RU2085589C1 - Cyclosporine - Google Patents

Abstract

FIELD: microbiological industry, antibiotics. SUBSTANCE: invention relates to cyclosporines of the formula:

Description

Изобретение касается новых циклоспоринов, которые могут использоваться в качестве фармацевтических средств. The invention relates to new cyclosporins that can be used as pharmaceuticals.

Циклоспорины относятся к классу циклических поли-N-метилированных ундекапептидов особой структуры, обычно обладающих фармакологическим действием, обычно иммуносупрессивным, противовоспалительным и/или противопаразитарным. Cyclosporins belong to the class of cyclic poly-N-methylated undecapeptides of a special structure, usually having a pharmacological effect, usually immunosuppressive, anti-inflammatory and / or antiparasitic.

Первым выделенным циклоспорином был грибковый метаболит Cyclosporine известный под названием циклоспорин A и производимый промышленностью с торговой маркой Сандиммун (Samdimmun). Это вещество представляет собой циклоспорин следующей формулы (А):

где MeBmt является N-метил-(4R)-4-бут-2E-ен-1-ил-4-метил-(L)-треонильным остатком формулы (B)

где x-y- представляет собой -CH=CH- (trans).The first cyclosporine isolated was the fungal metabolite Cyclosporine, known as cyclosporin A and manufactured by the industry under the brand name Sanddmun (Samdimmun). This substance is cyclosporin of the following formula (A):

where MeBmt is an N-methyl- (4R) -4-but-2E-en-1-yl-4-methyl- (L) -threonyl radical of the formula (B)

where xy- represents -CH = CH- (trans).

Со времени открытия циклоспорина было выделено и идентифицировано обширное множество природных циклоспоринов, а также синтезированы многие циклоспорины, не встречающиеся в природе, посредством полностью синтетических или полу-синтетических технологий или посредством применения методов модифицирования культуры. Этот класс веществ теперь, таким образом, значителен и включает, например, природные циклоспорины от A до Z [Traber и др. 1, Helv. Chim. Acta, 60, 1247 1255 (1977); Traber и др. 2, Helv. Chim. Acta, 65, 165 1667 (1982); Kobel и др. Europ. J. Applid Microbiology and Biotechnology, 14, 273 -240, (1982); и von Wartburg и др. Progrees in Allergy, 38, 28 45, (1986)] а также разнообразные неприродные циклоспорины и искусственные или синтетические циклоспорины, включая дигидроциклоспорины, у которых группа -x-y- остатка MeBmt (см. формулу B выше) является насыщенной с получением -CH₂-CH₂-; модифицированные циклоспорины (например, такие, у которых 3'-O-атом остатка MeBmt ацилирован или еще один заместитель введен к α-углеродному этому остатка Sar (саркозил) в 3-позиции); циклоспорины, у которых остаток MeBmt присутствует в изомерной форме (например, такие, у которых конфигурация через позиции 6' и 7' остатка MeBmt является скорее цис, чем транс); и циклоспорины, у которых вариантные аминокислоты введены в специфических позициях внутри пептидной последовательности, например, те, в которых использован общий метод синтеза циклоспоринов по Венгеру (Wenger R.) [см. Traber и др. 1, Traber и др. 2, Kobel и др. те же ссылки, что и выше; патенты США NN 4 108985; 4 220 641; 4 288 431; 4 544 351; 4 396 542 и 4 798 823; Европейские заявки NN 34567А; 56782А; 300784А; 300785А и 414632А; N 4914188; Международная заявка WO 86/02080, патенты Великобритании NN 2 06 119 и 2 207 678; Wenger 1, Transpl.Proc. 15 Suppl. 1:2230 (1983); Wenger 2, Angew. Chem. Int. Ed. 24, 77 (1985) и Wenger 3, Progress in Chemistry of Organic Natural Products, 50, 123 (1986).Since the discovery of cyclosporin, a large number of natural cyclosporins have been isolated and identified, and many cyclosporins that are not found in nature have been synthesized through fully synthetic or semi-synthetic technologies or through the application of culture modification methods. This class of substances is now, therefore, significant and includes, for example, natural cyclosporins from A to Z [Traber et al. 1, Helv. Chim. Acta 60, 1247 1255 (1977); Traber et al. 2, Helv. Chim. Acta 65, 165 1667 (1982); Kobel et al. Europ. J. Applid Microbiology and Biotechnology, 14, 273-240, (1982); and von Wartburg et al. Progrees in Allergy, 38, 28 45, (1986)] as well as a variety of non-natural cyclosporins and artificial or synthetic cyclosporins, including dihydrocyclosporins, in which the -xy- group of the MeBmt residue (see formula B above) is saturated to give —CH ₂ —CH ₂ -; modified cyclosporins (for example, those in which the 3'-O atom of the MeBmt residue is acylated or another substituent is introduced to the α-carbon of this Sar residue (sarcosyl) at the 3-position); cyclosporins in which the MeBmt residue is present in isomeric form (for example, those in which the configuration through positions 6 ′ and 7 ′ of the MeBmt residue is cis rather than trans); and cyclosporins, in which variant amino acids are introduced at specific positions within the peptide sequence, for example, those that use the general method for the synthesis of cyclosporins according to Wenger (Wenger R.) [see Traber and others 1, Traber and others 2, Kobel and others the same links as above; U.S. Patent Nos. 4,089,885; 4,220,641; 4,288,431; 4,554,351; 4,396,542 and 4,798,823; European application NN 34567A; 56782A; 300784A; 300785A and 414632A; N 4914188; International application WO 86/02080, UK patents NN 2 06 119 and 2 207 678; Wenger 1, Transpl.Proc. 15 Suppl. 1: 2230 (1983); Wenger 2, Angew. Chem. Int. Ed. 24, 77 (1985) and Wenger 3, Progress in Chemistry of Organic Natural Products, 50, 123 (1986).

Класс циклоспоринов, таким образом, действительно очень велик и включает, например, [Thr] ²-, [Val] ²-, [Nva] ²- и [Nva]²-[Nva]⁵-циклоспорины (известные как циклоспорины C, D, G и M соответственно), [3-0-ацетил-MeBmt] ¹-циклоспорин (также известный как ацетат циклоспорина A), [дигидро-MeBmt] ¹-[Val] ²-циклоспорин (также известный как дигидро-циклоспорин D), [(D)Ser] >⁸-циклоспорин, [Melle]¹¹-циклоспорин, [(D)MeVal]¹¹-циклоспорин (также известный как циклоспорин H), [MeAla]⁶-циклоспорин, [(D)Pro]³-циклоспорин и т. д.The class of cyclosporins, therefore, is really very large and includes, for example, [Thr] ² -, [Val] ² -, [Nva] ² - and [Nva] ² - [Nva] ⁵ -cyclosporins (known as cyclosporins C, D , G and M, respectively), [3-0-acetyl-MeBmt] ¹ -cyclosporin (also known as cyclosporin A acetate), [dihydro-MeBmt] ¹ - [Val] ² -cyclosporin (also known as dihydro-cyclosporin D) , [(D) Ser]> ^8- cyclosporin, [Melle] ^11- cyclosporin, [(D) MeVal] ^11- cyclosporin (also known as cyclosporin H), [MeAla] ^6- cyclosporin, [(D) Pro] ³ -cyclosporin, etc.

В соответствии с принятой номенклатурой циклоспоринов они определены в предлагаемом описании и формуле изобретения со ссылкой на структуру циклоспорина A. Это сделано таким образом, чтобы сначала обозначить те остатки (радикалы) молекулы, которые отличаются от остатков (радикалов) циклоспорина А, и используя термин "Циклоспорины" для того, чтобы указать, что остальные радикалы те же, что у Циклоспорина A. В то же время префикс "дигидро-" используется для обозначения циклоспоринов, у которых остаток MeBmt гидрогенирован (дигидро-MeBmt), т. е. -x-y представляет собой -CH₂-CH₂-.In accordance with the accepted nomenclature of cyclosporins, they are defined in the proposed description and claims with reference to the structure of cyclosporin A. This is done in such a way as to first designate those residues (radicals) of the molecule that differ from the residues (radicals) of cyclosporin A, and using the term " Cyclosporins "to indicate that the remaining radicals are the same as for Cyclosporin A. At the same time, the prefix" dihydro "is used to denote cyclosporins in which the MeBmt residue is hydrogenated (dihydro-MeBmt), i.e. -xy before nent is -CH ₂ -CH ₂ -.

Таким образом, [Thr]²-циклоспорин является циклоспорином, имеющим последовательность, показанную в формуле A, но в которой aAbu во 2-й позиции заменен на Thr и [дигидро-MeBmt]¹-[Val]²-циклоспорин является циклоспорином, имеющим последовательность, показанную в формуле A, но в которой остаток MeBmt в позиции 1 гидрогенирован, а αAbu во 2-й позиции заменен на Val.Thus, [Thr] ² -cyclosporin is cyclosporin having the sequence shown in formula A, but in which aAbu in the 2nd position is replaced by Thr and [dihydro-MeBmt] ¹ - [Val] ² -cyclosporin is cyclosporin having the sequence shown in formula A, but in which the MeBmt residue at position 1 is hydrogenated and αAbu at position 2 is replaced by Val.

Кроме того, аминокислотные остатки, показанные в виде сокращений, например Ala, MeVal, αAbu и т.д. должны пониматься в соответствии с принятой практикой, как имеющие (L)-конфигурацию, если не указано иного, как, например, в случае "(D)-Ala". Сокращения, начинающиеся с букв "Me", как, например, в случае "MeLeu", представляют α-N-метилированные остатки. Остатки молекулы циклоспорина индивидуально пронумерованы, как принято в данной области, по часовой стрелке и начиная с остатка MeBmt и дигидро-MeBmt в позиции 1. Такая цифровая последовательность применена во всем описании и пунктах формулы. In addition, amino acid residues shown as abbreviations, for example Ala, MeVal, αAbu, etc. should be understood in accordance with accepted practice as having an (L) -configuration, unless otherwise indicated, such as, for example, in the case of "(D) -Ala". Abbreviations beginning with the letters "Me", as, for example, in the case of "MeLeu", represent α-N-methylated residues. The residues of the cyclosporin molecule are individually numbered, as is customary in the art, clockwise and starting from the remainder of MeBmt and dihydro-MeBmt at position 1. Such a digital sequence is used throughout the description and claims.

