RU2066188C1 - Method of human leukocyte interferon preparing - Google Patents

Abstract

FIELD: medicinal industry. SUBSTANCE: method involves the use of Newcastle disease virus as an inducer. Virus is purified and concentrated by ultrafiltration method on diaphragm at pore size 0.1-0.45 mm. Induction and biosynthesis of interferon is carried out simultaneously without nutrient medium change. EFFECT: simplified method.

Description

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к производству человеческого лейкоцитарного интерферона. The invention relates to the medical industry, namely to the production of human leukocyte interferon.

В действующем в настоящее время регламенте производства человеческого лейкоцитарного интерферона существует следующая последовательность технологических операций: выделяют лейкоциты из донорской крови, суспендируют их в питательной среде, добавляют к лейкоцитам аллантоисный вирус-индуктор и инкубируют при 37^o C 1-2 часа. Затем лейкоциты отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость, содержащую балластные белки, удаляют, а осадок лейкоцитов ресуспендируют в свежей порции среды 199 с необходимыми добавками и инкубируют при 37^o C 18-20 часов. По истечении времени биосинтеза, отделяют среду, содержащую интерферон, от лейкоцитов центрифугированием, осадок с отработанными лейкоцитами отбрасывают (1).In the current procedure for the production of human leukocyte interferon, the following sequence of technological operations exists: leukocytes are extracted from donated blood, suspended in a nutrient medium, an allantoic virus inducer is added to leukocytes and incubated for 1-2 hours at 37 ^° C. Then the leukocytes are separated by centrifugation, the supernatant containing ballast proteins is removed, and the leukocyte sediment is resuspended in a fresh portion of medium 199 with the necessary additives and incubated at 37 ^o C for 18-20 hours. At the end of the biosynthesis time, the medium containing interferon is separated from the leukocytes by centrifugation, the pellet with spent leukocytes is discarded (1).

Для индукции интерфероногенеза используют вирус болезни Ньюкасл (ВБН), который выращивают в аллантоисной полости 9-10 дневных куриных эмбрионов. В действующих регламентах к лейкоцитам добавляют вируссодержащую аллантоисную жидкость (ВАЖ) без какой-либо предварительной обработки. ВАЖ, помимо вируса
индуктора, содержит аллантоисные белки, среди которых есть и овальбумин, являющийся сильным аллергеном. Таким образом, вместе с вирусом-индуктором в лейкоциты вносится и овальбумин, присутствие которого в препаратах интерферона ограничено действующей ФС 42-247ВС-91 в пределах 50 нг/мл. Для того, чтобы не превысить указанное значение овальбумина, в регламентах предусмотрено центрифугирование после стадии индукции, в результате которого надосадочную жидкость, содержащую овальбумин и другие аллантоисные белки удаляют, а осадок лейкоцитов ресуспендируют в новой питательной среде. Таким образом, концентрация овальбумина значительно снижается.Newcastle disease virus (VBI), which is grown in the allantoic cavity of 9-10 day old chicken embryos, is used to induce interferonogenesis. In current regulations, a virus-containing allantoic fluid (IMPORTANT) is added to leukocytes without any preliminary treatment. IMPORTANT, besides the virus
inducer, contains allantoic proteins, among which there is ovalbumin, which is a strong allergen. Thus, together with the inducer virus, ovalbumin is introduced into the leukocytes, the presence of which in interferon preparations is limited by the acting FS 42-247BC-91 within 50 ng / ml. In order not to exceed the indicated value of ovalbumin, the regulations provide for centrifugation after the induction stage, as a result of which the supernatant containing ovalbumin and other allantoic proteins is removed and the leukocyte sediment is resuspended in a new nutrient medium. Thus, the concentration of ovalbumin is significantly reduced.

