RU1833690C - Method for determining antigens and antibodies - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine; agriculture. SUBSTANCE: method involves using specific chelating agents showing high relative fluorescence output. EFFECT: high sensitivity and accuracy in detecting antigens, antibodies and biologically active substances present in trace quantities.

Description

Изобретение относится к иммуноанализу, а именно к иммунофлуоресцентным методам анализа с временным разрешением. The invention relates to immunoassay, namely to immunofluorescence assays with time resolution.

Цель изобретения повышение чувствительности способа. The purpose of the invention is to increase the sensitivity of the method.

Способ осуществляют следующим образом. В качестве меток используют комплексы лантанидов с хелатами общей формулы I или II

N

N

(I)

N

(II) где один из R₁-R₄-CH₂COOH, а остальные три СН₂СООН или
CH₂-COO-NH

CO-CH₂-CO-CF₃ или общей формулы III

N

N

(III) где один из R₁-R₆-СН₂СООН, а остальные четыре СН₂СООН или
CH₂-COO-NH

CO-CH₂-CO-CF₃ при этом комплекс обязательно содержит по крайней мере один заместитель
CH₂-COO-NH

CO-CH₂-CO-CF₃
Флуоресцентные выходы данных хелатных комплексов с европием равны 10⁶-2,4x x10⁷.The method is as follows. Lanthanide complexes with chelates of the general formula I or II are used as labels

N

N

(I)

N

(II) where one of R ₁ -R ₄ -CH ₂ COOH, and the remaining three CH ₂ COOH or
CH ₂ -COO-NH

CO-CH ₂ —CO-CF ₃ or general formula III

N

N

(III) where one of R ₁ -R ₆ -CH ₂ COOH, and the remaining four CH ₂ COOH or
CH ₂ -COO-NH

CO-CH ₂ -CO-CF ₃ wherein the complex necessarily contains at least one substituent
CH ₂ -COO-NH

CO-CH ₂ -CO-CF ₃
The fluorescence yields of these chelate complexes with europium are 10 ⁶ -2,4x x10 ⁷ .

Способ может быть осуществлен в любых вариантах твердофазного анализа, описанных для радиоизотопных, ферментных и флуоресцентных маркеров, а также в гомогенных методах, основанных на тушении и возгорании флуоресценции при связывании меченого соединения. Способ применим к любым соединениям, для которых возможно получение неспецифических антител и с которыми возможно ковалентное связывание маркера (например, поли- и моноклональные антитела, анти-антитела, различные антигены, гормоны, лекарства, вирусные частицы, бактерии, белки, опухолевые маркеры, пептиды, белок А стафилококка). The method can be carried out in any variants of the solid-phase analysis described for radioisotope, enzyme and fluorescence markers, as well as in homogeneous methods based on quenching and ignition of fluorescence upon binding of the labeled compound. The method is applicable to any compounds for which non-specific antibodies are possible and with which covalent marker binding is possible (for example, poly- and monoclonal antibodies, anti-antibodies, various antigens, hormones, drugs, viral particles, bacteria, proteins, tumor markers, peptides , Staphylococcus A protein).

П р и м е р 1. Синтез 4-аминобензоилтрифторацетона гидрохлорида (АБТФА) (IV). PRI me R 1. Synthesis of 4-aminobenzoyl trifluoroacetone hydrochloride (ABTFA) (IV).