Теперь хорошо известно, что циклоспорин действует посредством вмешательства в процесс T-клеточной активации посредством блокирования инициации транскрипции IL-2, хотя полностью этот механизм еще не объяснен. Циклоспорин, как было установлено, образует комплекс с 17 КД цитозольным протеином (циклофилином), который встречается во многих типах клеток и идентичен пептидил-пролил-цистранс-изомеразе, ферменту, вовлеченному в (трехмерную) укладку белка. It is now well known that cyclosporin acts by interfering with T-cell activation by blocking the initiation of transcription of IL-2, although this mechanism has not yet been fully explained. Cyclosporin has been found to form a complex with 17 CD cytosolic protein (cyclophilin), which is found in many types of cells and is identical to peptidyl-prolyl-cystrans-isomerase, an enzyme involved in (three-dimensional) protein folding.

Однако до сих пор неясно, коррелируется ли связывание с циклофилином напрямую с иммуносупрессивной активностью циклоспоринов, или действительно связывание с циклофилином само по себе является достаточным критерием иммуносупрессивной активности. However, it is still unclear whether binding to cyclophilin directly correlates with the immunosuppressive activity of cyclosporins, or whether binding to cyclophilin is in itself a sufficient criterion for immunosuppressive activity.

Теперь обнаружено, что имеются циклоспорины, сильно связывающиеся с циклофилином, по совсем не иммуносупрессивные. Из этого следует, что связывание с циклофилином является необходимым, но не достаточным критерием иммуносупрессивной активности. It has now been discovered that there are cyclosporins that bind strongly to cyclophilin and are not immunosuppressive at all. It follows that binding to cyclophilin is a necessary but not sufficient criterion for immunosuppressive activity.

Предлагаемое изобретение обеспечивает циклоспорины, обладающие активностью против репликации вируса ВИЧ-1. The present invention provides cyclosporins having anti-HIV-1 replication activity.

Вирус человеческого иммунодефицита (ВИЧ) заражает преимущественно T-хелперные (T4) лимфоциты, хотя он реплицируется также в других различных типах клеток, особенно относящихся к моноцитам. Вирус вызывает медленно прогрессирующее заболевание иммунной системы, характеризующееся постепенным разрушением клеток T4, называемое СПИДом. Другие иммунологические нарушения при СПИДе это повышение количества цитотоксичных/супрессорных (T8) лимфоцитов, дефективный процесс антигенной презентации/узнавания и поликлональная активная B-клеток. Механизм деструкции T4 клеток все еще неясен. Похоже, что инфицируется сравнительно немного T4 клеток, и, следовательно, непосредственное цитопатическое действие вируса может быть не единственной причиной разрушения T4 клеток. При этом выдвинута гипотеза, что деструкция T4 клеток может усиливаться автоиммунным процессом, запусканием продуцирующими ВИЧ или покрытыми ВИЧ-белком клетками T4. Это непрерывное антигенное стимулирование может привести к состоянию перманентной активации T4 клеток, которые должны усиливать ВИЧ-репликацию в этих клетках и расширить T-цитотоксичные клоны. Незараженные T4 клетки могут становиться антигенными посредством присоединения экзогенного вирусного gp120 к CD4 молекулам и таким образом, станут мишенью T-цитотоксичной реакции. The human immunodeficiency virus (HIV) primarily infects T helper (T4) lymphocytes, although it also replicates in various other types of cells, especially monocytes. The virus causes a slowly progressive immune system disease characterized by the gradual destruction of T4 cells, called AIDS. Other immunological disorders in AIDS include an increase in the number of cytotoxic / suppressor (T8) lymphocytes, a defective process of antigen presentation / recognition, and polyclonal active B-cells. The mechanism of T4 cell destruction is still unclear. It seems that relatively few T4 cells are infected, and therefore, the direct cytopathic effect of the virus may not be the only cause of T4 cell destruction. At the same time, it was hypothesized that the destruction of T4 cells can be enhanced by the autoimmune process, triggering T4-producing HIV-producing or HIV-coated HIV proteins. This continuous antigenic stimulation can lead to a state of permanent activation of T4 cells, which should enhance HIV replication in these cells and expand T-cytotoxic clones. Uninfected T4 cells can become antigenic by attaching exogenous viral gp120 to CD4 molecules and thus become the target of a T-cytotoxic reaction.

В патенте США N 4 814 323 раскрыто, что циклоспорин обладает активностью против СПИДа, и что в общем "циклоспорины, известные как иммуносупрессоры", могут быть полезными для борьбы с этой болезнью. В нем, однако, не предполагается, что не-иммуносупрессивные циклоспорины могут обладать этим свойством. US Pat. No. 4,814,323 discloses that cyclosporin has anti-AIDS activity and that, in general, “cyclosporins, known as immunosuppressants,” may be useful in controlling this disease. It does not, however, suggest that non-immunosuppressive cyclosporins may possess this property.

Неожиданно было обнаружено, что циклоспорины, связывающиеся с циклофилином, но не являющиеся иммуносупрессивными, проявляет эффект ингибирования репликации ВИЧ-1. Unexpectedly, it was found that cyclosporins that bind to cyclophilin, but are not immunosuppressive, have an effect of inhibiting HIV-1 replication.

Циклоспорин считается связывающимся с циклофилином, если он связывается с человеческим рекомбинантным циклофилином по меньшей мере на одну пятую, так же, как это делает циклоспорин в конкурирующем тесте ELISA, описанном Quesniaux (Eur. J. Immunol, 1987, 17, 1359 1365). В этом тесте испытуемые циклоспорины добавляют во время инкубирования циклофилина с покрытым BSA-циклоспорином, и рассчитывают концентрацию IC₅₀, необходимую для получения 50% -ного ингибирования контрольной реакции без конкурента. Результаты выражены в BR (пропорции связывания), являющейся десятичным логарифмом отношения IC₅₀ испытуемого соединения к IC₅₀ циклоспорина A, испытываемого одновременно с ним, т. е. BR 1,0 указывает на то, что испытуемое соединение связывает циклофилин в десять раз хуже циклоспорина A, а отрицательное значение указывает на более сильное связывание, чем в случае циклоспорина A.Cyclosporin is considered to bind to cyclophilin if it binds to human recombinant cyclophilin by at least one fifth, just as cyclosporin does in the competing ELISA test described by Quesniaux (Eur. J. Immunol, 1987, 17, 1359 1365). In this test, test cyclosporins are added during incubation of cyclophilin coated with BSA-cyclosporin, and the concentration of IC ₅₀ required to obtain 50% inhibition of the control reaction without competitor is calculated. The results are expressed in BR (binding ratio), which is the decimal logarithm of the ratio of the IC _{50 of the} test compound to the IC _{50 of} cyclosporin A tested simultaneously with it, i.e., BR 1.0 indicates that the test compound binds cyclophilin ten times worse than cyclosporin A, and a negative value indicates stronger binding than in the case of cyclosporin A.

Циклоспорин, активный против ВИЧ, имеет BR менее 0,7 (поскольку log₁₀5 примерно равно 0.7), предпочтительно равный нулю или меньше нуля.Anti-HIV cyclosporin has a BR of less than 0.7 (since log ₁₀ 5 is approximately 0.7), preferably zero or less than zero.

Циклоспорин считается неиммуносупрессивным, если он обладает активностью в реакции MLR (Смещенной Лимфоцитной Реакции) не более 5% предпочтительно, не более 2% такой реакции циклоспорина A. Реакция MLR описана T.Meo ("Immunological Methods", L. Lefkovits B.Peris, Eds. Academic Press, N.Y. 227-239 (1979). Клетки селезенки (0,5 х 10⁶) мышей Bald/c (самка 8 10 нед) инкубируют в течение 5 дн совместно с 0,5 х 10⁶ облученными (2000 рад) клетками или с клетками селезенки мышей CBA (8-10-недельного возраста), обработанными митомицином C. Облученные аллогенные клетки вызывают пролиферативную реакцию в селезеночных клетках Bald/c, которая может быть измерена посредством введения меченого предшественника в ДНК. Поскольку клетки-стимуляторы облучены (или обработаны митомицином C), они не дают пролиферативной реакции на клетки Balb/c, но сохраняют свою антигенность.Cyclosporin is considered non-immunosuppressive if it has an activity in the MLR (Displaced Lymphocytic Reaction) reaction of not more than 5%, preferably not more than 2% of such cyclosporin A. The MLR reaction is described by T. Meo ("Immunological Methods", L. Lefkovits B. Peris, Eds. Academic Press, NY 227-239 (1979). Spleen cells (0.5 x 10 ⁶ ) of Bald / c mice (female 8 10 weeks) are incubated for 5 days together with 0.5 x 10 ⁶ irradiated (2000 rad ) cells or with spleen cells of CBA mice (8-10 weeks old) treated with mitomycin C. Irradiated allogeneic cells cause a proliferative reaction in the spleen Bald / c cells, which can be measured by introducing a labeled precursor into DNA.As stimulator cells are irradiated (or treated with mitomycin C), they do not give a proliferative reaction to Balb / c cells, but retain their antigenicity.

Установленный IC₅₀ в реакции MLR испытуемого соединения сравнивает с IC₅₀ циклоспорина A, установленным в параллельном эксперименте.The established IC ₅₀ in the MLR reaction of the test compound is compared with the IC _{50 of} cyclosporin A established in a parallel experiment.

Активность циклоспоринов в качестве ингибиторов репликации ВИЧ-1 может продемонстрировать следующая методика проведения теста:
1. Ингибирование вызываемого ВИЧ-1 цитопатического действия в клетках МТ4.The activity of cyclosporins as inhibitors of HIV-1 replication can be demonstrated by the following test procedure:
1. Inhibition of HIV-1-induced cytopathic effect in MT4 cells.

