Synthesis of YGGFL and PGGFL by the method "monomer to monomer."
The synthesis was carried out using a mask with a checkerboard pattern with a cell size of 50 μm, similar to that shown in FIG. 15. The difference was that, at an additional stage, P was introduced into the centers of the substrate with GGFL. The introduction of P was carried out by irradiating the protected GGFL with light through a mask and then contacting the substrate with P in the manner described above. As a result, half of the substrate surface contained YGGFL and the other half contained PGGFL.

Излучение флуоресцентной картины показало, что и в этом случае легко можно различить области, в которых произошло связывание. Radiation from the fluorescence pattern showed that even in this case, it is easy to distinguish between the regions in which the binding occurred.

K. Синтез YGGFL и YPGGFL способом "мономер к мономеру."
Для дополнительной иллюстрации возможностей настоящего изобретения осуществляли синтез YGGFL и YPGGFL с шахматным рисунком на субстрате аналогичным вышеописанному образом. Полученная флуоресцентная картина свидетельствовала о том, что антитело однозначно распознавало последовательность YGGFL и не связывалось в областях, в которых присутствовал YPGGFL.K. Synthesis of YGGFL and YPGGFL by the "Monomer to Monomer Method"
To further illustrate the capabilities of the present invention, the synthesis of YGGFL and YPGGFL with a checkerboard pattern on a substrate was carried out in the same manner as described above. The resulting fluorescence pattern indicated that the antibody uniquely recognized the YGGFL sequence and did not bind in areas in which YPGGFL was present.

L. Синтез шестнадцати различных аминокислотных последовательностей и определение относительной прочности их связывания с антителом Герца. L. Synthesis of sixteen different amino acid sequences and determination of the relative strength of their binding to the Hertz antibody.

С помощью вышеописанного способа на каждом из двух стеклянных предметных стекол синтезировали по 16 различных аминокислотных последовательностей (опыт повторяли 4 раза). Последовательности синтезировали путем введения последовательности NVOC-GFL на всей поверхности предметного стекла. Затем с помощью нескольких масок на субстрат селективно наносили два слоя аминокислот. Каждая область имела размер 0,25 • 0,0625 см. Первое предметное стекло содержало аминокислотные последовательности, состоявшие только из L-, а второе только из D-аминокислот. На фиг. 17A и B показаны картины различных областей соответственно первого и второго предметных стекол. Картины, показанные на фиг. 17A и B, воспроизводились по четыре раза для каждого предметного стекла. После этого осуществляли контактирование предметных стекол с антителом Герца и меченым флуоресцеином козьим антимышиным антителом. Using the above method, 16 different amino acid sequences were synthesized on each of two glass slides (the experiment was repeated 4 times). The sequences were synthesized by introducing the sequence NVOC-GFL on the entire surface of the slide. Then, using several masks, two layers of amino acids were selectively applied to the substrate. Each region had a size of 0.25 • 0.0625 cm. The first glass slide contained amino acid sequences consisting only of L-, and the second only of D-amino acids. In FIG. 17A and B show pictures of different regions of the first and second glass slides, respectively. The paintings shown in FIG. 17A and B were reproduced four times for each slide. After that, the slides were contacted with a Hertz antibody and fluorescein-labeled goat anti-mouse antibody.

На флуоресцентной картине первого стекла, содержавшего только L-аминокислоты, присутствовали красные (свидетельствовавшие о прочном связывании, а именно на них регистрировалось 149000 или более фотонов) и темные (свидетельствовавшие об отсутствие или незначительном связывании антител Герца, регистрация 20000 или менее фотонов) участки. Последовательность YAGFL и YSGFL также хорошо распознаются этим антителом. В отличие от этого большинство остальных последовательностей или совсем не связываются с этим антителом или связываются в незначительной степени. Четыре повторных опыта показали хорошую сходимость в отношении количества связанных антител. In the fluorescent picture of the first glass containing only L-amino acids, there were red (indicating strong binding, namely 149,000 or more photons) and dark (indicating the absence or slight binding of Hertz antibodies, registration of 20,000 or less photons). The YAGFL and YSGFL sequences are also well recognized by this antibody. In contrast, most of the remaining sequences either do not bind to this antibody at all or bind to a small extent. Four repeated experiments showed good convergence in terms of the number of bound antibodies.