Однако центрифугирование в условиях производства интерферона заключает в себе ряд недостатков:
трудоемкость этапа центрифугирования, включающего разлив взвеси лейкоцитов с ВАЖ из биореактора во флаконы перед центрифугированием, отсос надосадочной жидкости из каждого флакона, добавление свежей среды к лейкоцитам и наконец подачу лейкоцитов из флаконов в биореактор. Все эти операции требуют строгого соблюдения правил асептики и антисептики;
при достаточно большом производстве значительный расход стерильного материала и флаконов, что приводит к перегрузке стерилизационного оборудования;
необходимость значительного числа центрифугируют для одновременного центрифугирования лейкоцитарно-вирусной суспензии;
возможность травмирования лейкоцитов в процессе центрифугирования, что может привести к снижению продукции интерферона;
манипуляции, связанные с центрифугированием, значительно увеличивают продолжительность рабочей смены.However, centrifugation in the production of interferon has a number of disadvantages:
the complexity of the centrifugation step, including the spill of leukocyte suspension from the bioreactor from the bioreactor into the vials before centrifugation, the suction of the supernatant from each vial, the addition of fresh medium to the leukocytes, and finally the leukocyte from the vials to the bioreactor. All these operations require strict adherence to the rules of asepsis and antiseptics;
with a sufficiently large production, a significant consumption of sterile material and bottles, which leads to overloading of sterilization equipment;
the need for a significant number of centrifuged for simultaneous centrifugation of the leukocyte-viral suspension;
the possibility of injury to leukocytes during centrifugation, which can lead to a decrease in interferon production;
centrifugal manipulations significantly increase the duration of the work shift.

Хотя этап центрифугирования и дает значительное снижение концентрации овальбумина, однако в ряде случаев препараты интерферона все же содержат овальбумин в концентрациях выше допустимой. Поэтому в производстве инъекционного препарата интерферона и препарата интерлок для дальнейшего удаления этого аллергена используется иммуносорбция на сорбенте с кроличьими антителами к овальбумину или гельфильтрация на колонках с гелями типа АсА-44. Эти дополнительные манипуляции отличаются большой трудоемкостью, длительностью и многоступенчатостью. Although the centrifugation step provides a significant decrease in the concentration of ovalbumin, in some cases, interferon preparations still contain ovalbumin at concentrations higher than the permissible level. Therefore, in the manufacture of an injectable preparation of interferon and an interlock preparation, immunosorption on a sorbent with rabbit antibodies to ovalbumin or gel filtration on columns with AsA-44 gels is used to further remove this allergen. These additional manipulations are very labor intensive, durable and multi-stage.

Недавно предложен способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона, в котором для индукции используют аллантоисный вирус болезни Ньюкасл, концентрированный и очищенный методом ультрафильтрации-диафильтрации в постоянном объеме на мембранах с порогом отсекания по молекулярной массе 100 или 300 кD. Препараты интерферона, полученные с использованием этого вируса, не содержат овальбумин по данным высокочувствительного иммуноферментного метода (2). Recently, a method for producing human leukocyte interferon has been proposed, in which the allantoic virus of Newcastle disease is used for induction, concentrated and purified by constant volume ultrafiltration-diafiltration on membranes with a cut-off threshold for molecular weight of 100 or 300 kD. Interferon preparations obtained using this virus do not contain ovalbumin according to the highly sensitive enzyme immunoassay (2).

Способ осуществляется следующим образом:
1 этап: Удаляют грубые примеси из вируссодержащей аллантоисной жидкости на микрофильтрационных мембранах с диаметром пор 0,5 или 0,8 мМ, заправленных в плоскорамную разделительную установку.The method is as follows:
Stage 1: Coarse impurities are removed from the virus-containing allantoic fluid on microfiltration membranes with pore diameters of 0.5 or 0.8 mM, charged into a planar separation unit.

2 этап. Осветленную вируссодержащую аллантоисную жидкость подают на ультрафильтрационные мембраны с порогом отсекания 100 или 300 кD, заправленные в плоскокамерную разделительную установку. Вирус концентрируют до желаемого объема, затем проводят очистку в режиме диафильтрации при постоянном объеме вирусного концентрата, используя 15-20 объемов 0,01 М натрий-фосфатного буфера, содержащего 0,15 М хлористого натрия (рН 7,4-7,6). Фильтрат отбрасывают, а очищенный концентрат проверяют на степень очистки и биологические свойства. 2 stage. The clarified virus-containing allantoic fluid is fed to ultrafiltration membranes with a cut-off threshold of 100 or 300 kD, tucked into a flat-chamber separation unit. The virus is concentrated to the desired volume, then it is purified by diafiltration with a constant volume of the virus concentrate using 15-20 volumes of 0.01 M sodium phosphate buffer containing 0.15 M sodium chloride (pH 7.4-7.6). The filtrate is discarded, and the purified concentrate is checked for the degree of purification and biological properties.

