RU2084458C1 - Decapeptide showing antitumor activity - Google Patents
Decapeptide showing antitumor activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2084458C1 RU2084458C1 RU93026760A RU93026760A RU2084458C1 RU 2084458 C1 RU2084458 C1 RU 2084458C1 RU 93026760 A RU93026760 A RU 93026760A RU 93026760 A RU93026760 A RU 93026760A RU 2084458 C1 RU2084458 C1 RU 2084458C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pro
- tert
- decapeptide
- ser
- phe
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к химии пептидов, точнее к декапептиду, аналогу рилизинг-фактора лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов - люлиберина, обладающего противоопухолевой активностью на экспериментальных моделях гормон-зависимых опухолей. The invention relates to the chemistry of peptides, more specifically to decapeptide, an analogue of the releasing factor of luteinizing and follicle-stimulating hormones - luliberin, which has antitumor activity in experimental models of hormone-dependent tumors.
Декапептид имеет следующую общую структуру:
H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Изобретение может стать основой для создания лекарственной противоопухолевой формы.The decapeptide has the following general structure:
H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2
The invention can become the basis for creating a medicinal antitumor form.
Известно, что при терапии ряда онкологических заболеваний (опухоли яичников, простаты, молочной железа, ряда хондросарком и остеосарком) в качестве лекарственных средств используют аналоги пептидных гормонов, в частности, люлиберина (1). It is known that in the treatment of a number of oncological diseases (tumors of the ovaries, prostate, mammary gland, a number of chondrosarcomas and osteosarcomas), peptide hormone analogues, in particular, luliberin, are used as drugs (1).
Люлиберин амид линейного декапептида:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Основной его функцией в организме является регуляция выделения лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, которые, в свою очередь, влияют на уровень половых стероидных гормонов.Luliberin amide linear decapeptide:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2
Its main function in the body is the regulation of the release of luteinizing and follicle-stimulating hormones, which, in turn, affect the level of sex steroid hormones.
Синтезировано множество агонистов и антагонистов люлиберина (см. табл. 1). Как те, так и другие могут применяться в онкологии, поскольку они способны снижать уровень гормонов и влиять таким образом на рост гормонзависимых опухолей. Synthesized many agonists and antagonists of luliberin (see table. 1). Both those and others can be used in oncology, since they are able to reduce hormone levels and thus affect the growth of hormone-dependent tumors.
Агонисты вещества, которые связываются с люлибериноновыми рецепторами и вызывают люлиберино-подобный эффект. При длительном введении больших доз высокоактивных агонистов развивается эффект парадоксальной ингибиции, связанный с уменьшением количества соответствующих рецепторов. Agonists are substances that bind to luliberinone receptors and cause a luliberin-like effect. With the long-term administration of large doses of highly active agonists, the effect of paradoxical inhibition develops, associated with a decrease in the number of corresponding receptors.
Антагонисты также связываются с люлибериновыми рецепторами, но люлиберино-подобного эффекта не вызывают и являются конкурентными ингибиторами люлиберина. Antagonists also bind to luliberin receptors, but do not cause a luliberin-like effect and are competitive inhibitors of luliberin.
Такие агонисты как: "Декапептил"-pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg- Pro-Gly-NH 2 (2,6); "Бусерилин"-pGlu His-Trp-Ser-Tyr-D- Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt (3, 6); "Лейпролид" -pGlu-His-Trp-Ser- Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt (3); "Золадекс" pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D- Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Aza-Gly (4) производятся в промышленности и используются в клинике.Agonists such as: Decapeptyl-pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 (2.6); Buserilin-pGlu His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (Bu t ) -Leu-Arg-Pro-NHEt (3, 6); Leuprolide-pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt (3); Zoladex pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (Bu t ) -Leu-Arg-Pro-Aza-Gly (4) are manufactured in industry and used in the clinic.
В качестве возможных противоопухолевых препаратов описаны и антагонисты люлиберина (9): Ac-p-F-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D- Trp-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2, Ac-p-Cl-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser- Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2.Luliberin antagonists have also been described as possible antitumor drugs (9): Ac-pFD-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH 2 , Ac-p-Cl-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH 2 .
