RU2016895C1 - Strain of bacteria arthrobacter crystallopoietes - a destructor of pyridine - Google Patents

Abstract

FIELD: biological treatment of industrial sewage. SUBSTANCE: strain Arthrobacter crystallopoietes VKM Ac-1334D decomposes pyridine and forms 3-hydroxy- and 2,3-dihydroxypyridines as intermediate products. Strain A. crystallopoietes VKM Ac-1334D is isolated from accumulative culture of microorganism-destructors of pyridine compounds obtained from soil samples of chemical-pharmaceutical plant. This strain utilizes pyridine as a single source of nitrogen and carbon at concentration up to 1.5 g/l for 48 h and forms 3-hydroxy- and 2,3-dihydroxypyridines with yield 0.1% after 24 h of culture growth. EFFECT: enhanced effectiveness of bacterial strain. 1 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма, который может найти применение при биологической очистке промышленных сточных вод ряда производств микробиологической и медицинской промышленности от высокотоксичного пиридина, а также образующего в качестве промежуточных продуктов деградации 3-гидрокси- и 2,3-дигидроксипиридины - синтоны в синтезе ряда ценных физиологически активных соединений. The invention relates to the microbiological industry and relates to the production of a new strain that can find application in the biological treatment of industrial wastewater from a number of microbiological and medical industries from highly toxic pyridine, as well as 3-hydroxy and 2,3-dihydroxypyridines, which are formed as intermediate degradation products synthons in the synthesis of a number of valuable physiologically active compounds.

Известен штамм Nocardia sр. Z-1, использующий пиридин в качестве источник углерода и азота в концентрации до 0,1 об.%. Known strain of Nocardia sp. Z-1, using pyridine as a source of carbon and nitrogen at a concentration of up to 0.1 vol.%.

К недостаткам данного штамма можно отнести следующие:
рост при более низких концентрациях пиридина;
медленную утилизацию субстрата;
неспособность образовывать гидроксипроизводные пиридина.The disadvantages of this strain include the following:
growth at lower pyridine concentrations;
slow utilization of the substrate;
inability to form hydroxy derivatives of pyridine.

Известен штамм Corynebacterium sр., утилизирующий пиридин в концентрации до 0,15 об.%. Known strain of Corynebacterium sp., Utilizing pyridine in a concentration of up to 0.15 vol.%.

К недостаткам данной культуры можно отнести следующие:
потребность в дополнительном источнике азота;
неспособность образовывать гидроксипроизводные пиридина.The disadvantages of this culture include the following:
need for an additional source of nitrogen;
inability to form hydroxy derivatives of pyridine.

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения является штамм Nocardia р. КМ-2, который способен утилизировать пиридин и образовывать в качестве промежуточного соединения 3-гидроксипиридин. The closest analogue (prototype) of the present invention is a strain of Nocardia p. KM-2, which is capable of utilizing pyridine and forming 3-hydroxypyridine as an intermediate.

К недостаткам данного штамма можно отнести неспособность образовывать 2,3-дигидроксипиридин, который является более ценным препаратом. The disadvantages of this strain include the inability to form 2,3-dihydroxypyridine, which is a more valuable drug.

Целью изобретения является выделение нового штамма бактерий, утилизирующих пиридин с образованием в качестве промежуточных продуктов 3-гидрокси- и 2,3-дигидроксипиридинов. Эти соединения могут быть использованы как синтоны в синтезе ряда ценных физиологически активных веществ. The aim of the invention is the isolation of a new strain of bacteria utilizing pyridine with the formation of 3-hydroxy and 2,3-dihydroxypyridines as intermediates. These compounds can be used as synthons in the synthesis of a number of valuable physiologically active substances.

Это достигается выделением штамма Аrthrobacter crystalloрoietes ВКМ Ас-1334Д из накопительной культуры микроорганизмов - деструкторов пиридиновых соединений, полученной из образцов почвы, взятых с территории химико-фармацевтического завода. This is achieved by isolating the Arthrobacter crystallo-VKET As-1334D strain from the accumulative culture of microorganisms - destructors of pyridine compounds obtained from soil samples taken from the territory of the chemical-pharmaceutical plant.

