RU2061755C1 - METHOD OF STABILIZATION OF FUNGAL β-GALACTOSIDASE ULTRACONCENTRATE - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, enzymology. SUBSTANCE: method of stabilization of fungal beta-galactosidase liquid form involves its concentration up to the dry matter mass part 20-25% and the following addition of sorbic acid at amount 0.02-0.04% to liquid form mass. Proposed method provides the storage of product under noncontrolled temperature conditions, to decrease enzyme preparation consumption (as compared with dry form at serum lactose hydrolysis) and decrease environment pollution. EFFECT: improved method of enzyme stabilization.

Description

Настоящее изобретение относится к способу получения ферментных препаратов для гидролиза лактозы в молочной сыворотке. The present invention relates to a method for producing enzyme preparations for the hydrolysis of lactose in whey.

Известно использование в качестве биокатализатора для гидролиза лактозы в молочной сыворотке сухих форм грибных бета-галактозидаз, которые в виде порошка добавляются в молочную сыворотку (Cristian E, Sorensen S. Получение и применение лактозы. Патент США N 4007283, 1976 г.Guiraud R, Jacgues E. и др. Способ использования молочной сыворотки. Заявка Франции 2309154, 1976 г. ). It is known to use as a biocatalyst for the hydrolysis of lactose in milk whey dry forms of mushroom beta-galactosidases, which are added in powder form to milk whey (Cristian E, Sorensen S. Preparation and use of lactose. US patent N 4007283, 1976 Guiraud R, Jacgues E. et al. Method for the use of whey. Application France 2309154, 1976).

Сухие формы хорошо хранятся, однако при использовании обладают рядом недостатков пылят при растворении, вызывая аллергические реакции, недостаточно равномерно растворяются, что приводит к увеличению дозировки препарата, и, главное, дороги с экономической точки зрения, так как сушка является чрезвычайно энергоемким процессом, к тому же при сушке частично теряется активность препарата. Dry forms are well stored, but when used they have a number of drawbacks, they dust when dissolved, causing allergic reactions, do not dissolve evenly enough, which leads to an increase in the dosage of the drug, and, most importantly, it is expensive from an economic point of view, since drying is an extremely energy-intensive process. while drying, the activity of the drug is partially lost.

Для промышленной сушки используется жидкая форма ферментного препарата в виде ультраконцентрата грибной бета-галактозидазы с массовой долей сухих веществ ( 10 12 ) Такой ультраконцентрат может быть использован для гидролиза лактозы в молочной сыворотке, однако он чрезвычайно нестабилен в хранении и уже через двое суток, даже при температуре ( 4 10)^oC, подвергается микробиологическому заражению. Кроме того, низкая массовая доля сухих веществ в ультраконцентрате делает нецелесообразным его низкотемпературное ( при отрицательных температурах ) хранение и транспортировку.For industrial drying, a liquid form of the enzyme preparation is used in the form of an ultra-concentrate of mushroom beta-galactosidase with a mass fraction of solids (10 12). Such an ultra-concentrate can be used for hydrolysis of lactose in whey, but it is extremely unstable in storage and after two days, even when temperature (4 10) ^o C, is exposed to microbiological infection. In addition, the low mass fraction of solids in the ultra-concentrate makes it inappropriate to keep it at low temperatures (at low temperatures) and transport it.

Получение же жидких форм бета-галактозидаз с длительных сроком хранения в неконтролируемых температурных условиях неизвестно. The production of liquid forms of beta-galactosidases with a long shelf life under uncontrolled temperature conditions is unknown.

Известно использование в качестве биокаталиэаторов для гидролиза лактозы в молоке жидких форм дрожжевых бета-галактозидаз под торговыми марками Jactozym и Maxilact (Jactozym. Рекламный материал фирмы Novo. Голландия; Maxilact Рекламный материал фирмы Gist Brocades, Голландия ). The use of liquid forms of yeast beta-galactosidases under the trademarks Jactozym and Maxilact (Jactozym. Promotional material from Novo. Holland; Maxilact Promotional material from Gist Brocades, Holland) is known to be used as biocatalysts for the hydrolysis of lactose in milk.

Недостатками этих препаратов является невозможность их хрипения в неконтролируемых температурных условиях и большая дозировка при гидролизе молочной сыворотки. Препараты Jactozym и Maxilact хранят при температуре ( 3 5 )^oC (Jactozym) и (0. 5)^oC (Maxilact) в течение трех месяцев с момента получения.The disadvantages of these drugs is the impossibility of wheezing in uncontrolled temperature conditions and a large dosage during whey hydrolysis. Jactozym and Maxilact preparations are stored at a temperature of (3 5) ^o C (Jactozym) and (0. 5) ^o C (Maxilact) for three months from the date of receipt.

