RU2009500C1 - Method for preparation of cytotoxic conjugation - Google Patents

Abstract

FIELD: treatment of tumors and transplantation practice. SUBSTANCE: conjugating 14-haloidarubicine (1 da) with monoclonal antibody or fragment thereof containing at least one antigen-binding portion of antigen produces cytotoxic conjugation which is cleaned of darubicine by adsorptive or ion-exchange chromatography. EFFECT: intensified cytotoxic effect of conjugation. 2 tbl

Description

Изобретение относится к конъюгантам иммуноглобулина, способу их получения и использованию. The invention relates to immunoglobulin conjugants, a method for their preparation and use.

Общая концепция целенаправленной доставки антинеопластических веществ к опухолям, используя моноклональные антитела (Moab) известна, и в настоящее время определяется ее терапевтическое значение. Обычно такой подход включает получение конъюгантов антитела с токсическим веществом, способных селективно локализоваться и убивать клетки опухоли. Основное внимание уделялось конструированию иммунотоксинов из A-цепей токсинов растений и бактерий и антител, таких которые связывают антиген и, проникая внутрь, ведут к гибели клеток. В действительности многие Moab, которые считались специфичными к опухолям, оказались также реакционноспособными по отношению к субпопуляциям нормальных клеток, и, следовательно, может оказаться невозможным использовать такие сильные токсины из-за того, что потенциально они могут повредить нормальные ткани. Безопасной альтернативой растительным токсинам является соединение антител с обычными противоопухолевыми препаратами такими, как доксорубицин, виндезин, хлорамбуцил, мелфалан и метотрексат. Из-за неспецифической токсичности обычно используемых антинеопластических агентов предпринимались попытки повысить их терапевтический индекс путем соединения их с Moab и с ассоциированными с опухолью антигенами. The general concept of targeted delivery of antineoplastic substances to tumors using monoclonal antibodies (Moabs) is known, and its therapeutic value is currently being determined. Typically, this approach involves the preparation of conjugants of an antibody with a toxic substance capable of selectively localizing and killing tumor cells. The main attention was paid to the construction of immunotoxins from the A-chains of plant and bacterial toxins and antibodies, which bind the antigen and penetrate inside and lead to cell death. In fact, many Moabs that were thought to be tumor specific were also reactive with respect to subpopulations of normal cells, and therefore it may not be possible to use such strong toxins because they could potentially damage normal tissues. A safe alternative to plant toxins is combining antibodies with conventional anticancer drugs such as doxorubicin, vindesine, chlorambucil, melphalan and methotrexate. Due to the non-specific toxicity of commonly used antineoplastic agents, attempts have been made to increase their therapeutic index by combining them with Moab and with tumor associated antigens.

Цель - повышение цитотоксического действия конъюганта. The goal is to increase the cytotoxic effect of the conjugant.

Настоящее изобретение раскрывает конъюганты иммуноглобулина, включающая Ida, соединенные с моноклональными антителами или их фрагментами, включающими по меньшей мере, один из участков связывания антигена данного антитела. The present invention discloses immunoglobulin conjugants comprising Ida coupled to monoclonal antibodies or fragments thereof comprising at least one of the antigen binding sites of a given antibody.

Ida описан в патенте США 4077988. Предпочтительно 2-8 молекул Ida ковалентно связаны с каждой молекулой антитела или фрагмента антитела, более предпочтительно 2-6. Обычно, но не обязательно, молекулы Ida присоединены в положении 14 к моноклональному антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно они связаны непосредственно, хотя возможна связь через инертный носитель или сшивающий агент. Ida может быть связан с моноклональным антителом или фрагментом антитела посредством аминогруппы. Это можно осуществить, используя разлагающийся пептидный соединитель, декстрановый носитель, кислотночувствительный соединитель или полиглутаминовую кислоту. Ida is described in US Pat. No. 4,077,988. Preferably, 2-8 Ida molecules are covalently linked to each antibody molecule or antibody fragment, more preferably 2-6. Typically, but not necessarily, Ida molecules are attached at position 14 to a monoclonal antibody or antibody fragment. Preferably, they are bonded directly, although bonding via an inert carrier or a crosslinking agent is possible. Ida may be coupled to a monoclonal antibody or antibody fragment via an amino group. This can be accomplished using a degradable peptide connector, a dextran carrier, an acid-sensitive connector, or polyglutamic acid.

Обычно каждое антитело или фрагмент антитела специфичны к антигену на поверхности клеток, против которых необходимо воздействовать Ida. Например, антитело или фрагмент антитела могут быть специфичны к соответствующей ткани-мишени такой, как неоплазм у человека. Примерами неоплазмов у человека, на которые может быть желательно направить действие Ida, являются опухоли груди, оболочной кишки, легких, простаты, яичников, тимуса и другие раки, саркомы и лейкемии. Антитело и фрагмент антитела может быть специфичен к неоплазмам у животных. Можно использовать антитело или фрагмент антитела специфичный к рецептору трансферина (TFR) человека, который присутствует на делящихся клетках, эритроидных клетках-предшественника и клетках различных опухолей. Подходящее анти-ТГР моноклональное антител можно использовать против рецептора трансферина на клетках LiCR-LON-Uhy-2(NMy-2). Typically, each antibody or antibody fragment is specific for the antigen on the surface of the cells against which Ida needs to be attacked. For example, an antibody or antibody fragment may be specific for an appropriate target tissue, such as human neoplasm. Examples of human neoplasms that may be desirable to target Ida are tumors of the breast, colon, lung, prostate, ovary, thymus, and other cancers, sarcomas, and leukemia. The antibody and antibody fragment may be specific for neoplasms in animals. An antibody or antibody fragment specific for a human transferrin receptor (TFR) can be used that is present on dividing cells, erythroid progenitor cells and various tumor cells. Suitable anti-TGR monoclonal antibodies can be used against the transferrin receptor on LiCR-LON-Uhy-2 (NMy-2) cells.

Если конъюганты иммуноглобулина предполагается использовать для уничтожения специфичных популяций Т-лимфоцитов, то антитело или фрагмент антитела специфичен к клеточному поверхностному антигену, который сам по себе специфичен к этим Т-лимфоцитам. Поэтому антитело или фрагмент антитела может быть специфичен к популяции хелперов, супрессоров или цитотоксичных Т-лимфоцитов. If immunoglobulin conjugants are intended to be used to kill specific populations of T-lymphocytes, then an antibody or antibody fragment is specific for a cell surface antigen, which in itself is specific for these T-lymphocytes. Therefore, an antibody or antibody fragment may be specific for a population of helpers, suppressors, or cytotoxic T lymphocytes.