(При написании структур использованы сокращения аминокислот, рекомендованные IUPAC-IUB (6), а также: NHEt этиламид, Aza-Gly-аза-глицин, D-Ser(But)-O-(трет-бутил)-D серин, Ac ацетил, p-F-D-Phe - пара-фтор-D-фенилаланин, p-Cl-D-Phe-пара-хлор-D-фенилаланин).(When writing the structures, amino acid reductions recommended by IUPAC-IUB (6) were used, as well as: NHEt ethylamide, Aza-Gly-aza-glycine, D-Ser (Bu t ) -O- (tert-butyl) -D serine, Ac acetyl, pFD-Phe - para-fluoro-D-phenylalanine, p-Cl-D-Phe-para-chloro-D-phenylalanine).
Большинство высокоактивных антагонистов люлиберина получают путем множественных замен в последовательности гормона на неприродные аминокислоты и аминокислоты D-конфигурации, что значительно повышает стоимость синтеза. Кроме того, наличие протяженных участков, состоящих из гидрофобных аминокислотных остатков, характерных для такого рода препаратов, приводит к развитию аллергических реакций (N7). Определенным недостатком известных аналогов люлиберина является также наличие остатков триптофана и гистидина, подверженных побочным реакциям.Most highly active luliberin antagonists are obtained by multiple substitutions in the hormone sequence for unnatural amino acids and amino acids of the D configuration, which significantly increases the cost of synthesis. In addition, the presence of extended sections consisting of hydrophobic amino acid residues characteristic of such preparations leads to the development of allergic reactions (N 7 ). A certain disadvantage of the known analogues of luliberin is also the presence of tryptophan and histidine residues that are prone to adverse reactions.
В зависимости от структуры стоимость агонистов или антагонистов люлиберина составляет от 100 до 500 DM за 5 мг (см. каталог "Bachem", 1991 г). Depending on the structure, the cost of luliberin agonists or antagonists is from 100 to 500 DM per 5 mg (see the Bachem catalog, 1991).
Задачей предлагаемого изобретения является полипептид, обладающий высокой биологической активностью и лишенный вышеперечисленных недостатков, то есть не содержащий триптофан, гистидин и не имеющий протяженных участков, состоящих из гидрофобных неприродных аминокислот. The objective of the invention is a polypeptide having high biological activity and devoid of the above disadvantages, that is, does not contain tryptophan, histidine and does not have extended sections consisting of hydrophobic unnatural amino acids.
Эта задача решалась декапептидом общей формулы:
H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Prg-Pro-Gly-NH2
Заявленный декапептид синтезировали твердофазным методом с использованием стандартных приемов.This problem was solved by the decapeptide of the general formula:
H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Prg-Pro-Gly-NH 2
The claimed decapeptide was synthesized by the solid phase method using standard techniques.
Анализ известного уровня науки и техники показал, что заявленный декапептид является новым и отличается по структуре от наиболее близких аналогов:
H-Pro-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (заявленный декапептид);
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(люлиберин);
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,
aGlu-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (два последних пептида из каталога фирмы "Bachem", 1991)
Таким образом, можно утверждать, что вещество соответствует требованию "новизна".Analysis of the known level of science and technology showed that the claimed decapeptide is new and differs in structure from the closest analogues:
H-Pro-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 (claimed decapeptide);
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 (luliberin);
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 ,
aGlu-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 (the last two peptides from the catalog of the company "Bachem", 1991)
Thus, it can be argued that the substance meets the requirement of "novelty."
Заявленный декапептид в отличие от большинства известных аналогов люлиберина, имеющих на N-конце пироглутаминовую кислоту или защищенный аминокислотный остаток, содержит в первом положении свободный пролин. Получение высокоактивного вещества при подобной модификации невозможно было предсказать заранее, поскольку существует мнение, что свободный N-конец в такого рода препаратах приводит к снижению биологической активности (8), что доказывает неочевидность предлагаемого решения. The claimed decapeptide, unlike most of the known analogues of luliberin, having pyroglutamic acid or a protected amino acid residue at the N-terminus, contains free proline in the first position. The preparation of a highly active substance with such a modification could not be predicted in advance, since there is an opinion that the free N-terminus in such preparations leads to a decrease in biological activity (8), which proves the non-obviousness of the proposed solution.
Нами было показано, что рассматриваемый декапептид обладает высокой противоопухолевой активностью при терапии рака простаты у крыс до 84% торможения роста опухоли в дозе 100 мкг/кг в день, что соответствует 25 мкг на животное. В том же тесте и той же дозе коммерческий препарат "бусерилин" показал торможение роста опухоли 63% Было найдено также, что заявленный декапептид оказывает тормозящее воздействие (до 54%) на рак молочной железы у мышей. We have shown that the decapeptide in question has high antitumor activity in the treatment of prostate cancer in rats up to 84% inhibition of tumor growth at a dose of 100 μg / kg per day, which corresponds to 25 μg per animal. In the same test and the same dose, the commercial drug Buserilin showed inhibition of tumor growth of 63%. It was also found that the claimed decapeptide exerts an inhibitory effect (up to 54%) on breast cancer in mice.