Для выделения использовали синтетическую среду. В качестве источника углерода и азота использовали пиридин. Чистую культуру выделяли из отдельной колонии, полученной путем рассева накопительной культуры на чашки с агаризованной синтетической средой с пиридином. A synthetic medium was used for isolation. Pyridine was used as a source of carbon and nitrogen. Pure culture was isolated from a separate colony obtained by sieving the accumulation culture on plates with agarized synthetic medium with pyridine.

Штамм хранят как методами лиофилизации и криоконсервации, так и субкультивированием. Штамм Аrthrobacter crystalloрoietes депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКМ Ас-1334Д, непатогенен. The strain is stored both by lyophilization and cryopreservation methods, and by subculture. The strain Arthrobacter crystalloroietes was deposited in the All-Union Collection of Microorganisms of the IBPM Academy of Sciences of the USSR under the number VKM Ac-1334D, non-pathogenic.

Морфологические и культуральные признаки. Morphological and cultural characters.

Клетки грамположительные, неподвижные, бесспоровые, некислотоустойчивые. Во время роста наблюдаются морфологические изменения клеток: молодая культура (12-24 ч) состоит из палочек, слегка изогнутых, собранных в короткие цепочки по 2-3, образующих Х,Y,V-образные структуры. Старые культуры (2-7 дней) состоят главным образом из кокковидных клеток. При пересеве на свежую среду рост происходит путем увеличения кокковидных клеток. Размеры клеток 0,5-0,8х1,2-4,0 мкм. На агаризованной синтетической среде с пиридином культура однородна, колонии круглые, блестящие, гладкие, выпуклые, сначала белесые, но при старении желтеют, размер 0,5-3,0 мм, пастообразной консистенции, с ровным краем, вырастают за 48 ч. На МПА вид колоний не менялся, однако их размер был больше (1-4 мм), вырастают за 36 ч. В жидкой синтетической среде с пиридином штамм растет, образуя муть, небольшой осадок, который при взбалтывании легко взмучивается. Наблюдается образование желтого пигмента. На МПБ образуется светло-желтая пленка, небольшой осадок. Gram-positive cells, motionless, indisputable, non-acid-resistant. During growth, morphological changes in cells are observed: a young culture (12-24 hours) consists of sticks, slightly curved, assembled in short chains of 2-3, forming X, Y, V-shaped structures. Older cultures (2-7 days) consist mainly of coccoid cells. When reseeding on fresh medium, growth occurs by increasing cocciform cells. Cell sizes 0.5-0.8 x 1.2-4.0 microns. On an agarized synthetic medium with pyridine, the culture is homogeneous, the colonies are round, shiny, smooth, convex, initially whitish, but yellow with aging, size 0.5-3.0 mm, pasty consistency, with a smooth edge, grow in 48 hours. On MPA the appearance of the colonies did not change, but their size was larger (1-4 mm), they grow in 36 hours. In a liquid synthetic medium with pyridine, the strain grows, forming a dregs, a small precipitate that easily agitates with agitation. The formation of a yellow pigment is observed. A light yellow film forms on the BCH, a small precipitate.

Физиолого-биохимические признаки. Physiological and biochemical characteristics.

Строгий аэроб, оптимальная температура роста 28-30^оС, максимальная 42^оС, минимальная 12-15^оС. Оптимум рН 7,0-7,2. Каталазо- и оксидазоположителен. Не образует кислот при росте на глюкозе, галактозе, фруктозе, мальтозе, арабинозе, рибозе, ксилозе, сахарозе, рафинозе, манните, глицерина, сорбите, дульците. Не образует индола и сероводорода. Нитраты восстанавливает, желатину не разжижает, тирозин не расщепляет, крахмал не гидролизует, образует уреазу. Усваивает пропионат, сукцинат, ацетат, малеат, слабо цитрат, не усваивает оксалоацетат. Клеточная стенка содержит лизин, менахиноны - 9 (Н₂). Признаки штамма устойчивы. В факторах роста не нуждается. Антибиотики - тетрациклин, ампициллин абсолютно подавляют рост штамма. Сильно подавляют рост рифампицин, канамицин, стрептомицин.Strict aerobe, optimum growth temperature 28-30 ^{° C,} maximum 42 ^{° C,} a minimum of 12-15 ° ^C Optimum pH 7.0-7.2. Catalase and oxide positive. It does not form acids when grown on glucose, galactose, fructose, maltose, arabinose, ribose, xylose, sucrose, raffinose, mannitol, glycerol, sorbite, dulcite. Does not form indole and hydrogen sulfide. It restores nitrates, does not dilute gelatin, does not break down tyrosine, does not hydrolyze starch, and forms urease. Absorbs propionate, succinate, acetate, maleate, weakly citrate, does not absorb oxaloacetate. The cell wall contains lysine, menaquinones - 9 (H ₂ ). The signs of the strain are stable. It does not need growth factors. Antibiotics - tetracycline, ampicillin absolutely inhibit the growth of the strain. Strongly inhibit the growth of rifampicin, kanamycin, streptomycin.