Предпочтительно моноклональное антитело или фрагмент антитела того же класса, что и то, против которого предполагается использовать конъюгант иммуноглобулина. Моноклональное антитело или фрагмент антитела человека или мыши обычно поэтому используют, когда предполагается вводить соединение человеку. Предпочтительно, чтобы антитело или фрагмент антитела был класса IgG. Фрагмент антитела может Fab или Fab' или F(ab)₂ фрагмент.Preferably, a monoclonal antibody or antibody fragment of the same class as that against which the immunoglobulin conjugate is intended to be used. A monoclonal antibody or a fragment of a human or mouse antibody is usually therefore used when the compound is intended to be administered to a human. Preferably, the antibody or antibody fragment is of the IgG class. The antibody fragment may be Fab or Fab 'or F (ab) ₂ fragment.

Можно использовать также мономер IgM, который можно получить из IgM-антитела путем протеолитического ферментативного переваривания. You can also use the IgM monomer, which can be obtained from an IgM antibody by proteolytic enzymatic digestion.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Конъюганты иммуноглобулина получают по настоящему изобретению по способу, который включает соединение Ida с моноклональным антителом или фрагментом антитела. Предпочтительно 14-гало-Ida вводят во взаимодействие с моноклональным антителом или фрагментом антитела. 14-заместитель может быть фтором, хлором, бромом или иодом, но предпочтительно бром. 14-бром-Ida описан в патенте США N 4125607. Конъюгацию, таким образом, можно осуществить способом, который включает: а) смешение моноклонального антитела или фрагмента антитела с молярным избытком 14-гало-Ida; б) проведение реакции при 18-37^оС; с) удаление осадка; удаление непрореагировавших исходных материалов путем гельфильтрации и е) удаление препарата (Ida) путем абсорбционной хроматографии или ионообменной хроматографии.Immunoglobulin conjugants are prepared according to the present invention by a method which comprises combining an Ida with a monoclonal antibody or antibody fragment. Preferably, 14-halo-Ida is introduced into interaction with a monoclonal antibody or antibody fragment. The 14 substituent may be fluoro, chloro, bromo or iodo, but preferably bromo. 14-bromo-Ida is described in US Pat. No. 4,125,607. Conjugation can thus be accomplished by a method that includes: a) mixing a monoclonal antibody or antibody fragment with a molar excess of 14-halo-Ida; b) conducting the reaction at 18-37 ^{° C;} c) sediment removal; removal of unreacted starting materials by gel filtration; and e) removal of the preparation (Ida) by absorption chromatography or ion exchange chromatography.

Стадию (а) обычно проводят в смешивающемся с водой органическом растворителе таком, как N-N-диметилформамид. Предпочтительный молярный избыток 14-гало-Ida на стадии (а) до 50 раз. На стадии (b) реакцию предпочтительно проводят в течение 1-8 ч. Обычно реакцию проводят при комнатной температуре. Stage (a) is usually carried out in a water-miscible organic solvent such as N-N-dimethylformamide. The preferred molar excess of 14-halo-Ida in step (a) is up to 50 times. In step (b), the reaction is preferably carried out for 1-8 hours. Typically, the reaction is carried out at room temperature.

Можно использовать и другие способы получения конъюганта. Если необходимо, чтобы конъюгант имел инертный носитель или сшивающий агент, расположенный между Ida и моноклональным антителом или фрагмент антитела, носитель или сшивающий агент обычно сначала присоединяют к атому углерода С-14 Ida и затем присоединяют к антителу или фрагменту антитела. Как указано выше, антитело или фрагмент антитела может быть связан с Ida посредством аминогруппы путем использования расщепляющегося пептидного соединителя, декстранового носителя, кислотночувствительного соединения или полиглутаминовой кислоты. You can use other methods for producing conjugant. If it is necessary that the conjugant has an inert carrier or crosslinking agent located between the Ida and the monoclonal antibody or antibody fragment, the carrier or crosslinking agent is usually first attached to the C-14 carbon atom of Ida and then attached to the antibody or antibody fragment. As indicated above, an antibody or antibody fragment may be coupled to Ida via an amino group using a cleavable peptide connector, a dextran carrier, an acid-sensitive compound, or polyglutamic acid.

Конъюганты иммуноглобулина по настоящему изобретению можно использовать для лечения рака у людей и млекопитающих. Можно применять терапевтически эффективное количество конъюганта. Рак может представлять собой твердую опухоль, асцитную опухоль или лейкемию. Неоплазмы у человека, которые можно лечить настоящими конъюгантами, указаны выше. Можно вводить два и более конъюганта в которых моноклональное антитело или фрагмент антитела в каждом конъюгате имеет различную специфичность. The immunoglobulin conjugants of the present invention can be used to treat cancer in humans and mammals. A therapeutically effective amount of a conjugant may be used. The cancer may be a solid tumor, ascites tumor, or leukemia. Human neoplasms that can be treated with these conjugants are indicated above. You can enter two or more conjugants in which the monoclonal antibody or antibody fragment in each conjugate has a different specificity.

Конъюгант можно вводить в виде инъекции. Можно его применять паэнтерально, например внутривенно. Его можно вводить локально или непосредственно в опухоль. Количество конъюганта, вводимое больному, зависит от различных факторов таких, как вид подлежащий лечению опухоли, состояние больного. Обычная доза составляет 0,4-1,6 мк конъюганта на 1 кг веса тела. Настоящие конъюганты можно применить совместно с другими химиотерапевтическими агентами или с агентами, усиливающими активность настоящих конъюгантов, например, вазоактивные агенты или фактор омертвления опухоли. The conjugant can be administered as an injection. It can be used parenterally, for example intravenously. It can be injected locally or directly into the tumor. The amount of conjugant administered to the patient depends on various factors such as the type of tumor to be treated and the condition of the patient. The usual dose is 0.4-1.6 microns conjugant per 1 kg of body weight. These conjugants can be used in conjunction with other chemotherapeutic agents or with agents that enhance the activity of these conjugants, for example, vasoactive agents or tumor necrosis factor.

Конъюганты можно также использовать для специфичного удаления подкласса Т-лимфоцитов из популяции клеток. Человеку или животному можно ввести цитотоксично эффективное количество конъюганта, включающего моноклональное антитело или фрагмент антитела, направленный против клеточного поверхностного антитела, присутствующего на подлежащих удалению лимфоцитах. При альтернативном варианте популяцию клеток можно инкубировать in vitro с таким конъюгантом. Можно использовать комбинацию конъюгантов против двух или более клеточных поверхностных антигенов. Подлежащие удалению лимфоциты могут представлять собой хелперы, супрессоры или цитотоксичные Т-клетки. Conjugants can also be used to specifically remove a subclass of T lymphocytes from a cell population. A human or animal can be administered a cytotoxic effective amount of a conjugant comprising a monoclonal antibody or antibody fragment directed against a cell surface antibody present on lymphocytes to be removed. Alternatively, the cell population can be incubated in vitro with such a conjugant. A combination of conjugants against two or more cellular surface antigens may be used. The lymphocytes to be removed may be helpers, suppressors, or cytotoxic T cells.