Целью предлагаемого изобретения является обеспечение длительного срока хранения жидкой формы ( ультаконцентрата ) грибной бета-галактозидазы в неконтролируемых температурных условиях. The aim of the invention is the provision of a long shelf life of the liquid form (ultconcentrate) of mushroom beta-galactosidase in uncontrolled temperature conditions.

Указанная цель достигается концентрированием ультраконцентрата грибной бета-галактозидазы до массовой доли сухих веществ (20 25 ) и добавлением к сконцентрированному раствору стабилизатора ( консерванта ) сорбиновой кислоты в количестве ( 0,02 0,04)% к массе жидкой формы. This goal is achieved by concentrating the ultraconcentrate of mushroom beta-galactosidase to a mass fraction of solids (20 25) and adding to the concentrated solution of a stabilizer (preservative) sorbic acid in an amount of (0.02 0.04)% by weight of the liquid form.

Для достижения указанной цели раствор бета-галактозидазы после ультраконцентрирования подвергают дополнительному концентрированию до массовой доли сухих веществ ( 20 25 )% используя известные способы концентрирования ( например, вакуум выпаривание,вымораживание ), и затем добавляют сорбиновую кислоту в количестве (0,02. 0,04 ) к массе концентрата. To achieve this goal, the beta-galactosidase solution after ultraconcentration is subjected to additional concentration to a mass fraction of solids (20 25)% using known concentration methods (for example, vacuum evaporation, freezing), and then add sorbic acid in an amount of (0.02. 0, 04) to the mass of the concentrate.

Раствор грибной бета-галактозидазы после ультраконцентрирования с массовой долей сухих веществ ( 10 12 )% и активностью (110 130 ) Е/мл заливают в полиэтиленовую канистру и замораживают в холодильной камере при температуре не выше минус 5^oC. После полного замораживания емкость вынимают из камеры и, сняв колпачок, помещают при комнатной температуре в перевернутом состоянии на стеклянную или пластмассовую воронку, под которой помещается сборник. В ходе постепенного размораживания собирают фракцию жидкой формы грибной бета-галактозидазы с активностью ( 280 320 ) Е/мл и массовой долей сухих веществ ( 20 25 )
Более низкая массовая доля сухих веществ в ультраконцентрате грибной бета-галактозидазы делает, как уже указывалось, неэкономичным его хранение и транспортировку. С другой стороны, молочная сыворотка перед гидролизом лактозы подвергается концентрированию до массовой доли сухих веществ ( 20 25 ) и, таким образом, упрощается расчет дозы внесения ферментного препарата. Увеличение же массовой доли сухих веществ в ультраконцентрате свыше 25% ведет к увеличению энергозатрат на концентрирование и необходимости использования дополнительного технологического оборудования ( вакуумвыпарных установок ), в то время как указанный диапазон концентраций можно получить, например, вымораживанием.The solution of mushroom beta-galactosidase after ultraconcentration with a mass fraction of solids (10 12)% and activity (110 130) U / ml is poured into a polyethylene canister and frozen in a refrigerator at a temperature not exceeding minus 5 ^o C. After complete freezing, the container is removed from chamber and, having removed the cap, placed at room temperature in an inverted state on a glass or plastic funnel, under which the collection is placed. During the gradual thawing, a fraction of the liquid form of the mushroom beta-galactosidase with activity (280 320) U / ml and mass fraction of solids (20 25) is collected
The lower mass fraction of solids in the ultra-concentrate mushroom beta-galactosidase makes, as already mentioned, its storage and transportation uneconomical. On the other hand, whey before hydrolysis of lactose is subjected to concentration to a mass fraction of solids (20 25) and, thus, the calculation of the dose of the enzyme preparation is simplified. An increase in the mass fraction of solids in an ultra-concentrate of more than 25% leads to an increase in energy consumption for concentration and the need to use additional processing equipment (vacuum boiling units), while the indicated concentration range can be obtained, for example, by freezing.

В качестве стабилизатора предложено использовать сорбиновую кислоту так, чтобы ее массовая доля в жидкой форме грибной бета-галактозидазы составляла ( 0,02 0.04 )% Такая концентрация сорбиновой кислоты является необходимой и достаточной для получения стабилизированной жидкой формы грибной бета-галактозидазы, способной храниться в неконтролируемых температурных условиях в течение шести и более месяцев без значительной потери активности и без микробиологического заражения. It is proposed to use sorbic acid as a stabilizer so that its mass fraction in the liquid form of mushroom beta-galactosidase is (0.02 0.04)%. Such a concentration of sorbic acid is necessary and sufficient to obtain a stabilized liquid form of mushroom beta-galactosidase, which can be stored in uncontrolled temperature conditions for six months or more without significant loss of activity and without microbiological infection.

