RU2064948C1

RU2064948C1 - Metal complexes of porphyrin-ketones, sensitive member for oxygen optical assay in liquid or gaseous medium and a method of oxygen determination

Info

Publication number: RU2064948C1
Authority: RU
Inventors: Д.Б. Папковский; Г.В. Пономарев; И.Н. Курочкин; С.Ф. Чернов
Original assignee: Папковский Дмитрий Борисович
Priority date: 1992-07-20
Filing date: 1992-07-20
Publication date: 1996-08-10

Abstract

FIELD: analytical chemistry, veterinary, medicine, biotechnology, food industry. SUBSTANCE: platinum and palladium complexes of new substituted porphyrin-ketones. Sensitive member for optical determination of oxygen in liquid or gaseous medium - polystyrene-formed article with distributed platinum or palladium complexes of new substituted porphyrin-ketones in it which is used as phosphorescent dye. Sensitive member is made as film (thickness is 1-20 mc) that can be fixed on solid backing or optical member. Formed article can contain oxygen-dependent enzyme layer. Method of oxygen determination involves the use of this sensitive member which is contacted with sample to be analyzed and connected by optical fiber with phosphorescence detector at optimal sensitivity at 700-850 nm. Sensitive member sensitivity is excited by light-diode at the range of dye absorption and recorded its at impulse regimen at optimal emission value at the range 570-630 nm. Oxygen concentration is calculated by value of intensity and/or phosphorescence life time on the basis of monoexponential property of phosphorescence damping. Platinum and palladium complexes of new substituted porphyrin-ketones have quantum yields and phosphorescence life time similar with porphyrin complexes and intense absorption band at the range 560-620 nm. Shift value of visible absorption band is 50-60 nm as compared with that of metal-porphyrin. Phosphorescence is shifted to long-wave region by about 100 nm. EFFECT: simplified method of oxygen assay, increased precision. 9 dwg

Description

Изобретение относится к области аналитической химии и техники и может быть использовано в медицинской диагностике, клинической медицине, в биотехнологии, пищевой промышленности, ветеринарии, экологических исследованиях. The invention relates to the field of analytical chemistry and technology and can be used in medical diagnostics, clinical medicine, biotechnology, food industry, veterinary medicine, environmental research.

В тех случаях, когда стоит задача определения или непрерывного мониторинга биологически активных соединений, наиболее эффективным является использование устройств-биосенсоров. In cases where the task is to determine or continuously monitor biologically active compounds, the use of biosensor devices is most effective.

Молекулярный кислород является одним из важнейших объектов анализа и в то же время субстратом множества ферментативных реакций. Он, как известно, является также эффективным тушителем люминесценции красителей. Эффективность тушения люминесценции кислородом определяется длительностью (или временем жизни) люминесценции, природой красителя и среды, в которой регистрируется тушение. При удачном подборе люминесцирующего красителя, матрицы для него и соответствующих элементов оптоэлектроники возможно создание эффективных оптических кислородных сенсоров, способных осуществлять точное количественное определение кислорода. Соответствующий прибор может быть реализован с использованием компактного, простого и дешевого (волоконно) оптического оборудования [1]
Оптическая детекция кислорода может вестись путем измерения интенсивности люминесценции либо времени жизни люминесценции красителя. Последний подход является более предпочтительный, поскольку он не зависит от концентрации красителя, ее изменении во времени и флуктуаций рабочих характеристик компонентов оптической детектирующей системы [2]
В настоящее время в литературе описан ряд подходов к созданию оптических кислородных сенсоров и ферментных биосенсоров на их основе. В качестве активного кислород-чувствительного элемента в них обычно используются полимерные композиции на основе люминесцирующих красителей, которые проницаемы для молекулярного кислорода, растворенного в анализируемой системе. Он выполняется в виде кислородной мембраны, которая наносится или крепится на конце оптического волокна или в рабочей оптической ячейке.Molecular oxygen is one of the most important objects of analysis and, at the same time, the substrate of many enzymatic reactions. It is also known to be an effective quencher of luminescence dyes. The efficiency of quenching of luminescence by oxygen is determined by the duration (or lifetime) of the luminescence, the nature of the dye and the medium in which quenching is detected. With the successful selection of the luminescent dye, the matrix for it and the corresponding elements of optoelectronics, it is possible to create effective optical oxygen sensors capable of accurately quantifying oxygen. The corresponding device can be implemented using compact, simple and cheap (fiber) optical equipment [1]
Optical oxygen detection can be carried out by measuring the luminescence intensity or the luminescence lifetime of the dye. The latter approach is preferable, since it does not depend on the dye concentration, its change in time, and fluctuations in the operating characteristics of the components of the optical detection system [2]
Currently, the literature describes a number of approaches to the creation of optical oxygen sensors and enzymatic biosensors based on them. As an active oxygen-sensitive element, they usually use polymer compositions based on luminescent dyes, which are permeable to molecular oxygen dissolved in the analyzed system. It is made in the form of an oxygen membrane, which is deposited or attached to the end of the optical fiber or in the working optical cell.

В качестве люминесцирующих кислород-чувствительных элементов предложено использовать полимерные композиции на основе полиароматических красителей (например, пирена или декациклена [3]), а также на основе флуоресцирующих комплексов рутения (Ru(bpy)3, Ru(phen)3 и др.) [4] Однако полиароматические красители требуют ультрафиолетового возбуждения, что сложно реализуется на волоконно-оптическом оборудовании и светодиодах. Кроме того, короткая длительность люминесценции этих красителей усложняет создание сенсоров основанных на принципе измерения времен жизни. Это связано с быстродействием полупроводниковой электроники (свето- и фотодиодов), которая также обычно составляет порядка 1-2 микросекунд. Комплексы рутения, как правило, обладают сложной координационной химией и фотохимией и плохо растворимы в полимерах, обычно используемых для получения кислород-чувствительных композиций. Это приводит к практическим сложностям при создании простых, компактных и дешевых приборов. It is proposed to use polymer compositions based on polyaromatic dyes (for example, pyrene or decacycylene [3]), as well as based on fluorescent ruthenium complexes (Ru (bpy) 3, Ru (phen) 3, etc.) as luminescent oxygen-sensitive elements [ 4] However, polyaromatic dyes require ultraviolet excitation, which is difficult to implement on fiber-optic equipment and LEDs. In addition, the short luminescence duration of these dyes complicates the creation of sensors based on the principle of measuring lifetimes. This is due to the speed of semiconductor electronics (light and photodiodes), which also usually amounts to about 1-2 microseconds. Ruthenium complexes, as a rule, have complex coordination chemistry and photochemistry and are poorly soluble in polymers commonly used to produce oxygen-sensitive compositions. This leads to practical difficulties in creating simple, compact and cheap devices.

Наиболее близким к изобретению являются фосфоресцирующие красители, чувствительные элементы на их основе и способ определения кислорода, описанные в патенте [5] Его основу составляет использование фосфоресцирующих красителей порфириновой природы Pt- и Pd-комплексов порфиринов. Эти красители имеют полосы поглощения в видимой области спектра и обладают интенсивной фосфоресценцией [6] Показана их эффективность для люминесцентной детекции кислорода. Closest to the invention are phosphorescent dyes, sensitive elements based on them and the method for determining oxygen described in the patent [5]. It is based on the use of phosphorescent dyes of the porphyrin nature of the Pt and Pd complexes of porphyrins. These dyes have absorption bands in the visible region of the spectrum and have intense phosphorescence [6] Their effectiveness for luminescent oxygen detection has been shown.

Однако при создании кислородных сенсоров и биосенсоров на основе этих соединений возникают следующие проблемы. Во-первых, платиновые комплексы порфиринов, которые наиболее удобны для детекции кислорода в физиологическом диапазоне концентраций О-20% в воздухе или 10-250 мМ в воде), плохо совместимы с имеющейся полупроводниковой оптоэлектроникой, главным образом с источниками света. Зеленые и темно-зеленые светодиоды (на основе GaP, с узким спектром испускания и максимумом при 557 и 567 нм, соответственно) оказываются малоэффективными для возбуждения люминесценции Pt-порфиринов (они имеют узкую полосу поглощения с максимумом при 535 нм). В то же время синие светодиоды (на основе SiC с широким спектром испускания и максимумом в области 480 нм) имеют существенно более низкий энергетический выход по сравнению с светодиодами видимого спектра [7] К тому же интеграл перекрывания их эмиссии и поглощения Pt-порфиринов невелик. However, when creating oxygen sensors and biosensors based on these compounds, the following problems arise. First, platinum porphyrin complexes, which are most convenient for oxygen detection in the physiological range of O-20% concentrations in air or 10-250 mM in water), are poorly compatible with existing semiconductor optoelectronics, mainly with light sources. Green and dark green LEDs (based on GaP, with a narrow emission spectrum and maximum at 557 and 567 nm, respectively) are ineffective for excitation of luminescence of Pt-porphyrins (they have a narrow absorption band with a maximum at 535 nm). At the same time, blue LEDs (based on SiC with a wide emission spectrum and a maximum in the region of 480 nm) have a significantly lower energy yield compared to the visible spectrum LEDs [7]. Moreover, the overlap integral of their emission and absorption of Pt-porphyrins is small.

