RU2019108270A

RU2019108270A - Способы дискретной амплификации полного генома

Info

Publication number: RU2019108270A
Application number: RU2019108270A
Authority: RU
Inventors: Сяолян Санни СЕ; Дун СИН; Чи-Хан ЧАН
Original assignee: Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж
Priority date: 2016-08-31
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2020-10-01
Also published as: RU2736351C2; US20210285038A1; JP2019531714A; AU2016421196A1; CA3034959A1; JP6882453B2; RU2019108270A3; EP3507379A4; EP3507379A1; WO2018039969A1; MX2019002376A; CN109923214A

Claims

1. Способ амплификации геномной нуклеиновой кислоты, включающий

контактирование геномной ДНК с множеством димеров транспозазы, связанной с транспозоном ДНК, при этом транспозон ДНК включает сайт связывания транспозазы, необязательную штрихкодовую последовательность и сайт связывания праймера, при этом множество димеров связывается с целевыми местоположениями вдоль двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и транспозаза расщепляет геномную ДНК на множество фрагментов двухцепочечной геномной ДНК, представляющих собой библиотеку фрагментов геномной ДНК, при этом каждый фрагмент двухцепочечной геномной ДНК содержит транспозон ДНК, связанный с каждым 5’-концом двухцепочечного фрагмента геномной ДНК,

заполнение пропуска между ДНК-транспозоном и фрагментом геномной ДНК с образованием библиотеки продуктов удлинения фрагментов двухцепочечной геномной ДНК, имеющих участки связывания праймеров на каждом конце,

создание подмножества водных капель в масляной фазе, при этом каждая водная капля подмножества содержит продукт удлинения фрагмента двухцепочечной геномной ДНК из библиотеки и реагенты для амплификации,

амплификацию фрагмента двухцепочечной геномной ДНК в каждой капле воды из подмножества капель с целью создания ампликонов фрагментов двухцепочечной геномной ДНК в каждой капле воды, причем амплификация происходит во всех каплях подмножества капель, и

сбор ампликонов из подмножества капель воды.

2. Способ по п. 1, согласно которому геномная ДНК является полной геномной ДНК, полученной из одной клетки.

3. Способ по п. 1, согласно которому транспозаза является транспозазой Tn5, транспозазой Mu, транспозазой Tn7 или транспозазой IS5.

4. Способ по п. 1, согласно которому транспозон ДНК включает штрихкодовую последовательность.

5. Способ по п. 1, согласно которому транспозон ДНК включает штрихкодовую последовательность, и при этом сайт связывания праймера находится на 5’-конце транспозона ДНК.

6. Способ по п. 1, согласно которому транспозон ДНК включает двухцепочечный сайт связывания Tnp в 19 п.о. и липкий конец, при этом липкий конец включает штрихкодовую последовательность и сайт связывания праймера на 5’-конце липкого конца.

7. Способ по п. 1, согласно которому связанные транспозазы удаляют из двухцепочечных фрагментов до заполнения пропуска и удлинения фрагментов двухцепочечной геномной ДНК.

8. Способ по п. 1, согласно которому транспозазы представляют собой транспозазы Tn5, каждая из которых образует комплекс с транспозоном ДНК, при этом транспозон ДНК включает двухцепочечный сайт связывания Tnp в 19 п.о. и липкий конец, при этом липкий конец включает штрихкодовую последовательность и сайт связывания праймера.

9. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию секвенирования ампликонов, собранных из подмножества капель воды.

10. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию обнаружения однонуклеотидных вариаций в ампликонах, собранных из подмножества капель воды.

11. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию обнаружения вариаций числа копий в ампликонах, собранных из подмножества капель воды.

12. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию обнаружения структурных изменений в ампликонах, собранных из подмножества капель воды.

13. Способ по п. 1, согласно которому геномная ДНК представляет собой ДНК из пренатальной клетки.

