RU2082982C1 - Method for solid-phase luminescent immunoanalysis of components of biological fluids - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine; immunology; microbiology; biochemistry. SUBSTANCE: immunosorbents are immobilized on inner wall of capillary in form of several reactive zones. Sample under study and reactants interact. As capillary is exposed to irradiation by radiation source, luminescent signal is generated, intensity of which is in proportion to quantity of component to be detected. After binding biological fluid components with immunosorbents, biotin-related antibodies are introduced into capillary pipe, while platinum or palladium complex of porphyrin with avidin or streptoavidin is used as luminescent reactant. Retarded luminescence of reactive zones in capillary pipe is measured with time lag between excitation sessions and luminescence registration sessions. EFFECT: amplified valid luminescence signal; greater authenticity of analytical results. 1 tbl

Description

Изобретение относится к иммунодиагностике, в частности к способам определения компонентов биологических жидкостей и может быть использовано в медицине, микробиологии, биохимии. The invention relates to immunodiagnostics, in particular to methods for determining the components of biological fluids and can be used in medicine, microbiology, biochemistry.

Известен иммуноферментный способ определения множества компонентов биологических жидкостей с использованием капиллярной трубки (пат. США N 4690907, МКИ 436-514). Сущность способа заключается в том, что в капиллярной трубке создают несколько реактивных зон-сегментов твердофазного носителя (пористой матрицы), на которых иммобилизованы различные антигены или антитела, способные связываться в иммунный комплекс с антителами или антигенами, присутствующими в контролируемой жидкости. Пористая матрица может быть выполнена в виде зерен, частичек волокон и т.п. Реактивные зоны разделены пористыми нереактивными зонами, при этом первый и последний сегменты выполнены также нереактивными и играют роль уплотнителей. Образец исследуемой жидкости и флуорогенный субстрат подаются в капиллярную трубку под действием капиллярных сил, и при наличии в исследуемой жидкости искомых компонентов образуется иммунный комплекс, при этом каждая реактивная зона окрашивается в определенный цвет. Known enzyme immunoassay method for determining many components of biological fluids using a capillary tube (US Pat. US N 4690907, MKI 436-514). The essence of the method lies in the fact that several reactive zones-segments of a solid-phase carrier (porous matrix) are created in a capillary tube, on which various antigens or antibodies are able to bind to the immune complex with antibodies or antigens present in a controlled fluid. The porous matrix can be made in the form of grains, particles of fibers, etc. Reactive zones are separated by porous non-reactive zones, while the first and last segments are also non-reactive and play the role of sealants. A sample of the test fluid and fluorogenic substrate are fed into the capillary tube under the action of capillary forces, and in the presence of the desired components in the test fluid, an immune complex is formed, with each reactive zone being colored in a certain color.

Длительность подготовки пористых носителей к анализу, необходимость соблюдения определенных условий для хранения их приводят к усложнению способа. В связи с тем, что иммуноферментная реакция происходит в жидкости, при работе с капиллярами, заполненными пористым носителем, необходимо соблюдать осторожность, т.к. встряхивание приводит к миграции вещества с одного сегмента на другой, смешению цветов, что снижает достоверность результатов анализа, а использование в качестве флуоресцентной метки флуоресцеин изотиоцианата позволяет измерять только короткоживущую флуоресценцию; при этом уменьшается чувствительность измерений из-за наличия фоновой люминесценции гетерологичных примесей. The duration of the preparation of porous media for analysis, the need to comply with certain conditions for their storage lead to a complication of the method. Due to the fact that the enzyme-linked immunosorbent reaction occurs in a liquid, care must be taken when working with capillaries filled with a porous carrier. shaking leads to the migration of the substance from one segment to another, to the mixing of colors, which reduces the reliability of the analysis results, and the use of fluorescein isothiocyanate as a fluorescent label allows only short-lived fluorescence to be measured; this decreases the measurement sensitivity due to the presence of background luminescence of heterologous impurities.