Палладиевые комплексы порфиринов имеют более удобные спектральные характеристики и могут возбуждаться зелеными светодиодами. Однако в обычных условиях (насыщение воздухом) их люминесценция в сотни раз потушена кислородом из-за чересчур большого времени жизни, которое составляет порядка 1 миллисекунды. Это делает их малопригодными для измерения кислорода в физиологическом диапазоне концентраций. Palladium complexes of porphyrins have more convenient spectral characteristics and can be excited by green LEDs. However, under normal conditions (air saturation), their luminescence is quenched by oxygen hundreds of times because of the excessively long lifetime, which is about 1 millisecond. This makes them unsuitable for measuring oxygen in the physiological concentration range.

При использовании полимерных люминесцирующих композиций на основе металлопорфиринов для оптической детекции кислорода также возникает ряд сложностей. К ним относится, в частности, то, что кинетика люминесценции описанных в патенте [5] полимерных композиций на основе металлопорфиринов (полихлорвинил, полиметилметакрилат с пластификаторами в качестве матриц) имеет многоэкспоненциальный характер. Это существенно затрудняет калибровку, обработку экспериментальных данных и определение концентрации кислорода по люминесценции и может влиять на точность измерений. Невысокая фотохимическая стабильность порфириновых соединений также ограничивает их применение в оптических сенсорах. When using polymer luminescent compositions based on metalloporphyrins for optical oxygen detection, a number of difficulties also arise. These include, in particular, the fact that the luminescence kinetics of the polymer compositions based on metalloporphyrins described in the patent [5] (polyvinyl chloride, polymethyl methacrylate with plasticizers as matrices) is multi-exponential. This substantially complicates the calibration, processing of experimental data, and determination of oxygen concentration from luminescence and can affect the accuracy of measurements. The low photochemical stability of porphyrin compounds also limits their use in optical sensors.

В настоящее время не описано создание и использование оптоволоконных устройств для детекции кислорода на базе полупроводниковой электроники и фосфоресцирующих порфириновых красителей, а также ферментных биосенсоров. Currently, the creation and use of fiber-optic devices for oxygen detection based on semiconductor electronics and phosphorescent porphyrin dyes, as well as enzyme biosensors, has not been described.

Задачей настоящего изобретения является синтез новых, фосфоресцирующих красителей, являющихся производными металлокомплексов порфиринов, главным образом Pt(II)- и Pd(II)-комплексов, которые перспективны, в частности, для использования в волоконно-оптических кислородных сенсорах. The objective of the present invention is the synthesis of new, phosphorescent dyes, which are derivatives of porphyrin metal complexes, mainly Pt (II) and Pd (II) complexes, which are promising, in particular, for use in fiber-optic oxygen sensors.

Другой целью изобретения является разработка чувствительных элементов на основе этих новых красителей, главным образом полимерных кислород-чувствительных фосфоресцирующих композиций (кислородных мембран и/или покрытий), а также ферментных мембран на основе вышеуказанных кислород-чувствительных композиций и кислород-зависимых ферментов. Названные чувствительные элементы предназначены для оптической детекции кислорода и/или биологически активных соединений (метаболитов) в образцах. Another objective of the invention is the development of sensitive elements based on these new dyes, mainly polymer oxygen-sensitive phosphorescent compositions (oxygen membranes and / or coatings), as well as enzyme membranes based on the above oxygen-sensitive compositions and oxygen-dependent enzymes. These sensitive elements are intended for optical detection of oxygen and / or biologically active compounds (metabolites) in samples.

Наконец, целью изобретения является разработка нового способа определения кислорода, который основан на использовании вышеописанных фосфоресцирующих красителей и чувствительных элементов. Finally, the aim of the invention is to develop a new method for the determination of oxygen, which is based on the use of the above phosphorescent dyes and sensitive elements.

Сущность изобретения и реализации поставленных целей заключаются в следующем. The invention and the implementation of the goals are as follows.

Синтез новых фосфоресцирующих красителей осуществляют путем направленной химической модификации порфиринового макроцикла, которая проводится таким образом, чтобы, затронув в минимальной степени способность соответствующих металлокомплексов, интенсивно фосфоресцировать при комнатной температуре, изменить при этом спектральные характеристики фосфоресценции. Производные порфиринов получаются селективным окислением определенного фрагмента порфиринового макроцикла, которое приводит к изменению вследствие этого электронных спектров и некоторых физических характеристик. Процесс химической модификации заключается в конечном счете в получении новых соединений - порфирин-кетонов (или оксо-хлоринов), из которых затем получают металлокомплексы с Pt²⁺ и Pd²⁺. В результате такой модификации удалось синтезировать ранее не описанный класс соединений, которые отличаются структурой, оптическими и физическими свойствами от соответствующих порфириновых соединений, а также родственным им комплексам хлоринов, дигидрохлоринов и т.п. [8]).The synthesis of new phosphorescent dyes is carried out by directed chemical modification of the porphyrin macrocycle, which is carried out in such a way that, having minimized the ability of the corresponding metal complexes, to intensively phosphoresce at room temperature, changing the spectral characteristics of phosphorescence. Derivatives of porphyrins are obtained by selective oxidation of a specific fragment of the porphyrin macrocycle, which leads to a change in this electronic spectra and some physical characteristics. The process of chemical modification ultimately consists in obtaining new compounds - porphyrin-ketones (or oxo-chlorins), from which metal complexes with Pt ²⁺ and Pd ²⁺ are then obtained. As a result of this modification, it was possible to synthesize a previously undescribed class of compounds that differ in structure, optical and physical properties from the corresponding porphyrin compounds, as well as their related complexes of chlorins, dihydrochlorins, etc. [8]).

Структура комплексов порфирин-кетонов (I), а также родственных им комплексов порфиринов (II) и хлоринов (III) приведена ниже. The structure of the porphyrin-ketone (I) complexes, as well as their related complexes of porphyrins (II) and chlorins (III) are given below.

Схема синтеза металлокомплексов порфирин кетонов приведена ниже. The synthesis scheme for porphyrin ketone metal complexes is given below.

Pt- и Pd-комплексы порфирин-кетонов также интенсивно фосфоресцируют при комнатной температуре, квантовые выходы и времена жизни фосфоресценции близки к соответствующим порфириновым комплексам. Они имеют интенсивную полосу поглощения (возбуждения) в области 580-620 нм, которая на 50-60 нм более длинноволновая по сравнению с соответствующими металлопорфиринами. Спектр фосфоресценции также смещен в длинноволновую область более чем на 100 нм. В частности, Pt-комплексы порфирин-кетонов имеют длинноволновый максимум поглощения 591 нм и максимум фосфоресценции при 758 нм. Благодаря таким свойствами они хорошо совместимы с полупроводниковыми источниками видимого света (например, желтыми светодиодами имеющими оптимум эмиссии при 586 нм) и могут быть эффективно использованы для детекции кислорода вместо соответствующих Pt-порфиринов. Полосы поглощения и фосфоресценции палладиевых комплексов порфирин-кетонов сдвинуты соответственно на 10 и 30 нм в красную область по сравнению с платиновыми комплексами и также эффективно возбуждаются желтыми или оранжевыми и красными светодиодами. Pt and Pd complexes of porphyrin ketones also intensively phosphoresce at room temperature, quantum yields and phosphorescence lifetimes are close to the corresponding porphyrin complexes. They have an intense absorption (excitation) band in the region of 580-620 nm, which is 50-60 nm longer than the corresponding metalloporphyrins. The phosphorescence spectrum is also shifted to the long-wavelength region by more than 100 nm. In particular, the Pt complexes of porphyrin ketones have a long-wavelength absorption maximum of 591 nm and a maximum phosphorescence at 758 nm. Owing to these properties, they are well compatible with semiconductor visible light sources (for example, yellow LEDs having an optimum emission at 586 nm) and can be effectively used for oxygen detection instead of the corresponding Pt-porphyrins. The absorption and phosphorescence bands of palladium complexes of porphyrin-ketones are shifted by 10 and 30 nm, respectively, to the red region compared to platinum complexes and are also effectively excited by yellow or orange and red LEDs.

Новые соединения, формально будучи частично окисленными производными порфиринов, помимо более удачных спектральных характеристик, выгодно отличаются от известных еще повышенной устойчивостью к фото- и химическому окислению. Соответствующие экспериментальные данные приведены в дополнительных материалах. New compounds, formally being partially oxidized by derivatives of porphyrins, in addition to more successful spectral characteristics, compares favorably with those known for their increased resistance to photo- and chemical oxidation. Relevant experimental data are given in additional materials.

