RU19761U1 - DEVICE FOR ISOLATING CELLS FROM BIOLOGICAL LIQUIDS - Google Patents

Abstract

Устройство для выделения клеток из биологических жидкостей, содержащее проточную камеру с входным и выходным отверстиями, соединенными, соответственно, с емкостями для подачи биологической жидкости и сбора выделенных клеток, источник света, возбуждающий флуоресценцию окрашенных клеток и источник лазерного излучения длиной волны 257 нм и мощностью 20-100 мW, расположенные над проточной камерой, оптико-электронный блок, состоящий из оптических элементов и детектора света, оптический затвор и решающее устройство, отличающееся тем, что проточная камера имеет три выходных отверстия, расположенных под углом 120относительно друг друга и соединенных канавками с входным отверстием, расположенным в центральной части камеры и имеющим диаметр 80-100 мкм, оптико-электронный блок, имеющий три детектора света, дополнительно содержит опак-иллюминатор, направляющий свет от источника, возбуждающего флуоресценцию, на входное отверстие проточной камеры, а также вращающуюся призму, находящуюся за оптическим затвором и направляющую свет лазера на выходные отверстия проточной камеры.A device for separating cells from biological fluids, containing a flow chamber with inlet and outlet openings, respectively connected to containers for supplying biological fluid and collecting isolated cells, a light source that excites fluorescence of stained cells and a laser source with a wavelength of 257 nm and a power of 20 -100 mW located above the flow chamber, an optoelectronic unit consisting of optical elements and a light detector, an optical shutter and a resolving device, characterized in that The second chamber has three outlet openings located at an angle of 120 relative to each other and connected by grooves to an inlet located in the central part of the chamber and having a diameter of 80-100 μm, the optoelectronic unit having three light detectors, further comprises an opaque porthole guiding light from a source that excites fluorescence to the inlet of the flow chamber, as well as a rotating prism located behind the optical shutter and directing the laser light to the output openings of the flow chamber.

Description

УСТРОЙСТВО для ЬЫДьЛЕНИЯ КЛЕТОК из БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙDEVICE FOR CELLING OF CELLS FROM BIOLOGICAL LIQUIDS

Заявляемая полезная модель относится к области биологии и медицины, а именно к устройствам, позволяющим получать однотипные популяции клеток из гетергенных клеточных взвесей.The inventive utility model relates to the field of biology and medicine, and in particular to devices that allow to obtain the same type of cell population from heterogeneous cell suspensions.

Необходимость разделения таких клеточных взвесей обусловлена задачами как биологического ( в работах по биотехнологии, иммунологии, генетике, аналитической цитологии, клеточной биохимии и др.), так и медицинского характера ( например, при лечении гемобластозов, лучевой болезни и т.д.).The need to separate such cell suspensions is determined by the tasks of both biological (in biotechnology, immunology, genetics, analytical cytology, cell biochemistry, etc.) and medical nature (for example, in the treatment of hemoblastoses, radiation sickness, etc.).

В настоящее время для этих целей используются проточные цитофлуориметры типа: - Epics Elite фирмы Coulter Electronics (USA) или FACStar plus фирмы Beckton Dickinson (USA).Currently, flow cytometer types are used for these purposes: Epics Elite from Coulter Electronics (USA) or FACStar plus from Beckton Dickinson (USA).

Эти устройства состоят из проточной камеры, вибрирующей с частотой 20 кГц, с центральным отверстием диаметром 80 -250 мкм, зарядного устройства, отклоняющих пластин, находящихся под напряжением 2-3 кВ, источника лазерного излучения, возбуждающего флуоресценцию клеток, оптико-электронного блока регистрации, усиления и обработки флуоресцентного сигнала, решающего устройства, системы подачи клеточной взвеси и сбора выделенной клеточной популяции.These devices consist of a flow chamber vibrating at a frequency of 20 kHz, with a central hole with a diameter of 80 -250 μm, a charging device, deflecting plates under a voltage of 2-3 kV, a laser radiation source that excites cell fluorescence, an optoelectronic recording unit, amplification and processing of a fluorescent signal, a solver, a system for supplying cell suspension and collecting an isolated cell population.