Известен способ одновременного анализа нескольких аналитов в потоке жидкого образца с использованием капиллярной трубки, заполненной серией реактивных сегментов, каждый из которых имеет антигены или антитела, иммобилизованные на его поверхности (заявка PCT N 89/00290, кл. G 01 N 33/543). Реактивные сегменты разделены водонерастворимыми нереактивными сегментами. При осуществлении способа капиллярную трубку с помощью шприца, присоединенного у одному из ее концов, наполняют исследуемым образцом, после отмывки наполняют вторичным иммунореагентом, способным реагировать с одним из компонентов комплекса, образовавшегося на поверхности твердофазного носителя (реактивного сегмента), удаляют несвязавшийся вторичный иммунореагент из капиллярной трубки. После осуществления иммунологической реакции связавшийся с твердофазным носителем компонент исследуемой биологической жидкости детектируют облучением капилляра и измерением люминесценции (флуоресценции) от каждого сегмента отдельно. Качественный анализ осуществляют визуально, количественный с использованием измерительной аппаратуры. Из-за большой внутренней поверхности в капиллярной трубке по отношению к объему и за счет малых расстояний происходит быстрое молекулярное взаимодействие аналита и реагента, что приводит к ускорению способа и уменьшению объема реагентов и аналита, требуемых для исследования. Способ позволяет использовать множество субстратов для определения множества компонентов биологических жидкостей. A known method for the simultaneous analysis of several analytes in a liquid sample stream using a capillary tube filled with a series of reactive segments, each of which has antigens or antibodies immobilized on its surface (PCT application N 89/00290, class G 01 N 33/543). Reactive segments are separated by water-insoluble non-reactive segments. When implementing the method, the capillary tube is filled with the test sample using a syringe attached at one of its ends, after washing, it is filled with a secondary immunoreagent capable of reacting with one of the components of the complex formed on the surface of the solid-phase carrier (reactive segment), and the unbound secondary immunoreagent is removed from the capillary tube. After the implementation of the immunological reaction, the component of the studied biological fluid bound to the solid phase carrier is detected by irradiating the capillary and measuring luminescence (fluorescence) from each segment separately. Qualitative analysis is carried out visually, quantitatively using measuring equipment. Due to the large internal surface in the capillary tube with respect to the volume and due to small distances, a quick molecular interaction of the analyte and reagent occurs, which leads to an acceleration of the method and a decrease in the volume of reagents and analyte required for the study. The method allows the use of many substrates to determine the many components of biological fluids.

Однако, использование субстратных смесей, содержащих ферментные метки, требует разделения реактивных сегментов нереактивными, осторожной работы с капиллярной трубкой (без встряхивания), чтобы предотвратить перетекание продуктов реакции с одного реактивного сегмента на другой. Несоблюдение этих условий приводит к недостоверности результатов анализа, а введение нереактивных сегментов к увеличению габаритов капиллярной трубки и усложнению способа. However, the use of substrate mixtures containing enzyme labels requires separation of the reactive segments by non-reactive ones, careful handling of the capillary tube (without shaking) to prevent the reaction products from flowing from one reactive segment to another. Failure to comply with these conditions leads to unreliability of the analysis results, and the introduction of non-reactive segments to increase the size of the capillary tube and the complexity of the method.

Известен способ твердофазного фосфоресцентного иммуноанализа биологических жидкостей (авт.св. СССР N 1679382, кл. G 01 N 33/533). Сущность способа заключается в том, что для анализа пробы, содержащей два аналита одновременно, используется комбинированный иммуносорбент, содержащий антитела к двум антигенам. Антигены связывают с антителами, сенсибилизированными на твердом носителе, отмывают для удаления непрореагировавших компонентов и вносят смесь двух антител, меченных двумя разными металлопорфиринами (комбинированный иммуносорбент). Интенсивность фосфоресценции каждого металлопорфирина (определение антигенов) измеряют путем последовательной смены длин волн возбуждения и/или регистрации. A known method of solid-phase phosphorescence immunoassay of biological fluids (ed. St. USSR N 1679382, CL G 01 N 33/533). The essence of the method lies in the fact that for the analysis of a sample containing two analytes at the same time, a combined immunosorbent containing antibodies to two antigens is used. Antigens are bound to antibodies sensitized on a solid support, washed to remove unreacted components, and a mixture of two antibodies labeled with two different metalloporphyrins is introduced (combined immunosorbent). The phosphorescence intensity of each metalloporphyrin (determination of antigens) is measured by successively changing the excitation and / or recording wavelengths.

Недостатком способа является заметное перекрытие спектральных характеристик металлопорфиринов, которое удается снять лишь частично за счет различного временного режима регистрации, что затрудняет выделение одного антигена в присутствии другого. Кроме того, для определения каждого антигена используется определенный металлопорфирин, что не дает возможности определять несколько компонентов пробы одновременно. The disadvantage of this method is a noticeable overlap in the spectral characteristics of metalloporphyrins, which can only be partially removed due to the different time registration regime, which makes it difficult to isolate one antigen in the presence of another. In addition, a specific metalloporphyrin is used to determine each antigen, which makes it impossible to determine several components of the sample at the same time.