Как отмечалось выше, длинноволновый сдвиг электронных спектров полученных соединений достигается путем снижения ароматичности макроциклической структуры металлокомплекса. Аналогичный эффект известен также и для флуоресцирующих хлоринов, бактериохлоринов и их металлокомплексов (M.Gouterman. The Porphyrins/ed. D.Dolphin, 1979, v. 3, pp.1-165). Однако эти структуры, которые формально можно рассматривать как восстановленные порфирины, сильно подвержены фотоокислению и малоперспективны для применения в аналогичных целях. Высокой нестабильностью к фото- и химическому окислению обладают также порфирин-диоды и их металлокомплексы промежуточные соединения синтеза порфирин-кетонов (см.схему синтеза). As noted above, the long-wavelength shift of the electronic spectra of the obtained compounds is achieved by reducing the aromaticity of the macrocyclic structure of the metal complex. A similar effect is also known for fluorescent chlorins, bacteriochlorins and their metal complexes (M. Gouterman. The Porphyrins / ed. D. Dolphin, 1979, v. 3, pp. 1-165). However, these structures, which can be formally regarded as reduced porphyrins, are highly susceptible to photooxidation and have little promise for similar applications. Porphyrin diodes and their metal complexes intermediate compounds for the synthesis of porphyrin ketones are also highly unstable to photo- and chemical oxidation (see synthesis scheme).

Металлокомплексы различных порфирин-кетонов, полученных из соответствующих порфиринов и различающиеся только боковыми заместителями порфиринового ядра в 1-8 положениях, имеют близкие люминесцентные свойства. Все они с незначительными модификациями методик могут использоваться согласно настоящему изобретению. The metal complexes of various porphyrin ketones obtained from the corresponding porphyrins and differing only in the lateral substituents of the porphyrin core in 1-8 positions have similar luminescent properties. All of them with minor modifications to the procedures can be used according to the present invention.

На основе вышеописанных металлокомплексов-порфирин-кетонов, главным образом гидрофобных произвольных, а также полистирола, разработаны люминесцирующие кислород-чувствительные композиции (пленки). Новые композиции имеют ряд преимуществ по сравнению с ранее описанными композициями Pd- и Pt-порфиринов. В частности, их люминесценция описывается одноэкспоненциальным законом затухания, что существенно упрощает процедуру измерений и обработку экспериментальных данных при регистрации кислорода по принципу измерения времени жизни люминесценции. Они имеют быстрые и обратимые отклики на изменение концентрации кислорода. Эти полимерные композиции предназначены для использования в волоконно-оптических кислородных сенсорах и ферментных биосенсорах на их основе в качестве кислород-чувствительных элементов (мембран или покрытий). Композиции могут содержать небольшие добавки пластификаторов для улучшения их механических и адгезионных свойств. Мембраны и/или покрытия на основе вышеописанных композиций позволяют точно и количественно определять содержание кислорода на основании измерения интенсивности и/или времени жизни люминесценции. Based on the above-described metal complexes-porphyrin-ketones, mainly hydrophobic arbitrary, as well as polystyrene, luminescent oxygen-sensitive compositions (films) have been developed. The new compositions have several advantages over the previously described compositions of Pd and Pt porphyrins. In particular, their luminescence is described by a single-exponential attenuation law, which greatly simplifies the measurement procedure and the processing of experimental data when oxygen is recorded using the principle of measuring the luminescence lifetime. They have quick and reversible responses to changes in oxygen concentration. These polymer compositions are intended for use in fiber-optic oxygen sensors and enzymatic biosensors based on them as oxygen-sensitive elements (membranes or coatings). Compositions may contain small additives of plasticizers to improve their mechanical and adhesive properties. Membranes and / or coatings based on the above compositions allow accurate and quantitative determination of oxygen content based on measurements of luminescence intensity and / or lifetime.

Ферментные мембраны получают путем сопряжения соответствующих кислород-зависимых ферментов (или ферментных систем) с вышеописанными кислородными мембранами. Например, для фермента глюкозооксидазы (ГО), который катализирует реакцию:

количественную оценку содержания субстрата можно вести опосредованно по уровню потребления кислорода.Enzyme membranes are obtained by coupling the corresponding oxygen-dependent enzymes (or enzyme systems) with the above-described oxygen membranes. For example, for the enzyme glucose oxidase (GO), which catalyzes the reaction:

quantitative assessment of the substrate content can be carried out indirectly by the level of oxygen consumption.

Ферментные мембраны готовят путем иммобилизации фермента или ферментной системы, одним из субстратов которой является кислород, непосредственно на вышеописанной кислород-чувствительной полимерной композиции [1,2] Полученные таким образом мембраны чувствительны к соответствующему второму субстрату фермента. При введении субстрата в насыщенный воздухом анализируемый раствор такая мембрана дает люминесцентный отклик (возгорание люминесценции вследствие снятия тушения кислородом), который пропорционален концентрации субстрата. Мембраны с иммобилизованными глюкозооксидазой, лактатоксидазой, этинолоксидазой, холестериноксидазой, уреказой и т.п. могут использоваться в качестве активных элементов в соответствующих устройствах (биосенсорах) вместо вышеописанных кислородных мембран для определения соответственно глюкозы, лактата, этанола, холестерина, мочевой кислоты и др. Enzyme membranes are prepared by immobilizing an enzyme or enzyme system, one of the substrates of which is oxygen, directly on the above oxygen-sensitive polymer composition [1,2] The membranes thus obtained are sensitive to the corresponding second substrate of the enzyme. When a substrate is introduced into an air-saturated analyte solution, such a membrane gives a luminescent response (luminescence ignition due to removal of quenching by oxygen), which is proportional to the concentration of the substrate. Membranes with immobilized glucose oxidase, lactate oxidase, ethinol oxidase, cholesterol oxidase, urease, etc. can be used as active elements in appropriate devices (biosensors) instead of the oxygen membranes described above to determine glucose, lactate, ethanol, cholesterol, uric acid, etc.

Новый способ определения кислорода основан на использовании вышеописанных чувствительных элементов, содержащих новые кислород-чувствительные фосфоресцирующие красители, а также полупроводниковой оптоэлектроники и электронных схем микросекундной временной логики, которые позволяют вести измерение интенсивности и/или времени жизни люминесценции вышеуказанных композиций. A new method for determining oxygen is based on the use of the above-described sensitive elements containing new oxygen-sensitive phosphorescent dyes, as well as semiconductor optoelectronics and electronic microsecond time logic circuits, which make it possible to measure the intensity and / or luminescence lifetime of the above compositions.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами. The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Синтез Pt-октаэтилпорфин-кетона (гидрофобный, водонерастворимый краситель). Example 1. Synthesis of Pt-octaethylporfin-ketone (hydrophobic, water-insoluble dye).

а) 100 мг октаэтилпорфина (ОЭП) растворяют в 30 мл хлороформа. Добавляют 200 мг OsO₄ и 3 капли пиридина. Выдерживают 24 часа в темноте и затем пропускают через раствор ток сероводорода в течение 10 мин. Осадок сульфида осмия отфильтровывают. Раствор упаривают в вакууме досуха. Остаток хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ/эфир 95/5, Собирают основную фракцию цис-диола октаэтилпорфина, упаривают, кристаллизуют из хлороформ/метанола. Выход около 40%
б) 40 мг цис-диола октаэтилпорфина растворяют в 10 мл концентрированной серной кислоты и выдерживают 10 минут при комнатной температуре. Затем смесь выливают на тонкоизмельченный лед, нейтрализуют водным аммиаком. Осадок отфильтровывают, сушат, растворяют в 5 мл хлороформа и хроматографируют на колонке с силикагелем в хлороформе. Собирают основную фракцию октаэтилпорфин-кетона. Кристаллизуют из хлороформ/метанола. Выход около 90%
в) 30 мг октаэтилпорфин-кетона растворяют в 3 мл бензонитрила, добавляют 200 мг K₂PtCl₄ и кипятят в течение 3 часов. Затем смесь упаривают досуха. Остаток кипятят с 50 мл хлороформа 15 минут, полученный раствор упаривают досуха. Остаток хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ/ацетон 95/5. Собирают основную фракцию платинового комплекса октаэтилпорфин-кетон (Pt-ОЭП-кетон). Упаривают, получают 18 мг основного вещества. Выход около 60%
Данные элементного анализа для Pt-октаэтилпорфин-кетона. Найдено, C - 57,99; H 5,90; N 7,50. C₃₆H₄₄N₄OPt. Вычислено, C - 58,07; H 5,96; N 7,53.a) 100 mg of octaethylporfin (OED) are dissolved in 30 ml of chloroform. 200 mg of OsO ₄ and 3 drops of pyridine are added. It is held for 24 hours in the dark and then a stream of hydrogen sulfide is passed through the solution for 10 minutes. The precipitate of osmium sulfide is filtered off. The solution was evaporated to dryness in vacuo. The residue is chromatographed on a silica gel column in a chloroform / ether 95/5 system. The main fraction of cis-diol octaethyl porphin is collected, evaporated, crystallized from chloroform / methanol. Yield about 40%
b) 40 mg of cis-diol octaethylporfin is dissolved in 10 ml of concentrated sulfuric acid and incubated for 10 minutes at room temperature. Then the mixture is poured onto finely divided ice, neutralized with aqueous ammonia. The precipitate is filtered off, dried, dissolved in 5 ml of chloroform and chromatographed on a silica gel column in chloroform. The main fraction of octaethylporfin ketone is collected. Crystallized from chloroform / methanol. Yield about 90%
c) 30 mg of octaethylporfin-ketone are dissolved in 3 ml of benzonitrile, 200 mg of K ₂ PtCl ₄ are added and boiled for 3 hours. Then the mixture is evaporated to dryness. The residue is boiled with 50 ml of chloroform for 15 minutes, the resulting solution is evaporated to dryness. The residue is chromatographed on a silica gel column in a chloroform / acetone 95/5 system. The main fraction of the platinum complex octaethylporfin-ketone (Pt-OEP-ketone) is collected. Evaporate to obtain 18 mg of the basic substance. Yield about 60%
Elemental analysis data for Pt-octaethylporfin ketone. Found C, 57.99; H 5.90; N, 7.50. C ₃₆ H ₄₄ N ₄ OPt. Calculated, C - 58.07; H 5.96; N, 7.53.