При работе на этих установках клетки гетерогенной взвеси, предварительно окращенные флуоресцентнымикрасителямиWhen working on these plants, heterogeneous suspension cells previously coated with fluorescent dyes

флуорохромами или моноклональными антителами с флуоресцентными присадками, специфически связывающимися только с клетками определенного типа, поступают в проточную камеру. Клеточная взвесь, проходя через капиллярное отверстие проточной камеры принимает вид тонкой ламинарной струи, которая вытекает из выходного сопла. При этом клетки, находящиеся во взвеси, располагаются по центру струи друг за другом. Таким образом, происходит формирование моноклеточного потока. Проточная камера, формирующая струю, вибрирует за счет пьезокристалла, питающегося от звукового генератора, в результате чего ламинарная струйка разбивается на ряд отдельных капель. В среднем каждая сороковая капля содержит в себе по одной клетке, остальные капли пустые. Капли, следующие друг за другом, пересекают лазерный луч, возбуждающий флуоресценцию флуорохромов, окрашивающих клетки. Свет флуоресценции собирается, усиливается и регистрируется оптикоэлектронной системой, которая выдает сигнал на решающее устройство.fluorochromes or monoclonal antibodies with fluorescent additives that specifically bind only to cells of a certain type enter the flow chamber. Cell suspension, passing through the capillary hole of the flow chamber, takes the form of a thin laminar stream that flows from the outlet nozzle. In this case, the cells in suspension are located in the center of the jet one after another. Thus, the formation of a monocellular flow occurs. The flow chamber forming the jet vibrates due to the piezocrystal, powered by the sound generator, as a result of which the laminar stream is divided into a number of separate drops. On average, each fortieth drop contains one cell, the remaining drops are empty. Drops following each other cross a laser beam that excites fluorescence of fluorochromes staining cells. The fluorescence light is collected, amplified and recorded by an optoelectronic system, which provides a signal to a resolver.

. 4 ;y. :- ff.. 4; y. : - ff.

.-.tfjv.M.-V..-. tfjv.M.-V.

А61 J 1/0,5A61 J 1 / 0.5

.В зависимости от харктера сигнала флуоресценции (длины волны излучения или ее интенсивности) решающее устройство вырабатывает управляющий сигнал, приходящий на зарядный блок, который заряжает каплю с находящейся в ней клеткой зарядом статического электричества. Капли с клетками, имеющими другие флуоресцентные параметры или неокрашенные, заряжаются другим знаком заряда, не несущие клеток - не заряжаются. Заряженные капли проходят между дефлекторными пластинами, которые отклоняют их в зависимости от знака заряда в собирающие сосуды.. Depending on the nature of the fluorescence signal (radiation wavelength or its intensity), the decisive device generates a control signal that arrives at the charging unit, which charges the droplet with a static charge in the cell. Drops with cells that have other fluorescent parameters or are not stained are charged with a different charge sign, and those that do not carry cells are not charged. Charged droplets pass between deflector plates, which deflect them, depending on the sign of the charge, into the collecting vessels.

Таким образом, в одном сосуде собираются клетки, подлежащие вьщелению, а в другом все остальные.Thus, in one vessel the cells to be filled are collected, and in the other all the others.

Принципиальным недостатком данного устройства является невозможность выделения одновременно из одной и той же биологической жидкости нескольких различных клеточных популяций, что часто является необходимым и заставляет прибегать к последующим этапам сортировки, увеличивая время и затраты на выполнение данной процедуры.The fundamental disadvantage of this device is the impossibility of simultaneously isolating several different cell populations from the same biological fluid, which is often necessary and makes it necessary to resort to the subsequent stages of sorting, increasing the time and cost of performing this procedure.

Другим существенным недостатком является отсутствие полной герметизации установки, что исключало бы контакты исследуемого образца с внешней средой и, что необходимо при работе со стерильным или зараженным материалом. В ряде случаев соблюдение стерильности всей процедуры совершенно необходимо, например, при работах по пересадке клеток костного мозга, используемого при лечения лейкозов, лучевой болезни и т.д.Another significant drawback is the lack of complete sealing of the installation, which would exclude contact of the test sample with the external environment and, which is necessary when working with sterile or infected material. In some cases, maintaining the sterility of the entire procedure is absolutely necessary, for example, when working on a bone marrow cell transplant used in the treatment of leukemia, radiation sickness, etc.