3 этап. Выделенные из донорской крови лейкоциты взвешивают в среде N199. Очищенный вирус-индуктор вводят в среду с лейкоцитами и инкубируют при 37^o C в течении 1-3 ч. Затем лейкоциты отделяют центрифугированием при 1200 g в течение 15 мин. Осадок лейкоцитов ресуспендируют в свежей порции питательной среды. Через 18-20 ч инкубации при 37^o C целевой продукт отделяют от лейкоцитов центрифугированием.3 stage. Leukocytes isolated from donated blood are weighed in N199 medium. The purified inducer virus is introduced into the medium with leukocytes and incubated at 37 ^o C for 1-3 hours. Then, the leukocytes are separated by centrifugation at 1200 g for 15 minutes. Leukocyte sediment is resuspended in a fresh portion of the culture medium. After 18-20 hours of incubation at 37 ^o C, the target product is separated from leukocytes by centrifugation.

Однако применение для такого высокоочищенного вируса-индуктора не позволяет избежать центрифугирования после стадии индукции интерфероногенеза, так как концентрация овальбумина в противном случае будет превышать допустимую. However, the use of such a highly purified inducer virus does not allow centrifugation to be avoided after the induction phase of interferonogenesis, since the concentration of ovalbumin would otherwise exceed the permissible level.

В качестве прототипа изобретения выбирается последний способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона, так как он является наиболее близким по технической сущности. As a prototype of the invention, the last method for producing human leukocyte interferon is selected, since it is the closest in technical essence.

Цель изобретения упрощение способа получения человеческого лейкоцитарного интерферона. Эта цель достигается тем, что для индукции используют вирус болезни Ньюкасл, очищенный и концентрированный методом ультрафильтрации на мембранах с размером пор 0,1-0,45 mМ при этом индукцию и биосинтез интерферона проводят одновременно без смены питательной среды. The purpose of the invention is the simplification of the method for producing human leukocyte interferon. This goal is achieved by the fact that the virus of Newcastle disease, purified and concentrated by ultrafiltration on membranes with a pore size of 0.1-0.45 mM, is used for induction, while the induction and biosynthesis of interferon is carried out simultaneously without changing the nutrient medium.

Сравнительный анализ существенных признаков изобретения и прототипа свидетельствует, что отличительными признаками заявляемого изобретения являются применение вирусного индуктора, очищенного и концентрированного на мембранах с размером пор 0,1-0,45 mМ. Достигается при этом более высокая степень очистки вируса позволяет исключить из технологии получения лейкоцитарного интерферона наиболее трудоемкий этап этап центрифугирования и вести биосинтез интерферона одновременно с индукцией без смены питательной среды. A comparative analysis of the essential features of the invention and the prototype indicates that the hallmarks of the claimed invention are the use of a viral inducer, purified and concentrated on membranes with pore sizes of 0.1-0.45 mm. At the same time, a higher degree of virus purification is achieved, which makes it possible to exclude the most labor-intensive stage of centrifugation from the technology of producing leukocyte interferon and conduct biosynthesis of interferon simultaneously with induction without changing the nutrient medium.

Влияние приведенных отличительных признаков на достижение технического результата не следует из известного уровня знаний в области технологии производства вирусиндуцированных препаратов, следовательно, разработанный способ соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень". The influence of the above distinguishing features on the achievement of a technical result does not follow from a known level of knowledge in the field of technology for the production of virus-induced drugs, therefore, the developed method meets the criteria of "novelty" and "inventive step".

Способ осуществляется следующим образом. Вируссодержащую аллантоисную жидкость выдерживают после отсоса при температуре 4+2^oC не менее одного месяца. Перед очисткой и концентрацией осветляют вируссодержащую аллантоисную жидкость пропуская ее через комплекс фильтрующий погружной П-40М (НТК "Контур" С. Петербург).The method is as follows. Virus-containing allantoic fluid is maintained after suction at a temperature of 4 + 2 ^o C for at least one month. Before purification and concentration, the virus-containing allantoic liquid is clarified by passing it through a P-40M filtering submersible complex (NTK Kontur St. Petersburg).

