RU2036232C1 - Method of pyobacteriophage preparing - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: method involves cultivation of bacteria and bacteriophages of staphylococcus, streptococcus, pyocyanic bacillus, Escherichia coli, Proteus and Klebsiella on the liquid nutrient medium. Every species of bacterium and bacteriophage is cultured separately but under similar conditions of cultivation for all species. Cultivation is carried out under conditions of intensive aeration and stirring of medium using exponentially multiplying bacterial population. Prepared phage lysates of all bacteriophages were combined to the total volume, stirred and subjected for micro- and ultrafiltration at the regime of tangential flow through membrane (pore size is 0.2 mcm) and membranes showing retaining threshold of substances with molecular mass 150-200 kDa, and then final sterilizing microfiltration is carried out. Purification degree of bacteriophages from bacterium metabolites and medium proteins is 98± 1,1%. EFFECT: broadened spectrum of antibacterial activity of preparation, increased yield of bacteriophage biomass. 2 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству медицинских биологических препаратов. The invention relates to biotechnology, namely to the production of medical biological preparations.

Гнойно-воспалительные заболевания, вызванные бактериями стафилококка, стрептококка, синегнойной и кишечной палочкой, протеем, широко распространены и трудно поддаются антибиотикотерапии, часто заканчиваются смертельным исходом, особенно у детей раннего возраста. В последние годы наряду с перечисленными возбудителями в 10-30% случаев от больных выделяются бактерии клебсиелл пневмонии. Purulent-inflammatory diseases caused by bacteria Staphylococcus aureus, streptococcus, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli, Proteus, are widespread and difficult to respond to antibiotic therapy, often fatal, especially in young children. In recent years, along with the listed pathogens, bacteria Klebsiella pneumonia are isolated from patients in 10-30% of cases.

Известен препарат пиобактериофага комбинированного, включающий бактериофаги стафилококка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки и протея. Способ получения пиобактериофага предусматривает раздельное статическое культивирование бактериофагов в жидкой питательной среде в бутылях с использованием одномоментного добавления в питательную среду бактериальных клеток до концентрации 3˙10⁷ в 1 мл, находящихся в стадии отмирания (18-часовая культура) и маточного фага в количестве 0,2% от объема среды, без учета множественности заражения и урожайности бактериофагов с последующей стерилизующей микрофильтрацией в тупиковом режиме через керамические фильтры (свечи Шамберлана).Known drug combination pyobacteriophage, including bacteriophages of staphylococcus, streptococcus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Proteus. A method for producing a pyobacteriophage involves separate static cultivation of bacteriophages in a liquid nutrient medium in bottles using the simultaneous addition of bacterial cells to a nutrient medium to a concentration of 3 × 10 ⁷ in 1 ml, which are at the stage of dying (18-hour culture) and uterine phage in an amount of 0, 2% of the volume of the medium, excluding the multiplicity of infection and the productivity of bacteriophages, followed by sterilizing microfiltration in a dead end mode through ceramic filters (Chamberlain candles).

Недостатками известного способа являются:
низкий выход биомассы бактериофагов при их культивировании, обусловленный фазой развития (фаза отмирания) бактериальной популяции, использующейся для размножения фагов, а также неоптимизированными условиями культивирования;
нетехнологичность, связанная с использованием для стерилизующей микрофильтрации тупикового режима, керамических фильтров, обладающих низкой производительностью в связи с фильтрацией в тупиковом режиме;
нетехнологичность способа, обусловленная получением фагов в бутылях и невозможность получения препарата в больших объемах;
реактогенность препарата, связанная с присутствием в составе препарата белков питательной среды и метаболитов бактериальных клеток, образующихся в процессе роста бактериальной популяции, а также при фаголизисе;
недостаточно широкий спектр действия препарата, связанный с отсутствием в составе препарата бактериофагов клебсиелл пневмонии;
длительность технологического цикла более 30 ч.The disadvantages of this method are:
low yield of bacteriophage biomass during their cultivation, due to the development phase (dying phase) of the bacterial population used for propagation of phages, as well as non-optimized cultivation conditions;
low technology associated with the use of a dead end for sterilizing microfiltration, ceramic filters with low performance in connection with dead end filtration;
the lack of technology of the method, due to the receipt of phages in large bottles and the inability to obtain the drug in large volumes;
the reactogenicity of the drug associated with the presence in the composition of the preparation of proteins of the nutrient medium and metabolites of bacterial cells formed during the growth of the bacterial population, as well as with phagolysis;
insufficiently wide spectrum of action of the drug associated with the absence of bacteriophages of Klebsiella pneumonia in the composition of the drug;
the duration of the technological cycle is more than 30 hours

