RU2006134574A - METHOD FOR CONSTRUCTING RECOMBINANT BACTERIA BELONGING TO PANTOEA GENUS AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING BACTERIA BELONGING TO PANTOEA GENUS - Google Patents

Abstract

1. Способ конструирования рекомбинантной бактерии, включающийa) получение экзогенного фрагмента ДНК, который имеет в своем составе по крайней мере 2 сайта минимум по 30 п.о. в длину каждый, идентичных сайтам, расположенным в целевом гене на хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Panteoa,b) введение указанного линейного фрагмента ДНК в бактерию, принадлежащую к роду Panteoa, причем указанная бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продуктам генов gam, bet, and exo из фага лямбда, иc) отбор рекомбинантной бактерии, в которой указанный целевой ген заменен на указанный линейный фрагмент ДНК или линейный фрагмент ДНК встроен в целевой ген.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная бактерия является бактерией Pantoea ananatis SC17(0).3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный целевой ген в указанной рекомбинантной бактерии модифицирован инактивацией или удалением.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный целевой ген кодирует белок, который участвует в процессе расщепления целевого вещества или в процессе переноса целевого вещества в клетку.5. Способ конструирования библиотеки фрагментов ДНК, включающийa) введение набора фрагментов ДНК, которые частично идентичны целевому гену на хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Pantoea, в бактерию, отличающееся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продуктам генов gam, bet, и exo фага лямбда, иb) отбор бактерии, в которой указанный целевой ген заменен на указанные фрагменты ДНК.6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанные фрагменты ДНК содержат регуляторный элемент для экспрессии гена, выбранный из группы, состоящей из п�1. A method of constructing a recombinant bacterium, comprising a) obtaining an exogenous DNA fragment that comprises at least 2 sites of at least 30 bp. each identical in length to the sites located in the target gene on the chromosome of a bacterium belonging to the genus Panteoa, b) introducing said linear DNA fragment into a bacterium belonging to the genus Panteoa, said bacterium being modified in such a way that it is resistant to gam gene products, bet, and exo from lambda phage, and c) selection of a recombinant bacterium in which said target gene is replaced with said linear DNA fragment or a linear DNA fragment is inserted into the target gene. 2. The method according to claim 1, characterized in that said bacterium is a bacterium Pantoea ananatis SC17 (0). The method according to claim 1, characterized in that said target gene in said recombinant bacterium is modified by inactivation or deletion. The method according to claim 1, characterized in that said target gene encodes a protein that is involved in the process of cleavage of the target substance or in the process of transferring the target substance into the cell. A method of constructing a library of DNA fragments, comprising a) introducing a set of DNA fragments that are partially identical to the target gene on the chromosome of a bacterium belonging to the genus Pantoea, in a bacterium, characterized in that said bacterium is modified in such a way that it is resistant to gam, bet, and exo phage lambda, and b) selection of a bacterium in which said target gene is replaced with said DNA fragments. 6. The method according to claim 5, characterized in that said DNA fragments contain a regulatory element for gene expression selected from the group consisting of

Claims (18)