При массовой доле сообиновой кислоты в ультраконцентрате фермента менее 0,02 через 2-3 месяца обнаруживается микробиологическое выражение при сохранении ферментативной активности. При массовой доле сорбиновой кислоты более 0,04% микробиологического заражения не возникает, но происходит падение ферментативной активности на ( 40 50) в течение первого месяца хранения, в последующем активность продолжает падать. When the mass fraction of coobinic acid in the ultraconcentrate of the enzyme is less than 0.02, after 2-3 months a microbiological expression is detected while maintaining the enzymatic activity. With a mass fraction of sorbic acid of more than 0.04%, microbiological infection does not occur, but there is a decrease in enzymatic activity by (40 50) during the first month of storage, in the subsequent activity continues to fall.

Испытание других консервантов не принесло желаемых результатов: например, при использовании в качестве консерванта бензойной кислоты через три месяца обнаружена микробная зараженность при сохранении уровня бeта-галактозидазной активности. Testing of other preservatives did not bring the desired results: for example, when using benzoic acid as a preservative, microbial infection was detected after three months while maintaining the level of beta-galactosidase activity.

Устранение в технологической схеме получения ферментного препарата грибной бета-галактозидазы стадии выслушивания приводит к упрощению технологического процесса, уменьшению расхода энергоносителей и снижению себестоимости препарата, а также снижает загрязненность рабочих мест и окружающей среды. Elimination of the stage of listening in the technological scheme for obtaining the enzyme preparation of the mushroom beta-galactosidase enzyme simplifies the process, reduces energy consumption and reduces the cost of the drug, and also reduces the pollution of workplaces and the environment.

Пример 1. 3 л раствора грибной бета-галактозидазы после ультраконцентрирования с массовой долей сухих веществ 10% И и 10% и активностью 110 Е/мл заливают в полиэтиленовую канистру и замораживают в холодильной камере при температуре не выше минус 5^oC. После полного замораживания емкость вынимают из камеры и, сняв колпачок, помещают при комнатной температуре в перевернутом состоянии на стеклянную или пластмассовую воронку, под которой помещается сборник. В ходе постепенного размораживания собирают фракцию 500 мл жидкой формы грибной бета-галактозидазы с активностью 280 Е/мл и массовой долей сухих веществ 20%
В пять колб помещают по 100 мл отобранной фракции и добавляют по 10, 20, 30, 40 и 50 мг сорбиновой кислоты соответственно. Колбы закрывают пробками и хранят в нерегулируемых температурных условиях ( 15 30 )^oC в зависимости от времени года Результаты хранения представлены в таблице.Example 1. 3 l of a solution of mushroom beta-galactosidase after ultraconcentration with a mass fraction of solids of 10% I and 10% and an activity of 110 U / ml is poured into a polyethylene canister and frozen in a refrigerator at a temperature not exceeding minus 5 ^o C. After complete freezing the container is removed from the chamber and, having removed the cap, is placed at room temperature in an inverted state on a glass or plastic funnel under which the collector is placed. During gradual thawing, a fraction of 500 ml of the liquid form of the mushroom beta-galactosidase with an activity of 280 U / ml and a mass fraction of solids of 20% is collected
100 ml of the selected fraction are placed in five flasks and 10, 20, 30, 40 and 50 mg of sorbic acid are added, respectively. The flasks are closed with stoppers and stored in unregulated temperature conditions (15-30) ^o C depending on the time of year. Storage results are presented in the table.

Предлагаемый способ стабилизации жидкой формы грибной бета - галактозидазы позволяет обеспечить ее хранение в неконтролируемых температурных условиях, уменьшить расход ферментарного препарата по сравнению с сухой формой при гидролизе лактозы сыворотки и снизить загрязнение окружающей среды. ТТТ1 The proposed method of stabilization of the liquid form of mushroom beta - galactosidase allows for its storage in uncontrolled temperature conditions, to reduce the consumption of the enzyme preparation in comparison with the dry form during the hydrolysis of serum lactose and to reduce environmental pollution. TTT1

Claims (1)

Способ стабилизации ультраконцентрата грибной β- галактозидазы, заключающийся в том, что его концентрируют до массовой доли сухих веществ 20 - 25 мас. с последующим внесением сорбиновой кислоты в количестве 0,02 0,04 мас. The method of stabilization of the ultra-concentrate fungal β-galactosidase, which consists in the fact that it is concentrated to a mass fraction of solids of 20 to 25 wt. followed by the introduction of sorbic acid in an amount of 0.02 0.04 wt.

Images