Целью изобретения является разработка нового способа получения пиобактериофага и расширение спектра действия препарата. The aim of the invention is to develop a new method for producing pyobacteriophage and expanding the spectrum of action of the drug.

Для этого в состав препарата, содержащего бактериофаги стафиликокка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки и протея, дополнительно вводят бактериофаги клебсиелл, получение бактериофагов проводят с использованием экспоненциально размножающейся бактериальной популяции в жидкой питательной среде с последующей очисткой препарата путем микро- и ультрафильтрации в режиме тангенциального потока. Микрофильтрацию проводят на мембранах с размером пор 0,2 мкм, а ультрафильтрацию на мембранах с порогом задержания веществ 150-200 КД. После очистки проводят стерилизующую микрофильтрацию. To do this, a bacteriophage of Klebsiella is additionally introduced into the composition of the preparation containing bacteriophages of staphylococcus, streptococcus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Proteus, bacteriophages are obtained using an exponentially propagating bacterial population in a liquid nutrient medium, followed by purification of the drug by micro- and ultrafiltration in tangential mode flow. Microfiltration is carried out on membranes with a pore size of 0.2 μm, and ultrafiltration on membranes with a retention threshold of substances of 150-200 KD. After cleaning, sterilizing microfiltration is carried out.

Сравнение существенных признаков предлагаемого технического решения и прототипа показывает, что общим для них является процесс культивирования в жидкой питательной среде для получения биомассы фагов стафилококка, стрептококка, синегнойной, кишечной палочки и протея, а также процесс заключительной стерилизующей микрофильтрации фаголизатов для удаления бактериальных клеток. A comparison of the essential features of the proposed technical solution and the prototype shows that the process of cultivation in a liquid nutrient medium for obtaining the biomass of phages of staphylococcus, streptococcus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Proteus, as well as the process of final sterilizing microfiltration of phagolysates to remove bacterial cells is common to them.

Отличительными существенными признаками предлагаемого способа являются:
введение в состав препарата бактериофагов клебсиелл пневмонии, позволяющее на 75±2% расширить спектр литической активности препарата в отношении бактерий клебсиелл пневмонии и расширить показания к его применению (в прототипе компонент бактериофагов клебсиелл пневмонии отсутствует);
использование вместо статического культивирования на бактериальных клетках в стадии отмирания без учета урожайности фагов и множественности заражения (прототип) периодического динамического управляемого культивирования на экспоненциально размножающейся бактериальной популяции, позволяющего повысить на 50-90% выход биомассы фагов;
очистка препарата микрофильтрацией через мембраны с размером пор 0,2 мкм и ультрафильтрацией в режиме тангенциального потока на плоских мембранах УПМП с порогом задержания веществ 150-200 КД для очистки препарата фагов от метаболитов бактерий и белков питательной среды и снижения реактогенности и токсичности препарата при полостном введении. Степень очистки в сравнении с прототипом 98±1,1%
В литературе описан способ получения бактериофагов энтеробактерий (авт. св. N 1058283), предусматривающий периодическое динамическое культивирование на экспоненциально размножающейся бактериальной популяции.Distinctive essential features of the proposed method are:
the introduction of bacteriophages of Klebsiella pneumonia into the composition of the drug, which allows expanding the spectrum of lytic activity of the drug against bacteria of Klebsiella pneumonia by 75 ± 2% and expanding the indications for its use (there is no component of bacteriophages of Klebsiella pneumonia in the prototype);
using instead of static cultivation on bacterial cells in the dying stage, without taking into account the phage yield and multiplicity of infection (prototype), periodic dynamic controlled cultivation on an exponentially propagating bacterial population, which allows increasing the phage biomass yield by 50-90%;
purification of the drug by microfiltration through membranes with a pore size of 0.2 μm and ultrafiltration in the tangential flow mode on UPMP flat membranes with a retention threshold of 150-200 KD for purification of the phage preparation from bacterial metabolites and nutrient proteins and reducing the reactogenicity and toxicity of the drug during oral administration . The degree of purification in comparison with the prototype 98 ± 1,1%
The literature describes a method for producing bacteriophages of enterobacteria (ed. St. N 1058283), which provides for periodic dynamic cultivation on an exponentially breeding bacterial population.