По литературным данным подобные препараты исследованные на различных моделях рака предстательной и молочной желез эффективны в следующих дозах:
"Декапептил" 25 мкг в день или 25 мкг дважды в день (2, 13)
"Золадекс" 35 мкг в день (препарат вводился по 1 мг 1 раз в 28 дней в биодеградируемых капсулах) (4), "Лейпролид" 10 мкг дважды в день (3), Ac-p-F-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 или Ac-p-Cl-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-D-Ala- NH2 - по 50 мкг к день (5)
Высокая биологическая активность заявленного декапептида также подтверждает соответствие изобретения требованию "изобретательский уровень".According to the literature, similar drugs studied on various models of prostate and breast cancer are effective in the following doses:
Decapeptil 25 mcg daily or 25 mcg twice daily (2, 13)
The high biological activity of the claimed decapeptide also confirms the compliance of the invention with the requirement of "inventive step".
Для подтверждения соответствия заявленного изобретения требованию "промышленная применимость" приводим пример его получения. To confirm the compliance of the claimed invention to the requirement of "industrial applicability", we give an example of its receipt.
Синтез H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Синтез проводили твердофазным методом с использованием пептидного синтеза NPS-4000 ("Neosystem", Франция) на 4 метиобензгидриламинополимере той же фирмы. Использовали производные аминокислот L ряда фирмы "Reanal" (Венгрия): N-трет-бутилоксикарбони-O-бензилсерин, N трет-бутилоксикарбониопролин и гидрат N-трет-бутилоксикарбониллейцина; а также производные, полученные нами из аминокислот той же фирмы: N-трет бутилоксикарбонилглицин, N-трет-бутилоксикарбонил-NG-(мезитилен -2- сульфо)-аргинин, N-трет-бутилоксикарбонил-O-(3 -бромбензил)тирозин, и производные аминокислот D-ряда: Nα -трет-бутилоксикарбонил- Nε -(2 хлорбензилоксикарбонил)-D-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-D-фенилаланин. Для отщепления пептида от смолы использовали трифторметансульфокислоту производства фирмы "Fluka" (Швейцария).Synthesis of H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2
The synthesis was carried out by the solid-phase method using the peptide synthesis NPS-4000 (Neosystem, France) on 4 methiobenzhydrylaminopolymer of the same company. Used derivatives of amino acids L of a number of Reanal firm (Hungary): N-tert-butyloxycarboni-O-benzylserine, N tert-butyloxycarbonioproline and N-tert-butyloxycarbonylleucine hydrate; as well as derivatives that we obtained from amino acids of the same company: N-tert-butyloxycarbonylglycine, N-tert-butyloxycarbonyl-N G - (mesitylene -2-sulfo) -arginine, N-tert-butyloxycarbonyl-O- (3-bromobenzyl) tyrosine and derivatives of amino acids of the D-series: N α -tert-butyloxycarbonyl-N ε - (2 chlorobenzyloxycarbonyl) -D-lysine and N-tert-butyloxycarbonyl-D-phenylalanine. Trifluoromethanesulfonic acid manufactured by Fluka (Switzerland) was used to cleave the peptide from the resin.
Полноту прохождения реакций пептидообразования контролировали с помощью нингидринового теста (9). В том случае, если производилось ацилирование остатка пролина, использовали изатиновый тест (10). The completeness of the passage of peptide formation reactions was controlled using the ninhydrin test (9). If the proline residue was acylated, an isatin test was used (10).
Трифторуксусную кислоту и растворители готовили в соответствии с требованиями для твердофазного пептидного синтеза (11), триэтиламин перегоняли над щелочью, а затем над нингидрином. Trifluoroacetic acid and solvents were prepared in accordance with the requirements for solid-phase peptide synthesis (11), triethylamine was distilled over alkali, and then over ninhydrin.