Этот аспект настоящего изобретения можно использовать для предотвращения отторжения трансплантированной ткани у реципиента. Настоящие конъюганты можно использовать как иммуносупрессивные агенты. Реципиенту вводят такое количество конъюганта, которое эффективно предотвращает отторжение трансплантата. В данном случае предпочтительно удаляют цитотоксичные Т-клетки. This aspect of the present invention can be used to prevent rejection of transplanted tissue in a recipient. These conjugants can be used as immunosuppressive agents. The recipient is administered such an amount of conjugant that effectively prevents transplant rejection. In this case, cytotoxic T cells are preferably removed.

Рак у животных и человека можно лечить путем удаления Т-клеток-супрессоров введением соответствующего конъюганта. Аутоиммунные заболевания можно лечить путем введения конъюганта для удаления Т-клеток-хелперов. В каждом случае применяются указанные выше способ введения конъюганта и доза. Cancer in animals and humans can be treated by removing T-suppressor cells by administering an appropriate conjugant. Autoimmune diseases can be treated by administering a conjugant to remove helper T cells. In each case, the above method of administration of the conjugant and the dose are used.

Иммуноглобулиновые конъюганты приготавливают в виде фармацевтических композиций с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Можно использовать любой подходящий носитель или разбавитель. Immunoglobulin conjugants are prepared in the form of pharmaceutical compositions with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. Any suitable carrier or diluent may be used.

Способ поясняется примерами. The method is illustrated by examples.

П р и м е р 1. Материалы и способы. Опухолевые клетки. PRI me R 1. Materials and methods. Tumor cells.

Линии клеток, исследуемые в данном примере, включали вариант [E3] III(1)75NρE³(LY-2⁺ мышиной тимоны (ELY (LY-2, TFR) лимфомы.The cell lines tested in this example included the [E3] III (1) 75NρE ³ (LY-2 ⁺ mouse cumin (ELY (LY-2, TFR) lymphoma) variant.

СЕМ линию (TFR⁺) человеческих клеток и линию (250-30,6⁺) человеческих клеток COLO 205. Клетки сохранялись in vitro в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ДМЕ) или в среде R PMI 1640, в которую добавляли 10% -ную нагретую сыворотку новорожденного теленка Flow 2 мМ глютамина (Commonwealth Sorum Labratorisly Iney 100 мкг/мл стрептомицина Glasco, Meltawine, Australia и 1000 И. Е. /мл пенициллина Commonwealth Sorum Laboratories). Опухоль Е3 поддерживалась in vitro серийным пассажем в (С57BL/6xBA B/c/F₁ мышь/мышь CBF₁. У клетки изх асцитической жидкости промыли и центрифугировали (400g х 5 мл два раза в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), рН 7,3 повторно суспендировали в PBS и подкожно ввели (S. e) в абдоминальную стенку мыши: эти операции привели к прощупываемым опухолям до лечения. Мышь подвергли серии внутривенных (iv) или внутриопухолевых (it) обработок и ежесуточно измеряли последующий размер опухолей при помощи калибра-квадрата, производя измерения по перпендикулярным осям опухолей. Данные записывались как средний размер опухоли (произведение двух диаметров± cредняя квадратическая ошибка).CEM line (TFR ⁺ ) of human cells and COLO 205 line of human cells (250-30.6 ⁺ ). Cells were stored in vitro in Dulbecco's modified Eagle medium (DME) or in R PMI 1640 medium, to which 10% was added heated calf serum Flow 2 mM glutamine (Commonwealth Sorum Labratorisly Iney 100 μg / ml streptomycin Glasco, Meltawine, Australia and 1000 I.E. / ml penicillin Commonwealth Sorum Laboratories). The E3 tumor was maintained in vitro by serial passage in (C57BL / 6xBA B / c / F ₁ mouse / mouse CBF _1. The cells from the ascites were washed and centrifuged (400g x 5 ml twice in phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.3 was resuspended in PBS and subcutaneously injected (S. e) into the abdominal wall of the mouse: these operations led to palpable tumors before treatment.The mouse was subjected to a series of intravenous (iv) or intratumoral (it) treatments and the subsequent tumor size was measured daily using caliber-square, taking measurements along the perpendicular axes of the tumor Leu. Data were recorded as the average tumor size (product of two diameters ± mean square error).

Мыши. The mice.

CBA, (C57BL (6xBALB/c/CBF_I мыши) и голые мыши). Экспериментальные группы из 8-10 мышей одного пола и возраста использовали в каждом эксперименте.CBA, (C57BL (6xBALB / c / CBF _I mice) and nude mice). Experimental groups of 8-10 mice of the same sex and age were used in each experiment.

Моноклональные антитела. Monoclonal antibodies.

Использовали следующие моноклональные антитела: (i) Анти(Ly-2.1/IgGI), реагирующее с мышиной Ly-2.1 специфичностью A3C6(антиTFR/IgGI),
реагирующее с трансфериновым рецептором человека (TFR) и (iii) антитело, обозначенное 250-30.6, реагирующее с антигеном, присутствующим на клетках карциномы ободочной кишки человека.The following monoclonal antibodies were used: (i) Anti (Ly-2.1 / IgGI), reactive with mouse Ly-2.1 with specificity of A3C6 (anti-TFR / IgGI),
reacting with a human transferrin receptor (TFR); and (iii) an antibody designated 250-30.6, reacting with an antigen present on human colon carcinoma cells.

MoAb выделили из асцитической жидкости осаждением при помощи 40% -ного сульфата аммония, растворением в PBS и диализом тем же буферным раствором. Эти неочищенные препараты либо абсорбировали на протеин-A-сефарозе интенсивно промывали PB (рН 7,3) и разбавляли 0,2 М глицин(HCl) (рН 2,8), либо пропускали через синюю колонну A ligel. MoAb was isolated from ascitic fluid by precipitation with 40% ammonium sulfate, dissolution in PBS and dialysis with the same buffer solution. These crude preparations were either absorbed on protein A-Sepharose, washed extensively with PB (pH 7.3) and diluted with 0.2 M glycine (HCl) (pH 2.8), or passed through a blue A ligel column.

