RU2066995C1 - Method of preparing preparation stimulating cellular respiration - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine, biochemistry. SUBSTANCE: method involves enzymatic hydrolysis of defibrinized calf blood followed by isolation of the end product by ultrafiltration, concentration and sterilizing filtration. Enzymatic hydrolysis is carried out using bacterial endoprotease, enzyme inactivation is carried out by reaction mixture heating to 80-98 C and inert material at molecular mass above 5000-8000 Da is removed by step-by-step micro- and ultrafiltration. EFFECT: improved method of preparing.

Description

Изобретение относится к медицине и касается способа получения отечественного препарата, стимулирующего клеточное дыхание. Препараты аналогичного действия в СНГ не производятся, а импортируются из-за рубежа (солкосерил из Швейцарии, актовегин из Австрии). The invention relates to medicine and relates to a method for producing a domestic preparation stimulating cell respiration. Preparations of a similar effect are not produced in the CIS, but are imported from abroad (solcoseryl from Switzerland, Actovegin from Austria).

Известен способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание [1] Способ включает дефибринирование и гемолиз телячьей крови с последующим отделением веществ с мол.м. выше 8000 Д многоступенчатой ультрафильтрацией и частичного отделения неорганических веществ электродиализом. Биологическая активность полученного продукта находится на уровне коммерческих препаратов солкосерил (стимуляция поглощения O₂ не более, чем на 10% по сравнению со стандартным образцом).A known method of producing substances that stimulate cellular respiration [1] the Method includes defibrination and hemolysis of calf blood, followed by separation of substances from mol.m. above 8000 D by multistage ultrafiltration and partial separation of inorganic substances by electrodialysis. The biological activity of the obtained product is at the level of commercial preparations of solcoseryl (stimulation of the absorption of O ₂ no more than 10% compared with a standard sample).

Описанный способ позволяет получать полуфабрикат для производства препарата типа солкосерил, т.к. в нем не контролируется содержание белков, осаждаемых ТХУ (трихлоруксусной кислотой) и содержание дериватов гемоглобина (по реакции с О-толуидином). В технологическом отношении способ является трудоемким, требует использования сложной аппаратурной схемы. Большая длительность процесса 4-х ступенчатой ультрафильтрации (36 ч) приводит к необходимости использования больших количеств консервантов и их последующему удалению, что сопровождается дополнительным образованием солей. The described method allows to obtain a semi-finished product for the production of a drug such as solcoseryl, because it does not control the content of proteins precipitated by TCA (trichloroacetic acid) and the content of hemoglobin derivatives (by reaction with O-toluidine). Technologically, the method is time-consuming, requires the use of a complex hardware circuit. The long duration of the 4-stage ultrafiltration process (36 h) leads to the necessity of using large quantities of preservatives and their subsequent removal, which is accompanied by additional salt formation.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков и достигаемому эффекту является способ получения препарата, обладающего ранозаживляющим действием [2] В процессе его получения дефибринированную кровь молодых бычков или телят подвергают ферментативному гидролизу папаином при рН 6,5 7,4. Реакцию прекращают холодной водой. Фермент удаляют из реакционной смеси ультрафильтрацией с использованием фильтрующих элементов с порогом отсечения 10000 Д. Фильтрат концентрируют, смешивают со спиртом, выдерживают в течение 24 ч и фильтруют. Длительность всего процесса составляет более 40 ч. The closest in the set of essential features and the achieved effect is a method for producing a drug with a wound healing effect [2] In the process of its production, defibrinated blood of young bulls or calves is subjected to enzymatic hydrolysis by papain at pH 6.5 7.4. The reaction is stopped with cold water. The enzyme was removed from the reaction mixture by ultrafiltration using filter elements with a cut-off threshold of 10,000 D. The filtrate was concentrated, mixed with alcohol, aged for 24 hours and filtered. The duration of the whole process is more than 40 hours.