Пример 2. Получение Pd-октаэтилпорфин-кетона. 30 мг октаэтилкетона (см. пример 1) растворяют в 10 мл диметилформамида, добавляют раствор 100 мг PdCl₂ в 10 мл диметилформамида. Нагревают при 110^oС в течение 30 минут. Охлаждают до 70-80^oС, добавляют по каплям 5 мл воды, охлаждают. Выпавший осадок фильтруют, кристаллизуют из хлороформ/метанола. Получают 27 мг палладиевого комплекса октаэтилпорфин-кетона. Выход около 90%
Данные элементного анализа для Pd октаэтилпорфин-кетон. Найдено, С - 65,89; H 6,69; N 8,50. C₃₆H_44>N₄OPd. Вычислено, C - 65,99; H 6,77; N 8,55.Example 2. Obtaining Pd-octaethylporfin-ketone. 30 mg of octaethyl ketone (see Example 1) are dissolved in 10 ml of dimethylformamide, a solution of 100 mg of PdCl ₂ in 10 ml of dimethylformamide is added. Heated at 110 ^o C for 30 minutes. Cool to 70-80 ^o C, add dropwise 5 ml of water, cool. The precipitate was filtered, crystallized from chloroform / methanol. Obtain 27 mg of the palladium complex of octaethylporfin-ketone. Yield about 90%
Elemental analysis data for Pd octaethylporfin ketone. Found, C - 65.89; H 6.69; N, 8.50. C ₃₆ H _44> N ₄ OPd. Calculated, C - 65.99; H 6.77; N, 8.55.

Пример 3. Синтез Pt-копропорфирин I-кетона (водорастворимый краситель) и его тетраэтилового эфира. Example 3. Synthesis of Pt-coproporphyrin I-ketone (water-soluble dye) and its tetraethyl ether.

а) 100 мг тетраэтилового эфира копропорфирина I обрабатывают аналогично примеру 1а), но выдерживают с OsO₄ 12 часов. Получают цис-диол тетраэтилового эфира копропорфирина I с выходом 30%
б) 30 мг цис-диола растворяют в 10 мл концентрированной серной кислоты при 0^oC при перемешивании, выдерживают 15 минут. Раствор выливают на 100 г льда, нейтрализуют аммиаком. Осадок фильтруют, сушат, хроматографируют. Выход около 75% тетраэтилового эфира копропорфирина I-кетона (ТЭЭ КП-кетон).a) 100 mg of coproporphyrin tetraethyl ester I is treated analogously to example 1a), but incubated with OsO _{4 for} 12 hours. Coproporphyrin I cis-diol tetraethyl ester is obtained in 30% yield.
b) 30 mg of cis-diol is dissolved in 10 ml of concentrated sulfuric acid at 0 ^o C with stirring, incubated for 15 minutes. The solution is poured onto 100 g of ice, neutralized with ammonia. The precipitate was filtered, dried, chromatographed. The yield of about 75% of the tetraethyl ester of coproporphyrin I-ketone (TEE KP-ketone).

в) 20 мг ТЭЭ КП-кетона растворяют в 5 мл бензонитрила, добавляют 150 мг K₂PtCl₆ и кипятят 1 час. Раствор упаривают досуха. Остаток экстрагируют хлороформом. Хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ/эфир 10/1. Выход платинового комплекса тетраэтилового эфира копропорфирин I-кетона 75%
Данные элементного анализа для Pd копропорфирин I-кетона ТЭЭ. Найдено, C 59,51; H 5,87; N 6,27. C₄₄H₅₂N₄Pd. Вычислено, C - 59,56; H 5,91; N 6,31.c) 20 mg of TEE KP-ketone is dissolved in 5 ml of benzonitrile, 150 mg of K ₂ PtCl ₆ are added and boiled for 1 hour. The solution was evaporated to dryness. The residue was extracted with chloroform. Chromatograph on a silica gel column in chloroform / ether 10/1 system. The output of the platinum complex of tetraethyl ether coproporphyrin I-ketone 75%
Elemental analysis data for Pd coproporphyrin I-ketone TEE. Found C, 59.51; H 5.87; N, 6.27. C ₄₄ H ₅₂ N ₄ Pd. Calculated, C - 59.56; H 5.91; N, 6.31.

г) 15 мг тетраэтилового эфира Pd-копропорфирин I-кетона растворяют в 10 мл диоксана, добавляют 100 мг КОН в 1 мл воды. Нагревают при 70^oC в течение 4 часов. Добавляют 50 мл воды, нейтрализуют до рН 5 соляной кислотой. Осадок отфильтровывают, сушат. Выход Pt-копропорфирин I-кетона около 100%
Данные элементного анализа для Pd копропорфирин I-кетона. Найдено, C - 55,71; H 4,63; N 7,20. C₃₆H₃₆N₄O₉Pd. Вычислено, C 55,78; H 4,68; N 7,23.g) 15 mg of Pd-coproporphyrin I-ketone tetraethyl ether is dissolved in 10 ml of dioxane, 100 mg of KOH in 1 ml of water are added. Heated at 70 ^o C for 4 hours. Add 50 ml of water, neutralize to pH 5 with hydrochloric acid. The precipitate is filtered off and dried. The yield of Pt-coproporphyrin I-ketone is about 100%
Elemental analysis data for Pd coproporphyrin I-ketone. Found C, 55.71; H 4.63; N, 7.20. C ₃₆ H ₃₆ N ₄ O ₉ Pd. Calculated, C 55.78; H 4.68; N, 7.23.

Пример 4. Синтезы других комплексов порфирин-кетонов. Example 4. Syntheses of other complexes of porphyrin-ketones.

Pd комплексы копpопорфирин I-кетона и его тетраэтилового эфира синтезируются исходя из ТЭЭ копропорфирин I-кетона и PdCl₂ идентично комплексам октаэтилпорфин-кетону (см.пример 2).Pd complexes of coproporphyrin I-ketone and its tetraethyl ether are synthesized starting from TEE coproporphyrin I-ketone and PdCl ₂ identical to the complexes of octaethylporfin-ketone (see Example 2).

Комплексы этиопорфирин-кетона (R₁= R₃= R₅= R₇=CH₃, R₂=R₄=R₆=R₈=CH₂CH₃) синтезируются полностью аналогично соответствующим комплексам октаэтилпорфина (см. примеры 1, 2 описания).Ethioporphyrin-ketone complexes (R ₁ = R ₃ = R ₅ = R ₇ = CH ₃ , R ₂ = R ₄ = R ₆ = R ₈ = CH ₂ CH ₃ ) are synthesized completely analogously to the corresponding complexes of octaethylporfin (see examples 1, 2 descriptions).

Синтез Pd и Pt комплексов копропорфирина III-кетона и их тетраэтиловых эфиров. Копропоpфирин III (R₁= R₃= R₅= R₈= CH₃, R₂=R₄R₆R₇ CH₂CH₂COOCH₂CH₃ окисляют OsO₄ с последующей инкубацией с серной кислотой и очисткой аналогично примеру 1. При этом ввиду ассиметричной структуры исходного порфирина получается смесь четырех основных изомеров копропорфирин-кетона, которые спектрально неразличимы (т.е. идентичны) используется для получения Pt и Pd комплексов, методика полностью аналогична описанным в примерах 2, 3.Synthesis of Pd and Pt complexes of coproporphyrin III-ketone and their tetraethyl esters. Coproporphyrin III (R ₁ = R ₃ = R ₅ = R ₈ = CH ₃ , R ₂ = R ₄ R ₆ R ₇ CH ₂ CH ₂ COOCH ₂ CH _{3 is} oxidized with OsO ₄ , followed by incubation with sulfuric acid and purification as in Example 1. In this case, due to the asymmetric structure of the initial porphyrin, a mixture of four main isomers of coproporphyrin-ketone is obtained, which are spectrally indistinguishable (i.e. identical) is used to obtain Pt and Pd complexes, the technique is completely similar to that described in examples 2, 3.