Наиболее близким является способ множественного иммуноферментного анализа (пат США N 4806313, кл. МКИ 422-61). Сущность способа заключается в том, что на внутреннюю поверхность капилляра наносят несколько зон различных антигенов или антител. После отмывки для лучшего связывания с иммуносорбентами исследуемый образец биологической жидкости пропускают через капилляр несколько раз с использованием попеременного воздействия вакуума-давления. Затем пропускают промывочную жидкость для удаления несвязавшегося образца и после этого через капилляр пропускают флуорогенный субстрат. В способе используются ферментные метки, меченные различными флуоресцентными веществами. Подача исследуемого образца, конъюгата, флуорогенного субстрата и промывочной жидкости осуществляется циклически, несколько раз для лучшего использования небольшого количества реагентов образца. Использование капиллярной трубки в качестве твердофазного носителя позволяет использовать максимальное количество аналита, т.к. расстояние молекулярной диффузии мало. В качестве связывающих реагентов используют моно- и поликлональные антитела. The closest is the method of multiple enzyme immunoassay (US Pat. N 4,063,313, CL MKI 422-61). The essence of the method lies in the fact that several zones of various antigens or antibodies are applied to the inner surface of the capillary. After washing, for better binding to immunosorbents, the test sample of biological fluid is passed through the capillary several times using alternating exposure to vacuum-pressure. Wash liquid is then passed to remove an unbound sample, and then a fluorogenic substrate is passed through the capillary. The method uses enzyme labels labeled with various fluorescent substances. The test sample, conjugate, fluorogenic substrate and wash liquid are supplied cyclically several times to better use a small amount of sample reagents. The use of a capillary tube as a solid-phase carrier allows the use of the maximum amount of analyte, because the distance of molecular diffusion is small. Mono- and polyclonal antibodies are used as binding reagents.

Однако, не все ферментные метки, используемые при осуществлении способа, устойчивы к длительному хранению, что усложняет способ из-за необходимости следить за их состоянием. However, not all enzyme labels used in the implementation of the method are resistant to long-term storage, which complicates the method due to the need to monitor their condition.

Кроме того, при анализе гетерологичных систем и наличии флуоресцирующих примесей уменьшается соотношение сигнал/шум, что снижает чувствительность способа, а из-за того, что иммуноферментная реакция осуществляется в жидкости, существует угроза размывания реактивных зон, что приводит к недостоверности результатов анализа, а быстродействие способа ограничено необходимостью времени наработки из-за использования ферментной метки. In addition, when analyzing heterologous systems and the presence of fluorescent impurities, the signal-to-noise ratio decreases, which reduces the sensitivity of the method, and because the enzyme-linked immunosorbent reaction is carried out in a liquid, there is a risk of erosion of the reaction zones, which leads to unreliable analysis results, and the speed method is limited by the need for operating time due to the use of the enzyme label.

Решаемой задачей является создание способа твердофазного люминесцентного иммуноанализа малых количеств сложных (многокомпонентных) биологических жидкостей, в котором в качестве твердой фазы используется внутренняя поверхность капиллярной трубки, на которой иммобилизованы антитела в виде реактивных зон. При этом необходимо добиться увеличения полезного сигнала за счет увеличения соотношения сигнал/шум и повышения достоверности результатов анализа. The problem to be solved is the creation of a method of solid-phase luminescent immunoassay of small amounts of complex (multicomponent) biological fluids, in which the inner surface of the capillary tube is used as a solid phase, on which antibodies in the form of reactive zones are immobilized. In this case, it is necessary to increase the useful signal by increasing the signal-to-noise ratio and increasing the reliability of the analysis results.

Предлагается изобретение, решающее указанную задачу и устраняющее недостатки прототипа. An invention is proposed that solves this problem and eliminates the disadvantages of the prototype.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе твердофазного люминесцентного иммуноанализа множества компонентов биологической жидкости, включающем взаимодействие иммобилизованных на внутренней стенке капиллярной трубки в виде нескольких реактивных зон иммуносорбентов, исследуемого образца и реагента, определение наличия искомых компонентов биологической жидкости по световому сигналу от зон, возникающему при облучении капиллярной трубки источником излучения, после связывания компонентов исследуемой биологической жидкости с иммуносорбентами реактивных зон в капиллярную трубку вводят антитела, ковалентно связанные с биотином, а в качестве люминесцентного реагента используют Pt или Pd комплекс копропорфирина с авидином или стрептоавидином и измеряют замедленную люминесценцию реактивных зон капиллярной трубки с задержкой во времени между актами возбуждения и регистрации люминесценции. The essence of the invention lies in the fact that in the method of solid-phase luminescent immunoassay of many components of the biological fluid, including the interaction of immunosorbents immobilized on the inner wall of the capillary tube in the form of several reactive zones, the test sample and reagent, determining the presence of the desired components of the biological fluid by the light signal from the zones arising when the capillary tube is irradiated with a radiation source, after binding of the components of the studied biological fluid Antibodies covalently bound to biotin are introduced into the capillary tube with immunosorbents of the reactive zones, and a Pt or Pd complex of coproporphyrin with avidin or streptoavidin is used as a luminescent reagent, and the delayed luminescence of the reactive zones of the capillary tube is measured with a time delay between excitation and luminescence recordings.