Флуоресцентная картина предметного стекла с D-аминокислотами показала, что наиболее прочно связывается YGGFL- последовательность. Существенное связывание было обнаружено также в случае YaGFL, YsGFL и YpGFL. Остальные последовательности связываются с указанным антителом менее прочно, а последовательность yGGFL связывается слабо. The fluorescence picture of a glass slide with D-amino acids showed that the YGGFL sequence is most strongly bound. Significant binding was also found in the case of YaGFL, YsGFL and YpGFL. The remaining sequences bind to the indicated antibody less strongly, and the yGGFL sequence binds weakly.

В табл. 3 приведены различные испытания последовательности, расположенные в порядке убывания интенсивности флуоресцентного излучения, что дает информацию об относительной прочности связывания. In the table. Figure 3 shows various sequence tests arranged in decreasing order of fluorescence emission intensity, which provides information on the relative bond strength.

8. Другой вариант осуществления. 8. Another embodiment.

Другим аспектом настоящего изобретения являются способы связывания с поверхностью каркасного связующего элемента, каркасная форма которого обладает относительно низким сродством к другим веществам, таким как рецепторы и специфически связывающиеся соединения. Более подробно такие способы описаны в одновременно рассматриваемой заявке N 404920, поданной 8 сентября 1989 года и включенной в перечень ссылок к настоящей заявке. Another aspect of the present invention are methods of binding to the surface of a carcass binding element, the carcass form of which has a relatively low affinity for other substances, such as receptors and specifically binding compounds. Such methods are described in more detail in simultaneously considered application N 404920, filed September 8, 1989 and included in the list of links to this application.

В соответствии с этим другим аспектом предметом настоящего изобретения являются способы формирования на поверхности твердой подложки определенных областей, в которых возможна иммобилизация рецепторов. Суть этих способов заключается в использовании каркасных связующих элементов, что позволяет осуществлять селективную активацию определенных областей поверхности подложки. Для того, чтобы каркасные связующие элементы могли выполнять свою функцию, их выделяют в свободном виде, благодаря чему они оказываются способными связывать рецепторы после активирования определенных областей поверхности подложки. Активированные таким образом связующие элементы используют затем для иммобилизации в определенных областях поверхности подложки конкретных молекул, например, рецепторов. Вышеописанную процедуру повторяют на тех же или других участках поверхности, в результате чего получают подложку с поверхностью, разбитой на множество участков, содержащих, например, одинаковые или различные рецепторы. Если иммобилизированные таким образом рецепторы обладают различным сродством к одному или нескольким лигандам, то это дает возможность проводить скрининг и анализ лигандов в тех областях поверхности, которые содержат такие рецепторы. In accordance with this other aspect, the subject of the present invention is methods for forming certain regions on the surface of a solid substrate in which receptor immobilization is possible. The essence of these methods is the use of frame binding elements, which allows selective activation of certain areas of the surface of the substrate. In order for frame binding elements to fulfill their function, they are isolated in free form, so that they are able to bind receptors after activating certain areas of the substrate surface. The binding elements activated in this way are then used to immobilize specific molecules, for example, receptors, in certain areas of the substrate surface. The above procedure is repeated on the same or different parts of the surface, resulting in a substrate with a surface divided into many areas containing, for example, the same or different receptors. If the receptors immobilized in this way have a different affinity for one or more ligands, this makes it possible to screen and analyze ligands in those regions of the surface that contain such receptors.

Вышеуказанный альтернативный вариант осуществления изобретения позоволяет использовать новые каркасные связывающие элементы, соединенные с субстратом. Каркасные (неактивированные) элементы обладают относительно низким сродством к рецепторам веществ, специфически связывающихся с некаркасными связующими элементами, по сравнению с активированными связующими элементами. Вследствие этого такие связующие элементы не вступают в реакцию до тех пор, пока соответствующие области поверхности не будут активированы с помощью подходящего источника энергии. После такой активации каркасные группы становятся лабильными, в результате чего образуются активированные связующие элементы. Типичным источником энергии для такой активации является свет. The above alternative embodiment of the invention allows the use of new frame binding elements connected to the substrate. Frame (non-activated) elements have a relatively low affinity for receptors of substances that specifically bind to non-frame binding elements, compared with activated binding elements. As a result of this, such bonding elements do not react until the corresponding surface regions are activated with a suitable energy source. After such activation, the framework groups become labile, as a result of which activated binding elements are formed. A typical energy source for such activation is light.