Клетки штамма А. crystalloрoietes ВКМ Ас-1334Д содержат две плазмиды рВS320 и рВS321 с мол.м. 100 и 80 мДа соответственно. Опытами по элиминации и коньюгации доказано, что плазмида рВS321 (80 мДа) отвечает за способность к деградации пиридина данным штаммом. Митомицин С в концентрации 0,1 мкг/мл, додецилсульфат натрия (0,002%) вызывают элиминацию плазмиды рВS321 из клеток с одновременной потерей способности к деградации пиридина. Плазмида рВS321 коньюгативна и переносится в клетки штамма Аrthrobacter crystalloрoietes В-495 с частотой 10^-7 на клетку донора.The cells of the strain A. crystalloietes VKM Ac-1334D contain two plasmids pBS320 and pBS321 with mol.m. 100 and 80 mDa, respectively. It was proved by elimination and conjugation experiments that plasmid pBS321 (80 mDa) is responsible for the ability to degrade pyridine by this strain. Mitomycin C at a concentration of 0.1 μg / ml, sodium dodecyl sulfate (0.002%) cause the elimination of the plasmid pBS321 from cells with a simultaneous loss of the ability to degrade pyridine. Plasmid pBS321 is conjugative and is transferred to cells of the Arthrobacter crystalloietes B-495 strain with a frequency of 10 ^-7 per donor cell.

П р и м е р 1. Деградация пиридина в колбах при аэрации. PRI me R 1. The degradation of pyridine in flasks during aeration.

Штамм А. crystalloрoietes ВКМ Ас-1334Д выращивают на синтетической среде, используя в качестве источника углерода и азота пиридин. Культивирование проводят в качалочных колбах с 200 мл среды при 28-30^оС на качалке 200 об/мин.Strain A. crystalloietes VKM Ac-1334D is grown on synthetic medium using pyridine as a source of carbon and nitrogen. Cultivation is carried out in rocking flasks with 200 ml of medium at 28-30 ^about C on a rocking chair 200 rpm.

Получение посевного материала культуры для утилизации пиридина осуществляют следующим образом. Культуру штамма, хранившуюся на синтетической агаризованной среде с пиридином (1 г/л), переносят в пробирки с 10 мл среды, где содержится 1,5 г/л данного субстрата. Полученный посевной материал переносят в колбы с 200 мл среды с пиридином (1,5 г/л). В качестве посевного материала используют также жидкую культуру, хранившуюся в мицелиальных пробирках. Выращивание культуры проводят в течение 44-48 ч. Obtaining seed culture for the disposal of pyridine is as follows. The strain culture, stored on a synthetic agar medium with pyridine (1 g / l), is transferred to test tubes with 10 ml of medium containing 1.5 g / l of this substrate. The resulting seed was transferred to flasks with 200 ml of pyridine medium (1.5 g / l). A liquid culture stored in mycelial tubes is also used as seed. Cultivation is carried out for 44-48 hours

Полноту потребления пиридина определяют в подкисленной НСl до рН 2,0-3,0 и отделенной от биомассы центрифугированием культуральной жидкости на спектрофотометре, а также с помощью хромато-масс-спектрометрии. Динамика деструкции пиридина культурой А.crystalloрietes ВКМ Ас-1334Д приведена в таблице. The completeness of the consumption of pyridine is determined in acidified HCl to a pH of 2.0-3.0 and separated from the biomass by centrifugation of the culture fluid on a spectrophotometer, as well as by chromatography-mass spectrometry. The dynamics of the destruction of pyridine culture A.crystallorietes VKM Ac-1334D shown in the table.