Используют процедуру исследования, описанную Pauwels и др. (J. Virol. Meth. 20/309, 1988), с небольшими модификациями. Трансформированную HTLV-I T4-клеточную линию, МТ4, которая, как было заранее выяснено, являлась высоко восприимчивой к заражению ВИЧ, использовали в качестве мишенной клетки. Ингибирование ВИЧ-1 вызываемого штаммом HTLV-IIIB цитопатического действия определяли посредством измерения жизнеспособности как ВИЧ-инфицированных, так и псевдо-инфицированных клеток. Жизнеспособность оценивали спектрофотометрически посредством восстановления на месте (insitu) 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолбромида (МТТ). Зараженные вирусом и незараженные культуры без соединения включают в эксперимент в качестве контроля вместе с незараженными клетками, обработанными испытуемым соединением. Выбирают такую концентрацию клеток, чтобы количество клеток в 1 мл повышалось в 10 раз за 4 дн инкубирования культур псевдозараженных клеток. Количество вирусного инокулята регулировали так, чтобы вызвать гибель 90% мишенных клеток после 4-дневного инкубирования. Вирус адсорбируется на 10-кратно концентрированной клеточной суспензии при 37^oC в течение 1 ч. Затем инфицированные клетки разводят 1: 10 и вносят их в микротитровальные чашки, содержащие испытуемое соединение.The research procedure described by Pauwels et al. (J. Virol. Meth. 20/309, 1988), with minor modifications, is used. The transformed HTLV-I T4 cell line, MT4, which was previously found to be highly susceptible to HIV infection, was used as a target cell. The inhibition of HIV-1 induced by the HTLV-IIIB strain cytopathic effect was determined by measuring the viability of both HIV-infected and pseudo-infected cells. Viability was evaluated spectrophotometrically by in situ (insitu) reduction of 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazol bromide (MTT). Virus-infected and uninfected cultures without compound are included in the experiment as a control along with uninfected cells treated with the test compound. Choose a cell concentration such that the number of cells in 1 ml increases 10-fold over 4 days of incubation of pseudo-infected cell cultures. The amount of viral inoculum was adjusted to cause the death of 90% of the target cells after 4 days of incubation. The virus is adsorbed on a 10-fold concentrated cell suspension at 37 ^° C. for 1 hour. Then, the infected cells are diluted 1: 10 and introduced into microtiter plates containing the test compound.

2. Цитотоксичность. Для оценки анти-ВИЧ потенциала Y дополнительных клеточных линий и особенно у моноцитной клеточный линии (U937), сначала оценивали клеточную токсичность испытуемого соединения для этих клеточных линий. Суспензия клеток Jurkat и U937 доводят до концентрации 1 х 10⁵ клеток на мл и концентрируют в присутствии различных концентраций испытуемого соединения. Через 48 ч количества клеток в 1 мл сравнивают посредством окрашивания МТТ. Цитотоксичность клеток МТ4 может быть измерена точно так же.2. Cytotoxicity. To evaluate the anti-HIV potential of Y additional cell lines, and especially in a monocytic cell line (U937), the cellular toxicity of the test compound for these cell lines was first evaluated. The cell suspension of Jurkat and U937 was adjusted to a concentration of 1 x 10 ⁵ cells per ml and concentrated in the presence of various concentrations of the test compound. After 48 hours, the number of cells in 1 ml was compared by MTT staining. The cytotoxicity of MT4 cells can be measured in the same way.

3. Ингибирование репликации ВИЧ-1 в клетках Jurkat и U937. Линию Jurkat клеток Т4 и линию U937 моноцитов инфицировали посредством суспендирования 10-кратно концентрированных клеток в вирусном растворе. Адсорбцию осуществляли в течение 2 ч при 37^oC. Затем клетки осаждали центрифугированием, материал для инокуляции удаляли и клетки ресуспендировали при их исходной концентрации в свежей культуральной среде, содержащей испытуемое соединение. Таким образом, вещество добавляют после адсорбции. В дни (2, 5, 8, 12, 15 и 19) после инфицирования брали аликвоты инфицированных культур. Клетки центрифугировали и собирали надосадочную жидкость. В надосадочной жидкости определяли концентрацию вирусного антигена р24 посредством коммерческого набора ELLSA, которая затем служила в качестве параметра производства вируса. После каждого взятия аликвот клетки подсчитывали и их концентрацию доводили до 2 х 10⁵ клеток на мл посредством добавления свежей среды, содержащей испытуемое соединение в определенной концентрации.3. Inhibition of HIV-1 replication in Jurkat and U937 cells. The Jurkat T4 cell line and the U937 monocyte line were infected by suspending 10-fold concentrated cells in a viral solution. Adsorption was carried out for 2 hours at 37 ^° C. Then the cells were precipitated by centrifugation, the inoculation material was removed and the cells were resuspended at their initial concentration in fresh culture medium containing the test compound. Thus, the substance is added after adsorption. On days (2, 5, 8, 12, 15, and 19) after infection, aliquots of infected cultures were taken. Cells were centrifuged and the supernatant was collected. The concentration of p24 viral antigen was determined in the supernatant using a commercial ELLSA kit, which then served as a parameter for the production of the virus. After each aliquot, the cells were counted and their concentration was adjusted to 2 x 10 ⁵ cells per ml by adding fresh medium containing the test compound at a specific concentration.

Из соединений по изобретению, т. е. из не-иммуносупрессивных, связывающих циклофилин циклоспоринов, обладающих активностью против ВИЧ-1, некоторые являются новыми, а другие известны, однако активность против ВИЧ-1 известных соединений из этого числа ранее не была раскрыта, и во многих случаях в отношении известных соединений не было раскрыто, что они обладают какой-либо фармацевтической активностью. Of the compounds of the invention, i.e., of non-immunosuppressive cyclophilin-binding cyclosporins having anti-HIV-1 activity, some are new and others are known, however, anti-HIV-1 activity of known compounds from this number has not been previously disclosed, and in many cases, with respect to known compounds, it was not disclosed that they possess any pharmaceutical activity.

При этом обнаружено, что многие из упомянутых активных соединений имеют структуру, отличающуюся от структуры циклоспорина А в 4 и/или 5 позициях. It was found that many of the mentioned active compounds have a structure different from the structure of cyclosporin A in 4 and / or 5 positions.

Одну группу активных соединений составляют циклоспорины, у которых группа MeLeu в позиции 4 замещена различной N-метилированной аминокислотой, например, g-гидрокси-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr или MeAla. Кроме Melle и MeThr могут также использоваться их алло-формы Mealle и MeaThr. Стереохимия алло-формы такова, что в c-положении ее конфигурация противоположна конфигурации природной аминокислоты, и, таким образом, обычная форма и алло-форма составляют пару диастереоизомеров. One group of active compounds is cyclosporins, in which the MeLeu group at position 4 is replaced by a different N-methylated amino acid, for example, g-hydroxy-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr or MeAla. In addition to Melle and MeThr, their allo-forms Mealle and MeaThr can also be used. The stereochemistry of the allo-form is such that in the c-position its configuration is opposite to that of the natural amino acid, and thus, the usual form and allo-form make up a pair of diastereoisomers.

Еще одну группу упомянутых активных соединений составляют циклоспорины, у которых Val в 5-й позиции заменен на N-алкил-, предпочтительно, N-метил-, аминокислоту. Предпочтительно, этой N-алкилированной аминокислотой является Val или Leu. Предпочтительно, водород имино-группы [Val]⁵ заменен на неразветвленную C_1-6алкильную группу, предпочтительно, метил, этил или пропил, особенно предпочтительно метил. Эта последняя группа активных соединений полностью является новой.Another group of the mentioned active compounds are cyclosporins, in which Val in the 5th position is replaced by an N-alkyl, preferably N-methyl, amino acid. Preferably, this N-alkylated amino acid is Val or Leu. Preferably, the hydrogen of the imino group [Val] ^{5 is} replaced by an unbranched C _1-6 alkyl group, preferably methyl, ethyl or propyl, particularly preferably methyl. This last group of active compounds is completely new.

Дополнительно или альтернативно, определенные активные соединения могут отличаться от циклоспорина A в 1, 2, 3 и/или 6 позициях. Предпочтительную группу активных соединений составляют соединения формулы (I)

где W MeBmt, дигидро-MeBmt или 8'-гидрокси-MeBmt;
X αAbu, Val, Thr, Nva или O-метил-треонин (MeOThr);
R Sar или (D)-MeAla;
Y MeLeu, γ-гидрокси-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle или MeaThr;
Z Val, Leu, MeVal или MeLeu; и
Q MeLeu, g-гидрокси-MeLeu или MeAla;
при условии, что когда Y представляют MeLeu, тогда либо Z является MeVal или MeLeu, либо W является 8'-гидрокси-MeBmt.Additionally or alternatively, certain active compounds may differ from cyclosporin A at 1, 2, 3 and / or 6 positions. A preferred group of active compounds are compounds of formula (I)

where W MeBmt, dihydro-MeBmt or 8'-hydroxy-MeBmt;
X αAbu, Val, Thr, Nva or O-methyl-threonine (MeOThr);
R Sar or (D) -MeAla;
Y MeLeu, γ-hydroxy-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle or MeaThr;
Z Val, Leu, MeVal or MeLeu; and
Q MeLeu, g-hydroxy-MeLeu or MeAla;
with the proviso that when Y represents MeLeu, then either Z is MeVal or MeLeu, or W is 8'-hydroxy-MeBmt.

Группы W, X, Y, Z, Q и R имеют (независимо друг от друга) следующие предпочтительные значения:
W является предпочтительно W', где W'- MeBmt или дигидро-MeBmt;
X является предпочтительно X', где X' aAbu или Nva, более предпочтительно X'', где X'' αAbu;
R является предпочтительно R', где R' Sar;
V является предпочтительно Y', где Y'-γ-гидрокси-MeLeu, MeVal, MeThr или Melle;
Z является предпочтительно Z', где Z' Val или MeVal; и
Q является предпочтительно Q', где Q' MeLeu.The groups W, X, Y, Z, Q and R have (independently of each other) the following preferred meanings:
W is preferably W ', where W'-MeBmt or dihydro-MeBmt;
X is preferably X ′, where X ′ aAbu or Nva, more preferably X ″, where X ″ αAbu;
R is preferably R ', where R'Sar;
V is preferably Y ', where Y'-γ-hydroxy-MeLeu, MeVal, MeThr or Melle;
Z is preferably Z ', where Z' Val or MeVal; and
Q is preferably Q ', where Q' is MeLeu.

Одну особенно предпочтительную группу активных соединений по изобретению составляют соединения формулы (I), в которой W, это W', X-X', Y-Y', Z-Z', Q-Q', и R-R'. One particularly preferred group of active compounds of the invention are compounds of formula (I) wherein W is W ', X-X', Y-Y ', Z-Z', Q-Q ', and R-R'.