После активации находящихся на поверхности связующих элементов они могут соединяться с рецептором. Таким рецептором может быть моноклональное антитело, последовательность нуклеиновых кислот, рецептор лекарственного вещества и т. п. Как правило (хотя и не всегда), рецептор должен быть получен в такой форме, чтобы он мог быть связан (прямо или косвенно) со связующим элементом. Так, например, роль мостика между связующими элементами и рецепторами при желании могут играть специфически связывающиеся соединения, обладающие большим сродством к связующему элементу и к рецептору, или конъюгаты рецептора. По предлагаемому способу используются рецепторы, полученные в таком виде, что они сохраняют свою активность по отношению к конкретному лиганду. After activation of the binding elements located on the surface, they can bind to the receptor. Such a receptor can be a monoclonal antibody, a nucleic acid sequence, a drug receptor, etc. As a rule (although not always), the receptor must be obtained in such a form that it can be bound (directly or indirectly) to the connecting element. So, for example, the role of a bridge between the binding elements and receptors, if desired, can be played by specifically binding compounds with great affinity for the binding element and the receptor, or receptor conjugates. The proposed method uses receptors obtained in such a way that they retain their activity with respect to a particular ligand.

Предпочтительно в качестве каркасного связующего элемента, связанного с поверхностью твердого субстрата, используют фотоактивирующийся биотиновый комплекс, а именно биотин, молекула которого химически модифицирована фотоактивирующимися защитными группами таким образом, что в результате она обладает значительно более низким сродством к авидину или его аналогам по сравнению с природным биотином. По предпочтительному варианту осуществления эти защитные группы, локализованные в определенной области поверхности, удаляют путем облучения этой области подходящим источником излучения, в результате чего образуются связующие элементы, а именно биотин или соединение с аналогичной функциональностью, обладающие таким же сродством к авидину или его аналогам, как и биотин. Preferably, a photoactivating biotin complex, namely biotin, the molecule of which is chemically modified by photoactivating protective groups so that as a result it has a significantly lower affinity for avidin or its analogs compared to natural, is preferably used as a frame binding element bonded to the surface of a solid substrate biotin. According to a preferred embodiment, these protective groups localized in a certain area of the surface are removed by irradiation of this area with a suitable radiation source, resulting in the formation of binding elements, namely biotin or a compound with similar functionality, having the same affinity for avidin or its analogues, as and biotin.

По другому предпочтительному варианту осуществления авидин или его аналог выдерживают в контакте с активированными связующими элементами на поверхности до образования их прочной связи с авидином. Иммобилизированный таким образом на определенных участках поверхности авидин может затем выдерживаться с интересуемым рецептором или его конъюгатом. Предпочтительно, если авидин иммобилизирован на определенных участках поверхности субстрата, чтобы рецептор был биотинилирован. Им может быть, например, биотинилированное антитело. Другим предпочтительным вариантом осуществления является авидин/биотинилированный комплекс рецептора, приготовленный заранее для активации связующих элементов на поверхности. In another preferred embodiment, the avidin or its analogue is kept in contact with the activated bonding elements on the surface until they form a strong bond with avidin. Avidin thus immobilized in such a way on certain surface areas can then be maintained with the receptor of interest or its conjugate. Preferably, if avidin is immobilized in certain areas of the surface of the substrate, the receptor is biotinylated. It may be, for example, a biotinylated antibody. Another preferred embodiment is an avidin / biotinylated receptor complex prepared in advance to activate binding elements on the surface.

9. Вывод. 9. Conclusion.

Результатом настоящего изобретения являются значительно усовершенствованные способы и устройство для синтеза полимеров на субстрате. Следует отметить, что вышеприведенное описание служит чисто иллюстративным целям и не ограничивает объем изобретения. Для специалиста, ознакомившегося с приведенным описанием, очевидно, что возможны самые различные варианты осуществления изобретения. В данном случае изобретение описано, в первую очередь, на примере использования фотоотщепляемых защитных групп, однако для специалиста в данной области совершенно очевидно, что для этой цели может использоваться не только свет, но и другие источники излучения. Так, например, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления может оказаться целесообразным использовать защитные группы, чувствительные к облучению электронным пучком, рентгеновским излучением в комбинации с электронно-лучевой или рентгеновской литографией. По другому варианту осуществления защитные группы могут быть удалены путем воздействия на них электрического тока. Поэтому объем защиты настоящего изобретения не должен ограничиваться вышеприведенным описанием, а должен определяться прилагаемой формулой изобретения с учетом всех характеризуемых ею эквивалентов. The result of the present invention are significantly improved methods and apparatus for the synthesis of polymers on a substrate. It should be noted that the above description serves purely illustrative purposes and does not limit the scope of the invention. For a specialist who has read the above description, it is obvious that a variety of embodiments of the invention are possible. In this case, the invention is described, first of all, by the example of the use of photodetectable protective groups, however, it is quite obvious to a person skilled in the art that not only light but also other radiation sources can be used for this purpose. So, for example, in accordance with some variants of implementation, it may be appropriate to use protective groups that are sensitive to electron beam irradiation, x-ray radiation in combination with electron beam or x-ray lithography. In another embodiment, the protecting groups may be removed by exposure to electric current. Therefore, the scope of protection of the present invention should not be limited to the above description, but should be determined by the attached claims taking into account all equivalents characterized by it.