Пример 5. Люминесцентные свойства металлокомплексов порфирин-кетонов. Корректированные спектры возбуждения и некорректированные спектры эмиссии (фосфоресценции) снимали на люминесцентном спектрометре LS-50 (Perkin Elmer, Англия) для разбавленных растворов красителей (0,1-1,0 мМ) в соответствующем растворителе (толуол или водный буфер). Спектры Pt-октаэтилпорфина и синтезированного Pt-октаэтилпорфин-кетона приведены на рис.1. Спектры аналогичных Pd-производных приведены на рис.2. Как видно, химическая модификация приводит к значительному длинноволновому смешению в спектрах возбуждения и эмиссии новых красителей. Example 5. Luminescent properties of porphyrin-ketone metal complexes. The corrected excitation spectra and the uncorrected emission (phosphorescence) spectra were recorded on an LS-50 luminescent spectrometer (Perkin Elmer, England) for diluted dye solutions (0.1-1.0 mM) in an appropriate solvent (toluene or aqueous buffer). The spectra of Pt-octaethylporfin and synthesized Pt-octaethylporfin-ketone are shown in Fig. 1. The spectra of similar Pd derivatives are shown in Fig. 2. As can be seen, chemical modification leads to a significant long-wave mixing in the excitation and emission spectra of new dyes.

Спектры возбуждения и эмиссии металлокомплексов различных производных порфирин-кетонов (например Pt-ОЭП-кетон, Pt-капропорфирина I-кетона и тетраэтилового эфира Pt-копропорфирина I-кетона) практически идентичны вышеописанным (рис.1, 2). The spectra of excitation and emission of metal complexes of various derivatives of porphyrin ketones (e.g., Pt-OEP ketone, Pt-caproporphyrin I-ketone and tetraethyl ether Pt-coproporphyrin I-ketone) are almost identical to those described above (Figs. 1, 2).

Сравнительные свойства комплексов порфирин-кетонов приведены в таблице. Comparative properties of porphyrin-ketone complexes are given in the table.

Времена жизни фосфоресценции Pt-октаэтилпорфин-кетона и Pd-октаэтилпорфинкетона в обескислороженных растворах (мицеллярный 1% раствор Тритона Х-100, содержащий 10 мг/мл сульфита натрия, рН 7,0) при комнатной температуре составляют 60 и 450 микросекунд соответственно (25^oС). Для соответствующих металлопорфиринов эти значения составляют порядка 95 и 1100 микросекунд. Для производных различной структуры временные характеристики также оказываются близкими.The phosphorescence lifetimes of Pt-octaethyl porphin ketone and Pd octaethyl porphin ketone in oxygen-free solutions (micellar 1% solution of Triton X-100 containing 10 mg / ml sodium sulfite, pH 7.0) at room temperature are 60 and 450 microseconds, respectively (25 ^o FROM). For the corresponding metalloporphyrins, these values are of the order of 95 and 1100 microseconds. For derivatives of various structures, the temporal characteristics are also close.

Пример 6. Получение и свойства полимерных композиций на основе Рt-порфирин-кетонов. Example 6. Obtaining and properties of polymer compositions based on PT-porphyrin-ketones.

10 мг Pt-ОЭП-кетона растворяют в 1 мл хлороформа. Полученный раствор смешивают с 10 мл 5% раствора полистирола в толуоле. Полученный раствор полимерной композиции хранят при комнатной температуре в темноте. 10 mg of Pt-OEP ketone is dissolved in 1 ml of chloroform. The resulting solution was mixed with 10 ml of a 5% solution of polystyrene in toluene. The resulting solution of the polymer composition is stored at room temperature in the dark.

Для получения кислород-чувствительных покрытий и мембран раствор полимерной композиции наносят тонким слоем на горизонтальную поверхность оптического элемента (стеклянная пластина, прозрачная полиэфирная пленка или торец оптического волокна) и высушивают на воздухе в течение 1-12 часов. Полученные таким образом элементы с нанесенной пленкой полимерной композиции толщиной 1-20 микрон имеют удовлетворительные механические свойства и могут использоваться для оптической детекции кислорода в водной и газовой фазах. Высокая концентрация красителя в пленке обеспечивает эффективное поглощение возбуждающего света (оптическая плотность на длине волны 595 нм составляет 0,1-2 единиц) и высокие уровни люминесцентного сигнала. To obtain oxygen-sensitive coatings and membranes, a solution of the polymer composition is applied with a thin layer on the horizontal surface of the optical element (glass plate, transparent polyester film or end of the optical fiber) and dried in air for 1-12 hours. The thus obtained elements with a film-coated polymer composition with a thickness of 1-20 microns have satisfactory mechanical properties and can be used for optical detection of oxygen in the aqueous and gas phases. The high concentration of the dye in the film provides effective absorption of exciting light (optical density at a wavelength of 595 nm is 0.1-2 units) and high levels of the luminescent signal.

На рис.3 показаны кинетики затухания люминесценции полимерных композиций Pt- и Pd-октаэтилпорфин-кетонов в полистироле и их линеаризация по одноэкспоненциальному закону. Характер зависимостей не изменяется при различных концентрациях кислорода и при изменении концентрации красителя в полимере в диапазоне 0,1-50 мМ последнего. Времена жизни люминесценции красителей в композиции в отсутствии тушителя (кислорода) составляют 63,0 мкс и 450 мкс для Pt- и Pd-комплекса соответственно, при 25^oC.Figure 3 shows the luminescence decay kinetics of polymer compositions of Pt- and Pd-octaethylporfin-ketones in polystyrene and their linearization according to the one-exponential law. The nature of the dependences does not change at various oxygen concentrations and with a change in the concentration of the dye in the polymer in the range of 0.1-50 mm last. The luminescence lifetimes of dyes in the composition in the absence of a quencher (oxygen) are 63.0 μs and 450 μs for the Pt and Pd complex, respectively, at 25 ^o C.

На рис. 4 приведена калибровочная кривая для определения кислорода (давления воздуха) в газовой фазе с использованием полимерной кислород-чувствительной композиции на основе Pt-октаэтилпорфин-кетона. Она представлена в шкале времен жизни фосфоресценции (микросекунды), а также в линеаризованном виде в координатах Штерна-Фольмера (t_o/t [Q]). Амплитуда изменения времени жизни для обескислороженных и насыщенных воздухом сред составляет около 4 раз при 25^oС. Изменения интенсивности люминесценции и их характер аналогичны изменениям времени жизни люминесценции, что свидетельствует об истинно динамическом типе тушения люминесценции красителей в полимерных композициях.In fig. Figure 4 shows a calibration curve for determining oxygen (air pressure) in the gas phase using a polymer oxygen-sensitive composition based on Pt-octaethylporfin-ketone. It is presented on the phosphorescence lifetime scale (microseconds), as well as in a linearized form in Stern-Volmer coordinates (t _o / t [Q]). The amplitude of the change in the lifetime for oxygen-depleted and air-saturated media is about 4 times at 25 ^° C. The changes in the luminescence intensity and their nature are similar to the changes in the luminescence lifetime, which indicates a truly dynamic type of luminescence quenching of dyes in polymer compositions.

Аналогичным образом получают полимерные композиции исходя из Pt-, Pd-комплексов тетраэтилового эфира копропорфирина I-кетона и других гидрофобных порфирин-кетонов. Люминесцентные и кислород-чувствительные свойства полученных композиций аналогичны вышеописанным. In a similar manner, polymer compositions are prepared based on the Pt and Pd complexes of the coproporphyrin I-ketone tetraethyl ester and other hydrophobic porphyrin ketones. Luminescent and oxygen-sensitive properties of the obtained compositions are similar to those described above.

Содержание люминесцирующего красителя в полимерной композиции диктуется практическими соображениями. Нижний предел обусловлен чувствительностью детектирующей системы, поскольку величина фосфоресцентного сигнала прямо связан с концентрацией красителя. Верхний предел обусловлен, с одной стороны, растворимостью красителя в полимере, а с другой эффективностью поглощения возбуждающего света данной композицией. Если эффективность поглощения близка к 100% то практически весь возбуждающий свет трансформируется в фосфоресценцию и дальнейшее увеличение концентрации красителя не имеет смысла. В частности, для системы Pt-октаэтилпорфин-кетон-полистирол в описании указан исследованный диапазон концентраций красителя 0,1-50 мМ, который и соответствует весовому диапазону, приведенному затем в формуле: верхний предел составляет 5% (в/в). При более высоком соотношении при испарении растворителя (толуола) краситель в полимерной пленке агрегирует и/или выпадает в осадок, и удельный фосфоресцентный сигнал не растет. При 5% весовом содержании красителя эффективность поглощения возбуждающего света 3-микронной пленкой композиции составляет около 50% что близко к теоретическому пределу и вполне удовлетворяет практическим задачам. The content of the luminescent dye in the polymer composition is dictated by practical considerations. The lower limit is due to the sensitivity of the detecting system, since the value of the phosphorescent signal is directly related to the concentration of the dye. The upper limit is due, on the one hand, to the solubility of the dye in the polymer, and, on the other hand, to the efficiency of the absorption of exciting light by this composition. If the absorption efficiency is close to 100%, then practically all the exciting light is transformed into phosphorescence and a further increase in the dye concentration does not make sense. In particular, for the Pt-octaethylporfin-ketone-polystyrene system, the description describes the investigated range of dye concentrations of 0.1-50 mM, which corresponds to the weight range then given in the formula: the upper limit is 5% (w / w). At a higher ratio during evaporation of the solvent (toluene), the dye in the polymer film aggregates and / or precipitates, and the specific phosphorescent signal does not increase. At 5% by weight of the dye, the efficiency of the absorption of exciting light by a 3-micron film of the composition is about 50%, which is close to the theoretical limit and completely satisfies practical problems.