Особенно предпочтительными соединениями формулы 1 являются
a) [дигидро-MeBmt}¹-[g-гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин;
b) [MeVal]⁴-циклоспорин;
c) [Melle]⁴-циклоспорин;
d) [MeThr]⁴-циклоспорин;
e) [g-гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин,
f) [Nva]²]-[g -гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин;
g) [g -гидрокси-MeLeu]⁴-[g -гидрокси-MeLeu]⁶-циклоспорин;
h) [Nva]²-[g -гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин;
i) [MeVal]⁵-циклоспорин;
j) [MeOThr]²-[(D)MeAla]³-[MeVal]⁵-циклоспорин.Particularly preferred compounds of formula 1 are
a) [dihydro-MeBmt} ¹ - [g-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin;
b) [MeVal] ⁴ -cyclosporin;
c) [Melle] ⁴ -cyclosporin;
d) [MeThr] ⁴ -cyclosporin;
e) [g-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin,
f) [Nva] ² ] - [g-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin;
g) [g-hydroxy-MeLeu] ⁴ - [g-hydroxy-MeLeu] ⁶ -cyclosporin;
h) [Nva] ² - [g-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin;
i) [MeVal] ⁵ -cyclosporin;
j) [MeOThr] ² - [(D) MeAla] ³ - [MeVal] ⁵ -cyclosporin.

Кроме того, некоторые соединения, не охватываемые формулой (I), также относятся к группе упомянутых активных соединений, например,
k) [MeAla]⁶-циклоспорин и
l) [g -гидрокси-MeLeu]⁹-циклоспорин.In addition, some compounds not covered by formula (I) also belong to the group of active compounds mentioned, for example,
k) [MeAla] ⁶ -cyclosporin and
l) [g-hydroxy-MeLeu] ⁹ -cyclosporin.

Изобретение обеспечивает также новые активные соединения формулы (II):

где W', X, R, Y и Z такие, как определено выше, при условии, что
1) если Y является MeLeu или MeAla, то Z представляет собой MeVal или MeLeu;
2) если W' MeBmt, R Sar и Y-γ -гидрокси-MeLeu, то Z другой, чем Val.The invention also provides new active compounds of the formula (II):

where W ', X, R, Y and Z are as defined above, provided that
1) if Y is MeLeu or MeAla, then Z represents MeVal or MeLeu;
2) if W 'MeBmt, R Sar and Y-γ-hydroxy-MeLeu, then Z is different than Val.

Предпочтительную группу активных соединений по изобретению составляет соединения формулы (II), в которой X является X'', Y-Y', Z-Z', при условии, что если W' является MeBmt, то Y' другой, чем g -гидрокси-MeLeu. A preferred group of active compounds of the invention is compounds of formula (II) in which X is X ″, Y-Y ′, Z-Z ′, provided that if W ′ is MeBmt, then Y ′ is other than g-hydroxy -MeLeu.

Особенно предпочтительными соединениями являются соединения a), b), c), d), f) и h). Обнаружено, что некоторые из этих соединений, особенно соединения b) и c), блокируют иммуносупрессивное действие циклоспорина посредством блокирования его связывания с циклофилином, и таким образом действуют как антагонисты циклоспорина. Particularly preferred compounds are compounds a), b), c), d), f) and h). It has been found that some of these compounds, especially compounds b) and c), block the immunosuppressive effect of cyclosporin by blocking its binding to cyclophilin, and thus act as cyclosporin antagonists.

Активные соединения по изобретению могут быть получены многими путями, которые можно классифицировать так:
1). Ферментация.The active compounds of the invention can be prepared in many ways, which can be classified as follows:
one). Fermentation.

2). Биотрансформация. 2). Biotransformation.

3). Получение производных. 3). Derivatives.

4). Частичный синтез. 4). Partial synthesis.

5). Полный синтез. 5). Full synthesis.

1) Некоторые активные соединения по изобретению получают в качестве побочных продуктов ферментации исходных или модифицированных штаммов производящих циклоспорин микроорганизмов, таких как грибки Tolypocladium inflatum, как показано на примере производства соединения c), описанном в примере 1 ниже. 1) Some active compounds of the invention are produced as fermentation by-products of the initial or modified strains of cyclosporin-producing microorganisms, such as the fungi Tolypocladium inflatum, as shown in the production example of compound c) described in Example 1 below.

2) Другие активные соединения по изобретению, включая известные соединения j) и i) являются метаболитами циклоспорина, и могут быть выделены хроматографическими методами из мочи людей или животных, получающих цикоспорин. Кроме того, эти и другие метаболические трансформации возможны с использованием микроорганизмов, например, производство соединений c) и g) посредством биотрансформации циклоспорина A (примеры 2 и 3), или производство соединения f) посредством биотрансформации циклоспоирна G (пример 4). Эти примеры демонструруют новый способ получения циклоспоринов, имеющих один или более g -гидрокси-MeLeu остатков, и выделения продукта из ферментационного бульона. 2) Other active compounds of the invention, including the known compounds j) and i) are cyclosporin metabolites, and can be isolated by chromatographic methods from the urine of humans or animals receiving cyclosporin. In addition, these and other metabolic transformations are possible using microorganisms, for example, the production of compounds c) and g) through the biotransformation of cyclosporin A (examples 2 and 3), or the production of compound f) through the biotransformation of cyclosporin G (example 4). These examples demonstrate a new method for producing cyclosporins having one or more g-hydroxy-MeLeu residues and isolating the product from the fermentation broth.

3) Под получением производных понимают, что приводные или синтетические циклоспорины могут быть превращены в активные соединения по изобретению посредством одной или более химических реакций, в которых одна или более аминокислот модифицируют без открытия пептидных связей и их преобразования. Например, класс активных соединений по изобретению, у которых Val в позиции 5 является N-алкилированным, могут быть получены посредством реакции соответствующего циклоспорина, имеющего Val в 5-й позиции, с бутил-литием, с последующей реакцией с алкилирующим агентом, как показано на примере получения соединения h) (пример 5) и соединен i) (пример 6). 3) By the preparation of derivatives it is understood that driving or synthetic cyclosporins can be converted into the active compounds of the invention by one or more chemical reactions in which one or more amino acids are modified without opening the peptide bonds and converting them. For example, a class of active compounds of the invention in which Val at position 5 is N-alkyl can be prepared by reacting the corresponding cyclosporin having Val at 5th position with butyl lithium, followed by reaction with an alkylating agent, as shown in an example of the preparation of compound h) (example 5) and compound i) (example 6).

В качестве дополнительного примера соединение a) может быть получено посредством гидрогенирования соединения e) (Пример 7), а соединение J), которое также является главным метаболитом циклоспорина, может быть получено из известного соединения ацетата циклоспорина так, как описано в примере 8. As a further example, compound a) can be obtained by hydrogenating compound e) (Example 7), and compound J), which is also the main metabolite of cyclosporin, can be obtained from the known cyclosporin acetate compound as described in example 8.

4) Выражение "частичный синтез" использован для обозначения ряда химических реакций, в ходе которых открывается кольцо природного циклоспорина, удаляется одна или более аминокислот, добавляются другие аминокислоты, и кольцо снова закрывается. 4) The expression "partial synthesis" is used to denote a series of chemical reactions during which the ring of natural cyclosporin opens, one or more amino acids are removed, other amino acids are added, and the ring is closed again.

5) Полный синтез циклоспоринов может быть осуществлен посредством построения линейного ундекапептида и его зацикливанием, как описано Wenger (ссылка выше), а также в патенте США NN 4 396 542 и 4 798 823. В принципе, любой циклоспорин может быть получен путем полного синтеза, хотя если доступен один из остальных методов, то он может оказаться более удобным, чем полный синтез. Полный синтез может использоваться для получения соединения d) (пример 9), и для получения известного метаболитного соединения 1). 5) The complete synthesis of cyclosporins can be carried out by constructing a linear undecapeptide and its cycling, as described by Wenger (link above), as well as in US patent NN 4 396 542 and 4 798 823. In principle, any cyclosporin can be obtained by complete synthesis, although if one of the other methods is available, it may be more convenient than a complete synthesis. Complete synthesis can be used to obtain compound d) (Example 9), and to obtain the known metabolite compound 1).

Соединение k) является известным веществом, свойства которого описаны Quesniaus и др. [Mol. Immunol. 24, 1159 (1987)] и который также может быть получен полным синтезом. Например, в патенте США N 4 914 188 описан полный синтез этого соединения. Compound k) is a known substance whose properties are described by Quesniaus et al. [Mol. Immunol. 24, 1159 (1987)] and which can also be obtained by complete synthesis. For example, US Pat. No. 4,914,188 describes the complete synthesis of this compound.

Пример 1 [Meile]⁴-Циклоспорин (Соединение с). Продуцирующий штамм
Соединение с) получают ферментацией с использованием штамма Cy E 4556 грибка Tolypocladium inflatum, депонированного в DSM (Немецкая Коллекция Микроорганизмов) по условиям Будапештского договора 24 июля 1991 с депозитарным номером DSM 6627. Этот штамм является мутантом штамма NRRL 8044 вида Tolypocladium inflatum, и таксономически идентичен родительскому штамму, который полностью описан, например, в патенте Великобритании N 1 491 509.Example 1 [Meile] ^4- Cyclosporine (Compound c). Producing strain
Compound c) is obtained by fermentation using a strain of Cy E 4556 of the fungus Tolypocladium inflatum deposited in DSM (German Microorganism Collection) under the terms of the Budapest Treaty on July 24, 1991 with depository number DSM 6627. This strain is a mutant of strain NRRL 8044 of the species Tolypocladium inflatum, and is taxonomically identical the parent strain, which is fully described, for example, in British patent N 1 491 509.

Культуры. 1. Стартовая агаровая культура. Culture. 1. Starting agar culture.

Культуры штамма DSM 6627 на скошенном агаре выращивают 14 дн при 27^oC на следующей агаровой среде:
Дрожжевой экстракт (Gistex) 4 г
Солодовый экстракт (Wander) 20 г
Агар 20 г
Деминерализованная вода До 100 мл
PH среды доводят до 5,4 5,6 и ее стерилизуют в течение 20 мин при 120^oC.Culture of strain DSM 6627 on mowed agar was grown for 14 days at 27 ^o C on the following agar medium:
Yeast Extract (Gistex) 4 g
Malt Extract (Wander) 20 g
Agar 20 g
Demineralized water Up to 100 ml
The pH of the medium is adjusted to 5.4 5.6 and it is sterilized for 20 minutes at 120 ^o C.

2. Предкультура. 2. The preculture.