14. Способ по п. 1, согласно которому геномная ДНК представляет собой ДНК из раковой клетки.

15. Способ по п. 1, согласно которому геномная ДНК представляет собой ДНК из циркулирующей в крови опухолевой клетки.

16. Способ по п. 1, согласно которому геномная ДНК представляет собой ДНК из отдельной пренатальной клетки.

17. Способ по п. 1, согласно которому геномная ДНК представляет собой ДНК из отдельной раковой клетки.

18. Способ по п. 1, согласно которому геномная ДНК представляет собой ДНК из отдельной циркулирующей в крови опухолевой клетки.

19. Способ по п. 1, согласно которому множество водных капель в масляной фазе создают путем объединения масла с некоторым объемом водной среды, содержащей библиотеку продуктов удлинения фрагментов двухцепочечной геномной ДНК и реагенты для амплификации, таким образом, чтобы создать больше капель, чем имеется продуктов удлинения фрагментов двухцепочечной геномной ДНК в библиотеке.

20. Способ по п. 1, согласно которому множество водных капель в масляной фазе создают путем объединения масла с некоторым объемом водной среды, содержащей библиотеку продуктов удлинения фрагментов двухцепочечной геномной ДНК и реагенты для амплификации, таким образом, чтобы создать больше капель, чем имеется продуктов удлинения фрагментов двухцепочечной геномной ДНК в библиотеке, и при этом множество водных капель образуется спонтанно.

21. Способ по п. 1, согласно которому множество водных капель в масляной фазе создают путем объединения масла с некоторым объемом водной среды, содержащей библиотеку продуктов удлинения фрагментов двухцепочечной геномной ДНК и реагенты для амплификации, таким образом, чтобы создать больше капель, чем имеется продуктов удлинения фрагментов двухцепочечной геномной ДНК в библиотеке, и при этом множество водных капель создают путем энергичного смешивания масляной фазы и водной среды.

22. Способ по п. 1, согласно которому множество водных капель в масляной фазе создают путем объединения масляной фазы и водной среды внутри микрофлюидного чипа.

23. Способ по п. 1, согласно которому амплификация фрагмента двухцепочечной геномной ДНК в каждой водной капле из множества капель протекает в микрофлюидном чипе.

24. Способ по п. 1, согласно которому сайт связывания праймера является сайтом связывания специфического праймера ПЦР.

25. Способ по п. 1, согласно которому амплификация, происходящая во всех каплях множества капель, является ПЦР-амплификацией с использованием последовательности специфического праймера.

26. Способ амплификации геномной нуклеиновой кислоты, включающий

обработку геномной ДНК в водной среде множеством димеров транспозазы, связанной с транспозоном ДНК, при этом транспозон ДНК включает сайт связывания транспозазы и специфический сайт связывания праймера ПЦР, при этом множество димеров связывается с целевыми местоположениями вдоль двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и транспозаза расщепляет геномную ДНК на множество фрагментов двухцепочечной геномной ДНК, представляющих библиотеку фрагментов геномной ДНК, при этом каждый фрагмент двухцепочечной геномной ДНК имеет транспозон ДНК, связанный с каждым 5’-концом фрагмента двухцепочечной геномной ДНК,

заполнение пропуска между транспозоном ДНК и фрагментом геномной ДНК с образованием библиотеки продуктов удлинения фрагментов двухцепочечной геномной ДНК, имеющих специфические участки связывания праймеров ПЦР на каждом конце,

разделение водной среды на большое число водных капель в масляной фазе, при этом каждая водная капля включает не более одного фрагмента двухцепочечной геномной ДНК и дополнительно включает реагенты для амплификации,

амплификацию фрагмента двухцепочечной геномной ДНК в каждой капле воды с целью создания ампликонов фрагментов двухцепочечной геномной ДНК в каждой капле воды, причем амплификация происходит во всех каплях подмножества капель, и

сбор ампликонов из водных капель путем деэмульгирования водных капель.