Сравнение фотостабильности комплексов порфиринов и порфирин-кетонов проводили следующим образом. По одинаковым методам (см.выше) были изготовлены кислород-чувствительные элементы на основе pt-ОЭП и Pt-ОЭП-кетона, которые затем были подвергнуты интенсивному облучению полихроматическим светом в одинаковых условиях. Через 18-часов остаточный люминесцентный сигнал (интенсивность) составлял соответственно 34% и 95% т.е. фотохимическая стабильность кислород-чувствительных мембран на основе Pt-ОЭП-кетона примерно в 10 раз лучше, чем для аналогичных на основе Pt-ОЭП. Эти свойства также делают использование новых соединений более предпочтительным по сравнению с известными. A comparison of the photostability of the complexes of porphyrins and porphyrin-ketones was carried out as follows. Using the same methods (see above), oxygen-sensitive elements based on pt-OEP and Pt-OEP ketone were made, which were then subjected to intense irradiation with polychromatic light under the same conditions. After 18 hours, the residual luminescent signal (intensity) was 34% and 95%, respectively The photochemical stability of oxygen-sensitive membranes based on Pt-OEP-ketone is about 10 times better than for similar ones based on Pt-OEP. These properties also make the use of new compounds more preferable than known.

Пример 7. Определение кислорода с использованием полимерных композиций на основе платиновых комплексов порфирин-кетонов. Example 7. Determination of oxygen using polymer compositions based on platinum complexes of porphyrin-ketones.

Для этого был сконструирован прототип волоконно-оптического кислородного сенсора, изображенный в общем виде на рис.5. Основной его компонент - погружной активный элемент, который представляет собой кислород-чувствительную мембрану на основе вышеописанных полимерных композиций, закрепленную на конце раздвоенного волоконно-оптического жгута. Жгут обеспечивает эффективную оптическую связь между кислородной мембраной и оптоэлектронным детектором. For this, a prototype fiber-optic oxygen sensor was constructed, which is depicted in general form in Fig. 5. Its main component is a submersible active element, which is an oxygen-sensitive membrane based on the above polymer compositions, mounted on the end of a bifurcated fiber optic bundle. The harness provides an effective optical connection between the oxygen membrane and the optoelectronic detector.

Люминесцентный детектор оптимизирован под измерении люминесценции вышеописанных композиций. В нем используется импульсный режим измерения длительной люминесценции, который основан на согласованной модуляции интенсивности источника света (светодиода) и фотоприемника (фотодиода). Такой режим позволяет определять световые сигналы через определенное время (время задержки) после короткой вспышки источника света. Время задержки может быть переменной величиной, ее величина сравнима с временем затухания люминесценции композиции. Это позволяет определить по нескольким точкам кинетику затухания свечения, а также опорный сигнал (т.е. когда время задержки существенно превосходит время затухания), и рассчитать, таким образом, время жизни специфического сигнала (люминесценции). The luminescent detector is optimized for measuring the luminescence of the above compositions. It uses a pulsed mode of measuring long-term luminescence, which is based on coordinated modulation of the intensity of the light source (LED) and photodetector (photodiode). This mode allows you to define light signals after a certain time (delay time) after a short flash of the light source. The delay time can be a variable, its value is comparable with the decay time of the luminescence of the composition. This makes it possible to determine the kinetics of the decay of the glow, as well as the reference signal (i.e., when the delay time significantly exceeds the decay time), and thus calculate the lifetime of a specific signal (luminescence).

Блок-схема оптического кислородного сенсора, в состав которого входит оптоэлектронный люминесцентный детектор и кислородная мембрана на основе Pt-октаэтилпорфин-кетона, приведена на рис.6. В него входят:
люминесцирующая мембрана на основе Pt-комплекса порфирин-кетона;
(волоконно)оптический узел (раздвоенный световой жгут);
полупроводниковой импульсный источник света (светодиод или лазер) с оптимумом эмиссии в области 550-650 нм;
фотоприемник (фотодиод) с оптимумом чувствительности в области 700-850 нм;
электрическая схема модуляции интенсивности источника света;
электрическая схема модуляции напряжения на фотоприемнике;
электрическая схема согласования двух схем модуляции, обеспечивающая их обратную связь и переменное время задержки;
блок предусиления и/или усиления электрического сигнала с фотодиода;
блок обработки сигнала и вывода сигнала (аналоговый и/или цифровой);
блок питания постоянного тока.The block diagram of the optical oxygen sensor, which includes an optoelectronic luminescent detector and an oxygen membrane based on Pt-octaethylporfin ketone, is shown in Fig. 6. It includes:
a luminescent membrane based on the Pt complex of porphyrin-ketone;
(fiber) optical node (forked light bundle);
a semiconductor pulsed light source (LED or laser) with an optimum emission in the range of 550-650 nm;
photodetector (photo diode) with optimum sensitivity in the region of 700-850 nm;
electrical circuit for modulating the intensity of the light source;
electrical circuit for modulating voltage at the photodetector;
an electrical matching circuit for two modulation schemes, providing feedback and variable delay time;
block preamplification and / or amplification of the electrical signal from the photodiode;
signal processing and signal output unit (analog and / or digital);
DC power supply.

Устройство функционирует следующим образом. The device operates as follows.

Кислородная мембрана (диск диаметром 8 мм, закрепленный на общем конце раздвоенного волоконно-оптического жгута) имеет диффузионный контакт с анализируемым объектом (жидкость или газ), а также (волоконно)оптическую связь с детектором люминесценции. Оптический канал: светодиод мембрана фотодиод также оснащен оптическими фильтрами для эффективной дискриминации возбуждающего света и фосфоресценции. Светодиод обеспечивает возбуждение люминесценции композиции в области поглощения красителя, фотодиод - регистрацию фосфоресценции, испускаемой красителем, в соответствующей спектральной области. Электрический сигнал с фотодиода проходит схему предусиления и усиления и при необходимости преобразуется из аналогового в цифровой. Схемы модуляции, работающие в согласованном режиме с основной частотой порядка 1 кГц, необходимы для измерения рабочего и опорного сигналов. Рабочий сигнал с фотодиода измеряется спустя определенное время после затухания светодиода (время задержки), которое сравнимо с длительностью люминесценции красителя: диапазон 10-100 микросекунд. При работе в режиме измерения времен жизни рабочий сигнал измеряется при нескольких значениях времени задержки. Опорный сигнал измеряется при времени задержки значительно больше длительности люминесценции: порядка 300-1000 микросекунд. Время интегрирования единичного сигнала (ворота счета) сравнимо с временем затухания красителя и составляет порядка 100 микросекунд. Время накопления сигнала эквивалентно времени 100-1000 вспышек источника света. Принципиальная схема измерения времени жизни люминесценции приведена на рис.7. Схемы обработки и вывода информации с учетом величины опорного сигнала рассчитывают интегральные специфические сигналы (в единицах интенсивности люминесценции или времен жизни) и соответствующие им содержание кислорода в анализируемой среде. Устройство предусматривает проведение начальной калибровки по кислороду по крайней мере по двум точкам и периодических подкалибровок. The oxygen membrane (a disk with a diameter of 8 mm mounted on the common end of the bifurcated fiber optic bundle) has diffusion contact with the analyzed object (liquid or gas), as well as (fiber) optical communication with the luminescence detector. Optical channel: the LED membrane photodiode is also equipped with optical filters for effective discrimination of exciting light and phosphorescence. The LED provides excitation of the luminescence of the composition in the region of dye absorption, the photodiode - registration of phosphorescence emitted by the dye in the corresponding spectral region. The electrical signal from the photodiode passes the preamplification and amplification circuit and, if necessary, is converted from analog to digital. Modulation schemes operating in a coordinated mode with a fundamental frequency of the order of 1 kHz are necessary for measuring the working and reference signals. The working signal from the photodiode is measured after a certain time after the damping of the LED (delay time), which is comparable to the dye luminescence duration: range 10-100 microseconds. When operating in the mode of measuring lifetimes, the working signal is measured at several values of the delay time. The reference signal is measured at a delay time significantly longer than the luminescence duration: about 300-1000 microseconds. The integration time of a single signal (counting gate) is comparable to the dye decay time and is about 100 microseconds. The signal accumulation time is equivalent to a time of 100-1000 flashes of a light source. A schematic diagram of measuring the luminescence lifetime is shown in Fig. 7. The information processing and output schemes, taking into account the magnitude of the reference signal, calculate specific integral signals (in units of luminescence intensity or lifetimes) and the corresponding oxygen content in the analyzed medium. The device provides for the initial calibration of oxygen at least two points and periodic sub-calibrations.