Споры из мицелия 4 стартовых культур суспендируют в 40 мл 0,9-ного солевого раствора. В каждую из серии 500-миллилитровых колб Эрленмевера (Erlenmever), содержащих каждая 100 мл предкультуральной среды, инокулируют 20 мл этой суспензии. Состав предкультуры следующий:
Казеин (Amber EHC) 25 г
Мальтоза 75 г
KH₂PO₄ 1 г
KCl 2.5 г
Деминерализованная вода до 1000 мл
PH среды доводят до 5,2 5,5 добавлением HCl, а затем стерилизуют в течение 20 мин при 120^oC. Предкультуры ферментируют в течение 24 ч при 27^oC на роторном шейкере со скоростью 200 об/мин с эксцентричностью 50 мм.Spores from the mycelium of 4 starter cultures are suspended in 40 ml of 0.9% saline. In each of a series of 500 ml Erlenmever flasks, each containing 100 ml of precultural medium, 20 ml of this suspension were inoculated. The composition of the preculture is as follows:
Casein (Amber EHC) 25 g
Maltose 75 g
KH ₂ PO ₄ 1 g
KCl 2.5 g
Demineralized water up to 1000 ml
The pH of the medium was adjusted to 5.2 5.5 by the addition of HCl, and then sterilized for 20 minutes at 120 ^° C. The precultures were fermented for 24 hours at 27 ^° C on a rotary shaker at a speed of 200 rpm with an eccentricity of 50 mm.

3. Промежуточная культура. 3. Intermediate culture.

В 25-литровый стальной ферментер, содержащий 20 л предкультуральной среды, вводят 200 мл предкультуры. Промежуточную культуру ферментируют в течение 5 дн при 27^oC со скоростью перемешивания 150 об/мин и при скорости воздушного потока 0,5 л/мин на литр среды под давлением 0,5 бар.In a 25-liter steel fermenter containing 20 l of preculture medium, 200 ml of preculture is introduced. The intermediate culture is fermented for 5 days at 27 ^° C. with a stirring speed of 150 rpm and at an air flow rate of 0.5 l / min per liter of medium under a pressure of 0.5 bar.

4. Главная культура. 4. The main culture.

100 л предкультуральной среды инокулируют 10 литрами промежуточной среды и ферментируют в 120-литровом стальном ферментере. К этой среде добавляют 4 г/л D-Треонин, стерилизованный фильтрованием. Ферментацию осуществляют в течение 14 дн при 27^oC, при перемешивании со скоростью 70 об/мин и при скорости воздушного потока 0,4 л/мин на литр среды под давлением 0,5 бар, поддерживавшемся первым 5 дн, причем скорость перемешивания затем повышают до 100 об/мин, а скорость воздушного потока до 0,5 л/мин на весь остальной период ферментации.100 liters of precultural medium are inoculated with 10 liters of intermediate medium and fermented in a 120 liter steel fermenter. To this medium was added 4 g / L D-Threonine, filtered sterilized. Fermentation is carried out for 14 days at 27 ^o C, with stirring at a speed of 70 rpm and at a speed of air flow of 0.4 l / min per liter of medium under a pressure of 0.5 bar, maintained for the first 5 days, and the stirring speed is then increased up to 100 rpm, and the air flow rate up to 0.5 l / min for the rest of the fermentation period.

Выделение. Мицелий отделяют от культуральной среды и экстрагируют в аппарате Turrax путем раздавливания и перемешивания трижды с 10 л смеси метанол/вода (9:1 об/об). Разрушенный мицелий выделяют из растворителя посредством всасывающей фильтрации, и объединенные фильтраты концентрируют выпариванием под вакуумом при 40^oC до тех пор, пока пар не будет содержать только воду. Полученную смесь экстрагируют четырежды с использованием 2 л 1,2-дихлорэтанол на каждой экстракции, и объединенные растворы 1,2-дихлорэтана концентрируют выпариванием под вакуумом при 40^oC.Selection. The mycelium is separated from the culture medium and extracted in a Turrax apparatus by crushing and stirring three times with 10 l of a mixture of methanol / water (9: 1 v / v). The destroyed mycelium is isolated from the solvent by suction filtration, and the combined filtrates are concentrated by evaporation under vacuum at 40 ^° C. until the steam contains only water. The resulting mixture was extracted four times using 2 L of 1,2-dichloroethanol at each extraction, and the combined 1,2-dichloroethane solutions were concentrated by evaporation under vacuum at 40 ^° C.

Остаток подвергает хроматографии на силикагелевой колонке (10 кг силикагеля, размер гранул от 0,02 мм до 0,045 мм, "Grace", с использованием в качестве элюента смеси этилацетата и воды (фракциями по 2,5 л). Фракция 20-23, содержащие [Meile]⁴-циклоспорин, смешивают и затем разделяют хроматографически на силикагелевой колонке (600 г силикагеля, размер от 0,04 до 0,063 мм, "Merck") с использованием смеси хлороформ/метанол (98:2 по объему) в качестве элюента (размер фракции 300 мл). Дальнейшей очистки достигают посредством хроматографии на силикагелевой колонке (400 г силикагеля, размер гранул от 0,04 до 0,063 мм, "Merck") с использованием смеси метиленхлорид/метанол (98: 2 по объему) в качестве элюента (размер фракции 200 мл), с получением чистого [Meile]⁴-циклоспорина в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 155 158^oC; [p]D²⁰ -235^oC (c 0,68 в CHCl₃) и -193^oC (c 0,74 CH₃OH).The residue was subjected to silica gel column chromatography (10 kg of silica gel, granule size from 0.02 mm to 0.045 mm, Grace, using a mixture of ethyl acetate and water (2.5 l fractions) as eluent. Fraction 20-23, containing [Meile] ^4- cyclosporin, mixed and then separated by chromatography on a silica gel column (600 g of silica gel, size 0.04 to 0.063 mm, Merck) using a mixture of chloroform / methanol (98: 2 by volume) as eluent ( fraction size 300 ml). Further purification is achieved by chromatography on a silica gel column (400 g of silica I, granule size 0.04 to 0.063 mm, "Merck") using methylene chloride / methanol (98: 2 by volume) as eluent (fraction size 200 ml) to give pure [Meile] ⁴ -Ciclosporin as an amorphous white powder with a melting point of 155 158 ^o C; [p] D ²⁰ -235 ^o C (c 0.68 in CHCl ₃ ) and -193 ^o C (c 0.74 CH ₃ OH).

IR-спектр в CH₂Cl₂ показан на фиг. 1; ЯМР-спектр в CDCl₃ показан на фиг. 2.The IR spectrum in CH ₂ Cl _{2 is} shown in FIG. one; The NMR spectrum in CDCl _{3 is} shown in FIG. 2.

Пример 2 [g-гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин (Соединение е). Соединение е) получают путем биотрансформации циклоспорина микроорганизмом Sebekia benihana. Использованный исходный штамм называется NRLL 11111 и принадлежит к видам Sebekua benihana (Dietz, Li: Sebekia, new denus of the family Actinoplaceae. Abstrs. 82nd Ann. Meet. Soc. Microbiol. 163, Atlanta, 1982). Этот штамм способен гидроксилировать новобиоцин. Штамм в культуре, использованный для получения Соединения е) и родственных ему соединений, депонирован в коллекции DSM (D-3300, Брауншвейг) с депозитарным номером DSM 6182.Example 2 [g-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin (Compound e). Compound e) is obtained by biotransformation of cyclosporine by the microorganism Sebekia benihana. The original strain used is called NRLL 11111 and belongs to the species Sebekua benihana (Dietz, Li: Sebekia, new denus of the family Actinoplaceae. Abstrs. 82nd Ann. Meet. Soc. Microbiol. 163, Atlanta, 1982). This strain is capable of hydroxylating novobiocin. The culture strain used to obtain Compound e) and related compounds was deposited in the DSM collection (D-3300, Braunschweig) with depository number DSM 6182.

1. Агаровая стартовая культура. Культура штамм DSM 6182 на скошенном агаре выращивали в течение 10 дн при 27^oC. Агаровая среда имела следующий состав:
Глюкоза 10 г
Крахмал (растворимый) 20 г
Дрожжевой экстракт (Gistex) 5 г
Пептон (N-Z-Амин, Тип А, Шеффилд) 5 г
CaCO₃ 1 г
Агар (Bacto) 18 г
Деминерализованная вода до 1 литра
Уровень pH: нейтрализован до 7 добавлением NaOH/H₂SO₄.1. Agar starting culture. Culture strain DSM 6182 on mowed agar was grown for 10 days at 27 ^o C. Agar medium had the following composition:
Glucose 10 g
Starch (soluble) 20 g
Yeast Extract (Gistex) 5 g
Peptone (NZ-Amin, Type A, Sheffield) 5 g
CaCO ₃ 1 g
Agar (Bacto) 18 g
Demineralized water up to 1 liter
PH level: neutralized to 7 by the addition of NaOH / H ₂ SO ₄ .

Стерилизация: при 120^oC в течение 20 мин.Sterilization: at 120 ^o C for 20 minutes

2. Предкультура. 2. The preculture.

Споры и мицелий исходной культуры суспендировали в 10 мл 0,9-ного солевого раствора. В несколько колб Эрленмайера емкость по 200 мл, содержащих каждая по 50 мл предкультуральной среды, вводили в каждую по 5 мл этой суспензии. Spores and mycelium of the initial culture were suspended in 10 ml of 0.9% saline. In several Erlenmeyer flasks, a 200 ml capacity, each containing 50 ml of precultural medium, was introduced into each of 5 ml of this suspension.

Состав предкультуральной среды следующий:
Глюкоза 7 г
Крахмал (растворимый) 10 г
Дрожжевой экстракт (Gistex) 4.5 г
Солодовый экстракт (жидкий, Wander) 10 г
Пептон (N-Z-Амин, Тип А, Шеффилд) 2.5 г
CaCO₃ 1 г
Микроэлементный раствор N 235 1 мл
Деминерализованная вода До 1 л
Уровень pH: нейтрализован до 7 добавлением NaOH/H₂SO₄.The composition of the precultural environment is as follows:
Glucose 7 g
Starch (soluble) 10 g
Yeast Extract (Gistex) 4.5 g
Malt Extract (Liquid, Wander) 10 g
Peptone (NZ-Amin, Type A, Sheffield) 2.5 g
CaCO ₃ 1 g
Microelement solution N 235 1 ml
Demineralized water Up to 1 L
PH level: neutralized to 7 by the addition of NaOH / H ₂ SO ₄ .