Изобретение является новым, т.к. использование в качестве реагентов антител, меченных биотином, и Pt или Pd копропорфирина с авидином или стрептоавидином позволяет иммунный анализ на поверхности твердофазного носителя, что исключает размывание реактивных зон, перетекание реагентов с одной зоны на другую, что в свою очередь, повышает достоверность анализа. Измерение замедленной люминесценции реактивных зон с задержкой во времени между актами возбуждения и регистрации люминесценции позволяет увеличить отношение сигнал/шум за счет исключения флуоресценции гетерологичных примесей и измерительного оборудования, что приводит к повышению чувствительности анализа. Кроме того, использование одного универсального люминесцентного реагента для определения множества компонентов биологической жидкости, отсутствие необходимости хранения ферментных меток упрощают и удешевляют способ. The invention is new, because the use of biotin-labeled antibodies and Pt or Pd coproporphyrin with avidin or streptoavidin as reagents allows immune analysis on the surface of a solid-phase carrier, which eliminates the erosion of reactive zones and the flow of reagents from one zone to another, which in turn increases the reliability of the analysis. Measurement of delayed luminescence of reactive zones with a time delay between the acts of excitation and registration of luminescence makes it possible to increase the signal-to-noise ratio by eliminating the fluorescence of heterologous impurities and measuring equipment, which leads to an increase in the sensitivity of analysis. In addition, the use of one universal luminescent reagent to determine the many components of the biological fluid, the lack of the need for storage of enzyme labels simplify and reduce the cost of the method.

Изобретение имеет изобретательский уровень, т.к. авторам не известен люминесцентный способ одновременного определения множества компонентов биологической жидкости с заявляемой совокупностью признаков. The invention has an inventive step, because the authors are not aware of the luminescent method for the simultaneous determination of many components of biological fluid with the claimed combination of features.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Исследуемый образец с помощью перистальтического насоса со скоростью подачи 0,5-1 мл/мин пропускают через капиллярную трубку. Для лучшего связывания небольшого количества компонентов исследуемого образца с антителами, иммобилизованными на стенках капиллярной трубки, образец прокачивают через капиллярную трубку несколько раз. Отмывают капиллярную трубку для удаления несвязавшегося образца, пропуская через капиллярную трубку буфер анализа (изотоничный раствор 0,85% NaCl, бычий сывороточный альбумин (БСА) 1% и 0,1М карбонат бикарбонатный буфер (pH 7,4) и сульфит натрия в концентрации 2 мг/мл). Пропускают через капиллярную трубку несколько раз раствор антител, меченных биотином, отмывают трубку для удаления несвязавшихся антител, затем пропускают люминесцентный реагент Pt или Pd комплекс порфирина в авидином или стрептоавидином, отмывают от избытка несвязавшегося люминесцентного реагента буфером анализа, облучают стенки капиллярной трубки источником излучения и измеряют длительную люминесценцию прореагировавших зон с задержкой во времени между актами возбуждения и измерения люминесценции. О количестве искомых компонентов биологической жидкости судят по интенсивности люминесценции реактивных зон. The test sample with a peristaltic pump with a feed rate of 0.5-1 ml / min is passed through a capillary tube. For better binding of a small number of components of the test sample to antibodies immobilized on the walls of the capillary tube, the sample is pumped through the capillary tube several times. Wash the capillary tube to remove unbound sample by passing the assay buffer (isotonic solution of 0.85% NaCl, 1% bovine serum albumin (BSA) and 0.1 M carbonate bicarbonate buffer (pH 7.4) and sodium sulfite at a concentration of 2 through the capillary tube) mg / ml). A solution of antibodies labeled with biotin is passed through the capillary tube several times, the tube is washed to remove unbound antibodies, then the Pt or Pd luminescent reagent in avidin or streptoavidin is passed, the excess of the unbound luminescent reagent is washed off with an analysis buffer, the walls of the capillary tube are irradiated and the capillary tube is irradiated with a source of radiation long luminescence of the reacted zones with a time delay between the events of excitation and measurement of luminescence. The amount of the required components of the biological fluid is judged by the intensity of the luminescence of the reaction zones.

Пример 1. Приготовление капиллярной трубки для анализа. Example 1. Preparation of a capillary tube for analysis.

Для приготовления капиллярной трубки с реактивными зонами сенсибилизированных на ее внутренней поверхности антител используют поликлональные кроличьи антитела и/или моноклональные мышиные антитела к различным возбудителям заболеваний: сыпного тифа (R. Prowazekii), туляремии (Fr. tularensis), бруцелеза (Br. abortus), вируса венесуэльского энцефаломиэлита лошадей (ВЭЛ-V. equins encephalitis) и осповакцины (Vaccinia virus). To prepare a capillary tube with reactive zones of antibodies sensitized on its inner surface, polyclonal rabbit antibodies and / or monoclonal mouse antibodies to various pathogens are used: typhus (R. Prowazekii), tularemia (Fr. tularensis), brucellosis (Br. Abortus), horse venezuelan encephalomyelitis virus (VEL-V. equins encephalitis) and smallpox vaccines (Vaccinia virus).