В устройстве, описанном Kamentsky L.A. - The rapid cell spectrofotometr в кн.: Autometed cell identification and cell sorting .Ed. by G.Z. Wide and G.F. Bakz. Acad. Press New-York and London, 1970, pp.111-121., используется другой тип проточной камеры, которая устанавливается на предметном столике микроскопа. Камера представляет собой герметически закрытый блок с оптическими окнами снизу и сверху для подсветки и регистрации клеток через объектив микроскопа. В камере имеется канавка, по которой протекает взвесь клеток, подлежащих вьщелению. Под некоторым углом к этой канавке имеется другая (отводящая) канавка, которая соединена с устройством, представляющим собой поршень, перемещаемый щаговым двигателем, что позволяет импульсно отсасывать часть протекающей жидкости вместе с находящимися в ней клетками в собирающую емкость. Имеется также источник света, облучающий клетки снизу, оптико - электронный блок, собирающий, усиливающий и регистрирующий оптический сигнал от клеток, и решающее устройство.In the device described by Kamentsky L.A. - The rapid cell spectrofotometr in the book: Autometed cell identification and cell sorting .Ed. by G.Z. Wide and G.F. Bakz. Acad Press New-York and London, 1970, pp. 111-121., Another type of flow chamber is used which is mounted on a microscope stage. The camera is a hermetically sealed unit with optical windows bottom and top for illuminating and registering cells through the microscope lens. There is a groove in the chamber along which a suspension of cells to be injected flows. At a certain angle to this groove, there is another (diverting) groove, which is connected to a device that is a piston moved by a stepper motor, which allows it to pulse to suck out part of the flowing fluid, together with the cells in it, into a collecting container. There is also a light source that irradiates cells from below, an optical - electronic unit that collects, amplifies and records the optical signal from the cells, and a resolver.

поглощения света), медленно протекает по канавке. При прохождении поля зрения микроскопа клеткой с оптической характеристикой соответствующей заданной, оптико-электронное устройство регистрирует ее и вырабатывает сигнал, который включает шаговый двигатель, приводящий в движение поршень, в силу чего часть жидкости вместе с этой клеткой отсасывается в отводящий канал и попадает в собираюшую емкость.light absorption), slowly flows through the groove. When the microscope’s field of view passes through a cell with an optical characteristic corresponding to a given one, the optoelectronic device registers it and generates a signal that turns on the stepper motor, which drives the piston, whereby a part of the liquid, together with this cell, is sucked into the outlet channel and enters the collecting container .

В данном устройстве практически исключен контакт исследуемого материала с внешней средой и, таким образом, легко могут быть соблюдены условия стерильности и работы с контагиозным материалом.In this device, the contact of the test material with the external environment is practically excluded and, thus, the conditions of sterility and work with contagious material can be easily observed.

Однако, недостатком вьппеуказанного устройства является его низкая производительность и необходимость работать только с сильно разбавленными клеточными взвесями, так как в противном случае чистота выделенной взвеси клеток будет недостаточной.However, the disadvantage of the indicated device is its low productivity and the need to work only with highly diluted cell suspensions, since otherwise the purity of the isolated cell suspension will be insufficient.

Как и в предьщущем устройстве, одномоментно возможно вьщеление только одной клеточной субпопуляпии.As in the previous device, it is possible to inject only one cell subpopulation at a time.

Еще одно устройство для выделения однотипных клеточных взвесей из гетерогенной по клеточному составу биологической жидкости описано в журнале: Cytometry. Jan F. Keij, Ad С. Groenewegen, George B.J.Dubelar, and Jan W.M.Visser. ffigh-Speed Photodamage Cell Selection Using a FrequencyDoubled Argon Ion Laser. Cytometry, 1995. Vol. 19, N 3, pp.209-216.Another device for isolating the same type of cell suspension from a heterogeneous cell composition of biological fluid is described in the journal: Cytometry. Jan F. Keij, Ad C. Groenewegen, George B.J. Dubelar, and Jan W.M. Visser. ffigh-Speed Photodamage Cell Selection Using a FrequencyDoubled Argon Ion Laser. Cytometry, 1995. Vol. 19, N 3, pp. 209-216.