Осветленную вируссодержащую аллантоисную жидкость подают на микрофильтрационные мембраны, VVPP или GVLP или HVLP (Миллипор, США) с порогом отсечения 0,1 или 0,2 или 0,45 mM соответственно, заправленные в плоскопрограммную разделительную установку и концентрируют не менее, чем в 40 раз, затем проводят диафильтрацию концентрата вируса в постоянном объеме 8-10 объемами 0,9% хлористого натрия. Очищенный концентрат проверяют на стерильность, гемагглютинирующую активность. В одном мл концентрата в среднем содержится 10 000 12 000 ГАЕ вируса и 100-200 нг овальбумина (табл.1). The clarified virus-containing allantoic fluid is supplied to microfiltration membranes, VVPP or GVLP or HVLP (Millipore, USA) with a cut-off threshold of 0.1 or 0.2 or 0.45 mM, respectively, charged into a plane-program separation unit and concentrated at least 40 times then diafiltration of the virus concentrate is carried out in a constant volume of 8-10 volumes of 0.9% sodium chloride. The purified concentrate is checked for sterility, hemagglutinating activity. One ml of concentrate contains on average 10 000 12 000 GAE of the virus and 100-200 ng of ovalbumin (Table 1).

Суспендируют лейкоциты в 199 среде, содержащей необходимые добавки, и добавляют очищенный концентрат вируса-индуктора к лейкоцитам, из расчета 2-4 000 ГАЕ на 1 000 000 000 лейкоцитов, инкубируют взвесь при 37^oC в течение 18-20 ч, постоянно перемешивая. Затем лейкоциты удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость, содержащую интерферон, подкисляют 10% соляной кислотой до рН 2,2-2.4. Выдерживают подкисленный полуфабрикат интерферона в течение 10 дней для инактивации вируса-индуктора.The leukocytes are suspended in 199 medium containing the necessary additives, and the purified inducer virus concentrate is added to the leukocytes, at the rate of 2-4,000 GAU per 1,000,000,000 leukocytes, the suspension is incubated at 37 ^° C for 18-20 hours, constantly stirring. Then the leukocytes are removed by centrifugation, and the supernatant containing interferon is acidified with 10% hydrochloric acid to a pH of 2.2-2.4. The acidified semi-finished interferon is maintained for 10 days to inactivate the inducer virus.

Противовирусная активность полученного таким способом интерферона составляет 8-10 000 МЕ в мл, овальбумин отсутствует (табл.2). The antiviral activity of interferon obtained in this way is 8-10,000 IU per ml, ovalbumin is absent (Table 2).

Таким образом, предлагаемый способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона, в отличие от прототипа и существующих в настоящее время регламентов производства человеческого лейкоцитарного интерферона, является предпочтительнее, так как достигает тех же результатов при значительном упрощении способа, сокращении материальных и трудовых затрат, и экономии рабочего времени. Это достигается исключением в предлагаемом способе этапа центрифугирования после стадии индукции и соответственно устранением всех ранее перечисленных недостатков, сопутствующих центрифугированию. Thus, the proposed method for producing human leukocyte interferon, in contrast to the prototype and current regulations for the production of human leukocyte interferon, is preferable, since it achieves the same results with a significant simplification of the method, reducing material and labor costs, and saving working time. This is achieved by the exclusion in the proposed method of the centrifugation step after the induction step and, accordingly, the elimination of all the previously listed disadvantages associated with centrifugation.

Claims (1)

Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона, включающий выделение лейкоцитов, их суспендирование в питательной среде, индукцию аллантоисным вирусом болезни Ньюкасл, биосинтез интерферона, инактивацию вируса-индуктора, отличающийся тем, что для индукции используют вирус болезни Ньюкасл, очищенный и концентрированный методом ультрафильтрации на мембранах с размером пор 0,1-0,45 ммк, при этом индукцию и биосинтез проводят одновременно без смены питательной среды. A method for producing human leukocyte interferon, including the isolation of leukocytes, their suspension in a nutrient medium, induction of the Newcastle disease allantoic virus, interferon biosynthesis, inactivation of the inducer virus, characterized in that the Newcastle disease virus purified and concentrated by ultrafiltration on membranes with a size of membrane is used for induction then 0.1-0.45 mkm, while induction and biosynthesis are carried out simultaneously without changing the nutrient medium.

Images