Присоединение первого аминокислотного остатка к полимерному носителю проводили по следующему протоколу:
2 г 4-Метилбензгидриламинополимера с содержанием аминогрупп 0,55 ммоль на 1 г смолы помещали в реактор. После набухания смолы в 20 мл диметилформамида последовательно проводили следующие стадии обработки: 1). Промывка 20 мл диметилформамида 1 минута. 2). Двукратная обработка 20 мл 10% раствора триэтиламина в диметилформамиде в течение 1 и 2 мин. 3). Трехкратная промывка 20 мл диметилформамида по 1 мин. 4). Промывка 20 мл хлористого метилена 1 мин. 5). Заливали в реактор раствор 0,52 г (3,3 ммоль) N-трет-бутилоксикарбонилглицина в 15 мл хлористого метилена, перемешивали в течение 10 минут и прибавляли 0,517 мл (3,3 ммоль) N,N'-диизопропилкарбодиимида. Перемешивали 2 ч. 6). Трижды промывали 20 мл хлористого метилена по 1 мин.Attachment of the first amino acid residue to the polymer carrier was carried out according to the following protocol:
2 g of 4-methylbenzhydrylaminopolymer with an amino group content of 0.55 mmol per 1 g of resin were placed in a reactor. After swelling of the resin in 20 ml of dimethylformamide, the following processing steps were carried out sequentially: 1). Rinse with 20 ml of dimethylformamide for 1 minute. 2). Twofold treatment with 20 ml of a 10% solution of triethylamine in dimethylformamide for 1 and 2 minutes. 3). Three times washing with 20 ml of dimethylformamide for 1 min. 4). Rinse with 20 ml of methylene chloride for 1 min. 5). A solution of 0.52 g (3.3 mmol) of N-tert-butyloxycarbonylglycine in 15 ml of methylene chloride was poured into the reactor, stirred for 10 minutes and 0.517 ml (3.3 mmol) of N, N'-diisopropylcarbodiimide was added. Stirred for 2 hours. 6). Washed three times with 20 ml of methylene chloride for 1 min.
Проводили блокирование непрореагировавших аминогрупп. Для этого: 1). Полимер дважды обрабатывали 20 мл 10% раствора триэтиламина в хлористом метилене в течение 1 и 2 мин. 2). заливали 15,8 мл 10% раствора триэтилена в хлористом метилене и добавляли 1,04 мл (11 ммоль) уксусного ангидрида. Перемешивали 10 мин. 3). промывали 20 мл хлористого метилена 3 раза по 1 мин. Blocked unreacted amino groups. For this: 1). The polymer was treated twice with 20 ml of a 10% solution of triethylamine in methylene chloride for 1 and 2 minutes. 2). 15.8 ml of a 10% solution of triethylene in methylene chloride were added, and 1.04 ml (11 mmol) of acetic anhydride was added. Stirred for 10 minutes. 3). washed with 20 ml of methylene chloride 3 times for 1 min.
Далее все аминокислотные остатки присоединяли в соответствии с протоколом стандартного цикла, состоящего из стадий деблокирования, нейтрализации и конденсации. Протокол деблокирования включает в себя следующие операции: 1). Промывка 20 мл хлористого метилена в течение 1 мин. 2). Двукратная обработка 20 мл 50% раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене в течение 1 и 30 мин. 3). Двукратная промывка 20 мл хлористого метилена без перемешивания. 4). Двукратная промывка 20 мл хлористого метилена по 1 мин. Further, all amino acid residues were attached in accordance with the standard cycle protocol consisting of the stages of deprotection, neutralization and condensation. The release protocol includes the following operations: 1). Rinse with 20 ml of methylene chloride for 1 min. 2). Twofold treatment with 20 ml of a 50% solution of trifluoroacetic acid in methylene chloride for 1 and 30 minutes. 3). Twice washing with 20 ml of methylene chloride without stirring. 4). Twice washing with 20 ml of methylene chloride for 1 min.
Сразу по окончании деблокирования выполняли нейтрализацию: 1). Промывка 20 мл диметилформамида 1 мин. 2) Двукратная обработка 20 мл 10% раствора триэтиламина в диметилформамиде в течение 1 и 2 мин. 3). Трехкратная промывка 20 мл диметилформамида. Immediately upon completion of the release, neutralization was performed: 1). Rinse with 20 ml of dimethylformamide for 1 min. 2) Twofold treatment with 20 ml of a 10% solution of triethylamine in dimethylformamide for 1 and 2 minutes. 3). Three times washing with 20 ml of dimethylformamide.
Затем проводили конденсацию с трехкратным избытком соответствующего симметричного ангидрида аминокислоты в течение 1 2 ч. Then, condensation was carried out with a triple excess of the corresponding symmetric amino acid anhydride for 1 2 hours.