После нейтрализации MoAb подвергли диализу по отношению к PBS взяли аликвотную пробу и хранили при -70^оС. A3C6 получили внутрибрюшинной иммунизацией мыши CAB с недельными интервалами в течение трех недель клетками LiCR-LON-HMy-2-(HMy-2)/OKT9^+ve в количестве 2х10⁶, удаляя селезенки через трое суток после последней инъекции и сливая с клетками Р3-NSI-AG4-1(NG-1).After neutralizing MoAb was dialyzed against PBS to an aliquot taken and stored at -70 ° ^C. A3C6 CAB received intraperitoneal immunization mouse at weekly intervals for three weeks cells LiCR-LON-HMy-2- ( HMy- 2) / OKT9 ^{+ ve} in an amount of 2x10 ⁶ , removing the spleen three days after the last injection and merging with P3-NSI-AG4-1 (NG-1) cells.

Получение и количественная оценка конъюгантов. Preparation and quantification of conjugants.

Интактные анти-Ly-2.1, анти-TFRMoAb или 250-30.6 (1-2 мг/мл в борном буферном растворе, рН 8,0) смешали с молярным избытком (1-50) 14-бром-4-деметоксидаунорубицина (Br-Ida), растворенного в (NN)-диметилформамиде (ДМФ) при 10 мг/мл. Реакцию поддерживали при комнатной температуре 4 ч перед центрифугированием (400gx5 мин) для удаления любого осадка. Свободный Br-Ida и другие исходные вещества удалили гельфильтрационной хроматографией, используя колонну Sephadex G-25/РД-10. Pharmacia и конъюганты затем пропустили через колонну PorapaxA/Millipore для удаления любого поглощенного лекарства. Количество IdA, включенного в конъюганты лекарства MoAb определялось абсорбционной спектрометрией при 483 мм/Е₄₉₈ = 3,4х10³ М^-1см^-1 и протеиновой оценкой.Intact anti-Ly-2.1, anti-TFRMoAb or 250-30.6 (1-2 mg / ml in boric buffer solution, pH 8.0) were mixed with a molar excess (1-50) of 14-bromo-4-demethoxidaunorubicin (Br- Ida) dissolved in (NN) -dimethylformamide (DMF) at 10 mg / ml. The reaction was maintained at room temperature for 4 hours before centrifugation (400gx5 min) to remove any precipitate. Free Br-Ida and other starting materials were removed by gel filtration chromatography using a Sephadex G-25 / RD-10 column. Pharmacia and conjugants were then passed through a PorapaxA / Millipore column to remove any absorbed drug. The amount of IdA included in the conjugates of the MoAb drug was determined by absorption spectrometry at 483 mm / E ₄₉₈ = 3.4 x 10 ³ M ^-1 cm ^-1 and protein estimation.

Активность антитела. Antibody activity.

Тест на розеткообразование, использующий овечий антимышиный иммуноглобулин (SAMC), применили для определения активности антитела Ida-MoAb конъюгантов по сравнению со свободными моноклональными антителами (MoAb), которые подвергались тем же процедурам, которые используются в методики сцепления. A rosette test using sheep anti-mouse immunoglobulin (SAMC) was used to determine the activity of Ida-MoAb conjugate antibodies compared to free monoclonal antibodies (MoAb), which were subjected to the same procedures used in coupling techniques.

Активность лекарства. The activity of the drug.

(а) 24-часовой тест на подавление: 100 мкл клеток (2-5 х 10⁶/мл) внесли в микротитровальную чашку, с плоским дном и выращивали 1 ч при 37^оС. Свободный идарубицин (Ida), растворенный в PB, и конъюганты Ida-MoAb асептически отфильтровали и в стерильном PBS выполнили разбавления 450 мкл свободного Ida или конъюганта добавили в клетки, используя двойные лунки для каждой пробы: контрольные лунки получали 50 мкл PBS и клетки выращивали при 37^оС, 7% CO₂ в течение 24 ч.(a) 24-hour test at suppressing 100 ul of cells (2-5 x 10 ⁶ / ml) were made in microtiter plates, with a flat bottom and grown 1 h at 37 ° ^C. Free Idarubicin (Ida), dissolved in PB, and conjugates Ida-MoAb was aseptically filtered in sterile PBS fulfilled diluting 450 l of free Ida or conjugate was added to the cells using duplicate wells for each sample: control wells received 50 .mu.l of PBS, and the cells were grown at ³⁷ ° C, 7% CO ₂ for 24 h

b) 30-минутный тест на подавление: 200 мкл клеток (2-5 10⁶/мл) собрали в стерильные пробирки Эппендорфа, повторно суспендировали в стерильном лекарстве или конъюганте и смешивали 30 мин при 37^оС. Затем клетки центрифугировали (400g х 5 мин), повторно суспендировали в среде выращивания и 100 мкл аликвоты высеяли в микротитровальную чашку, используя двойные лунки для каждой пробы до инкубационного периода 16-24 ч. После инкубационного периода в обеих этих пробах добавили 50 мкг питательной среды, содержащей I и Ci[³H] тимидина (удельная активность = 5 Ci/ммоль); Amersham и чашки выращивали 2-4 ч. Клетки затем собрали, обезводили, отдельные пробы разделили и посчитали на бетасцинтилляционном счетчике. Введение [³H] тимидина выражалось, как процентное подавление во введении контрольных проб. Стандартная ошибка для любой точки создавалась двойными определениями и не превышала 5% для любой заданной экспериментальной точки.b) 30 minute test of the suppression of 200 ul of cells (2-5 October ⁶ / ml) were collected into sterile Eppendorf tubes, resuspended in sterile drug or conjugate and mixed 30 minutes at 37 ^C. The cells were then centrifuged (400g x 5 min), resuspended in the growth medium and 100 μl aliquots were seeded in a microtiter dish using double wells for each sample until the incubation period is 16-24 hours. After the incubation period, 50 μg of culture medium containing I and Ci was added in both samples [ ³ H] thymidine (specific activity = 5 Ci / mmol); Amersham and plates were grown for 2-4 hours. The cells were then collected, dehydrated, individual samples were separated and counted on a beta scintillation counter. The administration of [ ³ H] thymidine was expressed as percent inhibition in the administration of control samples. The standard error for any point was created by double definitions and did not exceed 5% for any given experimental point.

Токсичность. Toxicity.

Группам из 10-20 CBA мышей давали одну внутривенную инъекцию различных доз Ida и Ida-анти-Ly-2.1 и наблюдалась выживаемость мышей по отношению к дозе лекарства, выраженной в мг/кг. Органы этих мышей удаляли, взвешивали до фиксации в формалине и окрашивании гемотоксилином-эозином. Groups of 10-20 CBA mice were given a single intravenous injection of different doses of Ida and Ida-anti-Ly-2.1 and mice survived in relation to the dose of the drug, expressed in mg / kg. The organs of these mice were removed, weighed until fixation in formalin and stained with hemotoxylin-eosin.

