RU1831682C - Способ получени ферментного электрода дл определени L-лактата - Google Patents

Abstract

Использование: анализ биологических растворов в медицине дл  диагностики и в микробиологической промышленности. Цель - упрощение процесса, уменьшение рабочего потенциала и увеличение чувствительности . Сущность: при изготовлении ферментного электрода цитохром bz нанос т на поверхность стеклоуглеродного электрода , модифицированного сажей ПМ-75, предварительно окисленной в азотной кислоте , которую перед нанесением на электрод диспергируют в суспензии ацетона, содержащей 2-5% фторопластового лака и 12-20% сажи. 1 ил.. 3 табл. ё

Description

Изобретение относитс  к биохимии, а именно к методам получени  ферментных электродов, и может быть использовано з энзимологии дл  научно-исследовательских целей и в медицине или микробиологической промышленности дл  электрохимического определени  L-лактата в биологических средах, например в крови, в цел х диагностики.

Цель изобретени  - упрощение процесса .

Механизм действи  ферментного электрода объ сн етс  электроокисленй- ем восстановленного цитохрома 02 на поверхности модифицированного электрода. Цитохром Ь2 восстанавливаетс  Ыпактатом: Цит .Ь2(ж. L-лактат- г Цит .йасвос.у+пируват. В ходе обработки сажи азотной кислотой на ее поверхности образуютс  электроактивные хиноновые группы (Q). катализирующие злектроокис ение цитохрома 02: -. Цит.Ь2(вос.) + Q Цит.Ь2(ок.) + QH2

QH2-- 2е - 2Н + Q

Изобретение осуществл ют следующим образом.

Сажу ПМ-75 перед модификацией выдерживают в 55%-ной азотной кислоте в течение 5 сут при комнатной температуре. После этого ее промывают водой до нейтральной реакции (рН 7,0} и высушивают. Смесь приготовленной сажи и раствора фторопластового лака в ацетоне диспергируют ультразвуком при44 кГц в течение 0,5-1 ч. В полученную суспензию сажи погружают электрод на 3-5 с, затем его сушат, промывают дистиллированной водой и буферным раствором последовательно. На поверхность модифицированного сажей электрода

нанос т 10 мкл цитохрома Ь2, накрывают капроновой сеткой, а затем диализной цело- фановой мембраной, которую закрепл ют резиновым кольцом.

Электрод погружают в 0,1 М К-фосфат- цитратный буферный раствор рН 7,0, подключают к пол рографу, задава  рабочий потенциал -0,2 В относительно Ag/AgCI. В измерительную  чейку ввод т раствор исследуемого вещества и регистрируют зависи- мость стационарного тока электрода от концентрации L-лактата.

Пример 1. Определение концентрации L-лактата а водном растворе.

Электрод готов т по общей методике. При диспергировании сажи ультразвуком берут раствор ацетона, содержащий 2-5% фторопластового лака и 12:20% сажи; Определ ют зависимость электрода от концентрации L-лактата при потенциале электрода -0,2 В относительно Ag/AgCI электрода сравнени  (см.табл.1).

Из таблицы видно, что. линейна  зависимость тока от концентрации наблюдаетс  до 0,5 мМ L-лактата (см.чертеж).

Анализ показывает, что при использовании предложенного электрода электро- акисление лактата протекает при низком потенциале, что позвол ет исключить электроокисление аскорбиновой кислоты. Так- же, как видно из чертежа электрод обладает высокой чувствительностью (5.8 мкА/мм L- лактата), что позвол ет использовать дл  анализов биологические растворы, разбавленные в более высокой степени. При повы- шении концентрации сажи или лака выше верхнего предела ухудшаетс  электрохимическа  обратимость поверхностных групп сажи, и при выходе на нижний предел ухудшаетс  стабильность электрода.

Аналогично примеру 1 устанавливают, что электроокисление аскорбиновой .кислоты протекает при потенциале -0.1 В относительно Ag/AgCI, поэтому ее присутствие не вли ет на определение лактата при -0,2 В.

П р и м е р 2. Определение стабильности электрода.

Готов т электрод по общей методике. В течение 12 сут периодически определ ют величину тока электрода (потенциал элект-

рода -0.2 В относительно Ag/AgCI, концентраци  лактата 0,1-0,3 мМ). Данные приведены в табл.2.

Видно, что предлагаемый электрод сохран ет работоспособность не менее 12 сут, в ходе которых произведено не менее 40 измерений. Промывка электрода и измерение занимает не более 4 мин.

П р и м е р 3. Определение концентрации лактата в биологических растворах.

Готов т электрод по общей методике. Определ ют концентрацию L-лактата в плазме крови и культуральной жидкости выращивани  продуцентов вируса лейкоза быка аналогично примеру 1. Параллельно определ ют концентрацию лактата спектро- фотометрическим способом, по восстановлению феррицианида, катализируемому флавоцитохромом Ь2 при введении исследуемого образца е спектрофотометриче- скую  чейку. При введении в спектрофо- тометрическую или электрохимическую  чейку образцы биологических жидкостей разбавл ютс  в 10-40 раз. Полученные данные приведены в табл.3.

Как видно из данных табл.3, концентрации L-лактата, определенные при помощи ферментного электрода и измеренные спек- трофотометрическим способом, практически совпадают. Врем  определени  не превышает 4 мин. Следовательно, полученный электрод может быть применен дл  определени  L-лактата в биологических средах.

Преимуществом способа  вл етс  упрощение модификации стеклоуглеродного электрода.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  ферментного электрода дл  определени  L-лактата. включающий адсорбцию цитохрома b на слое токопровод щего материала, о т л и ч аю - щ и и с   тем, что, с целью упрощени  процесса, модификацию электрода провод т сажей, предварительно окисленной в азотной кислоте, при этом сажу перед нанесением на электрод диспергируют в суспензии ацетона, содержащей 2-5% фторопластового лака и 12-20% сажи.

   Таблица 1

   5

   Ч

   Г

   Z

   f Таблица 2

   Таблица 3