Способ позволяет получить препарат с более выраженной биологической активностью (стимулирование поглощения О₂ составляет 30% по сравнению со стандартным образцом), что, по-видимому, связано с проведением дополнительной стадии ферментативного гидролиза. Однако, используемый для гидролиза фермент папаин обладает низкой ферментативной активностью. Для поддержания его биологической активности добавляют большое количество высокоочищенного цистеина и увеличивают продолжительность стадии гидролиза до 15 ч. Необходимо отметить также, что папаин фермент растительного происхождения и импортируется в страны СНГ из-за рубежа. Данные о выходе целевого продукта и содержании в нем общего и аминного азота в описании не приведены.The method allows to obtain a drug with a more pronounced biological activity (stimulation of the absorption of O ₂ is 30% compared with a standard sample), which, apparently, is associated with an additional stage of enzymatic hydrolysis. However, the enzyme papain used for hydrolysis has a low enzymatic activity. To maintain its biological activity, a large amount of highly purified cysteine is added and the hydrolysis stage is increased to 15 hours. It should also be noted that papain is an enzyme of plant origin and is imported into the CIS countries from abroad. Data on the yield of the target product and the content of total and amine nitrogen in it are not given in the description.

Цель изобретения повышение биологической активности препарата, сокращение длительности процесса его получения. The purpose of the invention is to increase the biological activity of the drug, reducing the duration of the process for its preparation.

С этой целью получение препарата, стимулирующего клеточное дыхание, проводят путем ферментативного гидролиза дефибринированной крови телят с использованием фермента бактериальной эндопротеазы, инактивацию фермента осуществляют нагреванием реакционной смеси до 80 98^oC, затем из смеси удаляют вещества с молекулярной массой выше 5000 8000 Д с помощью ступенчатой ультрафильтрации.To this end, the preparation of a cell respiration stimulating preparation is carried out by enzymatic hydrolysis of defibrinated calf blood using the bacterial endoprotease enzyme, the enzyme is inactivated by heating the reaction mixture to 80 98 ^o C, then substances with a molecular weight above 5000 8000 D are removed from the mixture using a stepwise ultrafiltration.

Сравнение предлагаемого способа с известным показывает, что общими существенными признаками для них являются: ферментативный гидролиз дефибринированной крови телят с последующим выделением целевого продукта с использованием ультрафильтрации, концентрации упариванием и стерилизующей фильтрации. Однако, в отличие от прототипа, в заявляемом способе для ферментативного гидролиза используют другой фермент бактериальную эндопротеазу с широкой субстратной специфичностью, что позволяет повысить биологическую активность конечного продукта и сократить длительность процесса. Исключение стадии осаждения спиртом позволяет ускорить процедуру отделения веществ и сократить таким образом длительность технологического процесса. Введение тепловой инактивации фермента с последующей его денатурацией позволяет применить микрофильтрацию для удаления эндопротеазы и высокомолекулярных полипептидов из реакционной смеси. Частичное удаление полипептидов ускоряет последующую ультрафильтрацию. Comparison of the proposed method with the known one shows that the common essential features for them are: enzymatic hydrolysis of defibrinated blood of calves with subsequent isolation of the target product using ultrafiltration, concentration by evaporation and sterilizing filtration. However, in contrast to the prototype, in the claimed method for enzymatic hydrolysis, another enzyme is used bacterial endoprotease with broad substrate specificity, which allows to increase the biological activity of the final product and reduce the duration of the process. The elimination of the stage of precipitation with alcohol allows you to speed up the process of separation of substances and thus reduce the duration of the process. The introduction of thermal inactivation of the enzyme with its subsequent denaturation allows the use of microfiltration to remove endoprotease and high molecular weight polypeptides from the reaction mixture. Partial removal of polypeptides accelerates subsequent ultrafiltration.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Дефростированную или свежую плазму крови без следов гемоглобина и фибрина подвергают гидролизу сериновой эндопептидазой при температуре от 30 до 50^o в течение 3 5 ч. По окончании гидролиза реакционную массу при перемешивании нагревают до температуры 80 98^oC и выдерживают 20 60 мин. После охлаждения до комнатной температуры проводят последовательную микро- и ультрафильтрацию через мембранные установки с диаметром пор 0,5 мкм и с порогом отсечения 100 кД и 5 10 кД. Фильтрат упаривают до 1/5 1/6 первоначального объема и повторно проводят ультрафильтрацию через фильтры с порогом отсечения веществ 5 10 кД. Для приготовления лекарственной формы препарата, после добавления консерванта, проводят стерилизующую фильтрация на мембранных фильтрах с диаметром пор 0,22 мкм.The proposed method is as follows. Defrosted or fresh blood plasma without traces of hemoglobin and fibrin is subjected to hydrolysis with serine endopeptidase at a temperature of from 30 to 50 ^o for 3-5 hours. After hydrolysis, the reaction mass is heated to 80 80 ^o C with stirring and incubated for 20-60 minutes. After cooling to room temperature, sequential micro- and ultrafiltration is carried out through membrane units with a pore diameter of 0.5 μm and with a cut-off threshold of 100 kD and 5 10 kD. The filtrate is evaporated to 1/5 1/6 of the original volume and ultrafiltration is repeated through filters with a cut-off threshold of substances 5 10 kD. To prepare the dosage form of the drug, after adding a preservative, sterilizing filtration is carried out on membrane filters with a pore diameter of 0.22 μm.