АБТФА (IV) получают из 4-аминобензофенона (1) в три стадии
CH₃-

NH₂__→ CH₃-

H-

H __→
__→ CF₃-

H-

H __→ CF₃-

-

NH₂·HCl
Cтадия I. К уксусномуравьиному ангидриду, полученному из 7,1 мл (75 ммоль) уксусного ангидрида и 7,1 мл (183 ммоль) 98%-ной муравьиной кислоты, при 0-2^оС и перемешивании добавляют в течение 10 мин раствор 6,75 г (50 ммоль) 4-аминобензофенона в 10 мл 98%-ной муравьиной кислоты, полученную смесь перемешивают 1 ч при 60^оС. После охлаждения до комнатной температуры добавляют 7,2 мл воды и смесь упаривают досуха на роторном испарителе при 70-80^оС. Остаток растворяют в 100 мл хлороформа и промывают последовательно 5% -ной соляной кислотой, водой, 5%-ным карбонатом натрия, сушат над сульфатом магния и упаривают досуха. Твердый остаток перекристаллизовывают из бензола и сушат над фосфорным ангидридом в вакуум-эксикаторе. Получают 4-формиламиноацетофенол (II) в виде белых игольчатых кристаллов с т.пл. 105-106^оС (из бензола). Выход 6,99 г (85,7% от теоретического).ABTFA (IV) is obtained from 4-aminobenzophenone (1) in three stages
CH ₃ -

NH ₂ __ → CH ₃ -

H-

H __ →
__ → CF ₃ -

H-

H __ → CF ₃ -

-

NH ₂ HCl
Stage I. By uksusnomuravinomu anhydride prepared from 7.1 ml (75 mmol) of acetic anhydride and 7.1 ml (183 mmol) of 98% formic acid at 0-2 ^{° C} and stirring for 10 minutes a solution of 6 75 g (50 mmol) of 4-aminobenzophenone in 10 ml of 98% formic acid, the resulting mixture was stirred for 1 hour at 60 ^C. After cooling to room temperature, 7.2 ml of water was added and the mixture was evaporated to dryness on a rotary evaporator at 70 -80 ° ^C. The residue is dissolved in 100 ml of chloroform and washed successively with 5% hydrochloric acid, water, 5% sodium carbonate, with shat over magnesium sulfate and evaporated to dryness. The solid residue is recrystallized from benzene and dried over phosphoric anhydride in a vacuum desiccator. Get 4-formylaminoacetophenol (II) in the form of white needle crystals with so pl. 105-106 ^{° C} (from benzene). Yield 6.99 g (85.7% of theory).

Стадия II. К суспензии 1,13 г (21 ммоль) метилата натрия в 40 мл сухого диметилформамида (ДМФА) при перемешивании при 2-5^оС добавляют 4,92 г этилового эфира трифторуксусной кислоты (40 ммоль), а затем в течение 10 мин раствор 3,26 г (20 ммоль) 4-формиламиноацетофенола в 20 мл сухого ДМФА. Смесь дополнительно перемешивают 4 ч при комнатной температуре, добавляют 2,28 мл (40 ммоль) уксусной кислоты и упаривают в вакууме на роторном испарителе. Остаток растворяют в 400 мл хлороформа, промывают водой, сушат над сульфатом магния и упаривают досуха. Остаток перекристаллизовывают из бензола с обработкой активированным углем. После высушивания над фосфорным ангидридом получают 3,1 г (60% от теоретического) 4-формиламинобензоилтрифторацетона (III) в виде желтых игольчатых кристаллов с т.пл. 151,5-152,5^оС (из бензола).Stage II. To a suspension of 1.13 g (21 mmol) of sodium methoxide in 40 ml of dry dimethylformamide (DMF) with stirring at 2-5 ^{° C} was added 4.92 g of ethyl trifluoroacetate (40 mmol) and then over 10 minutes a solution of 3 , 26 g (20 mmol) of 4-formylaminoacetophenol in 20 ml of dry DMF. The mixture was further stirred for 4 hours at room temperature, 2.28 ml (40 mmol) of acetic acid was added and the mixture was evaporated in vacuo on a rotary evaporator. The residue was dissolved in 400 ml of chloroform, washed with water, dried over magnesium sulfate and evaporated to dryness. The residue was recrystallized from benzene with activated carbon. After drying over phosphoric anhydride, 3.1 g (60% of theory) of 4-formylaminobenzoyl trifluoroacetone (III) are obtained in the form of yellow needle crystals with mp. 151,5-152,5 ^C (from benzene).