Данное устройство состоит из проточной камеры, представляющей собой узкий капилляр, имеющий сверху 2 оптических окна, источника лазерого излучения, возбуждающего флуоресценцию, сфокусированного на первое оптическое окно, источника излучения света с длиной волны 257 нм и мощностью 20 - 100 MW разрушающего клетки, сфокусированного на второе онтическое окно, оптико-электронного блока, собирающего, регистрирующего , усиливающего оптический сигнал и выдающего управляющий импульс, решающего блока, вырабатывающего запирающий сигнал, оптического затвора и системы сбора выделенных клеток.This device consists of a flow chamber, which is a narrow capillary having on top 2 optical windows, a source of laser radiation that excites fluorescence, focused on the first optical window, a light source with a wavelength of 257 nm and a power of 20 - 100 MW destroying cells focused on a second ontic window, of an optoelectronic unit, collecting, recording, amplifying an optical signal and issuing a control pulse, a deciding unit generating a locking signal, an optical create and collect the isolated cells of the system.

Окрашенные клетки ( процедуры окраски не отличаются от нредыдущих ) протекают через капилляр проточной камеры за счет давления создаваемого на входе проточной системы, где пересекают луч первого лазера, возбуждающего флуоресценцию клетки. Свет флуоресценции проходит через оптическую систему и регистрируется оптическим детектором, который устанавливает принадлежность клетки к данному типу, после чего вырабатывает управляющий сигнал, поступающий , в свою очередь, на решающее устройство. Клетка же продолжает двигаться по капилляру далее, и пересекает луч второго (разрушающего) лазера. Если флуоресцентныепараметрыStained cells (staining procedures do not differ from the previous ones) flow through the capillary of the flow chamber due to the pressure created at the inlet of the flow system, where the beam of the first laser exciting the cell fluorescence crosses. Fluorescence light passes through the optical system and is recorded by an optical detector, which determines the cell belongs to this type, after which it generates a control signal, which, in turn, is transmitted to the resolver. The cell continues to move further along the capillary, and crosses the beam of the second (destructive) laser. If fluorescent parameters

соответствуют заданным параметрам, то решающее устройство выдает запирающий сигнал, закрывающий оптический затвор, и свет разрушающего лазера не достигает клетки.correspond to the specified parameters, the resolving device generates a locking signal that closes the optical shutter, and the light of the destructive laser does not reach the cell.

К положительным сторонам данного устройства относится высокая скорость работы (до 22000 клеток/с.) и чистота селекции (от 81 до 100%) клеток.The positive aspects of this device include high speed (up to 22000 cells / s.) And purity of selection (from 81 to 100%) cells.

Недостатком данного устройства, как и всех вьппеописанных, является невозможность одновременного получения более одной клеточной субпопуляции из гетерогенной клеточной взвеси.The disadvantage of this device, as well as all described above, is the impossibility of simultaneously obtaining more than one cell subpopulation from a heterogeneous cell suspension.

Данное устройство по числу совпадаюших признаков ближе всего сопоставимо с заявляемым и поэтому принято в качестве прототипа.This device according to the number of matching features is closest to the claimed one and is therefore accepted as a prototype.

Технической задачей настоящей полезной модели является обеспечение возможности получения одновременно нескольких (3 и более) субпопуляций из одной гетерогенной клеточной взвеси.The technical task of this utility model is to provide the possibility of simultaneously obtaining several (3 or more) subpopulations from one heterogeneous cell suspension.

Эта задача решается с помощью устройства состоящего из проточной камеры с входным и выходным отверстиями, соединенными соответственно с емкостями для подачи биологических жидкостей и сбора выделенных клеток, источника света, возбуждающего флуоресценцию, и источника лазерного с д:шной волны 257 нм и мощностью 20 100 MW, расположенных над проточной камерой, оптико - электронного блока, включающего оптические элементы и детектор света, оптического затвора и решающего устройства, в котором, согласно предлагаемой полезной модели, проточная камера содержит 3 выходных отверстия расположенных относительно друг друга под углом 120°. Каждое выходное отверстие соединено канавками со входным отверстием, находящимся в центральной части проточной камеры и имеющим диаметр 80-100 мкм. Дополнителп.но устройство имеет опак-иллюминатор и вращающуюся призму, расположеннзтю под оптическим окном, а оптикоэлектронный блок содержит 3 детектора света.This problem is solved using a device consisting of a flow chamber with inlet and outlet openings, respectively connected to containers for supplying biological fluids and collecting isolated cells, a light source that excites fluorescence, and a laser source with a wavelength of 257 nm and a power of 20,100 MW located above the flow chamber, an optical - electronic unit, including optical elements and a light detector, an optical shutter and a solving device, in which, according to the proposed utility model, the flow chambers and contains 3 outlet openings located relative to each other at an angle of 120 °. Each outlet is grooved to an inlet located in the central part of the flow chamber and having a diameter of 80-100 μm. In addition, the device has an opaque porthole and a rotating prism located under the optical window, and the optoelectronic unit contains 3 light detectors.