Капиллярную трубку составляют из фрагментов капилляров, на внутренних стенках которых сенсибилизированы определенные антитела. Фрагмент капилляра из полистирола длиной 10 мм и внутренним диаметром 1 мм заполняют раствором одного из антител в концентрации 20 мкг/мл и оставляют на сенсибилизацию в течение 12 часов при комнатной температуре. После этого капилляр промывают буфером анализа в объеме не менее десяти объемов капилляра и заполняют блокировочным раствором, содержащим изотонический раствор NaCl (0,85%) в 0,1М карбонат бикарбонатном буфере с 1% БСА ("Serva" ФРГ). Блокировочным раствором также заполняют контрольный фрагмент капилляра, свободный от антител. После двухчасовой инкубации при температуре 37^oC капилляры промывают дистиллированной водой, объемом, превышающим объем капилляра в пять раз, и подсушивают при комнатной температуре в течение двух часов. После этого отдельные фрагменты капилляров, сенсибилизированные антителами к различным возбудителям заболеваний, и контрольный фрагмент капилляра объединяют в единую капиллярную трубку с помощью хлорвиниловых трубчатых сегментов. Подготовленные таким образом капиллярные трубки хранят в холодильнике при температуре 2-8^oC в полиэтиленовой упаковке до шести месяцев.The capillary tube is made up of fragments of capillaries, on the inner walls of which certain antibodies are sensitized. A fragment of a polystyrene capillary with a length of 10 mm and an inner diameter of 1 mm was filled with a solution of one of the antibodies at a concentration of 20 μg / ml and left for sensitization for 12 hours at room temperature. After that, the capillary is washed with an analysis buffer in a volume of at least ten volumes of the capillary and filled with a blocking solution containing an isotonic solution of NaCl (0.85%) in 0.1 M carbonate bicarbonate buffer with 1% BSA ("Serva" Germany). Blocking solution also fill the control fragment of the capillary, free of antibodies. After two hours of incubation at a temperature of 37 ^o C, the capillaries are washed with distilled water, a volume exceeding the volume of the capillary five times, and dried at room temperature for two hours. After that, individual fragments of capillaries sensitized by antibodies to various pathogens and the control fragment of the capillary are combined into a single capillary tube using vinyl chloride tubular segments. Thus prepared capillary tubes are stored in a refrigerator at a temperature of 2-8 ^o C in a plastic bag for up to six months.

Пример 2. Определение R. Prowazekii, Fr. tularensis и Br.abortus методом люминесцентного иммуноанализа. Example 2. Definition of R. Prowazekii, Fr. tularensis and Br.abortus by luminescence immunoassay.

В капиллярную трубку, сенсибилизированную антителами к возбудителям R. Prowazekii, Fr. tularensis, Br. abortus, Vaccinia virus и V. equins encephalitis вносят пробу мочи человека, содержащую 3•10⁴ микробных тел в 1 мл R. Prowazekii, 3•10⁴м. т./мл Fr. tularensis и 3•10⁴ м.т./мл Br. abortus. Пробу готовят из коммерческих препаратов: диагностикума туляремийного жидкого для объемной кровяно-капельной реакции агглютинации ВФС-42-63 (предприятие по производству бакпрепаратов, г.Одесса), диагностикума риккетсий Провачека корпускулярный сухой для реакции агглютинации ФС-42-5 (производство НИИЭМ им. Гамалеи, г.Москва), вакцины бруцеллезной сухой ВФС-42-111 (производство Омского НИИ ВС).Into a capillary tube sensitized by antibodies to pathogens R. Prowazekii, Fr. tularensis, Br. abortus, Vaccinia virus and V. equins encephalitis contribute a human urine sample containing 3 • 10 ⁴ microbial bodies in 1 ml of R. Prowazekii, 3 • 10 ⁴ mt / ml Fr. tularensis and 3 • 10 ⁴ mt / ml Br. abortus. The sample is prepared from commercial preparations: a tularemia liquid diagnosticum for a volumetric blood-drop agglutination test VFS-42-63 (a company for the production of bacterial preparations, Odessa), a rickettsium diagnostic test Provacheka dry corpuscular for an agglutination reaction FS-42-5 (manufactured by NIIEM them. Gamalei, Moscow), dry brucellosis vaccine VFS-42-111 (production of the Omsk Research Institute of Armed Forces).

Пробу объемом 1 мл прокачивают со скоростью 0,5 мл/мин через капиллярную трубку с помощью перистальтического насоса по замкнутому контуру в течение 15 мин. Затем вносят в трубку смесь из коньюгатов биотина (коммерческий препарат) с моно- и поликлональными антителами к возбудителям R. Prowazekii, Fr. tularensis и Br. abortus. Коньюгаты биотина с антителами готовят в соответствии с методикой, описанной в J. Immunological methods, 1992, v.140, p.247-253 и вносят в смеси в концентрации 0,5 мкг/мл каждый. A 1 ml sample is pumped at a rate of 0.5 ml / min through a capillary tube using a peristaltic pump in a closed loop for 15 minutes. Then a mixture of biotin conjugates (commercial preparation) with mono- and polyclonal antibodies to the pathogens R. Prowazekii, Fr. is introduced into the tube. tularensis and Br. abortus. Biotin antibody conjugates are prepared in accordance with the procedure described in J. Immunological methods, 1992, v.140, p.247-253 and each is added to the mixture at a concentration of 0.5 μg / ml.

После инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре несвязавшуюся смесь коньюгатов удаляют промывкой буфером анализа в объеме, эквивалентном пяти объемам капиллярной трубки, а затем в концентрации 0,1 мкг/мл вносят раствор люминесцентного метчика коньюгата Pt копропорфирина тетракислоты с авидином (ТУ 64-16-57-90). After an incubation of 15 minutes at room temperature, the unbound conjugate mixture is removed by washing with an assay buffer in an amount equivalent to five volumes of a capillary tube, and then at a concentration of 0.1 μg / ml a solution of a luminescent tap conjugate Pt coproporphyrin tetraacid with avidin is added (TU 64-16 -57-90).

Коньюгаты Pt копропорфирина с авидином предварительно готовят по методике получения коньюгатов копропорфирина с белками с помощью карбодиимидов (см. ЕР N 0071991 и N 0127797) и хранят в виде водного раствора с 50% глицерина в концентрации 100 мкг/мл. Раствор люминесцентного метчика инкубируют в капиллярной трубке в течение 15 мин и удаляют промывкой буфером анализа в объеме, равном десятикратному объему капиллярной трубки. Conjugates of Pt coproporphyrin with avidin are preliminarily prepared according to the method for producing conjugates of coproporphyrin with proteins using carbodiimides (see EP N 0071991 and N 0127797) and stored in an aqueous solution with 50% glycerol at a concentration of 100 μg / ml. The luminescent tap solution was incubated in the capillary tube for 15 minutes and removed by washing with the assay buffer in an amount equal to ten times the volume of the capillary tube.

После окончания реакции капиллярную трубку помещают в регистратор длительной люминесценции (Arcus 1232, Финляндия или ИФИ-01, ГосНИИ БП), облучают светом с длиной волны в максимуме поглощения Pt копропорфирина (381 нм) и регистрируют уровень длительной люминесценции на длине волны 645 нм. При этом возбуждение и регистрацию люминесценции осуществляют в стробоскопическом режиме с разнесением во времени между актами возбуждения и регистрации люминесценции 50 мкс и длительностью строба 100 мкс. Фиксируют уровень сигнала в каждой из пяти зон. After the reaction, the capillary tube is placed in a long-term luminescence recorder (Arcus 1232, Finland or IFI-01, GosNII BP), irradiated with light with a wavelength at the absorption maximum of Pt coproporphyrin (381 nm), and the level of long-term luminescence at a wavelength of 645 nm is recorded. In this case, the excitation and registration of luminescence is carried out in a stroboscopic mode with a time spacing between the acts of excitation and registration of luminescence of 50 μs and a strobe duration of 100 μs. The signal level in each of the five zones is recorded.

Результаты измерений приведены в таблице. The measurement results are shown in the table.

Пример 3. Определение V. equin encephalitis и Vaccinia virus. Example 3. Definition of V. equin encephalitis and Vaccinia virus.

В капиллярную трубку, приготовленную в соответствии с примером 1, вносят анализируемую пробу мочи человека, содержащую вирус осповакцины (V. Vaccinia) в концентрации 10⁴ 00Е/мл (оспо-образующих единиц) и вируса венесуэльского энцефалита (V. equin encephalitis) в концентрации, эквивалентной 2•10⁴ БОЕ/мл (бляшко-образующихся единиц). Для приготовления анализируемой пробы используют диагностикум ВЭЛ культурный концентрированный сухой для РТТА (производство Свердловского НИИ ВС).In a capillary tube prepared in accordance with Example 1, a test sample of human urine is added containing the vaccinia virus (V. Vaccinia) at a concentration of 10 ⁴ 00E / ml (smallpox-forming units) and the Venezuelan encephalitis virus (V. equin encephalitis) at a concentration equivalent to 2 • 10 ⁴ PFU / ml (plaque-forming units). For the preparation of the analyzed samples, the VEL diagnostic concentrated dry culture for RTTA is used (production of the Sverdlovsk Research Institute of Armed Forces).

Эксперимент проводят так же, как описано в примере 2. Данные эксперимента приведены в таблице. The experiment is carried out as described in example 2. The experimental data are shown in the table.

Пример 4. Определение Vaccinia virus и Fr. tularensis. Example 4. The definition of Vaccinia virus and Fr. tularensis.

