RU2098110C1

RU2098110C1 - Immunostimulating agent

Info

Publication number: RU2098110C1
Application number: RU93049440A
Authority: RU
Inventors: Л.А. Чекановская
Original assignee: Малое предприятие "Гемма-Б"; Чекановская Людмила Александровна
Priority date: 1993-10-26
Filing date: 1993-10-26
Publication date: 1997-12-10

Abstract

FIELD: medicine, veterinary science. SUBSTANCE: invention relates to effect of γ-PL on phagocytosis, lymphocyte proliferation, splenocyte activation and humoral responses in human in mouse. γ-PL does not show effect on phagocyte activity of murine peritoneal macrophages, recoveries the normal ratio of T-lymphocyte subpopulation of the human peripheral cultured lymphocytes in vitro; γ-PL is an immunoadjuvant showing broad spectrum of action, increases antibody titer to the protein and corpuscular antigens, corrects the immune response in immunodeficiency mouse, shows mitogenic property in vitro in murine splenocyte culture (CBA x C57B1/6)F1 and causes the appearance of 60-80% blast cells. EFFECT: enhanced effectiveness of agent. 4 tbl, 1 dwg

Description

Изобретение относится к области биологии, медицине, ветеринарии, а именно к иммуностимуляторам, и может быть использовано в медицине и ветеринарии как лекарственное средство для человека и животных, а также в биологии и медицине для научно-исследовательских целей. The invention relates to the field of biology, medicine, veterinary medicine, namely immunostimulants, and can be used in medicine and veterinary medicine as a medicine for humans and animals, as well as in biology and medicine for research purposes.

Известен полисахарид гамма-плант (γ-PL), обладающий противоинфекционным действием и не обладающий геммаглютинирующим действием. Known polysaccharide gamma plant (γ-PL), which has anti-infectious action and does not have hemmagglutinating effect.

Указанный препарат был представлен на выставке "Здоровье-93", 26.06 - 30.06.93, г. Москва (официальный каталог). The specified drug was presented at the exhibition "Health-93", 06/26 - 06/30/93, Moscow (official catalog).

Целью изобретения является применение g-PL как нетоксичного вещества в качестве иммуностимулирующего средства, проявляющего иммуноадьювантную и митогенную активности in vitro и in vivo. The aim of the invention is the use of g-PL as a non-toxic substance as an immunostimulating agent exhibiting immunoadjuvant and mitogenic activity in vitro and in vivo.

Сущность изобретения заключается в том, что было изучено действие g-PL на фагоцитоз перитонеальных макрофагов мыши, профилеративную активность лимфоцитов периферической крови больных и здоровых людей, активацию деления спленоцитов мышей in vitro, а также на гуморальный иммунный ответ у мышей различных генотипов и иммунный ответ у иммунодефицитных мышей. Критериями оценки действия g-PL служили титры антител (АТ) в сыворотке крови, число антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных животных и число субпопуляций лимфоцитов периферической крови человека. The essence of the invention lies in the fact that the effect of g-PL on the phagocytosis of mouse peritoneal macrophages, the proliferative activity of peripheral blood lymphocytes of patients and healthy people, the activation of in vitro division of splenocytes of mice, as well as on the humoral immune response in mice of various genotypes and the immune response in immunodeficient mice. The criteria for evaluating the effect of g-PL were serum antibody titers (AT), the number of antibody-forming cells (AOKs) in the spleen of immunized animals, and the number of subpopulations of human peripheral blood lymphocytes.

Пример 1. Влияние g-PL на фагоцитоз эритроцитов барана (ЭБ) перитонеальными макрофагами мыши in vitro. Example 1. The effect of g-PL on phagocytosis of sheep erythrocytes (EB) by mouse peritoneal macrophages in vitro.

Фагоцитоз (ЭБ) легко доступен для количественной спектрофотометрии внутриклеточного гемоглобина (Morita T. Perkins E.H. - J.reticuioendothel.Soc. 1965, 2. 406 419). Phagocytosis (EB) is readily available for quantitative spectrophotometry of intracellular hemoglobin (Morita T. Perkins E.H. - J. reticuioendothel.Soc. 1965, 2. 406 419).