Однако использование экспоненциально размножающейся бактериальной популяции для получения стафилококкового, стрептококкового, синегнойного бактериофагов в литературе не описано. However, the use of an exponentially breeding bacterial population to obtain staphylococcal, streptococcal, pseudomonas bacteriophages is not described in the literature.

Описанный в литературе способ очистки бактериофагов (авт. св. NN 1412302) включает в себя четыре этапа: микрофильтрацию, которая проводится в тупиковом режиме в три этапа (на фильтр-картоне, на целлюлозных мембранах с размером пор 0,5-0,7 мкм, затем на целлюлозных мембранах с размером пор 0,2 мкм) и четвертый этап очистка фаголизатов методом ультрафильтрации в режиме тангенциального потока через полые волокна с порогом задержания веществ 100 КД. Предлагаемый способ включает двухэтапную очистку: микрофильтрацию в режиме тангенциального потока на капроновых мембранах с размером пор 0,2 мкм и очистку ультрафильтрацией в режиме тангенциального потока на плоских мембранах с размером пор 150-200 КД. Предлагаемый способ микрофильтрации на капроновых мембранах более технологичен, производителен и выдерживает 50-70 циклов в отличие от одноразовых целлюлозных мембран и фильтр-картона. Плоские мембраны для ультрафильтрации имеют размер пор 150-200 КД, они более производительны, чем модули с полыми волокнами, вследствие большей скорости потока на плоскорамных установках, определяемой диаметром просвета волокна (полые волокна) и высотой камеры (плоскорамная установка). Использование полых волокон не позволяет в отличие от плоских мембран удалять из фаголизатов вещества, в том числе и фракции эндотоксина, образующиеся при фаголизисе, с молекулярной массой более 100 КД. Очистка на полых волокнах фаголизатов, полученных на таких средах, как мясопептонный бульон и бульон Мартена, содержащих высокомолекулярные фракции белков и пептидов, практически невозможна вследствие образования слоя белка на внутренней поверхности волокон и замедления фильтрации из-за белок-белковых взаимодействий. На плоскорамных установках фаголизаты, полученные на мясопептонном бульоне и бульоне Мартена, фильтруются также хорошо, как и фаголизаты, не содержащие высокомолекулярных белков и пептидов питательных сред. The method for cleaning bacteriophages described in the literature (ed. St. NN 1412302) includes four stages: microfiltration, which is carried out in a deadlock mode in three stages (on filter paper, on cellulose membranes with pore size 0.5-0.7 μm , then on cellulose membranes with a pore size of 0.2 μm) and the fourth stage is the purification of phagolysates by ultrafiltration in tangential flow through hollow fibers with a retention threshold of 100 KD. The proposed method includes two-stage cleaning: microfiltration in the tangential flow mode on nylon membranes with a pore size of 0.2 μm and ultrafiltration cleaning in the tangential flow mode on flat membranes with pore sizes of 150-200 KD. The proposed method of microfiltration on kapron membranes is more technologically advanced, productive and can withstand 50-70 cycles in contrast to disposable cellulose membranes and filter cardboard. Flat ultrafiltration membranes have a pore size of 150-200 KD, they are more productive than modules with hollow fibers, due to the higher flow rate on flat-bed installations, determined by the diameter of the fiber lumen (hollow fibers) and the height of the chamber (flat-bed installation). The use of hollow fibers, in contrast to flat membranes, does not allow removal of substances from phagolysates, including endotoxin fractions formed during phagolysis, with a molecular weight of more than 100 KD. Purification of hollow fibers of phagolysates obtained on media such as meat and peptone broth and Marten broth, containing high molecular weight fractions of proteins and peptides, is practically impossible due to the formation of a protein layer on the inner surface of the fibers and slow filtration due to protein-protein interactions. On flat-bed plants, the phagolysates obtained on the meat and peptone broth and Marten broth are filtered as well as the phagolysates that do not contain high molecular weight proteins and peptides of the culture medium.