Стадия III. Смесь 0,52 (2 ммоль) 4-формиламинобензоилтрифторацетона. 8 мл сухого этанола и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты греют на кипящей водяной бане 1,5 ч. Затем упаривают досуха на роторном испарителе и сушат в вакууме над фосфорным ангидридом. Получают 0,49 г (92,5% от теоретического) АБТФА в виде желтых мелких кристаллов. Stage III. A mixture of 0.52 (2 mmol) of 4-formylaminobenzoyl trifluoroacetone. 8 ml of dry ethanol and 0.8 ml of concentrated hydrochloric acid are heated in a boiling water bath for 1.5 hours. Then they are evaporated to dryness on a rotary evaporator and dried in vacuum over phosphoric anhydride. Obtain 0.49 g (92.5% of theory) of ABTFA in the form of yellow small crystals.

Синтез конъюгата иммуноглобулин мыши 4-аминобензоилтрифторацетон-диэтилентриаминпентауксусная кислота (lgG-АБТФА-ДТПА). Synthesis of mouse immunoglobulin conjugate 4-aminobenzoyl trifluoroacetone-diethylenetriaminepentaacetic acid (IgG-ABTFA-DTPA).

К раствору 10 мг ДТПА в 10 мкл диметилсульфоксида добавляют 4 мкл триэтиламина, а затем при перемешивании по каплям 10 мкл раствора, содержащего 9 мг АБТФА в диметилсульфоксиде и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. 10 мкл реакционной смеси добавляют к 200 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера (рН 8,5), содержащего 10 мг/мл lgG и оставляют на ночь при 4^оС. Очистку конъюгата проводят методом гельфильтрации с использованием колонки 1,5х20 см с носителем Sephadex G-50, собирая фракции белкового пика.To a solution of 10 mg of DTPA in 10 μl of dimethyl sulfoxide, 4 μl of triethylamine is added, and then, with stirring, 10 μl of a solution containing 9 mg of ABTFA in dimethyl sulfoxide is added dropwise and left for 1 h at room temperature. 10 .mu.l of the reaction mixture was added to 200 .mu.l of 0.1 M bicarbonate buffer (pH 8.5) containing 10 mg / ml lgG and left overnight at 4 ° ^C. Purification of the conjugate is performed by gel filtration using a column with a carrier 1,5h20 cm Sephadex G-50 collecting protein peak fractions.

Соотношение lgG/АБТФА, которое определяли по поглощению на длинах волн 280 и 330 нм соответственно, было равно 1/5. The logG / ABTFA ratio, which was determined by the absorption at wavelengths of 280 and 330 nm, respectively, was 1/5.

Измерение относительного флуоресцентного выхода лантанидного комплекса. Measurement of the relative fluorescence yield of the lanthanide complex.

Относительный флуорецентный выход определяют по формуле
Φ_отн=

где I_che, I_и интенсивность флуоресценции; C_che, C_εи концентрации; K_che, K_εи константы затухания флуоресценции хелатированного и нехелатированного европия соответственно.The relative fluorescence yield is determined by the formula
Φ _rel =

where I _che , I _and fluorescence intensity; C _che , C _{ε and} concentration; K _che , K _ε, and fluorescence decay constants of chelated and non-chelated europium, respectively.

Для определения относительного флуоресцентного выхода европиевого хелата с LgG-АБТФА-ДТПА смешивают в эквимолярном соотношении 10^-5 М растворы хлорида европия и lgG-АБТФА-ДТПА в 50 мМ трисгидроксилметиламинометан-НСl (рН 6,6) с 0,15 М NaCl и 0,02% тритона Х-100 и 10^-5 М триоктилфосфиноксида. Интенсивность флуоресценции европия измеряют на импульсном люминесцентном спектрометре LS-50 (Perkin Elmer) с временным разрешением на длине волны 615 нм и для свободного, и для хелатированного европия. Длина волны возбуждения для нехелатированного европия 395 нм и для хелата с lgG-АБТФА-ДТПА 330 нм.To determine the relative fluorescent europium chelate output LgG-ABTFA-DTPA is mixed in an equimolar ratio of 10 ^-5 M solutions of europium chloride and lgG-ABTFA-DTPA in 50 mM trisgidroksilmetilaminometan-HCl (pH 6.6) with 0.15 M NaCl and 0 , 02% Triton X-100 and 10 ^-5 M trioctylphosphine oxide. The fluorescence intensity of europium is measured on a LS-50 pulsed luminescence spectrometer (Perkin Elmer) with a time resolution at a wavelength of 615 nm for both free and chelated europium. The excitation wavelength for unchelated europium is 395 nm and for a chelate with logG-ABTFA-DTPA of 330 nm.