Для лучшего понимания предлагаемой модели приведена принципиальная схема устройства (Фиг. 1 ), где:For a better understanding of the proposed model is a schematic diagram of the device (Fig. 1), where:

1- проточная камера1- flow chamber

2- емкости для сбора выделенных клеток2- containers for collecting isolated cells

3- емкость для биологической жидкости3- capacity for biological fluid

4- входное отверстие4 inlet

5- выходные отверстия5- outlets

6- источник света возбуждающий флуоресценцию6- fluorescence exciting light source

7- опак - иллюминатор7- opak - porthole

10-источник лазериого излучения с длиной волны 257 нм и мощностью 20-100MW10-source laser radiation with a wavelength of 257 nm and a power of 20-100MW

11- оптический затвор11- optical shutter

12- вращающаяся призма12- rotating prism

13- луч, возбуждающий флуоресценцию13- beam, exciting fluorescence

14- лазерный луч, разрушающий клетку14- cell-destroying laser beam

Работа устройства осуществляется следующим образом:The operation of the device is as follows:

Клеточная взвесь, содержащая разные типы клеток, предварительно окрашивается флуоресцентными красителями - флуорохромами или моноклональными антителами с флуоресцентными присадками, специфически связывающимися с клетками, подлежащими вьщелению. При этом важно, чтобы оптические параметры флуорохромов ( спектры флуоресценции, интенсивность и др.) окрашивающих различные типы клеток, не перекрывались. Современные методы позволяют проводить такие процедуры, окрашивая клеточные взвеси несколькими красителями с разными оптическими свойствами. Окрашенная таким образом взвесь помешается в емкость (3) и под влиянием давления, созданного на входе системы, поступает во входное отверстие (4) проточной камеры (1). Входное отверстие (4) находится в центре проточной камеры (1), имеет диаметр 80-100 мкм и служит для формирования моноклеточного потока, в котором клетки, находясь на некотором расстоянии друг от друга, двигаются по определенной траектории. Входное отверстие (4) камеры (1), сверху, через опак-иллюминатор (7), освещается светом возбуждающим флуоресценцию (13) флуорохрома от источнка излучения (6).Cell suspension containing different types of cells is pre-stained with fluorescent dyes - fluorochromes or monoclonal antibodies with fluorescent additives that specifically bind to cells to be injected. It is important that the optical parameters of fluorochromes (fluorescence spectra, intensity, etc.) staining different types of cells do not overlap. Modern methods make it possible to carry out such procedures by staining cell suspensions with several dyes with different optical properties. The suspension colored in this way will be placed in the container (3) and, under the influence of the pressure created at the system inlet, enters the inlet (4) of the flow chamber (1). The inlet (4) is located in the center of the flow chamber (1), has a diameter of 80-100 μm and serves to form a monocellular flow in which cells, being at a certain distance from each other, move along a certain path. The inlet (4) of the chamber (1), from above, through an opaque porthole (7), is illuminated with light that excites fluorescence (13) of the fluorochrome from the radiation source (6).

Таким образом формируется информационно - измерительный объем, проходя который каждая клетка начинает флуоресцировать, излучая спектр того красителя, который специфичен для данного типа клеток.Thus, an informational-measuring volume is formed, passing through which each cell begins to fluoresce, emitting a spectrum of that dye that is specific for this type of cell.