Claims (32)

1. Способ получения аминокислотных или нуклеиновокислотных последовательностей на субстрате, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:
а) воздействие на первую область субстрата активатором для удаления защитных групп;
б) воздействие, по меньшей мере, на эту первую область первым аминокислотным или нуклеотидным мономером;
в) воздействие на вторую область активатором для удаления защитных групп;
г) контактирование по меньшей мере второй области с вторым аминокислотным или нуклеотидным мономером.1. The method of obtaining amino acid or nucleic acid sequences on a substrate, characterized in that the following stages are carried out:
a) exposure to the first region of the substrate with an activator to remove protective groups;
b) the impact of at least this first region of the first amino acid or nucleotide monomer;
C) the impact on the second region of the activator to remove protective groups;
g) contacting at least the second region with a second amino acid or nucleotide monomer. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве активатора используют активатор, выбранный из группы, состоящей из ионных пучков, электронных пучков, рентгеновского, ультрафиолетового излучений, света, инфракрасного света, микроволнового излучения, электротоков, радиоволн и их комбинаций. 2. The method according to claim 1, characterized in that the activator is an activator selected from the group consisting of ion beams, electron beams, X-ray, ultraviolet radiation, light, infrared light, microwave radiation, electric currents, radio waves and combinations thereof. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что защитными группами являются фоточувствительные защитные группы. 3. The method according to claim 1, characterized in that the protective groups are photosensitive protective groups. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные стадии воздействия на субстрат активатором представляет собой стадии, на которых определенные области субстрата подвергают воздействию света. 4. The method according to claim 1, characterized in that said steps of exposing the substrate to an activator are stages in which certain regions of the substrate are exposed to light. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что первым и вторым мономером являются аминокислоты. 5. The method according to claim 1, characterized in that the first and second monomer are amino acids. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что осуществляют, кроме того, стадию скрининга аминокислотных и нуклеиновокислотных последовательностей на субстрате для определения их сродства к рецептору, причем эта стадия скрининга включает операцию контактирования субстрата с рецептором и определение присутствия рецептора в первой и второй областях. 6. The method according to claim 1, characterized in that, in addition, carry out the stage of screening amino acid and nucleic acid sequences on a substrate to determine their affinity for the receptor, and this stage of screening includes the operation of contacting the substrate with the receptor and determining the presence of the receptor in the first and second areas. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанным рецептором является антитело. 7. The method according to claim 6, characterized in that said receptor is an antibody. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что субстрат выбирают из группы, состоящей из полимеризованной пленки Лэнгмюра-Болджетта, стекла с функциональными группами, германия, кремния, полимеров политетрафторэтилена, полистирола, арсенида галлия и комбинаций перечисленных материалов. 8. The method according to claim 1, characterized in that the substrate is selected from the group consisting of a polymerized Langmuir-Bolgett film, glass with functional groups, germanium, silicon, polytetrafluoroethylene polymers, polystyrene, gallium arsenide and combinations of these materials. 9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что защитные группы выбирают из группы, состоящей из о-нитробензиловых производных 6-нитровератрилоксикарбонила, 2-нитробензилоксикарбонила, циннамоильных производных и их смесей. 9. The method according to p. 1, characterized in that the protective group is selected from the group consisting of o-nitrobenzyl derivatives of 6-nitroveratryloxycarbonyl, 2-nitrobenzyloxycarbonyl, cinnamoyl derivatives and mixtures thereof. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что первая и вторая области имеют общую поверхность менее 1 см² каждая.10. The method according to claim 1, characterized in that the first and second regions have a common surface of less than 1 cm ² each. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что каждая из указанных первой и второй областей имеет общую поверхность примерно 1 - 10000 мкм².11. The method according to claim 1, characterized in that each of these first and second regions has a common surface of about 1-10,000 microns ² . 12. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве света используют источник монохроматического когерентного света. 12. The method according to claim 4, characterized in that the light source is a monochromatic coherent light source. 13. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные стадии воздействия на субстрат активатором осуществляют при использовании раствора, контактирующего с субстратом. 13. The method according to claim 1, characterized in that these stages of exposure to the substrate by the activator is carried out using a solution in contact with the substrate. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный раствор содержит, кроме того, первый или второй аминокислотный или нуклеотидный мономер. 