Стерилизация: при 120^oC в течение 20 мин.Sterilization: at 120 ^o C for 20 minutes

Микроэлементный раствор N 235:
H₃BO₃ 0,1 г
FeSO₄•7H₂O 5 г
KI 0,05 г
CoCl₂•6H₂O 2 г
CuSO₄•5H₂O 0,2 г
MnCl₂•4H₂O 2 г
ZnSO₄•7H₂O 4 г
Деминерализованная вода До 1 л
H₂SO₄ (97%) 1 мл
Предкультуры ферментируют в течение 4 дн при 27^oC на роторном шейкере при скорости вращения 200 об/мин с эксцентричностью 50 мм.Trace element N 235:
H ₃ BO ₃ 0.1 g
FeSO ₄ • 7H ₂ O 5 g
KI 0.05 g
CoCl ₂ • 6H ₂ O 2 g
CuSO ₄ • 5H ₂ O 0.2 g
MnCl ₂ • 4H ₂ O 2 g
ZnSO ₄ • 7H ₂ O 4 g
Demineralized water Up to 1 L
H ₂ SO ₄ (97%) 1 ml
The precultures were fermented for 4 days at 27 ^° C. on a rotary shaker at a rotation speed of 200 rpm with an eccentricity of 50 mm.

3. Промежуточная культура
В несколько колб Эрленмайера емкость по 200 мл, содержащих каждая по 50 мл предкультуральной среды, вводили в каждую по 5 мл предкультуры. Промежуточную культуру ферментировали в течение 3 дн при 27^oC на роторном шейкере при скорости вращения 200 об/мин с эксцентричностью 50 мм.3. Intermediate culture
In several Erlenmeyer flasks, a 200 ml capacity, each containing 50 ml of precultural medium, was introduced into each of 5 ml of preculture. The intermediate culture was fermented for 3 days at 27 ^° C. on a rotary shaker at a rotation speed of 200 rpm with an eccentricity of 50 mm.

4. Главная культура
В несколько колб Эрленмайера емкость по 500 мл, содержащих каждая по 50 мл главной среды (всего 12 л), вводили в каждую по 5 мл промежуточной культуры. Эти культуры ферментируют в течение 3 дн при 27^oC на роторном шейкере при 200 об/мин с эксцентричностью 50 мм. Через 24 ч циклоспорин A (7,5 мг), растворенный в метаноле, добавили к главной культуре (150 мг/л).4. Main culture
In several Erlenmeyer flasks, a 500 ml capacity, each containing 50 ml of the main medium (total 12 L), was introduced into each of 5 ml of the intermediate culture. These cultures were fermented for 3 days at 27 ^° C. on a rotary shaker at 200 rpm with an eccentricity of 50 mm. After 24 hours, cyclosporin A (7.5 mg) dissolved in methanol was added to the main culture (150 mg / L).

Состав главной культуральной среды следующий:
Церелоза 10 г
Декстрин 10 г
Крахмал (растворимый) 10 г
Дрожжевой экстракт (Gistex) 2,5 г
Мука из соевых бобов (Nurupan, Edelsoya) 12,5 г
K₂HPO₄ 0,25 г
KH₂PO₄ 0,12 г
MgSO₄•7H₂O 0,10 г
CaCl₂•6H₂O 0,05 г
Микроэлементный раствор АС-1 1 мл
Деминерализованной воды До 1 л
Уровень pH: нейтрализован до 7,2 7,5 добавлением KOH/H₂SO₄.The composition of the main culture medium is as follows:
Cerelose 10 g
Dextrin 10 g
Starch (soluble) 10 g
Yeast Extract (Gistex) 2.5 g
Soya flour (Nurupan, Edelsoya) 12.5 g
K ₂ HPO ₄ 0.25 g
KH ₂ PO ₄ 0.12 g
MgSO ₄ • 7H ₂ O 0.10 g
CaCl ₂ • 6H ₂ O 0.05 g
Microelement solution AC-1 1 ml
Demineralized water up to 1 liter
PH level: neutralized to 7.2 7.5 by the addition of KOH / H ₂ SO ₄ .

Стерилизация: при 120^oC в течение 20 мин.Sterilization: at 120 ^o C for 20 minutes

Микроэлементный раствор АС-1: этот раствор имел тот же состав, что микроэлементный раствор N 235, но с добавлением (NH₄)₅Mo₇O₂₄ (0,2 г).Microelement solution AC-1: this solution had the same composition as microelement solution N 235, but with the addition of (NH ₄ ) ₅ Mo ₇ O ₂₄ (0.2 g).

5. Выделение. 5. Isolation.

Мицелий отделяют из культуральной среды и полученный культуральный фильтрат (13 л) экстрагируют трижды 1,2-дихлорэтаном, используемом в количестве 1,5 л на каждую экстракцию. Комбинированные растворы 1,2-дихлорэтана выпаривают под вакуумом при температуре 40^oC. Неочищенный остаток подвергают гель-фильтрованию (Sephadex LH-20) с использованием метанола в качестве элюента. Эти фракции, содержащие циклоспориновые соединения (525 мг), смешивают и хроматографируют на силикагеле (50 г, размер гранул 0,04 0,063 мм, "Merck") с использованием смеси хлороформ/метанол в качестве элюента. Повторной хроматографией с использованием той же системы получают чистый [ g -гидроксид-MeLeu]⁴-циклоспорин в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 150 153^oC, [p]D²⁰ -225^oC (c=0,53 в CHCl₃) и -171^oC (c 0,44 CH₃OH).The mycelium is separated from the culture medium and the resulting culture filtrate (13 L) is extracted three times with 1,2-dichloroethane, used in an amount of 1.5 L for each extraction. Combined solutions of 1,2-dichloroethane are evaporated in vacuo at 40 ^° C. The crude residue is subjected to gel filtration (Sephadex LH-20) using methanol as an eluent. These fractions containing cyclosporin compounds (525 mg) were mixed and chromatographed on silica gel (50 g, particle size 0.04 0.063 mm, Merck) using chloroform / methanol as eluent. Repeated chromatography using the same system yields pure [g-hydroxide-MeLeu] ⁴ -cyclosporin as an amorphous white powder with a melting point of 150 153 ^o C, [p] D ²⁰ -225 ^o C (c = 0.53 in CHCl ₃ ) and -171 ^° C (c 0.44 CH ₃ OH).

Пример 3. [ g -гидрокси-MeLeu] ⁴-[ g -гидрокси-MeLeu]⁶-циклоспорин (Соединение g). Более полярные фракции, получаемые при очистке [ g -гидрокси-MeLeu] ⁴-циклоспорина, далее очищают посредством повторной хроматографии на силикагелевой колонке (размер гранул 0,04-0,063 мм) с использованием смеси ацетон/гексан в соотношении 2: 1 в качестве элюента, с последующей хроматографии на силикагеле с использованием смеси метил-т. бутиловый эфир/метанол/вода в соотношении 90:9:1 в качестве элюента. Первые фракции содержат [ g -гидрокси-MeLeu] ⁴-циклоспорин, который далее очищают посредством обесцвечивания активированным углем с получением чистого соединения в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 162-164^oC, [p]D²⁰ -211^oC (c=0,50 в CHCl₃) и -157^oC (c 0,52 CH₃OH).Example 3. [g-hydroxy-MeLeu] ⁴ - [g-hydroxy-MeLeu] ⁶ -cyclosporin (Compound g). The more polar fractions obtained by purification of [g-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin are further purified by flash chromatography on a silica gel column (granule size 0.04-0.063 mm) using a 2: 1 acetone / hexane mixture as eluent followed by chromatography on silica gel using a mixture of methyl t. butyl ether / methanol / water in a ratio of 90: 9: 1 as eluent. The first fractions contain [g-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin, which is further purified by decolorization with activated carbon to obtain a pure compound in the form of an amorphous white powder with a melting point of 162-164 ^o C, [p] D ²⁰ -211 ^o C (c = 0.50 in CHCl ₃ ) and -157 ^° C (c 0.52 CH ₃ OH).

Более поздние фракции из вышеуказанной хроматографической силикагелевой колонки содержат [ g -гидрокси-MeLeu]⁴-[ g -гидрокси-MeLeu]⁶-циклоспорин и далее очищают посредством обесцвечивания активированным углем с получением чистого целевого соединения в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 157-160^oC, [p]D²⁰ -217^oC (c 0,54 в CHCl₃) и -176^oC (c 0,42 CH₃OH).Later fractions from the above chromatographic silica gel column contain [g-hydroxy-MeLeu] ⁴ - [g-hydroxy-MeLeu] ⁶ -cyclosporin and are further purified by decolorization with activated carbon to give the pure target compound as an amorphous white powder with a melting point of 157- 160 ^o C, [p] D ²⁰ -217 ^o C (c 0.54 in CHCl ₃ ) and -176 ^o C (c 0.42 CH ₃ OH).

Пример 4. [Nva]² [ g -гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин (Соединение f).Example 4. [Nva] ² [g-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin (Compound f).

Это соединение получают посредством процедуры, аналогичной процедуре получения соединения е) ([ g -гидрокси-MeLeu]⁴ -циклоспорин), но с использованием циклоспорина G ([Nva]² -циклоспорин) в качестве исходного материала. После очистки посредством повторной хроматографии на силикагелевой колонке с использованием этилацетата, насыщенного водой, и смеси ацетон/гексан 2: 1 в качестве элюента, соответственно, целевое соединение получают в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 138 - 141^oC, [p]D²⁰ -213^oC (c 0,69 в CHCl₃) и -168^oC (c 0,70 в CH₃OH).This compound is prepared by a procedure analogous to the preparation of compound e) ([g-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin), but using cyclosporin G ([Nva] ² -cyclosporin) as the starting material. After purification by repeated chromatography on a silica gel column using water-saturated ethyl acetate and a 2: 1 acetone / hexane mixture as eluent, respectively, the target compound is obtained as an amorphous white powder with a melting point 138 - 141 ^° C, [p] D ²⁰ -213 ^o C (c 0.69 in CHCl ₃ ) and -168 ^o C (c 0.70 in CH ₃ OH).

Пример 5 [Nva]⁵-циклоспорин (Соединение h)
Циклоспорин А (0,60 г 0,5 ммоль), растворенный в тетрагидрофуране (20 мл), инкубируют с 0,63 мл 1,6 М раствора бутиллития (1,0 Ммоль) в гексане. Полученный раствор реагируют с диметил сульфатом (0,1 мл, 1,5 ммоль) при -78^oC. Реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и перемешивают до утра.Example 5 [Nva] ⁵ -cyclosporin (Compound h)
Cyclosporin A (0.60 g 0.5 mmol) dissolved in tetrahydrofuran (20 ml) is incubated with 0.63 ml of a 1.6 M solution of butyllithium (1.0 mmol) in hexane. The resulting solution was reacted with dimethyl sulfate (0.1 ml, 1.5 mmol) at -78 ^° C. The reaction mixture was slowly warmed to room temperature and stirred overnight.