В капиллярную трубку, приготовленную в соответствии с примером 1, вносят анализируемую пробу мочи человека, содержащую вирус осповакцины в концентрации 10⁵ 00Е/мл и возбудитель туляремии в концентрации 3•10⁵ м.т./мл.An assayed human urine sample containing vaccinia virus at a concentration of 10 ⁵ 00U / ml and a tularemia pathogen at a concentration of 3 • 10 ⁵ mt / ml is introduced into a capillary tube prepared in accordance with Example 1.

Эксперимент проводят так же, как описано в примере 2. Данные эксперимента приведены в таблице. The experiment is carried out as described in example 2. The experimental data are shown in the table.

Пример 5. Определение Vaccinia virus и Fr. tularensis. Example 5. The definition of Vaccinia virus and Fr. tularensis.

В капиллярную трубку, приготовленную в соответствии с примером 1, вносят анализируемую пробу мочи человека, содержащую вирус осповакцины в концентрации 10⁶ 00Е/мл, и возбудитель туляремии в концентрации 3•10⁶ м.т./мл.An assayed human urine sample containing vaccinia virus at a concentration of 10 ⁶ 00 U / ml and a tularemia pathogen at a concentration of 3 • 10 ⁶ mt / ml are introduced into a capillary tube prepared in accordance with Example 1.

Эксперимент проводят так же, как описано в примере 2. Данные эксперимента приведены в таблице. The experiment is carried out as described in example 2. The experimental data are shown in the table.

Пример 6. Определение Vaccinia virus и Fr. tularensis. Example 6. The definition of Vaccinia virus and Fr. tularensis.

В капиллярную трубку, приготовленную в соответствии с примером 1, вносят анализируемую пробу мочи человека, содержащую вирус осповакцины в концентрации 10⁵ 00Е/мл, и возбудитель туляремии в концентрации 3•10⁵ м.т./мл. Эксперимент проводят так же, как описано в примере 2, только в качестве люминесцентного метчика используют коньюгат Pt копропорфирина со стрептоавидином в той же концентрации, что и в примере 2, приготовленный по той же методике.An assayed human urine sample containing vaccinia virus at a concentration of 10 ⁵ 00U / ml and a tularemia pathogen at a concentration of 3 • 10 ⁵ mt / ml are introduced into a capillary tube prepared in accordance with Example 1. The experiment is carried out in the same manner as described in example 2, only conjugate Pt of coproporphyrin with streptoavidin in the same concentration as in example 2, prepared according to the same procedure, is used as a luminescent tap.

Результаты анализа приведены в таблице. The results of the analysis are given in the table.

Пример 7. Определение Fr. tularensis и Vaccinia virus. Example 7. The definition of Fr. tularensis and Vaccinia virus.

Эксперимент проводят так же, как описано в примерах 2, 6, только в качестве люминесцентного метчика используют конъюгат Pd копропорфирина со стрептоавидином в той же концентрации и приготовленный по аналогичной методике. При этом длительную люминесценцию измеряют на длине волны 665 нм при возбуждении на длине волны 392 нм с задержкой во времени 300 мкс и длительностью строба 600 мкс. The experiment is carried out in the same way as described in examples 2, 6, only as a luminescent tap, conjugate Pd of coproporphyrin with streptavidin at the same concentration and prepared according to a similar method is used. In this case, long-term luminescence is measured at a wavelength of 665 nm when excited at a wavelength of 392 nm with a time delay of 300 μs and a strobe duration of 600 μs.

Результаты измерений сведены в таблице. The measurement results are summarized in the table.

Пример 8. Определение Vaccinia Virus и Fr. tularensis. Example 8. The definition of Vaccinia Virus and Fr. tularensis.

Эксперимент проводят аналогично примерам 2, 7, только в качестве люминесцентной метки используют конъюгат Pd копропорфирина с авидином в той же концентрации, приготовленный по аналогичной методике. The experiment is carried out analogously to examples 2, 7, only conjugate Pd of coproporphyrin with avidin at the same concentration prepared according to a similar method is used as a luminescent label.

Результаты измерений приведены в таблице. The measurement results are shown in the table.

Пример 9. Определение Fr. tularensis и R. Prowazekii. Example 9. The definition of Fr. tularensis and R. Prowazekii.

Эксперимент осуществляют так же, как описано в примере 2, только в качестве исследуемого образца используют пробу сыворотки крови человека, содержащую бактериальные и риккетсиозные антигены. The experiment is carried out in the same manner as described in example 2, only as a test sample, a human blood serum sample containing bacterial and rickettsial antigens is used.

Результаты экспериментов приведены в таблице. The experimental results are shown in the table.