Для получения перитонеальных макрофагов мышей забивают цервикальной дислокацией и стерилизуют в 70% спирте. В брюшную полость вводят 3 4 мл жидкости (изотонический буфер с добавлением гепарина и 20 мл сыворотки эмбрионов коров из расчета на 1 л). После чего перитонеальную жидкость медленно отсасывают. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 150 g, ресуспендируют осадок в растворе Хенкса. Все процедуры проводят на льду. Клетки в количестве 2•10⁶ в 1 мл заливают в лунки по 200 мкл и инкубируют 4 ч в CO₂ инкубаторе. Затем меняют полную среду и оставляют на 12 ч в CO₂ инкубаторе. Добавляют свежеотмытые ЭБ и проводят инкубацию в термостате. Через 30, 60, 90, 120, 150 мин в отдельных лунках отбирают супернатант и проводят гипотонический шок. В результате этой процедуры удаляются ЭБ, не подвергнутые фагоцитозу. Проводят детектирование при длине волны 405 нм -специфической для поглощения гемоглобина. В опытах исследовали группы макрофагов, инкубировавшиеся различное время с g-PL.To obtain peritoneal macrophages, mice are sacrificed by cervical dislocation and sterilized in 70% alcohol. 3 4 ml of liquid is injected into the abdominal cavity (isotonic buffer with heparin and 20 ml of serum of cow embryos per 1 l). Then the peritoneal fluid is slowly sucked off. Cells are pelleted by centrifugation for 10 min at 150 g, and the pellet is resuspended in Hanks solution. All procedures are carried out on ice. Cells in an amount of 2 • 10 ⁶ in 1 ml are poured into wells of 200 μl and incubated for 4 hours in a CO ₂ incubator. Then the complete medium is changed and left for 12 hours in a CO ₂ incubator. Freshly washed EBs are added and incubation is carried out in a thermostat. After 30, 60, 90, 120, 150 min, supernatant was collected in separate wells and hypotonic shock was performed. As a result of this procedure, EBs not subjected to phagocytosis are removed. Detection is carried out at a wavelength of 405 nm, which is specific for the absorption of hemoglobin. In the experiments, groups of macrophages that were incubated at different times with g-PL were studied.

Данные представлены на чертеже. Кривая 1 представляет фагоцитоз ЭБ перитонеальными макрофагами. Кривая 2 отражает фагоцитоз ЭБ перитонеальными макрофагами, которые инкубировались различное время и в разных модификациях с g-PL. Обе кривые построены с вычетом фонового поглощения. Из представленных значений фагоцитоза видно, что g-PL не оказывает какого-либо влияния на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мыши. Переваривающая активность макрофагов и влияние на нее g-PL не исследовались. The data presented in the drawing. Curve 1 represents phagocytosis of EB by peritoneal macrophages. Curve 2 reflects the phagocytosis of EB by peritoneal macrophages, which were incubated at different times and in different modifications with g-PL. Both curves are plotted minus background absorption. From the presented values of phagocytosis, it can be seen that g-PL does not have any effect on the phagocytic activity of mouse peritoneal macrophages. The digesting activity of macrophages and the effect of g-PL on it have not been studied.

Пример 2. Влияние g-PL на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови больных и здоровых людей in vitro. Example 2. The effect of g-PL on the proliferative activity of peripheral blood lymphocytes of patients and healthy people in vitro.