Выделение флэш-хроматографией (SiO₂, 5% смесь метанол/эфир), с последующим HPLC (обратная фаза) дает целевой продукт. Это соединение характеризуется посредством 300 МГц¹H ЯМР спектром CDCl₃, показанным на фиг. 3.Isolation by flash chromatography (SiO ₂ , 5% methanol / ether), followed by HPLC (reverse phase), gives the desired product. This compound is characterized by a 300 MHz ¹ H NMR spectrum of CDCl ₃ shown in FIG. 3.

Пример 6. [MeOThr]²-[(D)MeAla]³-[MeVaL]⁵-циклоспорин (Соединение i).Example 6. [MeOThr] ² - [(D) MeAla] ³ - [MeVaL] ⁵ -cyclosporin (Compound i).

Смесь 480 мл THF (абсолютный) и 6,96 г (49,2 ммоль) диизопропиламина охлаждают до -80^oC, и в нее медленно добавляют через шприц 33,5 мл 1,33 М раствора бутиллития в гексане (= 44,5 ммоль). Смесь перемешивают в течение 30 мин при -80^oC, а затем через шприц в течение 2 3 мин добавляют раствор 8 г (6,6 ммоль) циклоспорина C ([The]²-циклоспорин) в 120 мл абсолютного THF. Чистый раствор перемешивают еще при -80^oC, а затем медленно добавляют 2,06 мл метилиодида.A mixture of 480 ml THF (absolute) and 6.96 g (49.2 mmol) of diisopropylamine was cooled to -80 ^° C, and 33.5 ml of a 1.33 M solution of butyl lithium in hexane (= 44.5 mmol). The mixture was stirred for 30 minutes at -80 ^° C, and then a solution of 8 g (6.6 mmol) of cyclosporin C ([The] ² -cyclosporin) in 120 ml of absolute THF was added via syringe over 2 minutes. The pure solution was stirred at -80 ^° C, and then 2.06 ml of methyl iodide was slowly added.

Смеси позволяют нагреться до комнатной температуры в течение 2 ч, а затем добавляют 40 мл воды и растворители выпаривают на роторном выпаривателе при 30^oC под давлением 15 мм рт.ст. Остаток разделяют между водой и эфиром, и слой эфира четырежды полу-насыщенным солевым раствором, сушат над сульфатом магния и выпаривают с получением остатка весом 8,1 г.The mixture was allowed to warm to room temperature over 2 hours, then 40 ml of water were added and the solvents were evaporated on a rotary evaporator at 30 ^° C. under a pressure of 15 mmHg. The residue was partitioned between water and ether, and the ether layer was four times semi-saturated with brine, dried over magnesium sulfate and evaporated to give a residue weighing 8.1 g.

Остаток хроматографируют на 1200 г Кизельгеля с водо-насыщенным этилацетатом с получением неочищенного продукта, который после еще одной хроматографии на 200 г Кизельгеля с 5% MeOH/CH₂Cl₂ дает чистый целевой продукт, [p] D²⁰ -195^oC (c 1,0 в CHCl₃).The residue is chromatographed on 1200 g of Kieselgel with water-saturated ethyl acetate to give a crude product, which, after another chromatography on 200 g of Kieselgel with 5% MeOH / CH ₂ Cl _2, gives the pure target product, [p] D ²⁰ -195 ^o C (c 1.0 in CHCl ₃ ).

Пример 7. [Дигидро-MeBmt]¹ [

-гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин (Соединение a)
К суспензии 200 мг предварительно гидрогенированый 10% смеси палладий/активированный уголь в 4 мл этанола добавляют 1,2 г [ g -гидрокси-MeLeu] ⁴-циклоспорина (Соединение e) в 10 мл этанола, и проводят гидрогенизацию при комнатной температуре до тех пор, пока водород перестает потребляться. После удаления катализатора фильтрованием, раствор выпаривают с получением целевого соединения в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 154-156^oC, [p]D²⁰ -225^oC (c 0,87 в CHCl₃) и -169^oC (c 0,70 в CH₃OH).Example 7. [Dihydro-MeBmt] ¹ [

-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin (Compound a)
To a suspension of 200 mg of a pre-hydrogenated 10% mixture of palladium / activated carbon in 4 ml of ethanol was added 1.2 g of [g-hydroxy-MeLeu] ^4- cyclosporin (Compound e) in 10 ml of ethanol, and hydrogenated at room temperature until until hydrogen ceases to be consumed. After removing the catalyst by filtration, the solution was evaporated to obtain the target compound in the form of an amorphous white powder with a melting point of 154-156 ^o C, [p] D ²⁰ -225 ^o C (c 0.87 in CHCl ₃ ) and -169 ^o C (c 0.70 in CH ₃ OH).

Пример 8. [8'-Гидрокси-MeBmt]¹- циклоспорин (Соединение j).Example 8. [8'-Hydroxy-MeBmt] ¹ - cyclosporine (Compound j).

1. [O-ацетил- w -бромо-MeBmt]¹-циклоспорин:
Смесь 25,0 г (20 ммоль) [O-ацетил-MeBmt]¹ -циклоспорина (Traber и др. Helv.Chim.Acta 1982, 65, 1653), 4,4 г (25 ммоль) N-бром-сукцилимида и 400 мг азобисизобутиронитрила в 250 мл тетрахлориде углерода нагревают с обратным холодильником в течение 2,5 ч. Растворитель выпаривают и заменяют эфиром, затем отфильтровывают от твердых веществ, промывают водой, сушат над сульфактом магния и выпаривают до сухого состояния. Остаток хроматографируют на силикагеле со смесью Этиловый эфир/этилацетат (4:1) с получением 10,7 г (40% ) аморфного продукта, который кристаллизуют из смеси эфир/гексан с получением 8,4 чистого вещества с температурой плавления 207 209^oC. Последующие фракции хроматографии содержат дополнительно 11,2 г продукта немного худшего качества.1. [O-acetyl-w-bromo-MeBmt] ¹ -cyclosporin:
A mixture of 25.0 g (20 mmol) of [O-acetyl-MeBmt] ¹ -cyclosporin (Traber et al. Helv.Chim.Acta 1982, 65, 1653), 4.4 g (25 mmol) of N-bromo-succylimide and 400 mg of azobisisobutyronitrile in 250 ml of carbon tetrachloride is heated under reflux for 2.5 hours. The solvent is evaporated and replaced with ether, then it is filtered off from solids, washed with water, dried over magnesium sulfate and evaporated to dryness. The residue was chromatographed on silica gel with ethyl ether / ethyl acetate (4: 1) to give 10.7 g (40%) of an amorphous product, which was crystallized from ether / hexane to give 8.4 pure material with a melting point of 207 209 ^° C. Subsequent chromatographic fractions contain an additional 11.2 g of slightly worse product.

2. [O-ацетил- w- ацетокси-MeBmt]¹-циклоспорин:
Смесь 4,31 г (3,3 ммоль) продукта стадии 1 (загрязненного, по оценке, 15 20% исходного материала) и 2,1 г (8 ммоль) тетраэтиламмоний-ацетат-тетрагидрата в метил-этил-кетоне, содержащая каталитическое количество иодида натрия, нагревают на масляной бане при 105^oC в течение 3 ч и выдерживают при комнатной температуре в течение выходных (до понедельника). Растворитель разбавляют метил-т-бутиловым эфиром и промывают водой и солевым раствором. Слой органических веществ сушат над сульфатом магния и выпаривают с получением 4,0 г неочищенного продукта, который очищают на колонке RP-18 с обратной фазой (240 г) с получением 3,07 г целевого продукта с температурой плавления 191 192^oC.2. [O-acetyl-w-acetoxy-MeBmt] ¹ -cyclosporin:
A mixture of 4.31 g (3.3 mmol) of the product of stage 1 (contaminated with an estimated 15 20% of the starting material) and 2.1 g (8 mmol) of tetraethylammonium acetate-tetrahydrate in methyl ethyl ketone containing a catalytic amount sodium iodide, heated in an oil bath at 105 ^o C for 3 h and kept at room temperature for the weekend (until Monday). The solvent was diluted with methyl t-butyl ether and washed with water and brine. The organic layer was dried over magnesium sulfate and evaporated to give 4.0 g of a crude product, which was purified on an RP-18 reverse phase column (240 g) to obtain 3.07 g of the expected product with a melting point of 191 192 ^° C.

3. [ w гидрокси-MeBmt]¹-циклоспорин:
Смешивают раствором 1,72 г (1,3 ммоль) продукта, полученного на стадии 2, в 75 мл метанола и раствором 1,2 г натрия в 50 мл метанола и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем раствор подкисляют уксусной кислотой. Растворитель выпаривают при пониженном давлении и остаток растворяют в метил-т-бутиловом эфире, промывают последовательно водой, солевым раствором и раствором бикарбоната натрия, сушат на сульфатом магния и выпаривают. Неочищенный продукт (1,6 г) элюируют из колонки RP-18 (240 г) смесью метанол/вода в соотношении 75:15 с получением 1,5 г чистого продукта. Образец кристаллизуют из смеси эфир/гексан с получением кристаллического продукта с температурой плавления 181 183^oC.3. [w hydroxy-MeBmt] ¹ -cyclosporin:
It is mixed with a solution of 1.72 g (1.3 mmol) of the product obtained in stage 2 in 75 ml of methanol and a solution of 1.2 g of sodium in 50 ml of methanol and kept at room temperature for 2 hours. Then, the solution was acidified with acetic acid. The solvent was evaporated under reduced pressure, and the residue was dissolved in methyl t-butyl ether, washed successively with water, brine and sodium bicarbonate solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product (1.6 g) was eluted from an RP-18 column (240 g) with a 75:15 methanol / water mixture to give 1.5 g of pure product. A sample is crystallized from ether / hexane to give a crystalline product with a melting point of 181 183 ^o C.

Пример 9. [MeThr]⁴-циклоспорин (Соединение d)
Полный синтез циклоспорина, как он описан в патентах США N 4 396 542 и 4 798 823, осуществляют с использованием MeThr в 4-й позиции вместо MeLeu. Продукт имеет [p]D²⁰ -249,6^oC (c 1,0 в CHCl₃).Example 9. [MeThr] ⁴ -cyclosporin (Compound d)
Complete synthesis of cyclosporin, as described in US Pat. Nos. 4,396,542 and 4,798,823, is carried out using MeThr in the 4th position instead of MeLeu. The product has [p] D ²⁰ -249.6 ^o C (c 1.0 in CHCl ₃ ).