1. Способ конструирования рекомбинантной бактерии, включающий1. A method of constructing a recombinant bacterium, comprising a) получение экзогенного фрагмента ДНК, который имеет в своем составе по крайней мере 2 сайта минимум по 30 п.о. в длину каждый, идентичных сайтам, расположенным в целевом гене на хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Panteoa,a) obtaining an exogenous DNA fragment that contains at least 2 sites of at least 30 bp in length each, identical to sites located in the target gene on the chromosome of a bacterium belonging to the genus Panteoa, b) введение указанного линейного фрагмента ДНК в бактерию, принадлежащую к роду Panteoa, причем указанная бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продуктам генов gam, bet, and exo из фага лямбда, иb) introducing said linear DNA fragment into a bacterium belonging to the genus Panteoa, said bacterium being modified to be resistant to the products of the gam, bet, and exo genes from the lambda phage, and c) отбор рекомбинантной бактерии, в которой указанный целевой ген заменен на указанный линейный фрагмент ДНК или линейный фрагмент ДНК встроен в целевой ген.c) selecting a recombinant bacterium in which said target gene is replaced with said linear DNA fragment or a linear DNA fragment is inserted into the target gene. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная бактерия является бактерией Pantoea ananatis SC17(0).2. The method according to claim 1, characterized in that the bacterium is a bacterium Pantoea ananatis SC17 (0). 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный целевой ген в указанной рекомбинантной бактерии модифицирован инактивацией или удалением.3. The method according to claim 1, characterized in that said target gene in said recombinant bacterium is modified by inactivation or deletion. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный целевой ген кодирует белок, который участвует в процессе расщепления целевого вещества или в процессе переноса целевого вещества в клетку.4. The method according to claim 1, characterized in that said target gene encodes a protein that is involved in the process of cleavage of the target substance or in the process of transferring the target substance into the cell. 5. Способ конструирования библиотеки фрагментов ДНК, включающий5. A method of constructing a library of DNA fragments, including a) введение набора фрагментов ДНК, которые частично идентичны целевому гену на хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Pantoea, в бактерию, отличающееся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продуктам генов gam, bet, и exo фага лямбда, иa) introducing a set of DNA fragments that are partially identical to the target gene on the chromosome of a bacterium belonging to the genus Pantoea, into a bacterium, characterized in that said bacterium is modified in such a way that it is resistant to the products of the gam, bet, and exo phage lambda genes, and b) отбор бактерии, в которой указанный целевой ген заменен на указанные фрагменты ДНК.b) selecting a bacterium in which said target gene is replaced with said DNA fragments. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанные фрагменты ДНК содержат регуляторный элемент для экспрессии гена, выбранный из группы, состоящей из промотора, сайта связывания рибосомы (RBS), оператора и их сочетания.6. The method according to claim 5, characterized in that said DNA fragments contain a regulatory element for gene expression selected from the group consisting of a promoter, a ribosome binding site (RBS), an operator, and combinations thereof. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный регуляторный элемент содержит в своем составе рандомизированную последовательность.7. The method according to claim 6, characterized in that said regulatory element comprises a randomized sequence. 8. Способ конструирования бактерии по п.1, включающий8. The method of constructing bacteria according to claim 1, including a) замену природных регуляторных элементов указанного целевого гена на указанные фрагменты ДНК, иa) replacing the natural regulatory elements of said target gene with said DNA fragments, and b) отбор бактерии с оптимизированным уровнем экспрессии указанного целевого гена отличающийся тем, что целевой ген кодирует белок, который участвует в биосинтезе и метаболизме целевого вещества, или в выведение целевого вещества из указанной бактерии.b) selecting a bacterium with an optimized expression level of said target gene, characterized in that the target gene encodes a protein that is involved in the biosynthesis and metabolism of the target substance, or in the removal of the target substance from the specified bacterium. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-аминокислоты.9. The method according to claim 8, characterized in that said bacterium is a bacterium producing L-amino acids. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-глицина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина и L-валина.10. The method according to claim 9, characterized in that said L-amino acid is selected from the group consisting of L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-glutamic acid, L- glutamine, L-glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine and L-valine. 11. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанная бактерия является бактерией-продуцентом нуклеиновой кислоты.11. The method of claim 8, wherein said bacterium is a nucleic acid producing bacterium. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из инозина, гуанозина, ксантозина и аденозина.12. The method according to claim 11, characterized in that said nucleic acid is selected from the group consisting of inosine, guanosine, xanthosine and adenosine. 13. Бактерия, принадлежащая к роду Pantoea, полученная способом по п.8.13. A bacterium belonging to the genus Pantoea, obtained by the method of claim 8. 14. Бактерия по п.13, отличающаяся тем, что указанные природные регуляторные элементы содержат участок размером в 35 пар оснований из промотора указанного гена.14. The bacterium according to item 13, wherein the said natural regulatory elements contain a plot of size 35 base pairs from the promoter of the specified gene. 15. Бактерия по п.13, отличающаяся тем, что указанный ген является геном yhfK.15. The bacterium according to item 13, wherein the specified gene is a yhfK gene. 16. Бактерия по п.13, отличающаяся тем, что указанный участок размером в 35 пар оснований выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO; 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и их сочетания.16. The bacterium according to item 13, wherein the specified site size of 35 base pairs is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO; 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, and combinations thereof. 17. Способ получения L-аминокислоты, включающий17. A method of obtaining an L-amino acid, comprising a) выращивание бактерии по п.13 в питательной среде, иa) growing bacteria according to item 13 in a nutrient medium, and b) выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.b) isolating said L-amino acid from the culture fluid. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-глицина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина и L-валина.18. The method according to 17, characterized in that said L-amino acid is selected from the group consisting of L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-glutamic acid, L- glutamine, L-glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine and L-valine.