Вышеописанное устройство позволяет измерять интенсивность и/или время жизни люминесценции вышеописанных кислородных мембран или покрытий, помещенных на конец раздвоенного оптического волокна, и по результатам этих измерений рассчитывать содержание кислорода в анализируемом образце. The above device allows you to measure the intensity and / or lifetime of the luminescence of the above oxygen membranes or coatings placed on the end of a bifurcated optical fiber, and from the results of these measurements to calculate the oxygen content in the analyzed sample.

На рис.8 показана типичная кривая люминесцентного отклика пленки на изменение концентрации кислорода в системе (водный раствор). Время 95% отклика составляет порядка 10 сек, включая время переноса активного элемента из раствора насыщенного воздухом в обескислороженный раствор. Figure 8 shows a typical curve of the luminescent response of a film to a change in the oxygen concentration in the system (aqueous solution). The 95% response time is of the order of 10 seconds, including the transfer time of the active element from a solution saturated with air to an oxygen-free solution.

Пример 8. Получение чувствительных элементов с использованием ферментов-оксидаз. Example 8. Obtaining sensitive elements using enzymes oxidases.

а) Чувствительный элемент для определения глюкозы. a) Sensitive element for the determination of glucose.

Полимерную композицию получают и наносят на полиэфирную подложку аналогично примеру 3. На полученной таким образом кислородной мембране иммобилизуют фермент глюкозоксидазу. Это осуществляют следующим образом. 50 мг фермента растворяют в 1 мл дистиллированной воды и добавляют раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 0,2% (в/в). Полученный раствор наносят на горизонтальную поверхность кислородной мембраны, равномерно распределяя его по площади примерно равной 25 см² и высушивают досуха на воздухе (1-3 часа). Полученную таким образом глюкозооксидазную мембрану хранят при +4^oC в сухом виде или в фосфатном буфере, рН 7,0 с 0,1% азида натрия.The polymer composition is prepared and applied to a polyester substrate in the same manner as in Example 3. The glucose oxidase enzyme is immobilized on the thus obtained oxygen membrane. This is as follows. 50 mg of the enzyme is dissolved in 1 ml of distilled water and a solution of glutaraldehyde is added to a final concentration of 0.2% (w / w). The resulting solution is applied to the horizontal surface of the oxygen membrane, uniformly distributing it over an area of approximately equal to 25 cm ² and dried to dryness in air (1-3 hours). Thus obtained glucose oxidase membrane is stored at + 4 ^o C in dry form or in phosphate buffer, pH 7.0 with 0.1% sodium azide.

Для детекции глюкозы используют вышеописанный кислородный датчик (см. пример 6), активный элемент которого оснащен вышеописанной глюкозооксидазной мембраной, а не кислородной мембраной. Измерения проводят в 0,05 М фосфатном буфере. Волоконно-оптический активный элемент последовательно погружают в растворы с различным содержанием глюкозы (в промежутках промывают чистым буфером) и контролируют изменением интенсивности люминесценции. Характерный вид кривой люминесцентного отклика волоконно-оптического глюкозного биосенсора погружного типа показан на рис.9. Величина конечного отклика в образце глюкозы (стационарный сигнал) после стабилизации люминесцентного сигнала (характерное время 2-10 мин) служит для количественной оценки содержания анализируемого вещества. По величине этого отклика (интенсивности или времени жизни) определяют соответствующее ему содержания глюкозы в образце, используя предварительно полученную калибровку. For the detection of glucose, the above-described oxygen sensor is used (see Example 6), the active element of which is equipped with the above-described glucose oxidase membrane, and not an oxygen membrane. Measurements are carried out in 0.05 M phosphate buffer. The fiber-optic active element is successively immersed in solutions with different glucose contents (washed in between with a clean buffer) and controlled by a change in the luminescence intensity. A typical view of the luminescent response curve of an immersion fiber-optic glucose biosensor is shown in Fig. 9. The value of the final response in the glucose sample (stationary signal) after stabilization of the luminescent signal (typical time 2-10 min) serves to quantify the content of the analyte. The magnitude of this response (intensity or lifetime) determines the corresponding glucose content in the sample using a previously obtained calibration.

б) Чувствительный элемент для определения холестерина. b) A sensitive element for determining cholesterol.

Ферментную мембрану на основе кислород-чувствительной композиции pt-ОЭП-кетон-полистирол и холестериноксидазы (из Pseudomonas fluorescens) получали аналогично методике из примера 7. К 0,2 мл фермента (3 мг/мл, 100 Ед/мл) добавляли глутаровый альдегид в конечной концентрации 0,2% наносили на поверхность кислородной мембраны (площадь 10 см²) и инкубировали 1 час при комнатной температуре (не высушивать досуха). Затем мембрану промывали и хранили в буфере при 4^oС.An enzyme membrane based on the oxygen-sensitive composition pt-OEP-ketone-polystyrene and cholesterol oxidase (from Pseudomonas fluorescens) was obtained analogously to the procedure of Example 7. Glutaraldehyde was added to 0.2 ml of the enzyme (3 mg / ml, 100 U / ml) a final concentration of 0.2% was applied to the surface of the oxygen membrane (10 cm ^{2 area} ) and incubated for 1 hour at room temperature (do not dry to dryness). Then the membrane was washed and stored in buffer at 4 ^o C.

На рис. 10 показан отклик ферментной мембраны на холестерин, 3 мг/мл. Условия: 0,05 М К-фосфатный буфер, рН 7,0, 10 мг/мл холата натрия, 23^oC. Методика измерений аналогична примеру 7.In fig. 10 shows the response of the enzyme membrane to cholesterol, 3 mg / ml. Conditions: 0.05 M K-phosphate buffer, pH 7.0, 10 mg / ml sodium cholate, 23 ^o C. The measurement procedure is similar to example 7.

Таким образом, в патенте описан новый класс фосфоресцирующих красителей, имеющих длинноволновые спектральные характеристики и высокую фотохимическую стабильность, которые перспективны для ряда практических применений. В частности, чувствительные элементы, разработанные на их основе, а также способ определения кислорода позволяют осуществлять точную количественную детекцию кислорода и спектра важнейших метаболитов с использованием несложной реагентной, методической и инструментальной базы. Thus, the patent describes a new class of phosphorescent dyes having long-wavelength spectral characteristics and high photochemical stability, which are promising for a number of practical applications. In particular, the sensitive elements developed on their basis, as well as the method for determining oxygen, allow for accurate quantitative detection of oxygen and the spectrum of the most important metabolites using a simple reagent, methodological and instrumental base.

Подписи к рисункам
Рис. 1. Спектры возбуждения (А) и спектры эмиссии (Б) Pt-октаэтилпорфина (_{____}) и Pt-октаэтилпорфин-кетона

Условия: 1 мкМ раствор красителя в обескислороженном мицеллярном водном растворе (1% Тритон Х-100, 10 мг/мл сульфита натрия, рН 7), 25^oС.Figure captions
Fig. 1. Excitation spectra (A) and emission spectra (B) of Pt-octaethylporfin ( _{____} ) and Pt-octaethylporfin-ketone

Conditions: 1 μm dye solution in an oxygen-free micellar aqueous solution (1% Triton X-100, 10 mg / ml sodium sulfite, pH 7), 25 ^o C.

Рис. 2. Спектры возбуждения (А) и спектры эмиссии (Б) Pd-октаэтилпорфина (_{____}) и Pd-октаэтилпорфин-кетона

Условия: 1 мкМ раствор красителя в обескислороженном мицеллярном водном растворе (1% Тритон Х-100, 10 мг/мл сульфита натрия, рН 7), 25^oС.Fig. 2. Excitation spectra (A) and emission spectra (B) of Pd-octaethylporfin ( _{____} ) and Pd-octaethylporfin-ketone

Рис. 3. Кинетики затухания фосфоресценции композиций Pt-октаэтилпорфинкетона (А) и Pd-октаэтилпорфин-кетона (Б) и полистирола и их линеаризация по одноэкспоненциальному закону затухания. Условия: 25^oС, соотношение полимер/краситель 100/1.Fig. 3. The phosphorescence decay kinetics of the compositions of Pt-octaethylporfinketone (A) and Pd-octaethylporfin-ketone (B) and polystyrene and their linearization according to the one-exponential decay law. Conditions: 25 ^o C, the ratio of polymer / dye 100/1.

Рис.4. Калибровочная кривая для определения кислорода (давления воздуха) в газовой фазе с использованием композиции Pt-октаэтилпорфин-кетон - полистирол. Кривая 1 в координатах (t_q, P), кривая 2 линеаризация в координатах Штерна-Фольмера (t_o/t, P). Условия аналогичны рис.3.Fig. 4. Calibration curve for determining oxygen (air pressure) in the gas phase using the composition Pt-octaethylporfin-ketone - polystyrene. Curve 1 in coordinates (t _q , P), curve 2 linearization in Stern-Volmer coordinates (t _o / t, P). The conditions are similar to Fig. 3.

Рис 5. Принцип работы волоконно-оптического кислородного (био)сенсора. Figure 5. The principle of operation of the fiber-optic oxygen (bio) sensor.