Чтобы получить симметричный ангидрид, 6 эквивалентов (6,6 ммоль) защищенного производного аминокислоты растворяли в 10 мл хлористого метилена (для растворения Nα -трет-бутилоксикарбонил-NG-(мезитилен-2-сульфо)аргинина и гидрата N-трет-бутилоксикарбониллейцина необходима добавка диметилформамида), при перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре добавляли 0,517 мл (3,3 ммоль) N,N'-диизопропилкарбодиимида. Через 10 мин хлористый метилен упаривали в вакууме, а остаток растворяли в 10 мл диметилформамида, раствор вносили в реактор.To obtain symmetric anhydride, 6 equivalents (6.6 mmol) of the protected amino acid derivative were dissolved in 10 ml of methylene chloride (to dissolve N α -t-butyloxycarbonyl-N G - (mesitylene-2-sulfo) arginine and N-tert-butyloxycarbonylleucine hydrate dimethylformamide addition is necessary), with stirring on a magnetic stirrer at room temperature, 0.517 ml (3.3 mmol) of N, N'-diisopropylcarbodiimide was added. After 10 min, methylene chloride was evaporated in vacuo, and the residue was dissolved in 10 ml of dimethylformamide, the solution was introduced into the reactor.
После окончания конденсации пептидил-полимер дважды промывали 20 мл диметилформамида по 1 мин, промывали 20 мл хлористого метилена 1 мин, выполняли тест на полноту прохождения реакции пептидообразования. В случае, если тест показывал наличие непрореагировавших аминогрупп, проводили повторную конденсацию карбодиимидным методом с добавкой 1-гидроксибензотриазола. Для этого проводили нейтрализацию по представленному выше протоколу и конденсацию в течение 1 2 ч. After the condensation was completed, the peptidyl polymer was washed twice with 20 ml of dimethylformamide for 1 min, washed with 20 ml of methylene chloride for 1 min, and the test for completeness of the passage of the peptide formation reaction was performed. If the test showed the presence of unreacted amino groups, re-condensation was carried out by the carbodiimide method with the addition of 1-hydroxybenzotriazole. To do this, neutralization was carried out according to the above protocol and condensation for 1 2 hours
Чтобы получить активированный карбоксильный компонент, в 10 мл диметилформамида растворяли 3 эквивалента (3,3 ммоль) защищенного производного аминокислоты и 0,446 г 1-гидроксибензотриазола (3,3 ммоль), при охлаждении до 0oC и перемешивании добавляли 0,517 мл N,N'-диизопропилкарбодиимида (3,3 ммоль), через 30 мин вносили в реактор. По окончании конденсации дважды промывали пептидил-полимер 20 мл диметилформамида по 1 мин, промывали 20 мл хлористого метилена 1 мин, выполняли тест на полноту прохождения реакции пептидообразования. В случае необходимости остаточные аминогруппы блокировали уксусным ангидридом, как было описано выше.To obtain the activated carboxy component, 3 equivalents (3.3 mmol) of the protected amino acid derivative and 0.446 g of 1-hydroxybenzotriazole (3.3 mmol) were dissolved in 10 ml of dimethylformamide, 0.517 ml of N, N ′ was added with cooling to 0 ° C and stirring. -diisopropylcarbodiimide (3.3 mmol) was introduced into the reactor after 30 minutes. At the end of the condensation, the peptidyl polymer was washed twice with 20 ml of dimethylformamide for 1 min, washed with 20 ml of methylene chloride for 1 min, and the test for completeness of the passage of the peptide formation reaction was performed. If necessary, residual amino groups were blocked with acetic anhydride, as described above.
После присоединения последнего аминокислотного остатка удаляли N-концевую трет-бутилоксикарбонильную группировку в соответствии с протоколом деблокирования, после чего пептидил-полимер высушивали и отщепляли пептид от смолы по следующей методике: к 1 г пептидил-полимера добавляли 1,5 мл тиоанизола, перемешивали на магнитной мешалке 10 мин, затем при охлаждении 0oC приливали 10 мл трифторуксусной кислоты, перемешивали 10 мин. По каплям добавляли 1 мл трифторметансульфокислоты, снимали охлаждение и перемешивали 2 ч при комнатной температуре. Разбавляли реакционную смесь 250 мл охлажденного серного эфира и отфильтровывали осажденный на полимере пептид на фильтре Шотта. Затем смывали пептид с полимера 3 мл трифторуксусной кислоты и высаживали 250 мл серного эфира. Выпавший продукт отфильтровывали, промывали эфиром и сушили в вакууме. Затем пептид обессоливали на колонке с сефадексом G-15 (1,9 x 110 см в 50% уксусной кислоте).After the addition of the last amino acid residue, the N-terminal tert-butyloxycarbonyl moiety was removed in accordance with the deprotection protocol, after which the peptidyl polymer was dried and the peptide was cleaved from the resin according to the following procedure: 1.5 ml of thioanisole was added to 1 g of the peptidyl polymer, and stirred on magnetic the stirrer for 10 minutes; then, with cooling at 0 ° C, 10 ml of trifluoroacetic acid were poured, stirred for 10 minutes. 1 ml of trifluoromethanesulfonic acid was added dropwise, cooling was removed and stirred for 2 hours at room temperature. The reaction mixture was diluted with 250 ml of chilled sulfuric ether and the peptide deposited on the polymer was filtered on a Schott filter. Then, the peptide was washed off the polymer with 3 ml of trifluoroacetic acid and 250 ml of sulfuric ether was planted. The precipitated product was filtered off, washed with ether and dried in vacuo. The peptide was then desalted on a Sephadex G-15 column (1.9 x 110 cm in 50% acetic acid).