Результаты. Results.

Получение и определение характеристик конъюгантов. Obtaining and characterization of conjugants.

Br-Ida ковалентно соединили с несколькими MoAb: против человеческого TFR, против антигена, присутствующего на раковых клетках ободочной кишки человека (антитело 250-30.5) и против Ly-2 аллоантигена мыши. Условия реакции установили для конъюгации, изменяя молярный избыток Br-Ida, добавленного в MoAb и на компромисс между более высоким введением Ida и более низкими протеиновыми выделениями. Ida/анти-Ly-2.1, Ida-анти-TFR и Ida-260-30.6 (данные не показаны) включали 3-5 молекул Ida при протеиновых выделениях больше 50% . Реакция Br-Ida с моноклональными антителами (MoAb) может обеспечить два типа связей. Для установления того, что было представлено, конъюганты подвергли воздействию рН 4,5 или 9,0 в течение 48 ч. 50% связанного лекарства было освобождено при воздействии основания (рН 9,0), в то время, как при рН 4,5 потерь не наблюдалось. Это позволяет предположить, что по меньшей мере 50% лекарства имеют сложноэфирную связь, так как сложноэфирная связь чувствительна к основным условиям, пока аминная связь является устойчивой. Br-Ida was covalently coupled to several MoAb: against human TFR, against the antigen present on cancer cells of the human colon (antibody 250-30.5) and against Ly-2 mouse alloantigen. Reaction conditions were established for conjugation by altering the molar excess of Br-Ida added to MoAb and to a compromise between higher Ida administration and lower protein secretions. Ida / anti-Ly-2.1, Ida-anti-TFR and Ida-260-30.6 (data not shown) included 3-5 Ida molecules with protein excretions greater than 50%. The reaction of Br-Ida with monoclonal antibodies (MoAb) can provide two types of bonds. To establish what was presented, the conjugants were exposed to pH 4.5 or 9.0 for 48 hours. 50% of the bound drug was released upon exposure to the base (pH 9.0), while at pH 4.5 no losses were observed. This suggests that at least 50% of the drug has an ester linkage, since the ester linkage is sensitive to basic conditions, while the amine linkage is stable.

Активность антитела. Antibody activity.

Титры антитела до и после конъюгации измеряли методом розеткообразования и они определялись, как разбавление, при котором 50% клеток-мишеней демонстрировали розетки. Ida-анти-Ly-2.1 конъюганты, содержащие 2 и 8 молекул Ida имели титры антитела по отношению к клеткам КЗ 1: 56000 и 1: 33000 соответственно, в то время, как титр неконъюгатированных антител был равен 1: 8000. Ida-250-40.6 конъюганты, содержащие 2 и 6 молекул Ida, имели титры антител против клеток COLO 205 1: 16000 и 1: 11000 соответственно, в то время как титр неконъюгатированных антител был 1: 33000. Таким образом, наблюдается некоторая потеря активности антител из-за процедуры конъюгации: конъюганты с менее 6 молекулами Ida-молекулой MoAb использовали для исследований in vitro и in vivo. Было отмечено, растворимость и активность антител Ida-анти-Ly-2.1 конъюгантов значительно снижаются ниже этих уровней внесения (данные не приводятся). Максимальное число молекул Ida, которые можно полезно вносить, сильно меняется в зависимости от индивидуального антитела. Antibody titers before and after conjugation were measured by the method of rosette formation and they were determined as dilution, in which 50% of the target cells showed rosettes. Ida-anti-Ly-2.1 conjugants containing 2 and 8 Ida molecules had antibody titers with respect to KZ cells 1: 56000 and 1: 33000, respectively, while the titer of unconjugated antibodies was 1: 8000. Ida-250- 40.6 conjugants containing 2 and 6 Ida molecules had antibody titers against COLO 205 cells of 1: 16000 and 1: 11000 respectively, while the titer of unconjugated antibodies was 1: 33000. Thus, there is some loss of antibody activity due to the procedure conjugation: conjugants with less than 6 molecules of the Ida MoAb molecule were used for in vitro and in vivo studies. It was noted that the solubility and activity of the antibodies Ida-anti-Ly-2.1 conjugants are significantly reduced below these levels of application (data not shown). The maximum number of Ida molecules that can be useful to add varies greatly depending on the individual antibody.

In vitro активность и идарубицин и идарубицин-моноклональные антитела конъюганты. In vitro activity and idarubicin and idarubicin-monoclonal antibodies conjugants.

In vitro цитотоксичность Ida и двух Ida-MoAb конъюгантов на линии клеток мыши ITT/I/75NSEB/Ly-2⁺TFR^-/ и линии клеток СЕМ человека (Ly-2-TFR) измеряли в 24-часовом тесте подавления и определяли И. Д. ₅₀/50% подавления при внесении стандартов 3Н-тимицина. Результаты показаны в табл. 1. И. Д. ₅₀ для Ida находилась в диапазоне 1,0-2,5% 10^-7 М для обеих проверяемых линий клеток (табл. 1) И. Д. ₅₀ для Ida-анти-Ly-2.1 на Е3 была в 4 раза больше и для Ida-анти-TFR на СЕМ значения И. Д. ₅₀ были в 1-2 раза больше, чем для свободного Ida (табл. 1). Следовательно, свободный Ida был более цитотоксичным по отношению к Е3 и СЕМ, чем Ida анти-Ly-2.1 и Ida-анти-TFR соответственно. Однако эти конъюганты Ida-MoAb проявляют 10-кратную меньшую цитотоксичность к нереагирующим линиям клеток (табл. 1), отмечая таким образом, что их цитотоксичное воздействие было специфичным и являлось результатом их задержки активности антител.In vitro, the cytotoxicity of Ida and two Ida-MoAb conjugants on the ITT / I / 75NSEB / Ly-2 ⁺ TFR ^- / mouse cell line and human CEM cell line (Ly-2-TFR) were measured in a 24-hour suppression test and I. D. ₅₀ /50% suppression when introducing standards 3H-thymycin. The results are shown in table. 1. I.D. ₅₀ for Ida was in the range of 1.0-2.5% 10 ^-7 M for both tested cell lines (Table 1). I.D. ₅₀ for Ida-anti-Ly-2.1 at E3 was 4 times more and for Ida-anti-TFR at CEM the values of I.D. ₅₀ were 1-2 times greater than for free Ida (Table 1). Therefore, free Ida was more cytotoxic to E3 and CEM than Ida anti-Ly-2.1 and Ida anti-TFR, respectively. However, these Ida-MoAb conjugants show 10-fold lower cytotoxicity to non-responsive cell lines (Table 1), thus noting that their cytotoxic effect was specific and was the result of their delayed antibody activity.