П р и м е р 2. Идентификация гидроксипиридинов в качестве промежуточных продуктов деградации пиридина штаммом А.crystalloрoietes ВКМ Ас-1334Д. PRI me R 2. Identification of hydroxypyridines as intermediate products of the degradation of pyridine strain A.crystalloroietes VKM Ac-1334D.

Культуральная жидкость, полученная в объеме 1 л и отделенная от клеток центрифугированием, экстрагировалась при нейтральном рН хлороформом в течение 30 ч. Хлороформенный экстракт упаривали в вакууме досуха, остаток растворяли в 0,5 мл этанола и хроматографировали в системе хлороформ - ацетон - этанол (7:2:2) на силикагеле РSС Fertigрlatten Kieselgel 60 F₂₅₄ Меrok. Из полосы с Rf=0,7 был выделен 3-гидроксипиридин, из полосы с Rf=0,4 - - 2,3-дигидроксипиридин. 3-гидрокси- и 2,3-дигидроксипиридины были выделены в количествах 1,5 и 2,0 мг соответственно (выход 0,1%).The culture fluid obtained in a volume of 1 L and separated from the cells by centrifugation was extracted with neutral chloroform for 30 h. The chloroform extract was evaporated to dryness in vacuo, the residue was dissolved in 0.5 ml of ethanol and chromatographed in a chloroform - acetone - ethanol system (7 : 2: 2) on PCS silica gel Fertigrlatten Kieselgel 60 F ₂₅₄ Merok. 3-hydroxypyridine was isolated from the band with Rf = 0.7; 2,3-dihydroxypyridine was isolated from the band with Rf = 0.4. 3-hydroxy- and 2,3-dihydroxypyridines were isolated in amounts of 1.5 and 2.0 mg, respectively (yield 0.1%).

Идентификацию этих соединений приводили в виде ТМС-производных на хромато-масс-спектрометре "Varian-МАТ-212" при энергии ионизации 70 эВ. The identification of these compounds was given in the form of TMS derivatives on a Varian-MAT-212 chromatography-mass spectrometer at an ionization energy of 70 eV.

Масс-спектры выделенных соединений (в скобках указана интенсивность в % к максимальному иону) следующие:
3-гидроксипиридин в виде ТМС-производного: 167(62) М⁺, 152(100), 136(4), 122(5), 78(4), 73(11);
2,3-гидроксипиридин в виде моно-ТМС-производного: 183(30) М⁺, 168(17), 155(4), 150(5), 139(15), 112(4), 73(100);
2,3-дигидроксипиридин в виде бис-ТМС-производного: 255(3) М⁺, 240(10), 225(49), 156(6), 103(74), 96(15), 73(100).The mass spectra of the isolated compounds (in parentheses indicate the intensity in% to the maximum ion) are as follows:
3-hydroxypyridine as a TMS derivative: 167 (62) M ⁺ , 152 (100), 136 (4), 122 (5), 78 (4), 73 (11);
2,3-hydroxypyridine as a mono-TMS derivative: 183 (30) M ⁺ , 168 (17), 155 (4), 150 (5), 139 (15), 112 (4), 73 (100);
2,3-dihydroxypyridine as a bis-TMS derivative: 255 (3) M ⁺ , 240 (10), 225 (49), 156 (6), 103 (74), 96 (15), 73 (100).

Кроме того, время удерживания (Rt) 3-гидрокси- и 2,3-дигидроксипиридинов идентично таковому для синтетических свидетелей. In addition, the retention times of (Rt) 3-hydroxy and 2,3-dihydroxypyridines are identical to those for synthetic witnesses.

Claims (1)

Штамм бактерий Arthrobacter crystallopoietes ВКМ Ас = 1334 D - деструктор пиридина. The bacterial strain Arthrobacter crystallopoietes VKM Ac = 1334 D is a pyridine destructor.

Images