Как видно из примера 2 (столбец 3 табл.) в пробах, содержащих возбудители Fr. tularensis, Br. abortus и R. Prowazekii, уровень сигнала реакционных зон, сенсибилизированных к присутствующим в пробе возбудителям, превышает уровень сигнала контрольной зоны (пороговый сигнал от фрагмента капилляра, не содержащего специфических антител, увеличенный на 6σ, в то время как уровень сигнала от реакционных зон, сенсибилизированных к другим возбудителям, отсутствующим в пробе (вирус осповакцины, ВЭЛ), не превышает уровень сигнала контрольной зоны. As can be seen from example 2 (column 3 of the table) in samples containing pathogens Fr. tularensis, Br. abortus and R. Prowazekii, the signal level of the reaction zones sensitized to the pathogens present in the sample exceeds the signal level of the control zone (the threshold signal from the capillary fragment containing no specific antibodies increased by 6σ, while the signal level from the reaction zones sensitized to other pathogens absent in the sample (vaccinia virus, VEL), does not exceed the signal level of the control zone.

Аналогичные выводы можно сделать из примера 3 (столбец 4 табл.)
Из примеров 2, 4, 5 (столбцы 4, 5, 6 табл.) видно, что повышение концентрации искомых антигенов в пробе в 10 и 100 раз (примеры 4 и 5 соответственно) приводит к эквивалентному увеличению сигнала от реакционных зон.Similar conclusions can be drawn from example 3 (column 4 of the table)
From examples 2, 4, 5 (columns 4, 5, 6 of the table), it is seen that an increase in the concentration of the desired antigens in the sample by 10 and 100 times (examples 4 and 5, respectively) leads to an equivalent increase in the signal from the reaction zones.

Аналогичные результаты получены при использовании конъюгатов Pt копропорфирина со стрептоавидином (примеры 6, 7, 8 столбцы 7, 8, 9 табл.) и Pd копропорфирина с авидином и стрептоавидином (пример 9 столбец 10 табл.)
Предлагаемый способ, в котором в качестве первого реагента использованы антитела, меченные биотином, а в качестве второго реагента конъюгаты Pt или Pd копропорфирина с авидином или стрептоавидином, позволяющие разнести во времени акты возбуждения и регистрации люминесценции, обеспечивает одновременное определение различных компонентов биологических жидкостей при уменьшении влияния фоновой люминесценции измерительного оборудования и примесей на величину полезного сигнала, что позволяет получить высокий уровень чувствительности, достоверности анализа и широкий динамический диапазон анализируемых концентраций.Similar results were obtained using conjugates of Pt coproporphyrin with streptavidin (examples 6, 7, 8 columns 7, 8, 9 of the table) and Pd coproporphyrin with avidin and streptavidin (example 9, column 10 of the table)
The proposed method, in which antibodies labeled with biotin are used as the first reagent, and coproporphyrin Pt or Pd conjugates with avidin or streptoavidin, which allow to separate the acts of excitation and registration of luminescence in time, allows the simultaneous determination of various components of biological fluids while reducing the effect background luminescence of measuring equipment and impurities by the value of the useful signal, which allows to obtain a high level of sensitivity, analysis characteristics and a wide dynamic range of the analyzed concentrations.

Для проведения анализа используется стандартное оборудование и химические вещества, выпускаемые отечественной промышленностью. For the analysis, standard equipment and chemicals produced by domestic industry are used.

Способ может быть использован при медицинских, ветеринарных и других клинических анализах образцов биологических жидкостей, при поиске возбудителей вирусной, бактериальной и риккетсиозной природы и других белковых веществ в пробах, отобранных из внешних источников. The method can be used in medical, veterinary and other clinical analyzes of samples of biological fluids, in the search for pathogens of viral, bacterial and rickettsial nature and other protein substances in samples taken from external sources.

Claims (1)

Способ твердофазного люминесцентного иммуноанализа компонентов биологических жидкостей, включающий взаимодействие иммобилизованных на внутренней стенке капиллярной трубки в виде нескольких реактивных зон иммуносорбентов, исследуемого образца и реагентов, определение наличия искомых компонентов биологической жидкости по световому сигналу от реактивных зон, возникающему при облучении капиллярной трубки источником излучения, отличающийся тем, что после связывания компонентов биологической жидкости с иммуносорбентами реактивных зон в капиллярную трубку вводят антитела, ковалентно связанные с биотипом, а в качестве люминесцентного реагента используют Pt- или Pd-комплекс копропорфирина с авидином или стрептоавидином и изменяют замедленную люминесценцию реактивных зон капиллярной трубки с задержкой во времени между актами возбуждения и регистрации люминесценции. The method of solid-phase luminescent immunoassay of components of biological fluids, including the interaction of immunosorbents reactive zones immobilized on the inner wall of the capillary tube, the test sample and reagents, determining the presence of the desired biological fluid components from the light signal from the reactive zones that occurs when the capillary tube is irradiated with a radiation source, different the fact that after binding the components of the biological fluid with reactive immunosorbents it is introduced into the capillary tube antibody covalently linked to biotype, and as luminescent reagent used Pt- or Pd-coproporphyrin complex with avidin or Streptoavidin delayed luminescence and changing the reactive zones of the capillary tube with a delay in time between the acts of excitation and luminescence.

Images