Конъюганты Ida-250.30.6 были слегка менее активными, чем свободный Ida. Свободный Ida имел И. Д. ₅₀ 6 х 10-8, в то время, как конъюгант имел И. Д. ₅₀ 3,55 х 10^-7 М на линии клеток-мишеней COLO 205.Ida-250.30.6 conjugants were slightly less active than free Ida. The free Ida had an ID of D. ₅₀ 6 x 10-8, while the conjugant had an ID of ₅₀ 3.55 x 10 ^-7 M on the line of target cells of COLO 205.

Для изучения, проявляют ли конъюганты избирательность в их цитотоксичном действии по отношению к клеткам-мишеням Ida анти-Ly-2.1 и Ida-анти-TFR выращивали 30 мин с Е3 (Ly-2⁺) клетками до вымывания несвязанного конъюганта и измерения цитотоксичности. Ida-анти-Ly-2.1 конъюгант имел И. Д. ₅₀ 6,2 х 10^-7 М для свободного Ida. В противоположность этому, нереагирующий Ida-анти-TFR конъюгант имел И. Д. ₅₀ 5,0 х 10^-6 М, т. е. в 10 раз больше, чем для свободного Ida, показывая, что активность связывания антител Ida-анти-Ly-2.1 конъюганта приводит к его избирательной цитотоксичности. Аналогично Ida-250-30.6 конъюгант и свободное лекарство выращивали 30 мин с COLO 205 (250-30.6 ⁺ ve) и Е3 (250-30.6 ^- ve) линиями клеток перед промывкой и проведением испытания на цитотоксичность. Обе линии клеток проявили аналогичную реакцию на дозу свободного лекарства, т. е. 9,2 х 10^-7 М для COLO 205 и 9,8 х 10^-7 М для Е3. Однако Ida-250.30.6 конъюгант был в 4 раза более токсичным по отношению к COLO 205, чем к нереактивной линии клеток Е3 антитела. Аналогичные результаты получили, используя линию клеток СЕМ и Ida-анти-Ly-2.1 как нереактивный стандарт (данные не показаны). Для дополнительной убежденности, что цитотоксичность конъюгантов Ida-MoAb для клеток мишеней была специфической и имела место в сайте связывания антитела, мы провели исследования по ингибированию цитотоксичности конъюганта, используя свободные MoAb.To study whether conjugants exhibit selectivity in their cytotoxic effect with respect to target cells, Ida anti-Ly-2.1 and Ida-anti-TFR were grown for 30 min with E3 (Ly-2 ⁺ ) cells before leaching of the unbound conjugant and measuring cytotoxicity. The Ida-anti-Ly-2.1 conjugant had an I.D. _{50 of} 6.2 x 10 ^-7 M for free Ida. In contrast, the non-responsive Ida-anti-TFR conjugant had an I.D. _{50 of} 5.0 x 10 ^-6 M, i.e., 10 times more than for free Ida, showing that the binding activity of the Ida-anti Ly-2.1 conjugant leads to its selective cytotoxicity. Similarly, Ida-250-30.6 conjugate and free drug were grown for 30 min with COLO 205 (250-30.6 ⁺ ve) and E3 (250-30.6 ^- ve) cell lines before washing and conducting a cytotoxicity test. Both cell lines showed a similar response to the dose of the free drug, i.e. 9.2 x 10 ^-7 M for COLO 205 and 9.8 x 10 ^-7 M for E3. However, the Ida-250.30.6 conjugant was 4 times more toxic to COLO 205 than to the non-reactive E3 antibody cell line. Similar results were obtained using the CEM cell line and Ida-anti-Ly-2.1 as a non-reactive standard (data not shown). To further verify that the cytotoxicity of the Ida-MoAb conjugants for target cells was specific and occurred at the antibody binding site, we conducted studies on the inhibition of the conjugant cytotoxicity using free MoAb.

При концентраиции Ida 4,0 х 10^-6 М (2 мкг анти-Ly-2.1), цитотоксичность конъюганта анти-Ly-2.1 на Е3 клетках была снижена на 70% после добавления 50 мкг (250 мкг/мл) анти-Ly-2.1, указывая, что цитотоксичность конъюганта Ida-анти-Ly-2.1 непосредственно связана с ее характеристикой связывания антител. Аналогичные контрольные результаты получили с 260-30.6. Следует отметить, что во всех тестах свободные анти-Ly-2.1, анти-TFR и 250-30.6 были нецитотоксичными (данные не показаны).At a concentration of Ida of 4.0 x 10 ^-6 M (2 μg anti-Ly-2.1), the cytotoxicity of the anti-Ly-2.1 conjugate on E3 cells was reduced by 70% after adding 50 μg (250 μg / ml) anti-Ly- 2.1, indicating that the cytotoxicity of the conjugant Ida-anti-Ly-2.1 is directly related to its antibody binding characteristics. Similar control results were obtained from 260-30.6. It should be noted that in all tests, free anti-Ly-2.1, anti-TFR and 250-30.6 were non-cytotoxic (data not shown).

In vitro лечение клеток мышиной тимомы ITT/I/ 75NS Е3. In vitro treatment of mouse thymoma cells ITT / I / 75NS E3.

Для оценки подавления роста твердых опухолей группы мышей CBI (10 особей в группе), привитых 2,0 х 10⁶ Е3 клетками подкожно в абдоминальной области, лечили внутривенными инъекциями одного из следующих препаратов: (I) PBS, (ii) анти-Ly-2.1 (iii) Ida, (iii) Ida-анти-TFR, или (v) Ida-анти-Ly-2.1. Мыши получали 20 мкг Ida и/или 1200 мкг анти-Ly-2.1 соответственно на 4 и 5 сут (размер опухоли = 0,1 см²) после инокуляции.To assess the inhibition of growth of solid tumors in a group of CBI mice (10 animals in a group), grafted with 2.0 x 10 ⁶ E3 cells subcutaneously in the abdominal region, they were treated with intravenous injection of one of the following drugs: (I) PBS, (ii) anti-Ly- 2.1 (iii) Ida, (iii) Ida-anti-TFR, or (v) Ida-anti-Ly-2.1. Mice received 20 μg of Ida and / or 1200 μg of anti-Ly-2.1 on days 4 and 5, respectively (tumor size = 0.1 cm ² ) after inoculation.