14. The method according to item 13, wherein said solution contains, in addition, the first or second amino acid or nucleotide monomer. 15. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный рецептор содержит, кроме того, метку, выбранную из группы, состоящей из радиоактивной и флуоресцентной меток, и стадия определения присутствия на субстрате рецептора представляет собой стадию детектирования указанной метки. 15. The method according to claim 6, characterized in that said receptor further comprises a label selected from the group consisting of radioactive and fluorescent labels, and the step of determining the presence of a receptor on a substrate is a step of detecting said label. 16. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадии воздействия (на субстрат) активатором включают, кроме того, следующие операции:
а) размещение маски вблизи от субстрата, причем указанная маска имеет по существу прозрачные и непрозрачные для используемой для облучения области длины волны света;
б) облучение маски светом от источника, генерирующего по меньшей мере свет указанной длины волны.16. The method according to claim 1, characterized in that the stage of exposure (to the substrate) by the activator includes, in addition, the following operations:
a) placing the mask near the substrate, said mask having substantially transparent and opaque to the light wavelength region used for irradiation;
b) irradiating the mask with light from a source generating at least light of a specified wavelength. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что перечисленные стадии повторяют, синтезируя на субстрате 10³ или более различных аминокислотных или нуклеотидных последовательностей.17. The method according to clause 16, characterized in that the above steps are repeated, synthesizing on the substrate 10 ³ or more different amino acid or nucleotide sequences. 18. Способ по п.1, отличающийся тем, что перечисленные стадии повторяют, синтезируя на субстрате 10⁶ или более различных аминокислотных или нуклеотидных последовательностей.18. The method according to claim 1, characterized in that the above steps are repeated, synthesizing on the substrate 10 ⁶ or more different amino acid or nucleotide sequences. 19. Способ получения аминокислотных или нуклеотидных последовательностей на субстрате причем эти последовательности включают по меньшей мере первый и второй аминокислотный или нуклеотидный мономеры, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:
а) активирование первой области субстрата, состоящего по меньшей мере из первой и второй областей, причем эти первая и вторая области субстрата содержат защитные группы, для удаления из нее этих защитных групп;
б) контактирование первого аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, причем этот первый мономер включает первую защитную группу, в результате чего первый аминокислотный или нуклеотидный мономер связывается с первой областью субстрата;
в) активирование второй области субстрата для удаления из нее защитных групп субстрата;
г) контактирование второго аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, причем этот второй мономер включает защитную группу, в результате чего второй аминокислотный или нуклеотидный мономер связывается с второй областью субстрата;
д) активирование первой области для удаления защитной группы первого мономера;
е) контактирование третьего аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате которого этот третий мономер связывается в первой области с образованием в результате первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности;
ж) активирование второй области для удаления защитной группы второго мономера;
з) контактирование четвертого аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате чего этот мономер связывается во второй области с образованием в результате второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, отличной от первой.19. A method of obtaining amino acid or nucleotide sequences on a substrate, and these sequences include at least the first and second amino acid or nucleotide monomers, characterized in that the following steps are carried out:
a) activating the first region of the substrate, consisting of at least the first and second regions, and these first and second regions of the substrate contain protective groups, to remove these protective groups from it;
b) contacting the first amino acid or nucleotide monomer with a substrate, wherein this first monomer comprises a first protecting group, whereby the first amino acid or nucleotide monomer binds to the first region of the substrate;
c) activation of the second region of the substrate to remove protective groups of the substrate from it;
d) contacting a second amino acid or nucleotide monomer with a substrate, the second monomer comprising a protective group, whereby the second amino acid or nucleotide monomer binds to the second region of the substrate;
d) activating the first region to remove the protective group of the first monomer;
f) contacting a third amino acid or nucleotide monomer with a substrate, as a result of which this third monomer binds in the first region to form the first amino acid or nucleotide sequence;
g) activation of the second region to remove the protective group of the second monomer;
h) contacting the fourth amino acid or nucleotide monomer with a substrate, as a result of which this monomer binds in the second region with the formation of a second amino acid or nucleotide sequence other than the first. 20. Способ получения аминокислотных и нуклеотидных последовательностей на субстрате, причем указанные последовательности включают по меньшей мере первый и второй аминокислотный или нуклеотидный мономеры, отличающийся тем, что осуществляют стадии:
а) деактивирование первой области субстрата, состоящего по меньшей мере из первой и второй областей, для получения в ней первой защитной группы;
б) контактирование первого аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате чего этот мономер связывается во второй области;
в) удаление защитной группы в первой области;
г) деактирование второй области для получения второй защитной группы во второй области;
д) контактирование второго аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате которого этот мономер связывается в первой области;
е) удаление защитной группы во второй области;
ж) деактирование первой области для получения в ней защитных групп;
з) контактирование третьего аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате чего этот мономер связывается во второй области с образованием первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности;
и) удаление защитных групп в первой области;
к) контактирование четвертого аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате чего этот мономер связывается в первой области с образованием второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, отличной от первой.20. A method of obtaining amino acid and nucleotide sequences on a substrate, and these sequences include at least the first and second amino acid or nucleotide monomers, characterized in that the stages are:
a) deactivating the first region of the substrate, consisting of at least the first and second regions, to obtain the first protective group;
b) contacting the first amino acid or nucleotide monomer with a substrate, as a result of which this monomer binds in the second region;
c) removal of the protective group in the first region;
d) deactivating the second region to obtain a second protective group in the second region;
d) contacting the second amino acid or nucleotide monomer with a substrate, as a result of which this monomer binds in the first region;
e) removal of the protective group in the second region;
g) deactivation of the first region to obtain protective groups in it;
h) contacting the third amino acid or nucleotide monomer with a substrate, as a result of which this monomer binds in the second region to form the first amino acid or nucleotide sequence;
i) removal of the protective groups in the first region;
j) contacting the fourth amino acid or nucleotide monomer with a substrate, as a result of which this monomer binds in the first region to form a second amino acid or nucleotide sequence other than the first. 21. Способ получения на субстрате по меньшей мере первой и второй отличающихся друг от друга аминокислотных или нуклеотидных полимерных последовательностей, которые имеют разную последовательность аминокислотных или нуклеотидных мономеров, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:
а) введение первой маски между субстратом и источником энергии, причем в этой маске имеются первые и вторые области, первые из которых пропускают, а вторые не пропускают энергию от указанного источника;
б) направление энергии от указанного источника на субстрат, в результате чего происходит удаление защитной группы из первой части первого аминокислотного или нуклеиновокислотного полимера, под указанными первыми областями указанной первой маски;
в) контактирование второй части первого полимера с субстратом с образованием в результате первой аминокислотной или нуклеотидной полимерной последовательности;
г) введение второй маски между субстратом и источником энергии, причем в указанной маске имеются первые и вторые области;
д) направление энергии от указанного источника на субстрат, в результате чего под воздействием энергии, проходящей через первые области второй маски, происходит удаление защитной группы из первых частей второго аминокислотного или нуклеотидного полимера и под первыми областями второй маски;
е) контактирование второй части второго аминокислотного или нуклеотидного полимера с субстратом, в результате которого эта вторая часть второго полимера связывается с первой его частью с образованием второй аминокислотной или нуклеотидной полимерной последовательности.21. The method of obtaining on a substrate of at least the first and second different amino acid or nucleotide polymer sequences that have a different sequence of amino acid or nucleotide monomers, characterized in that the following steps are carried out:
a) the introduction of the first mask between the substrate and the energy source, and in this mask there are first and second areas, the first of which pass, and the second do not pass energy from the specified source;
b) the direction of energy from the specified source to the substrate, resulting in the removal of the protective group from the first part of the first amino acid or nucleic acid polymer, under the specified first areas of the specified first mask;
C) contacting the second part of the first polymer with the substrate with the formation of the first amino acid or nucleotide polymer sequence;
g) the introduction of a second mask between the substrate and the energy source, and in the specified mask there are first and second areas;
d) the direction of energy from the specified source to the substrate, as a result of which, under the influence of energy passing through the first regions of the second mask, the protective group is removed from the first parts of the second amino acid or nucleotide polymer and under the first regions of the second mask;
