RU1838409C - Иммобилизованна аденилатциклаза чумного микроба - Google Patents

Abstract

Использование: биохими  и биотехнологи  относитс  к получению матриц с кова- лентно св занными белками. Сущность изобретени : получают иммобилизованную аденилатциклазу чумного микроба путем ковалентного св зывани  аденилатциклазы с окисленной с помощью периодата сефаро- зой CL 6B. Активность иммобилизованного фермента по отношению к нативному 95%. Активность сохран етс  в течение 6 мес.

Description

Изобретение относитс  к биохимии и биотехнологии, в частности к способам получени  матриц с ковалентно св занными белками.

Цель изобретени  - иммобилизаци  аденилатциклазы чумного микроба.

. Цель достигаетс  тем, что на окислзн- ной с помощью периодата сефарозе CL 6B ковалентно св зывают аденилатциклазу чумного микроба. В отличие от прототипа раствор дл  присоединени  фермента не содержит фосфатных ионов, инактивирующих аденилатциклазу.

Пример 1. 1,5 г сефарозы CL 6B, промытой 10-кратным объемом воды, помещают в пластиковый флакон объемом 15-20 мл. Добавл ют 3 мл 0,07 М раствора периодата натри  и медленно перемешивают реакционную смесь в течение 45-60 мин при комнатной температуре. Добавл ют 0,5 мл 2 М этиленгликол  и продолжают перемешивание еще 30 минут. Гель отфильтровывают на пористом стекл нном фильтре,

промывают водой, а затем 0,01 М натрий- карбонатным буфером (рН 9,5).

В 5 мл отдиализованного против 0,01 М карбонатного буфера (рН 8.5) раствора аденилатциклазы чумного микроба (0,5 мг/мл аденилатциклазы с активностью 2 нмоль/мг) внос т активированную матрицу и рН суспензии довод т до 9,5 с помощью 2 М гидроокиси натри . Реакцию продолжают в течение 24 часов, медленно вращал реакционный сосуд при 8-10°С.

Дл  восстановлени  азометинов и оставшихс  альдегидных групп добавл ют 3 мл свежеприготовленного раствора боро- гидрида натри  в концентрации 1 мг/мл в том же буфере. Реакцию продолжают при медленном перемешивании в течение 1 часа в холодном помещении. Гель промывают 0,01 М карбонатным буфером рН 8,5, затем 0,01 Мтрис-HCI рН 7,6. Активность св занной с матрицей аденилатциклазы определ ют по методу (Tovey K.S., Whelan J.A.M. A simple direct assay for cyclic AMP in plasma and other biological sampe using an improved

(Л

CO 00 b

GO

ompletive protelin binding technique. Clin. hlm. Acta, 1974, v.56, P.221-224). Ома сотавл ет 2,5 ед/г. За единицу активности денилатциклазы принимают количество аномелей цАМФ синтезированного одним г фермента за 1- минуту при 37°С. Количетво аденилатциклазы, иммобилизованной на 1 г носител  равно 1,3 мг, что составл ет 80% от добавленной дл  св зывани . Иммобилизованный фермент сохран ет 95% акивности по отношению к нативному состо нию, Иммобилизованна  аденилат- циклаза полностью сохран ла свою активность в течение 6 мес цев (срок наблюдени ).

Пример 2. Все операции провод т как в примере 1, но концентраци  аденилатциклазы составл ет 0,6 мг/мл, инкубаци  12 часов, температура 22°С. Дальнейшие операции как в примере 1. Количество адени- латцмклазы иммобилизованной на 1 г носител  составл ет 1,7 мг, что соответствует 85% от добавленной дл  св зывани . Активность св занной с матрицей аденилатциклазы соответствует 3,2 ед/г.

Пример 3. Все операции провод т как в примере 1, но аденилатциклазу отдиа- лизовывают против 0,01 М карбонатного буфера рН 9,5. Концентраци  фермента составл ет 0,5 мг/мл, врем  инкубации 10 часов, температура 28°С. Количество аденилатциклазы иммобилизованной на 1 г носител  составл ет 1,4 мг, что составл ет 82% от добавленной дл  св зывани . Активность св занной с матрицей аденилатциклазы составл ет 2,7 ед/г.

Как видно из приведенных примеров,, полученна  иммобилизованна  аденилат- циклзза чумного микроба  вл етс  высокоактивным и стабильным продуктом, имеющим большую биотехнологическую и биохимическую значиморть. Поскольку аденилатциклаза  вл етс  ферментом синтеза циклического аденозинмонофосфата - биологически активного вещества, используемого в биологии и медицине, то

иммобилизованна  форма фермента может быть использована в биотехнологическом процессе по получению цАМФ, благодар  легкой извлекаемое™ нуклеотида из реакционной смеси и возможности многократного использовани  матрицы, Кроме того, св занна  аденилатциклзза характеризуетс  стабильностью своей структуры, что обус- ловливаетвозможность ее

транспортировки на большие рассто ни  без привлечени  низкой температуры и других условий, обычно используемых дл  ферментов .

Ковалентноё св зывание аденилатциклазы может сыграть свою роль в изучении механизма ее действи , т.к. дает возможность быстро измен ть и контролировать окружение фермента. Если учесть, что большинство белков клетки, к числу которых относитс  аденилатциклаза, активируютс  присоединением или отщеплением неорганического фосфата, то, име  пришитый к матрице белок, последовательно ввод  или удал   изучаемые вещества из реакционной системы, можно точно, установить, какой именно ион катализирует его активность и какие энзимы клетки принимают в этом уча- стие.

Формула -и з обретени  Иммобилизованна  аденилатциклаза чумного микроба общей формулы

н и

P-C-N-E- . Мгде Р - остаток модифицированного перио- датным окислением сефарозы CL 6В,

Н - N-E остаток молекулы аденилатцикла- зы после восстановлени  борогидридом натри ,

обладающа  способностью синтезировать циклический аденозинмонофосфат.