В пределах 24 ч первой обработки обработанные Ida анти-Ly-2.1 мыши имели средний размер опухоли, равный 20% опухоли, леченных PBS мышей (т. е. 80% уменьшение массы опухоли). Очевидно, что один препарат анти-Ly-2.1 и Ida, ковалентно связанный с неспецифическим анти-TFR и MoAb не влияли на рост опухоли Е3. Опухоли мышей, получающих только Ida, уменьшались до 50% , однако 3 из этих мышей погибли, а другие имели 25% снижения массы тела. Within 24 hours of the first treatment, Ida-treated anti-Ly-2.1 mice had an average tumor size of 20% of the tumor treated with PBS mice (i.e., an 80% reduction in tumor weight). Obviously, one anti-Ly-2.1 and Ida drug covalently linked to non-specific anti-TFR and MoAb did not affect E3 tumor growth. Tumors of mice receiving Ida alone were reduced to 50%, however, 3 of these mice died, while others had a 25% decrease in body weight.

Индивидуальные кривые роста опухолей мышей, принимающих Ida-анти-Ly-2.1, показали снижение 9 и 10 опухолей во время курса лечения. 5 из 10 опухолей полностью регрессировали и не появились повторно (200 сут) и те опухоли, которые продолжали расти после завершения лечения (5 из 10) росли с меньшими скоростями, чем опухоли мышей, которых лечили PBS и Ida-анти-TFR. Был проведен дополнительный эксперимент для оценки внутривенного лечения больных опухолей, используя Ida-анти-Ly-2.1. Группам CBF_I мышей (10 особей в группе) инокулировали 3,0 х 10⁶ Е3 клеток, и мыши затем получили 15 мкг и 900 мкг Ida и анти-Ly-2.1 соответственно на 6 (размер опухоли = 0,2 см²) и 7 сут после инокуляции опухоли. Мыши, обработанные Ida-анти-Ly-2.1 имели средний размер опухоли на 50% меньше, чем мыши, обработанные PBS и 66% опухоли мышей, обработанных Ida на седьмые сутки. Эта тенденция продолжалась до окончания исследования (18 сут). Индивидуальные кривые роста опухолей 10 мышей CBF_I, принимавших Ida-анти-Ly-2.1 показывают, что было 4 регрессии и одно полное исчезновение массы опухоли (200 сут, данные не приводятся). Следовательно, Ida-анти-Ly-2.1 был эффективен против больших опухолей и в обоих экспериментах антиопухолевая активность Ida была значительно улучшена при связывании с анти-Ly-2.1 MoAb.Individual tumor growth curves of mice receiving Ida-anti-Ly-2.1 showed a decrease in 9 and 10 tumors during the course of treatment. 5 out of 10 tumors completely regressed and did not reappear (200 days), and those tumors that continued to grow after completion of treatment (5 out of 10) grew at lower rates than tumors in mice treated with PBS and Ida anti-TFR. An additional experiment was conducted to evaluate the intravenous treatment of diseased tumors using Ida-anti-Ly-2.1. The CBF _I groups of mice (10 animals in the group) were inoculated with 3.0 x 10 ⁶ E3 cells, and the mice then received 15 μg and 900 μg of Ida and anti-Ly-2.1, respectively, by 6 (tumor size = 0.2 cm ² ) and 7 days after tumor inoculation. Mice treated with Ida-anti-Ly-2.1 had an average tumor size of 50% less than mice treated with PBS and 66% of the tumor of mice treated with Ida on the seventh day. This trend continued until the end of the study (18 days). The individual tumor growth curves of 10 CBF _I mice treated with Ida-anti-Ly-2.1 show that there were 4 regressions and one complete disappearance of the tumor mass (200 days, data not shown). Therefore, Ida-anti-Ly-2.1 was effective against large tumors, and in both experiments, the anti-tumor activity of Ida was significantly improved upon binding to anti-Ly-2.1 MoAb.

In vitro лечение опухоли ободочной кишки человека COLO 205. In vitro treatment of a human colon tumor of the colon COLO 205.

Воздействие Ida-анти-250.30.5 конъюганта оценивалось на голых мышах (nu/nu), порождающих ксенотрансплантаты COLO 205. The effects of the Ida-anti-250.30.5 conjugant were evaluated on nude mice (nu / nu) generating COLO 205 xenografts.

Инъекции подкожно в абдоминальную стенку 2 х 10⁶ клеток привела к пальпируемой опухоли через 4 сут (примерно 0,1 см²). Группы из 10 мышей затем лечили внутривенными инъекциями одного из следующих препаратов ((I)PBS(ii) 250-30.6, (iii) Ida плюс 250-30.6 (неконъюгированные); (iv) Ida, (v) конъюгант Ida-250.30.6. Всего ввели 275 мкг Ida сериями внутривенных инъекций (5) на 4,5,6,10 и 12 сут после инокуляции опухоли.Subcutaneous injection into the abdominal wall of 2 x 10 ⁶ cells resulted in a palpable tumor after 4 days (approximately 0.1 cm ² ). Groups of 10 mice were then treated by intravenous injection of one of the following drugs: ((I) PBS (ii) 250-30.6, (iii) Ida plus 250-30.6 (unconjugated); (iv) Ida, (v) conjugate Ida-250.30.6 A total of 275 μg Ida was administered by a series of intravenous injections (5) at 4,5,6,10 and 12 days after tumor inoculation.

В группах мышей, которых лечили PBS или неконъюганированным 250-30.6 не наблюдался терапевтический эффект. При применении только Ida 2 из 10 мышей выжили, в то время, как все мыши из группы, получавшей неконъюганированный Ida плюс 250-30.6 были мертвы на 7 сут, проявив предварительно явные симптомы токсичности, такие, как потеря веса. Мыши, получившие конъюгант Ida 250-30.6 характеризовались резким уменьшением размера опухоли. В противоположность этому, кривые роста опухолей для отдельных мышей показывают, что 5 из 10 мышей имели опухоли, которые регрессировали на 7 сут, эти опухоли затем продолжали расти, хотя 2 из 10 мышей остались без опухолей. Эти мыши не проявляли симптомов токсичности. In groups of mice that were treated with PBS or unconjugated 250-30.6 no therapeutic effect was observed. When Ida alone was used, 2 out of 10 mice survived, while all the mice from the group receiving the unconjugated Ida plus 250-30.6 were dead for 7 days, showing previously obvious symptoms of toxicity, such as weight loss. The mice that received the Ida 250-30.6 conjugate were characterized by a sharp decrease in tumor size. In contrast, tumor growth curves for individual mice show that 5 out of 10 mice had tumors that regressed on day 7, these tumors then continued to grow, although 2 out of 10 mice were left without tumors. These mice showed no toxicity symptoms.

Внутриопухолевое лечение. Intratumoral treatment.