Биологическая активность препарата изучалась полярографическим методом с использованием закрытого кларковского электрода на изолированных гепатоцитах крыс. The biological activity of the drug was studied by the polarographic method using a closed Clarke electrode on isolated rat hepatocytes.

В прототипе биологическая активность препаратов оценивалась на аппаратуре Варбурга по стимулированию поглощения О₂ гомогенатом печени в процентах по отношению к стандарту солкосерила. В настоящее время этот метод заменен более современным полярографическим методом. Для сопоставимости результатов определения биологической активности, полученных в прототипе и заявляемом способе, в качестве контрольного образца использован стандарт солкосерила.In the prototype, the biological activity of the preparations was evaluated on a Warburg apparatus to stimulate the absorption of O _{2 by} liver homogenate as a percentage relative to the standard of solcoseryl. Currently, this method has been replaced by a more modern polarographic method. For comparability of the results of determining the biological activity obtained in the prototype and the claimed method, the standard of solcoseryl was used as a control sample.

Пример 1. Дефростированную или свежую сыворотку крови телят в возрасте до 6 месяцев в количестве 1000 мл и 400 мл дистиллированной воды помещают в реактор. Температура смеси 39±2^oC. В смесь добавляют 50 мг сериновой эндопротеазы. Ферментативный гидролиз белков сыворотки крови проводят при постоянном перемешивании при температуре 42±2^oC в течение 4 ч. Затем смесь нагревают до 95±2^oC и выдерживают при этой температуре 40 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры. Смесь фильтрат через мембранные фильтры с диаметром пор 0,5 мкм для отделения денатурированных белков. Затем проводят последовательную ультрафильтрацию фильтрата на мембранных установках с молекулярной массой отсечения веществ 100 кД и 98 кД. Полученный фильтрат упаривают в роторном испарителе до 20% первоначального объема сыворотки крови, взятой в опыт. После упаривания проводят ультрафильтрацию через мембранные фильтры с молекулярной массой отсечения веществ 5 кД. Выход 150 мл с содержанием общего азота 2,17 мг/мл и аминного азота 0,88 мг/мл (табл. 1).Example 1. Defrosted or fresh blood serum of calves under the age of 6 months in an amount of 1000 ml and 400 ml of distilled water are placed in a reactor. The temperature of the mixture is 39 ± 2 ^° C. 50 mg of serine endoprotease are added to the mixture. Enzymatic hydrolysis of blood serum proteins is carried out with constant stirring at a temperature of 42 ± 2 ^o C for 4 hours. Then the mixture is heated to 95 ± 2 ^o C and kept at this temperature for 40 minutes. The mixture was cooled to room temperature. Mixture the filtrate through membrane filters with a pore diameter of 0.5 μm to separate denatured proteins. Then, sequential ultrafiltration of the filtrate is carried out on membrane units with a molecular mass cut-off of 100 kD and 98 kD. The obtained filtrate is evaporated in a rotary evaporator to 20% of the initial volume of blood serum taken in the experiment. After evaporation, ultrafiltration is carried out through membrane filters with a molecular weight cut-off of substances of 5 kD. Yield 150 ml with a total nitrogen content of 2.17 mg / ml and an amine nitrogen of 0.88 mg / ml (Table 1).

Субстанцию гидролизата получают добавлением 0,150 г консерванта нипагина к 150 мл фильтрата, смесь выдерживают при 50^oC, постоянно перемешивая, до полного растворения нипагина. После чего проводят стерильную фильтрацию на мембранных фильтрах с размером пор 0,22 мкм. Раствор препарата в стерильных асептических условиях разливают в ампулу объемом 1 10 мл. Ампулу запаивают.The hydrolyzate substance is obtained by adding 0.150 g of nipagin preservative to 150 ml of the filtrate, the mixture is kept at 50 ^o C, stirring constantly, until the nipagin is completely dissolved. Then sterile filtration is carried out on membrane filters with a pore size of 0.22 μm. The solution of the drug under sterile aseptic conditions is poured into an ampoule with a volume of 1 10 ml. The ampoule is sealed.