Свет флуоресценции попадает на один из 3 детекторов света оптико электронного блока (8), который по спектральным параметрам определяет, к какому типу относится данная клетка, и выдает об этом сигнал на управляющий блок ( 9). Пройдя информационно - измерительный объем, клетка попадает в один из каналов и следует по нему к выходному отверстию (5). Каналы в местах впадения их в выходные отверстия (5) периодически облучаются светом (14) от лазера (10), имеющего интенсивность излучения 20 - 100 MW и длинну волны 257 нм. Облучение живых клеток таким лучом, приводит практически к 100% их гибели и разрушению. Этот луч постоянно перемещается по кругу за счет вращающейся призмы (12).The fluorescence light hits one of the 3 light detectors of the optoelectronic unit (8), which, by spectral parameters, determines what type this cell belongs to, and gives a signal about this to the control unit (9). Having passed the informational-measuring volume, the cell enters one of the channels and follows it to the outlet (5). The channels at the places where they enter the exit openings (5) are periodically irradiated with light (14) from a laser (10) having a radiation intensity of 20 - 100 MW and a wavelength of 257 nm. Irradiation of living cells with such a beam leads to almost 100% of their death and destruction. This beam is constantly moving in a circle due to a rotating prism (12).

вырабатывает импульс запрета, закрывающий оптическое окно (11).generates a prohibition pulse that closes the optical window (11).

Закрытие оптического окна происходит только на момент пересечения лазерным лучом того канала, который соответствует данному типу клетки.The optical window closes only at the moment the laser beam crosses the channel that corresponds to this type of cell.

Неповрежденная клетка следует по этому каналу камеры в собирающую емкость (2). Если клетка попадает в другой канал, то она уничтожается лазерным лучом. Весь путь движения клеток герметизирован.An intact cell follows this channel of the chamber into a collecting container (2). If a cell enters another channel, then it is destroyed by a laser beam. The whole path of the movement of cells is sealed.

Таким образом, предлагаемое устройство позволяет в стерильных условиях, с высокой скоростью одновременно сортировать и выделять 3 и более субпопуляций с высокой степенью чистоты сортируемого материала из гетерогенных по клеточному составу, биологических жидкостей и клеточных взвесей или очищать их от ненужных или патологических элементов.Thus, the proposed device allows in sterile conditions, at a high speed, to simultaneously sort and isolate 3 or more subpopulations with a high degree of purity of the sorted material from heterogeneous in cellular composition, biological fluids and cellular suspensions or to clear them of unnecessary or pathological elements.

Устройство разработано в лаборатории отдаленной лучевой патологии Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологического института МЗ РФ.The device was developed in the laboratory of remote radiation pathology of the Central Research X-ray and Radiological Institute of the Ministry of Health of the Russian Federation.

Claims (1)

Устройство для выделения клеток из биологических жидкостей, содержащее проточную камеру с входным и выходным отверстиями, соединенными, соответственно, с емкостями для подачи биологической жидкости и сбора выделенных клеток, источник света, возбуждающий флуоресценцию окрашенных клеток и источник лазерного излучения длиной волны 257 нм и мощностью 20-100 мW, расположенные над проточной камерой, оптико-электронный блок, состоящий из оптических элементов и детектора света, оптический затвор и решающее устройство, отличающееся тем, что проточная камера имеет три выходных отверстия, расположенных под углом 120^o относительно друг друга и соединенных канавками с входным отверстием, расположенным в центральной части камеры и имеющим диаметр 80-100 мкм, оптико-электронный блок, имеющий три детектора света, дополнительно содержит опак-иллюминатор, направляющий свет от источника, возбуждающего флуоресценцию, на входное отверстие проточной камеры, а также вращающуюся призму, находящуюся за оптическим затвором и направляющую свет лазера на выходные отверстия проточной камеры.

A device for extracting cells from biological fluids, containing a flow chamber with inlet and outlet openings, respectively connected to containers for supplying biological fluid and collecting isolated cells, a light source that excites fluorescence of stained cells and a laser source with a wavelength of 257 nm and a power of 20 -100 mW located above the flow chamber, an optoelectronic unit consisting of optical elements and a light detector, an optical shutter and a deciding device, characterized in that Single chamber has three output ports disposed at an angle of 120 ^o with respect to each other and connected to the inlet grooves located in the central part of the chamber and having a diameter of 80-100 microns, opto-electronic unit having three light detector, further comprises a opaque-porthole directing light from a source that excites fluorescence to the inlet of the flow chamber, as well as a rotating prism located behind the optical shutter and directing the laser light to the outlet openings of the flow chamber.