Лимфоциты периферической крови выделяют из гепаринизированной крови больных и здоровых людей в градиенте 9% раствора фиколл-верографин. Кровь аккуратно наслаивают на раствор градиента (1,0 1,0) и центрифугируют при 400 g 30 40 мин. Отбирают зону, содержащую лимфоциты. Клетки перемешивают в среде RPMI 1640 и центрифугируют при 200 g 15 мин. Осадок ресуспендируют и вновь центрифугируют при тех же условиях. Осадок клеток ресуспендируют в полной среде (RPMI 1640, 10% эмбриональная сыворотка теленка, 0,2М глутамина, 1М HEPES, гентамицин). Смешивают 50 100 мкл клеточной суспензии (1 - 2•10⁷ клеток) с равным объемом соответствующей меченой ФИТЦ антисыворотки и держат во льду 20 30 мин. Затем добавляют холодную среду и осаждают клетки цинтрифугированием. Отмывание клеток повторяют трижды, как указано выше. Окрашенные клетки помещают на предметное стекло и готовят мазок. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют в этаноле. Затем проводят микроскопию.Peripheral blood lymphocytes are isolated from heparinized blood of patients and healthy people in a gradient of 9% ficoll-verographin solution. Blood is carefully layered onto a gradient solution (1.0 1.0) and centrifuged at 400 g 30 40 min. An area containing lymphocytes is selected. Cells are mixed in RPMI 1640 medium and centrifuged at 200 g for 15 minutes. The precipitate was resuspended and centrifuged again under the same conditions. Cell pellet was resuspended in complete medium (RPMI 1640, 10% fetal calf serum, 0.2 M glutamine, 1 M HEPES, gentamicin). 50 100 μl of a cell suspension (1 - 2 • 10 ⁷ cells) are mixed with an equal volume of the corresponding FITC-labeled antiserum and kept in ice for 20 30 minutes. A cold medium is then added and cells are precipitated by centrifugation. Cell washing is repeated three times as described above. Stained cells are placed on a glass slide and a smear is prepared. The smear is dried in air and fixed in ethanol. Then, microscopy is performed.

В табл. 1 представлены показатели T-клеточных субпопуляций на 3, 5 и 7 сут культивирования лимфоцитов здоровых (A) и больных (Б) людей. In the table. Figure 1 shows the T-cell subpopulation indices on days 3, 5, and 7 of lymphocyte cultivation in healthy (A) and sick (B) people.

Данные (табл.1, Б), полученные in vitro в культуре лимфоцитов периферической крови людей с различными иммунодефицитными состояниями (нарушение T-звеньев, связанное с хроническими инфекциями), свидетельствуют о том, что непосредственное воздействие g-PL на лимфоциты приводит к восстановлению нормального соотношения субпопуляций T-лимфоцитов. При исходно нормальном количестве субпопуляций T-лимфоцитов (табл.1, А) совместное культивирование с g-PL не приводит к каким-либо количественным сдвигам. The data (Table 1, B) obtained in vitro in the culture of peripheral blood lymphocytes of people with various immunodeficiency states (T-link disturbance associated with chronic infections) indicate that the direct effect of g-PL on lymphocytes leads to the restoration of normal ratio of subpopulations of T-lymphocytes. With the initially normal number of subpopulations of T-lymphocytes (Table 1, A), co-cultivation with g-PL does not lead to any quantitative shifts.

Пример 3. Гуморальный иммунный ответ у мышей различных генотипов к корпускулярному и водорастворимому антигенам (АГ) и иммунный ответ у иммунодефицитных мышей до и после введения g-PL. Example 3. The humoral immune response in mice of various genotypes to corpuscular and water-soluble antigens (AH) and the immune response in immunodeficient mice before and after administration of g-PL.

Была изучена динамика антительного (АТ) ответа у мышей F1(CBAxC57B1/6) к белку возбудителя сибирской язвы (СЯ). Динамика титров АТ вторичного иммунного ответа к антигену СЯ при совместном введении с g-PL свидетельствует о значительном (в 10 20 раз) увеличении титров специфичных к СЯ AT IgG-типа. При этом пик вторичного иммунного ответа в отличие от контрольного (иммунизация мышей только белками СЯ) проявлялся раньше (с 7 сут), был выше и продолжительнее. We studied the dynamics of antibody (AT) response in F1 mice (CBAxC57B1 / 6) to anthrax pathogen protein (AH). The dynamics of the titers of ATs of the secondary immune response to the antigen of antioxidants when co-administered with g-PL indicates a significant (10 to 20 times) increase in titers of specific antibodies for antigens of the IgG type. In this case, the peak of the secondary immune response, in contrast to the control one (immunization of mice with SJ proteins only), manifested earlier (from day 7), was higher and longer.