Внутриопухолевая терапия оказалась полезным способом для иммунотерапии опухолей человека и животных. Следовательно, провели исследования для определения характеристик противоопухолевой активности конъюгантов Ida-анти-Ly-2.1 при введении их непосредственно в твердых Е3 опухоль. У групп из 10 мышей CBF_I, которым подкожно имплантировали 3,0 х 10⁶ Е3 клеток, развились опухоли (0,1-0,2 см²) на 5 сут после инокуляции опухоли. Лечение состояло из 2 инъекцией на 5 и 6 сут после имплантации опухоли, причем мыши получали одно из следующих лечений (1) PBS (2) Ida, (3) анти-Ly-2.1 или (4) Ida-анти-Ly-2.1 (общее количество Ida = 30 мкг). Ida-анти-Ly-2.1 проявил наибольшую антиопухолевую активность, свободный Ida и только анти-Ly-2.1 не проявили влияние на рост опухоли при введении прямо в опухоль. Мыши, которые получали Ida-анти-Ly-2.1 имели средний размер опухоли, равный 60% опухоли мышей, которые получали PB на 8 сут, и 30% опухоли мышей, которые получали PBS на 13 сут. Индивидуальные кривые роста опухолей (данные не показаны) мышей, которые получали Ida-анти-Ly-2.1, показали одну полную регрессию, в то время, как остальные мыши проявили задержанное снижение роста опухоли на 3 сут после завершения лечения.Intratumoral therapy has proven to be a useful method for immunotherapy of human and animal tumors. Therefore, studies were carried out to determine the antitumor activity of Ida-anti-Ly-2.1 conjugates when introduced directly into solid E3 tumors. Groups of 10 CBF _I mice, which were implanted with 3.0 x 10 ⁶ E3 cells subcutaneously, developed tumors (0.1-0.2 cm ² ) 5 days after tumor inoculation. The treatment consisted of 2 injections on days 5 and 6 after tumor implantation, and the mice received one of the following treatments: (1) PBS (2) Ida, (3) anti-Ly-2.1 or (4) Ida-anti-Ly-2.1 ( total Ida = 30 mcg). Ida-anti-Ly-2.1 showed the highest antitumor activity, free Ida and only anti-Ly-2.1 did not show tumor growth when introduced directly into the tumor. Mice that received Ida-anti-Ly-2.1 had an average tumor size of 60% of the tumor of mice that received PB on day 8 and 30% of the tumor of mice that received PBS on day 13. The individual tumor growth curves (data not shown) of mice that received Ida-anti-Ly-2.1 showed one complete regression, while the remaining mice showed a delayed decrease in tumor growth 3 days after completion of treatment.

Токсичность. Toxicity.

Для экспериментов по острой токсичности группам из 10 CBA (Ly-2.1⁺) мышей давали одну инъекцию различных доз Ida, Ida-анти-Ly-2.1 или Ida-анти-TFR. Все мыши, которым вводили Ida, показали начальную потерю веса до 25% от исходного веса; однако у мышей, обрабатываемых любым конъюгантом Ida-MoAb не наблюдалась потеря веса. В табл. 2 показана токсичность Ida и Ida-анти-MoAb конъюгантов, выраженная в значениях ЛД₅₀ и ЛД₁₀. Как показано, ЛД₁₀ Ida-анти-Ly-2.1 была 10,0 мг/кг Ida по сравнению с только 0,75 мг/кг для свободного Ida. В дополнение, конъюгант Ida-анти-TFR имел ЛД₁₀ 8,0 мг/кг. Конъюганты Ida-MoAb не проверялись на ЛД₅₀ дозу. Эти результаты показывают самый большой терапевтический индекс конъюгантов Ida-MoAb по сравнению со свободным Ida.For acute toxicity experiments, groups of 10 CBA (Ly-2.1 ⁺ ) mice were given a single injection of different doses of Ida, Ida-anti-Ly-2.1 or Ida-anti-TFR. All mice that were injected with Ida showed an initial weight loss of up to 25% of the original weight; however, no weight loss was observed in mice treated with any Ida-MoAb conjugate. In the table. Figure 2 shows the toxicity of Ida and Ida-anti-MoAb conjugants expressed in LD ₅₀ and LD ₁₀ values. As shown, the LD _{10 of} Ida-anti-Ly-2.1 was 10.0 mg / kg Ida compared to only 0.75 mg / kg for free Ida. In addition, the Ida-anti-TFR conjugate had an LD of ₁₀ 8.0 mg / kg. Ida-MoAb conjugants were not tested at an LD ₅₀ dose. These results show the highest therapeutic index of Ida-MoAb conjugates compared to free Ida.

N. T = не проверялись. N. T = not tested.

Гистопатологические результаты
Острый эффект: Внутривенное введение свободного Ida (1,0 мг/кг) приводит к атрофии белой пульпы в селезенке на 15 сут после лечения и некоторой гипертрофии сердечной мышечных волокон (данные не приводятся). В противоположность этому, одна доза Ida-анти-Ly-2.1 (2,4 мг/кг) не вызывала неспецифической тканевой токсичности, через 15 и 30 сут, хотя некоторое набухание гепатоцидов наблюдалось на 15 сут. (56) Hurwitz et al. Cancer Res. 35, 1975, 1175.Histopathological findings
Acute effect: Intravenous administration of free Ida (1.0 mg / kg) leads to atrophy of white pulp in the spleen 15 days after treatment and some hypertrophy of the cardiac muscle fibers (data not shown). In contrast, a single dose of Ida-anti-Ly-2.1 (2.4 mg / kg) did not cause nonspecific tissue toxicity after 15 and 30 days, although some swelling of hepatocides was observed on day 15. (56) Hurwitz et al. Cancer Res. 35, 1975, 1175.

Claims (1)

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО КОНЬЮГАТА путем смешивания моноклонального антитела специфического к поверхностному антигену клетки неоплазмы или фрагмента антитела с токсическим агентом с последующей очисткой продукта центрифугированием и фильтрацией, отличающийся тем, что, с целью повышения цитотоксического действия конъюгата, в качестве токсического агента используют 14-галоидарубицин, причем его берут в избытке, а при очистке продукта дополнительно осуществляют адсорбционную или ионообменную хроматографию для удаления свободного идарубицина. METHOD FOR PRODUCING A CYTOTOXIC CONJUGATE by mixing a monoclonal antibody specific for a neoplasm cell surface antigen or antibody fragment with a toxic agent, followed by purification of the product by centrifugation and filtration, characterized in that, in order to increase the cytotoxic effect of the conjugate, 14-halo is used as a toxic agent it is taken in excess, and when cleaning the product, adsorption or ion-exchange chromatography is additionally carried out to remove free one idarubicin.

Images