Проведенный анализ свидетельствует, что предлагаемая совокупность существенных признаков является новой, а влияние отличительных от прототипа существенных признаков на достижение технического результата не следует из известного уровня техники, т.е. предлагаемый способ соответствует критериям "новизна" и"изобретательский уровень". The analysis shows that the proposed set of essential features is new, and the influence of significant features distinctive from the prototype on the achievement of the technical result does not follow from the prior art, i.e. the proposed method meets the criteria of "novelty" and "inventive step".

П р и м е р 1. Способ получения пиобактериофага. PRI me R 1. The method of obtaining pyobacteriophage.

Способ культивирования бактериофагов, входящих в состав препарата пиобактериофага, является общим для всех. Культивирование бактериофагов проводят на бульоне Мартена, Хоттингера, мясопептонном бульоне или бульоне на основе ферментативного гемогидролизата. Культивирование проводят в ферментерах в условиях интенсивной аэрации и перемешивания при 30-70%-ном насыщении растворенным кислородом с использованием экспоненциально размножающейся бактериальной популяции. Каждый вид бактериофагов культивируют раздельно. Для этого в питательную среду вносят бактериальную культуру до конечной концентрации 5˙10⁷ бакт. кл/мл и выращивают при 37^оС в условиях 30-70%-ного насыщения кислородом в течение 1,0-1,5 ч до концентрации 2-5˙10⁸ бакт. кл/мл, после чего заражают бактериофагом с множественностью заражения 1/30 и культивируют в том же режиме в течение 1-2 ч до полного лизиса бактериальной популяции, после чего все бактериофаги сводят в единый объем, перемешивают и фильтруют в режиме тангенциального потока через фильтры с размером пор 0,2 мкм. Время фильтрации 100 л препарата составляет 10 мин. Отфильтрованный фаголизат очищают путем фильтрации через плоскорамный аппарат УФР-4М в режиме тангенциального потока через мембраны с порогом задержания веществ 150-200 КД. Степень очистки бактериофагов от метаболитов бактериальных клеток составляет 98±1,1 Затем очищенный препарат пиобактериофага фильтруют через стерильные фильтры типа "Владипор" с размером пор 0,2 мкм, после чего стерильно разливают в ампулы и флаконы и используют для лечения.The method of culturing bacteriophages that are part of the preparation of pyobacteriophage is common to all. The cultivation of bacteriophages is carried out on a Martin, Hottinger broth, meat and peptone broth or an enzymatic hemohydrolyzate broth. Cultivation is carried out in fermenters under conditions of intensive aeration and mixing at 30-70% saturation with dissolved oxygen using an exponentially multiplying bacterial population. Each type of bacteriophage is cultivated separately. For this, a bacterial culture is introduced into the nutrient medium to a final concentration of 5 × 10 ⁷ bact. cells / ml and grown at ³⁷ ° C in a 30-70% solution of oxygenation during 1.0-1.5 hours at a concentration of ⁸ 2-5˙10 bact. cells / ml, after which they are infected with a bacteriophage with a multiplicity of infection of 1/30 and cultured in the same mode for 1-2 hours until the bacterial population is completely lysed, after which all bacteriophages are brought into a single volume, mixed and filtered in a tangential flow mode through filters with a pore size of 0.2 microns. The filtration time of 100 l of the drug is 10 minutes. The filtered phagolysate is purified by filtration through a plane-mounted apparatus UVR-4M in a tangential flow mode through membranes with a retention threshold of 150-200 KD. The degree of purification of bacteriophages from bacterial cell metabolites is 98 ± 1.1. Then, the purified pyobacteriophage preparation is filtered through sterile Vladipor filters with a pore size of 0.2 μm, after which it is sterilely poured into ampoules and vials and used for treatment.