Гуморальный иммунный ответ изучают у мышей линий CBA, C 57 B 1/6 и (CBA•C 57 B 1/6)F1. В качестве АГ используют эритроциты барана (ЭБ). Для выявления клеток, образующих АТ, применяли метод локального гемолиза. (Иммунологические методы. М. Медицина, 1987). Совместное введение g-PL с корпускулярным АГ ЭБ 2•10⁶ вызывает максимальное образование АОК. Коэффициенты стимуляции приведены в табл.2.A humoral immune response was studied in CBA, C 57 B 1/6 and (CBA • C 57 B 1/6) F1 mice. Sheep red blood cells (EB) are used as AH. To identify the cells that form antibodies, the method of local hemolysis was used. (Immunological methods. M. Medicine, 1987). Co-administration of g-PL with corpuscular hypertension of EB 2 • 10 ⁶ causes the maximum formation of AOK. Stimulation factors are given in table 2.

В качестве иммунодефицитных мышей были выбраны B-мыши и мыши nude. Для получения B-мышей используют F1(CBAхC57B1/6). Тимэктомированным, летально облученным мышам (850 р) переносят клетки костного мозга (2•10⁷) и после восстановительного периода изучают иммунный ответ к ЭБ. В табл.3 приведено число АОК в селезенках мышей, иммунизированных различными дозами ЭБ. Видно, что у B-мышей и nude значительно снижен ответ к ЭБ.As immunodeficient mice, B-mice and nude mice were selected. To obtain B-mice using F1 (CBAxC57B1 / 6). Bone marrow cells (2 x 10 ⁷ ) are transferred to thymectomized, lethally irradiated mice (850 r), and after the recovery period the immune response to EB is studied. Table 3 shows the number of AOKs in the spleens of mice immunized with various doses of EB. It is seen that in B-mice and nude significantly reduced response to EB.

Экспериментальные данные обработаны с вычислением средней арифметической и доверительного интервала (p≅0,05). The experimental data were processed with the calculation of the arithmetic mean and confidence interval (p≅0.05).

Коэффициенты стимуляции гуморального иммунного ответа к ЭБ под воздействием g-PL в дозе 10 мкг/мышей у контрольных и опытных мышей приведены в табл.4. The coefficients of stimulation of the humoral immune response to EB under the influence of g-PL at a dose of 10 μg / mice in control and experimental mice are shown in table 4.

Из табл. 4 видно, что значения коэффициентов стимуляции у контрольных и опытных мышей сравнимы. From the table. 4 shows that the values of the stimulation coefficients in the control and experimental mice are comparable.

Пример 4. Митогенные свойства g-PL. Example 4. Mitogenic properties of g-PL.

Митогенные свойства g-PL исследуют in vitro в культуре спленоцитов мышей (CBAхC57B1/6)F1 (Meschell R.J. Dutton R.W. J.Exp.Med. 1967, v.126, p.423-432). Доза g-PL 10 мкг на 1•10⁶ клеток приводит к максимальному ответу лимфоцитов и вызывает появление 60 80% бластных клеток на вторые сутки культивирования. Кривая бластной трансформации g-PL имеет S-образную форму и подобна кривой бластной трансформации конканавалина A.The mitogenic properties of g-PL are studied in vitro in a culture of mouse splenocytes (CBAxC57B1 / 6) F1 (Meschell RJ Dutton RWJExp.Med. 1967, v.126, p. 423-432). A dose of g-PL of 10 μg per 1 • 10 ⁶ cells leads to a maximum response of lymphocytes and causes the appearance of 60 to 80% of blast cells on the second day of cultivation. The blast transformation curve of g-PL is S-shaped and similar to the blast transformation curve of concanavalin A.

Claims

Применение гамма-плант (γ-PL) в качестве иммуностимулирующего средства, проявляющего иммуноадьювантную и митогенную активности in vivo и in vitro. The use of gamma plants (γ-PL) as an immunostimulating agent exhibiting immunoadjuvant and mitogenic activity in vivo and in vitro.