Предварительную очистку проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке с сефадексом SE C-25 в градиенте пиридин-ацетатного буфера. Получили 0,148 г пептида с чистотой 75% по данным высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографии. Preliminary purification was carried out using ion exchange chromatography on a column with a Sephadex SE C-25 in a gradient of pyridine acetate buffer. Received 0.148 g of the peptide with a purity of 75% according to high performance reverse phase liquid chromatography.
Окончательную очистку производили с помощью высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографии на хроматографе фирмы "Millipore - Waters" (США) в следующих условиях: колонка Delta-Pak C-18 (19 x 300 мм, 15 мкм); элюент 0,01 М трифторуксусная кислота / 22% ацетонитрил, скорость потока 15 мл/мин, детекция при 230 нм. Final purification was performed using high-performance reverse phase liquid chromatography on a Millipore-Waters chromatograph (USA) under the following conditions: Delta-Pak C-18 column (19 x 300 mm, 15 μm); eluent 0.01 M trifluoroacetic acid / 22% acetonitrile,
После очистки пептид лиофилизовали. After purification, the peptide was lyophilized.
Продукт гомогенен по данным тонкослойной хроматографии и электрофореза. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках фирмы "Merck" (Германия) в системах трет-бутиловый спирт вода уксусная кислота 4:1:1 (Rf 0,13); н-бутиловый спирт уксусная кислота пиридин вода 15:3:10:12 (Rf 0,55); этилацетат пиридин уксусная кислота вода 25:20:6:11 (Rf 0,10)
Электрофорез проводили на бумаге "Filtrak" FN-12 в 2% уксусной кислоте при напряжении 150 В в течение 30 мин. Электрофоретическая подвижность продукта относительно глицина EGly 1,7.The product is homogeneous according to thin layer chromatography and electrophoresis. Thin layer chromatography was performed on Merck plates (Germany) in tert-butyl alcohol water acetic acid 4: 1: 1 systems (R f 0.13); n-butyl alcohol acetic acid pyridine water 15: 3: 10: 12 (R f 0.55); ethyl acetate pyridine acetic acid water 25: 20: 6: 11 (R f 0.10)
Electrophoresis was carried out on Filtrak FN-12 paper in 2% acetic acid at a voltage of 150 V for 30 minutes. Electrophoretic mobility of the product relative to glycine E Gly 1.7.
Индивидуальность продукта подтверждена высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографией, его чистота составляет более 95% при выходе 0,115 г с 1 г пептидил-полимера, что соответствует 36% от теоретически рассчитанного. The individuality of the product is confirmed by high-performance reverse-phase liquid chromatography, its purity is more than 95% at the yield of 0.115 g with 1 g of peptidyl polymer, which corresponds to 36% of theoretically calculated.
Структура пептида подтверждена аминокислотным анализом на аминокислотном анализаторе T 339 M ("Microtechna", Чехословакия). Данные анализа: Gly 1,02 (1); Leu 1,00 (1); Ser 0,95 (1); Pro 3,07 (3); Tyr 1,05 (1); Phe - 1,02 (1); Lys 0,93 (1); Arg 0,93 (1). The structure of the peptide was confirmed by amino acid analysis on an amino acid analyzer T 339 M ("Microtechna", Czechoslovakia). Analysis Data: Gly 1.02 (1); Leu 1.00 (1); Ser 0.95 (1); Pro 3.07 (3); Tyr 1.05 (1); Phe - 1.02 (1); Lys 0.93 (1); Arg 0.93 (1).