f) contacting the second part of the second amino acid or nucleotide polymer with a substrate, as a result of which this second part of the second polymer binds to its first part to form a second amino acid or nucleotide polymer sequence. 22. Способ скрининга большого количества аминокислотных последовательностей на связывание их с рецептором, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:
а) взаимодействие по меньшей мере первой поверхности стеклянной пластины, имеющей по меньшей мере одну первую поверхность, причем эта первая поверхность включает фотозащитный материал, выбранный из группы, состоящей из нитровератрилок сикарбонила и нитробензилоксикарбонила, с третбутоксикарбонилом, причем указанная стеклянная пластина является практически прозрачной по меньшей мере для ультрафиолетового света;
б) контактирование по меньшей мере первой поверхности с ТФК для удаления указанного третбутоксикарбонила;
в) помещение указанной стеклянной пластины в реактор, включающий реакционный объем, причем по меньшей мере первая поверхность пластины находится в этом реакционном объеме;
г) размещение маски на стеклянной пластине в первом положении, причем указанная маска включает первые участки и вторые участки, причем первые участки по существу прозрачны, а вторые непрозрачны по меньшей мере для ультрафиолетового света, и вторые участки включают экранирующий свет материал, размещенный на первой поверхности маски, указанная первая поверхность маски контактирует с указанной стеклянной пластиной;
д) заполнение реакционного объема реакционным раствором;
е) облучение маски по меньшей мере ультрафиолетовым светом, под действием которого происходит удаление фотозащитного материала по меньшей мере с первой поверхности стеклянной пластины под первыми участками маски;
ж) контактирование первой поверхности с первой аминокислотой, в результате чего эта аминокислота связывается с теми областями по меньшей мере первой поверхности, из которых был удален вышеуказанный фотозащитный материал, причем концевая группа этой первой аминокислоты содержит указанную фотозащитную группу;
з) помещение маски, контактирующей с указанной стеклянной пластиной, во второе положение;
и) облучение маски по меньшей мере ультрафиолетовым светом, под действием которого происходит удаление фотозащитного материала по меньшей мере с первой поверхности стеклянной пластины под первыми участками маски;
к) контактирование по меньшей мере первой поверхности со второй аминокислотой, в результате чего эта аминокислота связывается с теми областями по меньшей мере первой поверхности, из которых был удален вышеуказанный фотозащитный материал, причем концевая группа второй аминокислоты представляет собой фотозащитную группу;
л) помещение маски, контактирующей с указанной стеклянной пластиной, в третье положение;
м) облучение маски по меньшей мере ультрафиолетовым светом, под действием которого происходит удаление фотозащитного материала по меньшей мере с первой поверхности стеклянной пластины, находящейся под первыми участками маски;
н) воздействие по меньшей мере на первую поверхность третьей аминокислоты, в результате чего эта аминокислота связывается с теми областями по меньшей мере первой поверхности, из которых был удален вышеуказанный фотозащитный материал;
о) помещение маски, контактирующей с указанной стеклянной пластиной, в четвертое положение;
п) облучение маски по меньшей мере ультрафиолетовым светом, под действием которого происходит удаление указанного фотозащитного материала по меньшей мере с первой поверхности указанной стеклянной пластины, находящейся под первыми участками маски;
р) контактирование по меньшей мере первой поверхности с четвертой аминокислотой, в результате чего эта аминокислота связывается с теми областями по меньшей мере первой поверхности, из которых был удален вышеуказанный фотозащитный материал, и указанная по меньшей мере первая поверхность, включает по меньшей мере первую, вторую, третью, четвертую аминокислотные последовательности;
с) контактирование по меньшей мере первой поверхности с исследованным антителом, причем указанное антитело более прочно связывается по меньшей мере с первой, второй, третьей или четвертой из указанных аминокислотных последовательностей;
т) контактирование указанной по меньшей мере первой последовательности с рецептором, распознающим указанное исследуемое антитело и связывающимся с ним в местах его локализации, причем указанный рецептор включает флуоресцеин;
у) экспонирование указанной по меньшей мере первой поверхности светом, в результате чего она флуоресцирует по меньшей мере в той области, в которой локализована более прочно связанная аминокислотная последовательность;
ф) детектирование и регистрация интенсивности флуоресцентного излучения как функции положения, на указанной по меньшей мере первой поверхности.22. A method for screening a large number of amino acid sequences for binding to a receptor, characterized in that the following stages are carried out:
a) the interaction of at least the first surface of the glass plate having at least one first surface, and this first surface includes a photoprotective material selected from the group consisting of nitroveratrilocarbonyl and nitrobenzyloxycarbonyl, with tert-butoxycarbonyl, and the specified glass plate is practically transparent at least least for ultraviolet light;
b) contacting at least the first surface with TFA to remove said tert-butoxycarbonyl;
c) placing said glass plate in a reactor including a reaction volume, wherein at least a first surface of the plate is in this reaction volume;