Пример 2. Ферментативный гидролиз сыворотки крови телят проводят, как в примере 1. После окончания гидролиза смесь при перемешивании нагревают до температуры 85±2^oC и выдерживают 60 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,5 мкм. Затем проводят последовательную ультрафильтрацию фильтрата на мембранных установках с молекулярной массой отсечения веществ 100 кД и 5 кД. Полученный фильтрат упаривают в роторном испарителе до 20% первоначального объема сыворотки крови, взятой в опыт. После упаривания проводят ультрафильтрацию через мембранные фильтры с молекулярной массой отсечения 8 кД. Выход 165 мл с содержанием общего азота 2,50 мг/мл и аминного азота 0,92 мг/мл (табл. 1).Example 2. Enzymatic hydrolysis of blood serum of calves is carried out as in example 1. After the hydrolysis is completed, the mixture is heated to 85 ± 2 ^° C with stirring and held for 60 minutes. The mixture was cooled to room temperature and filtered through membrane filters with a pore diameter of 0.5 μm. Then, sequential ultrafiltration of the filtrate is carried out on membrane units with a molecular mass cut-off of 100 kD and 5 kD. The obtained filtrate is evaporated in a rotary evaporator to 20% of the initial volume of blood serum taken in the experiment. After evaporation, ultrafiltration is carried out through membrane filters with a molecular weight cut-off of 8 kD. The yield of 165 ml with a total nitrogen content of 2.50 mg / ml and amine nitrogen of 0.92 mg / ml (table. 1).

Субстанцию препарата получают, как в примере 1. The substance of the drug is obtained, as in example 1.

Биологическая активность полученных гидролизатов представлена в табл. 2. The biological activity of the obtained hydrolysates is presented in table. 2.

Как видно из таблицы, добавление гидролизата и стандарта (солкосерила) к изолированным гепатоцитам приводит к активации потребления ими С₂, при этом полученный препарат обладал в 2 раза большей активностью по сравнению со стандартом солкосерила или на 70% выше активности препарата, полученного по способу-прототипу.As can be seen from the table, the addition of the hydrolyzate and standard (solcoseryl) to isolated hepatocytes leads to activation of their consumption of C ₂ , while the resulting preparation had 2 times more activity compared to the standard of solcoseryl or 70% higher than the activity of the drug obtained by the method prototype.

Заявляемый способ обеспечивает получение целевого продукта, не содержащего в своем составе белков (о чем свидетельствует отрицательная реакция с ТХУ), гемоглобина и продуктов его гидролиза (отрицательная реакция с О-толуидином) и характеризуется высокой биологической активностью и высоким выходом конечного продукта. Длительность процесса получения препарата составляет 10-12 ч. The inventive method provides the target product that does not contain proteins (as evidenced by the negative reaction with TCA), hemoglobin and its hydrolysis products (negative reaction with O-toluidine) and is characterized by high biological activity and high yield of the final product. The duration of the process of obtaining the drug is 10-12 hours

Использованные источники информации
1. Патент СССР N 1748637, А 61 К 35/14, 1992.Used sources of information
1. USSR patent N 1748637, A 61 K 35/14, 1992.

2. РСТ N 89/06538, А 61 К 35/14, 1990. ТТТ1 2. PCT N 89/06538, A 61 K 35/14, 1990. TTT1

Claims (1)

Способ получения препарата, стимулирующего клеточное дыхание, путем ферментативного гидролиза дефибринированной крови телят с последующим выделением целевого продукта методами ультрафильтрации, концентрации и стерилизующей фильтрации, отличающийся тем, что ферментативный гидролиз проводят с использованием бактериальной эндопротеазы, инактивацию фермента осуществляют нагреванием реакционной смеси до 80 98°С, после чего балластные вещества с молекулярной массой выше 5000 8000 Д удаляют ступенчатой микро- и ультрафильтрацией. A method of obtaining a drug that stimulates cell respiration by enzymatic hydrolysis of defibrinated calf blood with the subsequent isolation of the target product by ultrafiltration, concentration and sterilizing filtration, characterized in that the enzymatic hydrolysis is carried out using bacterial endoprotease, the enzyme is inactivated by heating the reaction mixture to 80 98 ° C after which ballast substances with a molecular mass above 5000 8000 D are removed by step micro and ultrafiltration.

Images