По данным масс-спектрометрии пептид имеет массу 1160,6 (расчетное значение 1160,3). (Спектр снимали на времяпролетном масс-спектрометре с источником "Электроспрей" в Институте энергетических проблем химической физики). According to mass spectrometry, the peptide has a mass of 1160.6 (calculated value of 1160.3). (The spectrum was recorded on a time-of-flight mass spectrometer with an Electrospray source at the Institute of Energy Problems of Chemical Physics).
Исследование противоопухолевой активности
H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Исследование противоопухолевой активности проводилось в Институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей при Онкологическом научном центре ПАМН на крысах Aci и мышах C3H с опухолями предстательной и молочной желез соответственно. В опытных группах было 6 7 животных, в контрольных в два раза больше. Опухоли третьей генерации (предстательной железы от индуцированного метилхолантреном и тестостероном, молочной от спонтанного рака) перевивались животным под кожу правого бока. Препарат вводился подкожно в дистиллированной воде, крысам в течение 28, мышам 21 дня, в дозах 0,1; 1; 10 и 100 мкг/кг веса животного. Введение начинали через 48 ч после перевивки. Через неделю, 2, 3 и 4 недели после начала лечения опухоли измеряли по трем взаимно перпендикулярным диаметрам, вычисляли объем, находили среднюю величину, процент торможения роста опухоли вычисляли по формуле:
H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2
The study of antitumor activity was carried out at the Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors at the Cancer Research Center of the Academy of Medical Sciences on Aci rats and C 3 H mice with prostate and breast tumors, respectively. In the experimental groups there were 6 7 animals, in the control two times more. Tumors of the third generation (the prostate gland induced by methylcholanthrene and testosterone, the mammary gland from spontaneous cancer) were transplanted into the animals under the skin of the right side. The drug was administered subcutaneously in distilled water, rats for 28, mice for 21 days, in doses of 0.1; one; 10 and 100 μg / kg of animal weight. Administration was started 48 hours after inoculation. A week, 2, 3 and 4 weeks after the start of treatment, the tumors were measured by three mutually perpendicular diameters, the volume was calculated, the average value was found, the percentage of inhibition of tumor growth was calculated by the formula:
На модели рака предстательной железы был испытан коммерческий препарат "бусерилин" в дозе 100 мкг/кг. On a model of prostate cancer, the commercial drug Buserilin was tested at a dose of 100 mcg / kg.
Результаты представлены в таблице 3. The results are presented in table 3.
Протокол изучения цитотоксической активности H-Pro - D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 на культуре клеток карциномы яичников линии CaOv
Препарат H-Pro-D-Phe-Pro-Ser Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 проходил испытания в группе первичного отбора противоопухолевых препаратов НИИ экспериментальной диагностики в терапии опухолей ОНЦ РАМН. Вещество представляло собой лиофилизат, растворимый в воде.The protocol for studying the cytotoxic activity of H-Pro - D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 on a CaOv line of ovarian carcinoma cells
The drug H-Pro-D-Phe-Pro-Ser Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 was tested in the primary selection group of antitumor drugs of the Research Institute for Experimental Diagnostics in the treatment of tumors of the ONS RAMS. The substance was a water-soluble lyophilisate.
В качестве объекта исследования была использована культура опухолевых клеток карциномы яичников человека (линия CaOv). Культуру клеток выращивали на среде 199, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота, при 37oC.As an object of study, a culture of tumor cells of human ovarian carcinoma (CaOv line) was used. The cell culture was grown on medium 199 containing 10% serum of cattle, at 37 o C.
Цитотоксический эффект исследуемых соединений определяли радиометрическим методом по включению 3H-тимидина в клетки линии CaOv по стандартной методике. Вещество считалось цитотоксическим, если величина его CE50 (дозы, препятствующей включению в клетки 50% меченого тимидина по отношению к контролю) не превышала 1•10-4 М.The cytotoxic effect of the studied compounds was determined by the radiometric method according to the incorporation of 3 H-thymidine into the CaOv cell line by a standard method. A substance was considered cytotoxic if its CE 50 (dose that impeded the incorporation of 50% of labeled thymidine with respect to the control) did not exceed 1 × 10 -4 M.