Относительный флуоресцентный выход для lgG-АБТФА-ДТПА равен 2˙10⁶.The relative fluorescence yield for lgG-ABTFA-DTPA is 2 × 10 ⁶ .

Проведение конкурентного твердофазного иммуноанализа lgG мыши по измерению остаточного флуоресцентного сигнала в растворе. Conducting competitive solid-phase immunoassay of mouse IgG to measure the residual fluorescence signal in solution.

5 нг меченых lgG мыши инкубируют в лунках полистирольных стрипов (Eflab, Finkand), покрытых 10 мкг/lgG кролика против мыши, вместе со стандартными растворами, содержащими 0-4000 нг/мл lgG мыши в 0,2 мл буфера для проведения анализа (LKB, Wallac), 0,2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) при 37^оС в течение 2 ч. Остаточный флуоресцентный сигнал измеряют флуоресцентным спектрометром с временным разрешением. Возбуждение проводят азотным лазером (337 нм) с частотой 50 Гц и полушириной 10 нс. Сигнал измеряют на длине волны 613 нм в режиме счета фотонов в течение 10 с. Время задержки 300 мкс, счет импульсов 1 мс.5 ng labeled IgG mice are incubated in the wells of polystyrene strips (Eflab, Finkand) coated with 10 μg / IgG rabbit versus mouse, together with standard solutions containing 0-4000 ng / ml IgG mouse in 0.2 ml assay buffer (LKB , Wallac), 0,2% bovine serum albumin (BSA) at ³⁷ ° C for 2 hours. The residual fluorescent signal was measured with a fluorescence spectrometer temporal resolution. Excitation is carried out with a nitrogen laser (337 nm) with a frequency of 50 Hz and a half width of 10 ns. The signal is measured at a wavelength of 613 nm in the photon counting mode for 10 s. Delay time 300 μs, pulse count 1 ms.

П р и м е р 2. "Сэндвич" флуоресцентный иммуноанализ иммуноглобулина человека по измерению остаточного флуоресцентного сигнала в растворе. PRI me R 2. "Sandwich" fluorescence immunoassay of a human immunoglobulin to measure the residual fluorescence signal in solution.

lgG кролика против человека метят европиевым комплексом по методике, описанной выше для lgG мыши. Анализ проводят после инкубации стандартных растворов lgG человека (0-4000 нг/мл) в лунках полистирольных стрипов, покрытых lgG кролика против человека (10 мкг/мл), путем добавления 1 нг/мл коньюгата lgG кролика против человека, меченного европием, в буфере для анализа (LKB, Wallac) в течение 2 ч при 37^оС.anti-human rabbit IgG is labeled with the europium complex as described above for mouse IgG. The analysis is carried out after incubation of standard solutions of human IgG (0-4000 ng / ml) in the wells of polystyrene strips coated with rabbit anti-human IgG (10 μg / ml) by adding 1 ng / ml of IgG rabbit anti-human conjugate labeled with europium in a buffer for analysis (LKB, Wallac) for 2 hours at 37 ^about C.

П р и м е р 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА-этилендиаминтетрауксусную кислоту (lgG-АБТФА-ЭДТА). Соотношение АБТФА/lgG составляет 3/1. Относительный флуоресцентный выход 1,06 ˙10⁶.PRI me R 3. The method is carried out according to example 1, but instead of lgG-ABTFA-DTPA use lgG-ABTFA-ethylenediaminetetraacetic acid (lgG-ABTFA-EDTA). The ratio of ABTFA / logG is 3/1. Relative fluorescence yield 1.06 ˙10 ⁶ .

П р и м е р 4. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА 1,2-диаминоциклогексан N,N,N^', N^'-тетрауксусную кислоту. Соотношение АБТФА/lgG равно 5/1. Относительный флуоресцентный выход 1,1˙10⁶.PRI me R 4. The method is carried out according to example 1, but instead of lgG-ABTFA-DTPA use lgG-ABTFA 1,2-diaminocyclohexane N, N, N ^' , N ^' -tetraacetic acid. The ratio of ABTFA / logG is 5/1. Relative fluorescence yield 1.1˙10 ⁶ .