Как видно из табл. 1, использование предлагаемого способа позволяет:
повысить на 50-90% выход биомассы фагов при клуьтивировании и сократить время культивирования в среднем на 21 ч (Р<0,05, Р<0,001);
очистить препарат от метаболитов бактерий и белков среды на 98±1,1%
повысить производительность и сократить время стерилизующей микрофильтрации в среднем на 6 ч;
сократить время технологического цикла в среднем на 25 ч (Р<0,001)
П р и м е р 2. Биологические свойства препарата бактериофага.As can be seen from the table. 1, the use of the proposed method allows:
increase the yield of phage biomass by clutivation by 50-90% and reduce the cultivation time by an average of 21 hours (P <0.05, P <0.001);
purify the drug from metabolites of bacteria and proteins of the environment by 98 ± 1.1%
increase productivity and reduce the time of sterilizing microfiltration by an average of 6 hours;
reduce the cycle time by an average of 25 hours (P <0.001)
PRI me R 2. Biological properties of a bacteriophage preparation.

Препарат очищенного бактериофага, полученный предлагаемым способом, обладает активностью в отношении бактерий клебсиелл пневмонии 75±2% (табл. 2). Как видно из табл. 2, пиобактериофаг, полученный предлагаемым способом, в сравнении с прототипом был очищен от метаболитов бактериальных клеток и белков питательной среды. Степень очистки по белку составляет 98±1,1%
Препарат очищенного пиобактериофага в отличие от прототипа не обладал токсическими свойствами при внутрибрюшинном введении препарата белым мышам в дозе, в 3500 раз превышающей максимальную разовую для человека в пересчете на ед. массы тела. Гибели животных, падения массы тела и патологических изменений внутренних органов не обнаружено.The preparation of purified bacteriophage obtained by the proposed method has activity against bacteria Klebsiella pneumonia 75 ± 2% (table. 2). As can be seen from the table. 2, pyobacteriophage obtained by the proposed method, in comparison with the prototype was purified from metabolites of bacterial cells and proteins of the nutrient medium. The degree of protein purification is 98 ± 1.1%
The preparation of purified pyobacteriophage, unlike the prototype, did not have toxic properties when the drug was intraperitoneally administered to white mice at a dose that was 3,500 times the maximum single dose for humans in terms of unit. body weight. The death of animals, weight loss and pathological changes in internal organs were not detected.