Рис. 6. Блок-схема оптоэлектронного люминесцентного детектора кислородного сенсора. 1 волоконно-оптический выход с детектора на мембрану; 2 - светодиод; 3 фотодиод; 4 схема модуляции светодиода; 5 схема модуляции фотодиода; 6 схема синхронизации и задачи времени задержки; 7 - предусилитель и/или усилитель; 8 процессор для обработки и вывода информации. Fig. 6. Block diagram of an optoelectronic luminescent oxygen sensor detector. 1 fiber-optic output from the detector to the membrane; 2 - LED; 3 photodiode; 4 LED modulation scheme; 5 photodiode modulation scheme; 6 synchronization circuit and delay time tasks; 7 - preamplifier and / or amplifier; 8 processor for processing and output information.

Рис. 7. Схема модуляции напряжения на источнике света и фотоприемнике, используемая в оптоэлектронном детекторе для измерения интенсивности и/или времени жизни люминесценции полимерных композиций. Fig. 7. The voltage modulation circuit at the light source and photodetector, used in an optoelectronic detector to measure the intensity and / or luminescence lifetime of polymer compositions.

Рис.8. Стабильность интегрального люминесцентного сигнала (интенсивности, А), и кривая отклика волоконно-оптического кислородного сенсора на изменение концентрации кислорода в анализируемом водном растворе (Б). Изменение интенсивности (и соответственно времени жизни люминесценции) на кривой Б в области 40 сек отражает процесс переноса активного элемента из насыщенного воздухом раствора в обескислороженную среду. Fig. 8. The stability of the integrated luminescent signal (intensity, A), and the response curve of the fiber-optic oxygen sensor to changes in the oxygen concentration in the analyzed aqueous solution (B). The change in intensity (and, correspondingly, luminescence lifetime) on curve B in the region of 40 sec reflects the process of transfer of the active element from an air-saturated solution to an oxygen-free environment.

Рис. 9. Отклик погружного волоконно-оптического глюкозного биосенсора мембранного типа на различные концентрации глюкозы. Fig. 9. The response of a submersible fiber-optic glucose biosensor of the membrane type to various glucose concentrations.

Рис. 10. Отклик погружной ферментной мембраны на основе кислород-чувствительной полимерной композиции и холестериноксидазы на наличие холестерина (3 мг/мл) в анализируемом образце. Fig. 10. The response of an immersion enzyme membrane based on an oxygen-sensitive polymer composition and cholesterol oxidase to the presence of cholesterol (3 mg / ml) in the analyzed sample.

Claims

1. Металлокомплексы порфирин-кетонов общей формулы

где R₁-R₈ водород, низший алкил или -CH₂-CH₂COOR₉;
R₉ водород или алкил;
М Pt²⁺ или Pd²⁺,
в качестве фосфоресцирующих красителей.1. Metal complexes of porphyrin ketones of the general formula

where R ₁ -R ₈ hydrogen, lower alkyl or -CH ₂ -CH ₂ COOR ₉ ;
R _{9 is} hydrogen or alkyl;
M Pt ²⁺ or Pd ²⁺ ,
as phosphorescent dyes.

2. Металлокомплексы порфирин-кетонов по п.1, отличающиеся тем, что заместители R₁-R₈ означают этил.2. Metal complexes of porphyrin-ketones according to claim 1, characterized in that the substituents R ₁ -R ₈ mean ethyl.

3. Металлокомплексы порфирин-кетонов по п.1, отличающиеся тем, что заместители R₁, R₃, R₅ и R₇ означают метил, а R₂, R₄, R₆ и R₈ означают СН₂СН₂СООН.3. Metal complexes of porphyrin ketones according to claim 1, characterized in that the substituents R ₁ , R ₃ , R ₅ and R ₇ mean methyl, and R ₂ , R ₄ , R ₆ and R ₈ mean CH ₂ CH ₂ COOH.

4. Металлокомплексы порфирин-кетонов по п.1, отличающиеся тем, что заместители R₁, R₃, R₅ и R₇ означают метил, а R₂, R₄, R₆ и R₈ означают СН₂СН₂СООСН₃.4. The metal complexes of porphyrin ketones according to claim 1, characterized in that the substituents R ₁ , R ₃ , R ₅ and R ₇ mean methyl, and R ₂ , R ₄ , R ₆ and R ₈ mean CH ₂ CH ₂ COOCH ₃ .

5. Чувствительный элемент для оптического определения кислорода в жидкой или газовой среде, представляющий собой сформованное изделие из кислородопроницаемого полимера с распределенным в нем фосфореcцирующим красителем, отличающийся тем, что он выполнен в виде изделия, сформованного из полистирола, содержащего в качестве красителя металлкомплексы порфирин-кетонов общей формулы

где R₁-R₈ -водород, низший алкил или -СН₂СН₂СООR₉;
R₉ водород или алкил;
М Pt²⁺ или Pd²⁺.5. A sensitive element for the optical determination of oxygen in a liquid or gas medium, which is a molded product of an oxygen-permeable polymer with a phosphorescent dye distributed in it, characterized in that it is made of a product molded of polystyrene containing porphyrin-ketone metal complexes as a dye general formula

where R ₁ -R _{8 is} hydrogen, lower alkyl or —CH ₂ CH ₂ COOR ₉ ;
R _{9 is} hydrogen or alkyl;
M Pt ²⁺ or Pd ²⁺ .

6. Элемент по п.5, отличающийся тем, что он содержит в качестве красителя металлкомплексы октаэтилпорфирин-кетонов в количестве 5% от массы полистирола. 6. The element according to claim 5, characterized in that it contains metal complexes of octaethylporphyrin-ketones in the amount of 5% by weight of polystyrene as a dye.

7. Элемент по пп.5 и 6, отличающийся тем, что он выполнен в виде пленки толщиной 1-20 мк. 7. The element according to PP.5 and 6, characterized in that it is made in the form of a film with a thickness of 1-20 microns.

8. Элемент по пп.5 и 7, отличающийся тем, что он выполнен в виде пленки, закрепленной на твердой подложке или оптическом элементе. 8. The element according to claims 5 and 7, characterized in that it is made in the form of a film fixed to a solid substrate or optical element.

9. Элемент по пп.5 и 8, отличающийся тем, что сформованное изделие дополнительно содержит слой кислородзависимого фермента. 9. The element according to PP.5 and 8, characterized in that the molded product further comprises a layer of oxygen-dependent enzyme.

10. Способ определения кислорода, включающий использование чувствительного элемента на основе проницаемого для кислорода полимера с распределенным в нем фосфоресцирующим красителем, находящегося в контакте с анализируемым образцом и связанного посредством оптического волокна с детектором фосфоресценции, возбуждение фосфоресценции чувствительного элемента светодиодом в области поглощения красителя, регистрацию фосфоресценции и расчет концентрации кислорода по величине интенсивности и/или времени жизни фосфоресценции, отличающийся тем, что в качестве полимера используют полистирол, в качестве фосфоресцирующего красителя металлокомплексы общей формулы

где R₁-R₈ относятся к радикалам из группы водород, низший алкил или СН₂-СН₂-COO-R₉;
R₉ водород или алкил;
М Pt²⁺, Pd²⁺,
регистрацию флуоресценции ведут в импульсном режиме с временным разрешением с переменным временем задержки при возбуждении светодиодом, характеризующимся оптимальной величиной эмиссии в диапазоне 570 630 нм, при этом используют детектор с оптимальной чувствительностью при 700 850 нм, а расчет времени жизни ведут исходя из одноэкспоненциального характера затухания фосфоресценции.10. A method for determining oxygen, including the use of a sensing element based on an oxygen-permeable polymer with a phosphorescent dye distributed therein, in contact with the analyzed sample and connected via an optical fiber to a phosphorescence detector, excitation of phosphorescence of the sensitive element by an LED in the dye absorption region, registration of phosphorescence and calculating the oxygen concentration by the magnitude of the intensity and / or lifetime of phosphorescence, distinguishing I in that polystyrene is used as the polymer, as a phosphorescent dye metal complexes of the general formula

where R ₁ -R ₈ refer to radicals from the group hydrogen, lower alkyl or CH ₂ —CH ₂ —COO — R ₉ ;
R _{9 is} hydrogen or alkyl;
M Pt ²⁺ , Pd ²⁺ ,
fluorescence is recorded in a pulsed mode with a time resolution with a variable delay time when excited by an LED characterized by an optimal emission value in the range 570 630 nm, using a detector with optimal sensitivity at 700 850 nm, and the calculation of the lifetime is based on the one-exponential nature of the phosphorescence attenuation .

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве фосфоресцирующего красителя используют Pt-октаэтилпорфин-кетон, характеризующийся оптимальным значением фосфоресценции при длинах волн возбуждения и фосфоресценции 591 и 790 нм соответственно, а возбуждение осуществляют желтым светодиодом CaAs, характеризующимся оптимальной величиной эмиссии при 586 нм. 11. The method according to claim 10, characterized in that as a phosphorescent dye, Pt-octaethylporfin-ketone is used, characterized by the optimal value of phosphorescence at excitation and phosphorescence wavelengths of 591 and 790 nm, respectively, and the excitation is carried out by a yellow CaAs LED, characterized by the optimal emission value at 586 nm.