Результат, представленный в таблице 2, свидетельствует, что цитотоксическая активность исследуемого препарата ниже существующего пограничного критерия. The result, presented in table 2, indicates that the cytotoxic activity of the study drug is below the existing borderline criterion.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU93026760A RU2084458C1 (en) | 1993-05-27 | 1993-05-27 | Decapeptide showing antitumor activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU93026760A RU2084458C1 (en) | 1993-05-27 | 1993-05-27 | Decapeptide showing antitumor activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU93026760A RU93026760A (en) | 1995-03-10 |
| RU2084458C1 true RU2084458C1 (en) | 1997-07-20 |
Family
ID=20141669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU93026760A RU2084458C1 (en) | 1993-05-27 | 1993-05-27 | Decapeptide showing antitumor activity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2084458C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2572623C2 (en) * | 2010-10-26 | 2016-01-20 | Мареалис Ас | Peptide |
-
1993
- 1993-05-27 RU RU93026760A patent/RU2084458C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. LH - RH and its Analogues. Basic and Clinical Aspects, ed F. Labrie, A. Belanger, A. Dupont, Exceptc Medica, Amsterdam - New Jork - Oxford (1984). 2. J. Waxman c cotp. Br. Med. J., v. 291, p. 1387, 1985. 3. D. P. Rose, B. Pruitl, Cancer Res., v. 39, p. 3968, 1979. 4. Furr B.J.A., Hutchiuson F. G. in Progress in Clinical and Biological Rescarch, v. 185 A, New - Jork, 1985. 5. T.W.Redding, D.H. Coy, H.V. Shally, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 79, p. 1273 (1982). 6 Collected Tentative Rules & Recommendations of tho Commission on Biomedical Nommenclature JUPAC - JUB, second ed. (1975) American Soc. of Biol. Chemists, Jnc. Bethesda, Maryland, USA. 7. C.Bowers, X. Shao - bo, p.-F.L. Tang, M. Kubota, B.B.R.C. v. 137, N 1, p. 709 (1986). 8. Karten, J. E. Rivier, Endocrine Rev., v. 7, N 1, p. 44 (1986). 9. V.K. Sarin, S.B.H. Kent, M. Engelhard, R.B., Merrifield, Anal. Biochem., v. 117, N 1, p. 147 (1981). 10. E. Kaiser, C. D. Bossinger, R. L. Collescott, O.B. Olsen, Analitical chimica Acfa, * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2572623C2 (en) * | 2010-10-26 | 2016-01-20 | Мареалис Ас | Peptide |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR0161972B1 (en) | Octapeptide lhrh antagonists | |
| US4024248A (en) | Peptides having LH-RH/FSH-RH activity | |
| JP2514518B2 (en) | Somatostatin-like amide derivatives of heptapeptide and octapeptide, antitumor agent containing the same | |
| KR100225679B1 (en) | Nonapeptide bombesin antagonists | |
| IE902740A1 (en) | Lhrh analogs | |
| JPH03501969A (en) | An effective antagonist of the hormone-releasing luteinizing hormone that releases negligible amounts of histamine. | |
| JPH10510261A (en) | Protein: substituted tetra- and pentapeptide inhibitors of farnesyltransferase | |
| JPH0791314B2 (en) | Nonapeptide and decapeptide analogs of LHRH useful as LHRH antagonists | |
| JPH03504013A (en) | Peptide with T cell helper activity | |
| JP3838656B2 (en) | Polypeptide Bombesin Antagonist | |
| JP3801867B2 (en) | Novel LHRH antagonists with improved dissolution properties | |
| US4128638A (en) | Nona- and deca-peptide amide derivatives demonstrating high ovulation inducing activity | |
| WO1995004540A1 (en) | N-terminus modified analogs of lhrh | |
| US4656247A (en) | Effective hormonal peptides: D-3-QA1 6-LHRH | |
| HU186877B (en) | Process for preparing new hormone antagonists releasing luteinizing hormone and acid addition salts thereof | |
| US4721775A (en) | Effective peptides related to the luteinizing hormone releasing hormone from L-amino acids | |
| JPS617297A (en) | Therapeutical lhrh analogue | |
| RU2248982C2 (en) | Lhrh antagonists, their preparing, pharmaceutical composition and its preparing, method for treatment of tumor and infertility in mammals | |
| RU2084458C1 (en) | Decapeptide showing antitumor activity | |
| SI9111779A (en) | Lhrh-antagonists. | |
| JPH0631314B2 (en) | Novel gonadobereline derivative | |
| JP2001503444A (en) | Structurally strained LH-RH analogues, their use and pharmaceutical compositions containing them | |
| US5508383A (en) | Cyclic peptide LHRH antagonists | |
| EP2198878A1 (en) | Polypeptide bombesin antagonists | |
| JP4678619B2 (en) | Method for purifying LH-RH derivatives |