Кроме того, препарат очищенного пиобактериофага в отличие от прототипа не обладал токсическими свойствами при внутрибрюшинном введении в течение 21 дн в терапевтических дозах в расчете на ед. массы тела (хроническая токсичность). Препарат обладал антибактериальной активностью в отношении бактерий стафилококка в титре 10⁵-10⁶ по Аппельману, в титре 10⁶-10⁷ в отношении бактерий стрептококка. Активность компонентов бактериофагов кишечной и синегнойной палочек, протея также находилась в пределах 10⁵-10⁶ по Аппельману (табл. 2). В отличие от прототипа препарат очищенного пиобактериофага обладал антибактериальной активностью в отношении бактерий клебсиелл пневмонии в титре 10⁵-10⁷.In addition, the preparation of purified pyobacteriophage, unlike the prototype, did not have toxic properties when administered intraperitoneally for 21 days in therapeutic doses per unit. body weight (chronic toxicity). The drug had antibacterial activity against staph bacteria in a titer of 10 ⁵ -10 ⁶ according to Appelman, in a titer of 10 ⁶ -10 ⁷ against bacteria of streptococcus. The activity of the components of bacteriophages of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, Proteus was also in the range of 10 ⁵ -10 ⁶ according to Appelman (table. 2). In contrast to the prototype, the purified pyobacteriophage preparation had antibacterial activity against Klebsiella pneumonia bacteria in a titer of 10 ⁵ -10 ⁷ .

Таким образом, использование предлагаемого способа получения препарата пиобактериофага позволяет расширить на 75±2% спектр антибактериальной активности в отношении бактерий клебсиелл пневмонии, а также позволяет повысить качество за счет снижения токсических свойств препарата при полостном внутрибрюшинном введении за счет удаления в процессе очистки 98±1,1% из состава препарата метаболитов бактериальных клеток и белков культуральной среды. Thus, the use of the proposed method for producing the preparation of pyobacteriophage allows expanding the spectrum of antibacterial activity against bacteria of Klebsiella pneumonia by 75 ± 2%, and also improves the quality by reducing the toxic properties of the drug during cavity intraperitoneal administration due to removal of 98 ± 1 during the cleaning process. 1% of the composition of the drug metabolites of bacterial cells and proteins of the culture medium.

Кроме того, использование предлагаемого способа позволяет повысить выход на 50-90% биомассы бактериофагов при их культивировании, сократить время культивирования в среднем на 21 ч, повысить производительность и сократить время технологического цикла фильтрации в среднем на 25 ч и вести крупномасштабное производство. In addition, the use of the proposed method can increase the yield by 50-90% of the biomass of bacteriophages during their cultivation, reduce the cultivation time by an average of 21 hours, increase productivity and reduce the time of the filtration cycle by an average of 25 hours and conduct large-scale production.

Внедрение препарата очищенного пиобактериофага позволит дать практическому здравоохранению эффективный антибактериальный препарат, превосходящий по своей активности как антибиотики широкого спектра действия, так и антибиотики резерва, отличительным признаком которого в отличие от антибиотиков является отсутствие токсичности. The introduction of a purified pyobacteriophage preparation will allow practical healthcare to provide an effective antibacterial drug that is superior in activity to both broad-spectrum antibiotics and reserve antibiotics, the hallmark of which, in contrast to antibiotics, is the absence of toxicity.

Claims (1)

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИОБАКТЕРИОФАГА, включающий культивирование бактерий и бактериофагов стафилококка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки и протея в жидкой питательной среде с последующим сведением в один объем и стерилизующей микрофильтрацией, отличающийся тем, что дополнительно проводят культивирование бактерий и бактериофагов клебсиелл, для получения фаголизатов используют бактерии-продуценты в экспоненциальной фазе роста, микрофильтрацию проводят через мембраны с размером пор 0,2 мкм, после чего проводят ультрафильтрацию через мембраны с порогом задержания веществ 150 - 200 КД в режиме тангенциального потока. METHOD FOR PRODUCING PIOBACTERIOPHAGE, including the cultivation of bacteria and bacteriophages of staphylococcus, streptococcus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Proteus in a liquid nutrient medium, followed by reduction into one volume and sterilizing microfiltration, characterized in that bacteria and bacteriophages are also used for the production of clebs bacteria-producers in the exponential growth phase, microfiltration is carried out through membranes with a pore size of 0.2 μm, after which ultrafi tratsiyu substances through membranes with retention threshold 150 - 200 KD in tangential flow mode.

Images