Пример 10. [MeVal]⁴-циклоспорин (Соединение d).Example 10. [MeVal] ⁴ -cyclosporin (Compound d).

Полный синтез циклоспорина, как он описан в патентах США N 4 396 542 и 4 798 823, осуществляют с использованием MeVal в 4-й позиции вместо MeLeu. Продукт имеет [p]D²⁰ -226^oC (c 0,358 в CHCl₃).Complete synthesis of cyclosporin, as described in US Pat. Nos. 4,396,542 and 4,798,823, is carried out using MeVal in the 4th position instead of MeLeu. The product has [p] D ²⁰ -226 ^° C. (c 0.358 in CHCl ₃ ).

Пример 11. Иммуносупрессия и связывание циклофилина. Example 11. Immunosuppression and cyclophilin binding.

Активными Соединениями по изобретению, растворенными циклоспорину
В табл. 1 даны примеры (1) пропорции связывания циклофилина (BR) активными соединениями по изобретению, рассчитанной по результатам исследования ELISA и (2) иммуносупрессивной активности этих соединений, измеренной в процентах активности природного циклоспорина (IR - Иммуносупрессивная пропорция).The active compounds of the invention dissolved in cyclosporine
In the table. Figure 1 shows examples of (1) the proportion of cyclophilin (BR) binding by the active compounds of the invention calculated from the ELISA and (2) the immunosuppressive activity of these compounds, measured as a percentage of the activity of natural cyclosporin (IR - Immunosuppressive proportion).

Пояснения по значениям этих данных и по методам проведения исследований даны выше. Explanations on the values of these data and on research methods are given above.

Активные соединения по изобретению могут использоваться как при предотвращении СПИДа у ВИЧ-положительных пациентов, еще не имеющих символов заболевания, так и при лечении пациентов, страдающих СПИДом. У пациентов, у которых СПИД уже появился, введение активного соединения по изобретению будет реверсировать разрушение Т4 клеток, связанное со СПИДом, вызывать регрессию связанных со СПИДом нарушений, таких как саркома Капоши (Kaposi), и снижать вероятность новых случайных заражений. The active compounds of the invention can be used both in the prevention of AIDS in HIV-positive patients who do not yet have disease symbols, and in the treatment of patients with AIDS. In patients in whom AIDS has already appeared, administration of the active compound of the invention will reverse AIDS-related T4 cell destruction, cause regression of AIDS-related disorders, such as Kaposi sarcoma, and reduce the likelihood of new accidental infections.

Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает способ лечения и предотвращения синдрома приобретенного иммунодефицита и других нарушений, вызываемых вирусом ВИЧ-1 у пациента, зараженного указанным вирусом, предусматривающий введение указанном пациенту эффективного количества активного соединения по изобретению. Thus, the present invention provides a method for the treatment and prevention of acquired immunodeficiency syndrome and other disorders caused by the HIV-1 virus in a patient infected with said virus, comprising administering to said patient an effective amount of an active compound of the invention.

Активное соединение по изобретению может вводится любым традиционным путем, в частности энтерально, орально, в виде растворов для питья, таблеток или капсул или парантерально, например, в виде растворов или суспензий для инъекций. При внутривенном введении возможная дневная доза составляет от 1 до 20 мг/кг, предпочтительно от 3 до 10 мг/кг, а при оральном введении от 1 до 50 мг/кг, предпочтительно, от 7 до 20 мг/кг. The active compound of the invention can be administered by any conventional route, in particular enteral, oral, in the form of solutions for drinking, tablets or capsules, or parenterally, for example, in the form of solutions or suspensions for injection. For intravenous administration, the possible daily dose is from 1 to 20 mg / kg, preferably from 3 to 10 mg / kg, and when administered orally, from 1 to 50 mg / kg, preferably from 7 to 20 mg / kg.

Токсичность активных соединений по изобретению та же, что и у циклоспорина. Поскольку активные соединения по изобретению не являются иммуносупрессивными, то удается обойти определенные побочные эффекты, относящиеся к иммуносупрессии. Однако другие побочные эффекты, связанные с циклоспорином, в частности нефротоксичность при длительном применении, могут вызывать и циклоспоринами по изобретению. The toxicity of the active compounds of the invention is the same as that of cyclosporin. Since the active compounds of the invention are not immunosuppressive, certain side effects related to immunosuppression can be circumvented. However, other side effects associated with cyclosporine, in particular nephrotoxicity with prolonged use, can also cause cyclosporins according to the invention.

Предпочтительные галеновые формы для активных соединений по изобретению включают формы на основе микроэмульсий, описанных в патенте Великобритании N 2 222 770А, которые включают формы как внутреннего (орального), так и наружного применения, а также формы (оральные и инъекционные), полученные из растворов сухих веществ, соединяющих моноэфир сахарида и жировой кислоты, например, монолаурат сахарозы, как описано в патенте Великобритании N 2 209 671А. Подходящие дозированные формы на один прием для орального введения включают, например, от 25 до 200 мг активного соединения на дозировку. Preferred galenic forms for the active compounds of the invention include those based on the microemulsions described in UK Patent No. 2,222,770A, which include both internal (oral) and external forms as well as oral and injectable forms obtained from dry solutions substances connecting the monoester of saccharide and fatty acid, for example, sucrose monolaurate, as described in UK patent N 2 209 671A. Suitable unit dosage forms for oral administration include, for example, 25 to 200 mg of active compound per dosage.

Примеры галеновых форм. Examples of galenic forms.

Пример А
Продукт по примеру 1 50,0 мг
Гликофурол 180,0 мг
Миглиол 812 90,0 мг
Кремофор RH 40 180,0 мг
Альфа-Токоферол 0,5 мг
Пример B
Продукт по примеру 1 100,0 мг
Тетрагликоль 20,0 мг
Captex 800 20,0 мг
Nikkol HCO-40 860,0 мг
Бутилгидрокситолуол 1,0 мг
Пример C
Продукт по примеру 1 25,0 мг
Гликофурол 75 100,0 мг
Миглиол 812 35,0 мг
Кремофор RH 40 90,0 мг
Бутилгидроксианизол 0,2 мг
Пример D
Продукт по примеру 1 10,0 мг
Тетрагликоль 10,0 мг
Миритол 5,0
Кремофор RH 40 75,0
Альфа-Токоферол 0,1 мг
Отдельные компоненты этих примерных форм, а также методы их приготовления, полностью описаны в патенте Великобритании N 2 222 770А, содержание которого полностью включено в настоящее описание путем ссылки.Example A
The product according to example 1 50.0 mg
Glycofurol 180.0 mg
Migliol 812 90.0 mg
Cremophor RH 40 180.0 mg
Alpha Tocopherol 0.5 mg
Example B
The product according to example 1 100.0 mg
Tetraglycol 20.0 mg
Captex 800 20.0 mg
Nikkol HCO-40 860.0 mg
Butylhydroxytoluene 1.0 mg
Example C
The product according to example 1 25.0 mg
Glycofurol 75 100.0 mg
Migliol 812 35.0 mg
Cremophor RH 40 90.0 mg
Butylhydroxyanisole 0.2 mg
Example D
The product according to example 1 10.0 mg
Tetraglycol 10.0 mg
Miritol 5.0
Cremophor RH 40 75.0
Alpha Tocopherol 0.1 mg
The individual components of these exemplary forms, as well as methods for their preparation, are fully described in British Patent N 2,222,770A, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

Claims (4)

1. Циклоспорины формулы

где W MeBmt или дигидро MeBmt;
X-αAbu, Val, Thr, Nva или MeOThr;
R Sar или (D)-MeAla;
Y MeLeu, γ-гидрокси-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle или MeaThr;
Z Val, Leu, MeVal или MeLeu,
а при условии, что когда Y представляет MeLeu или MeAla, то Z является MeVal или MeLeu, и если W представляет MeBmt, R представляет Sar и Y представляет γ-гидрокси-MeLau, то Z другой, чем Val.1. Cyclosporins of the formula

where W MeBmt or dihydro MeBmt;
X-αAbu, Val, Thr, Nva or MeOThr;
R Sar or (D) -MeAla;
Y MeLeu, γ-hydroxy-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle or MeaThr;
Z Val, Leu, MeVal or MeLeu,
and provided that when Y is MeLeu or MeAla, then Z is MeVal or MeLeu, and if W is MeBmt, R is Sar and Y is γ-hydroxy-MeLau, then Z is other than Val. 2. Циклоспорин по п. 1 формулы

где W' MeBmt или дигидро-MeBmt,
Y' γгидрокси-MeLeu, MeVal, MeThr или Melle;
Z' Val или MeVal, а при условии, что если W' MeBmt, то Y' другой чем g-гидрокси-MeLeu.2. Cyclosporin according to claim 1 of the formula

where W 'MeBmt or dihydro-MeBmt,
Y 'γ-hydroxy-MeLeu, MeVal, MeThr or Melle;
Z 'Val or MeVal, and provided that if W' MeBmt, then Y 'is different than g-hydroxy-MeLeu. 3. Циклоспорин по п. 1, являющийся [дигидро-MeBmt]¹- γ-гидрокси-MeLeu] ⁴-циклоспорином, или [MeVal]⁴-циклоспорином, или [Melle]⁴-циклоспорином, или MeThr] ⁴ циклоспорином, или [Nva] ²-γ-гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорином, или [MeVal]⁵ циклоспорином, или [MeOThr]²[(D)MeAla]³ [MeVal]⁵-циклоспорином.3. The cyclosporin according to claim 1, which is [dihydro-MeBmt] ¹ - γ-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin, or [MeVal] ⁴ -cyclosporin, or [Melle] ⁴ -cyclosporin, or MeThr] ⁴ cyclosporine, or [ Nva] ^2- γ-hydroxy-MeLeu] ⁴ -cyclosporin, or [MeVal] ⁵ cyclosporin, or [MeOThr] ² [(D) MeAla] ³ [MeVal] ⁵ -cyclosporin. 4. Циклоспорин по п. 1 или 2 формулы [MeIle]⁴-циклоспорин.4. Cyclosporin according to claim 1 or 2 of the formula [MeIle] ⁴ -cyclosporin.

Images