П р и м е р 5. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА-оксисукцинимидный эфир диэтилентриаминпентауксусной кислоты (lgG-АБТФА-ПСЭДТПА), в котором соотношение АБТФА/ПСЭДТПА составляет 1/1. Соотношение АБТФА/lgG равно 5/1. Относительный флуоресцентный выход 2˙10⁶.PRI me R 5. The method is carried out according to example 1, but instead of lgG-ABTFA-DTPA, lgG-ABTFA-oxysuccinimide diethylenetriaminepentaacetic acid ester (lgG-ABTFA-PSEDTPA) in which the ratio of ABTFA / PSEDTPA is 1/1 is used. The ratio of ABTFA / logG is 5/1. Relative fluorescence yield 2 x 10 ⁶ .

П р и м е р 6. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА-ПСЭДТПА, где соотношение АБТФА/ПСЭДТПА составляет 2/1. Соотношение АБТФА/lgG равно 6/1. Относительный флуоресцентный выход 3,2˙10⁶.PRI me R 6. The method is carried out according to example 1, but instead of lgG-ABTFA-DTPA use lgG-ABTFA-PSEDTPA, where the ratio of ABTPA / PSEDTPA is 2/1. The ratio of ABTFA / logG is 6/1. Relative fluorescence yield 3.2˙10 ⁶ .

П р и м е р 7. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА-ПСЭДТПА, где соотношение АБТФА/ПСЭДТПА составляет 3/1. Соотношение АБТФА/lgG равно 8/1. Относительный флуоресцентный выход 4,2x x10⁶.PRI me R 7. The method is carried out according to example 1, but instead of lgG-ABTFA-DTPA use lgG-ABTFA-PSEDTPA, where the ratio of ABTPA / PSEDTPA is 3/1. The ratio of ABTFA / logG is 8/1. Relative fluorescence output 4.2x x10 ⁶ .

П р и м е р 8. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА-ПСЭДТПА, соотношение АБТФА/ПСЭДТПА составляет 4/1. Соотношение АБТФА/lgG равно 8. Относительный флуоресцентный выход 2,4x x10⁷.PRI me R 8. The method is carried out according to example 1, but instead of lgG-ABTFA-DTPA use lgG-ABTFA-PSEDTPA, the ratio of ABTPA / PSEDTPA is 4/1. The ratio of ABTFA / logG is 8. Relative fluorescence yield 2.4 x 10 ⁷ .

Таким образом, описанный способ позволяет повысить чувствительность определения антигенов или антител за счет использования соединений с высоким относительным флуоресцентным выходом. Thus, the described method allows to increase the sensitivity of determination of antigens or antibodies through the use of compounds with high relative fluorescence yield.

Claims (1)

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ИЛИ АНТИТЕЛ, предусматривающий инкубацию иммуносорбента с анализируемыми пробами, добавление коньюгата антигена или антитела с комплексом лантанида и хелатного соединения, отличающийся тем, что, с целью повышения его чувствительности, в качестве хелатного соединения используют соединение общей формулы I или II

где один из R₁ R₄ CH₂COOH,
а остальные три -CH₂COOH или

или общей формулы III

где один из R₁ R₅ CH₂COOH,
а остальные четыре -CH₂COOH

при этом комплекс содержит по крайней мере один заместитель

METHOD FOR DETERMINING ANTIGENS OR ANTIBODIES, comprising incubating the immunosorbent with the analyzed samples, adding an antigen or antibody conjugate with a complex of lanthanide and a chelate compound, characterized in that, in order to increase its sensitivity, a compound of the general formula I or II is used as a chelate compound

where one of R ₁ R ₄ CH ₂ COOH,
and the other three are -CH ₂ COOH or

or general formula III

where one of R ₁ R ₅ CH ₂ COOH,
and the other four are CH ₂ COOH

wherein the complex contains at least one substituent