d) placing the mask on the glass plate in the first position, said mask comprising first portions and second portions, the first portions being substantially transparent and the second opaque at least for ultraviolet light, and the second portions including light shielding material placed on the first surface mask, the first surface of the mask is in contact with the specified glass plate;
d) filling the reaction volume with the reaction solution;
e) irradiating the mask with at least ultraviolet light, which removes the photoprotective material from at least the first surface of the glass plate under the first sections of the mask;
g) contacting the first surface with the first amino acid, as a result of which this amino acid binds to those regions of at least the first surface from which the above photoprotective material has been removed, and the end group of this first amino acid contains the specified photoprotective group;
h) placing the mask in contact with the specified glass plate in a second position;
i) irradiating the mask with at least ultraviolet light, which removes the photoprotective material from at least the first surface of the glass plate under the first sections of the mask;
j) contacting at least the first surface with a second amino acid, as a result of which this amino acid binds to those regions of at least the first surface from which the above photoprotective material has been removed, wherein the end group of the second amino acid is a photoprotective group;
k) placing the mask in contact with said glass plate in a third position;
m) irradiating the mask with at least ultraviolet light, which removes the photoprotective material from at least the first surface of the glass plate, located under the first sections of the mask;
m) exposure to at least the first surface of the third amino acid, as a result of which this amino acid binds to those regions of at least the first surface from which the above photoprotective material has been removed;
n) placing the mask in contact with said glass plate in a fourth position;
o) irradiating the mask with at least ultraviolet light, under the influence of which the specified photoprotective material is removed from at least the first surface of the specified glass plate, located under the first sections of the mask;
p) contacting at least the first surface with a fourth amino acid, as a result of which this amino acid binds to those regions of at least the first surface from which the above photoprotective material has been removed, and said at least first surface includes at least the first, second , third, fourth amino acid sequences;
c) contacting at least the first surface with the investigated antibody, and the specified antibody is more strongly associated with at least the first, second, third or fourth of these amino acid sequences;
r) contacting said at least first sequence with a receptor that recognizes said test antibody and binds to it at its localization sites, said receptor comprising fluorescein;
s) exposing the indicated at least first surface to light, as a result of which it fluoresces in at least the region in which the more strongly bound amino acid sequence is located;
f) detecting and recording the intensity of the fluorescence radiation as a function of the position on the at least first surface. 23. Субстрат для скрининга на биологическую активность, отличающийся тем, что в предопределенных областях его поверхности содержится 10³ или более различных пептидных или нуклеиновокислотных лигандов.23. A substrate for screening for biological activity, characterized in that in predefined areas of its surface contains 10 ³ or more different peptide or nucleic acid ligands. 24. Субстрат по п.23, отличающийся тем, что в определенных областях его поверхности содержится 10⁴ или более различных лигандов.24. The substrate according to item 23, wherein in certain areas of its surface contains 10 ⁴ or more different ligands. 25. Субстрат по п.23, отличающийся тем, что в определенных областях его поверхности содержится 10⁵ или более различных лигандов.25. The substrate according to item 23, wherein in certain areas of its surface contains 10 ⁵ or more different ligands. 26. Субстрат по п.23, отличающийся тем, что в определенных областях его поверхности содержится 10⁶ или более различных лигандов.26. The substrate according to item 23, wherein in certain areas of its surface contains 10 ⁶ or more different ligands. 27. Субстрат по пп.23 - 26, отличающийся тем, что указанными лигандами являются пептиды. 27. The substrate according to PP.23 - 26, characterized in that the indicated ligands are peptides. 28. Субстрат по п.23, отличающийся тем, что указанные лиганды являются практически чистыми в пределах указанных определенных областей. 28. The substrate according to item 23, wherein the specified ligands are almost pure within the specified certain areas. 29. Способ по п.1, отличающийся тем, что первым и вторым мономером являются нуклеотиды. 29. The method according to claim 1, characterized in that the first and second monomer are nucleotides. 30. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанным рецептором является нуклеиновая кислота. 30. The method according to claim 6, characterized in that said receptor is a nucleic acid. 31. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный раствор содержит, кроме того, первый и второй нуклеотидный мономер. 31. The method according to item 13, wherein said solution contains, in addition, the first and second nucleotide monomer. 32. Субстрат по пп.23 - 26, отличающийся тем, что указанными лигандами являются нуклеиновые кислоты. 32. The substrate according to claims 23 to 26, characterized in that said ligands are nucleic acids.

Images