RU1780542C - Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК pPS 20, кодирующей изопенициллин-N-синтетазу, способ получени штамма СернаLоSроRIUм асRемоNIUм, обладающего активностью изопенициллин-N-синтетазы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к химической инженерии, в частности к получению последовательности ДНК, котора  кодирует активность изопенициллин-N-синтетазу Конструируют рекомЬинантную плазмид- ную ДНК pPS20 путем лигировани  Hind III фрагмента плазмиды размером 2,5 кв и Hind III фрагмента плазмиды 335. Полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм Cephalosporlum acremonlum ATCC 11550 с последующим культивированием, выделением целевого продукта. 1 табл

Description

Изобретение относитс  к генетической инженерии, в частности к получению последовательности ДНК, котора  кодирует активность изопенициллин-М-синтетазы. Синтетаза изопенициллина-N  вл етс  катализатором реакции, в которой изб-(L-a- аминоадипил) цистеинил-Д-валина образуетс  изопенициллин N. Эта реакци   вл етс  основной стадией в биосинтезе таких важных антибиотиков, как пенициллины из,Реп1сН11ит chrysogenum, Cephalosporlum acremonlum и Streptomyces clavuligerus, це- фалоспоритов из С. acremonlum и 7-меток- сицефалоспоринов из S clavuligerus.

Последовательность ДНК кодирующую активность изопенициллин-N- синтетазы выдел ют из Cephalosporium acremonlum, используют дл  конструировани  векторов экспрессии, которые обеспечивают экспрессию данного вещества.

Клеточные экстракты из Е coli, транс4 формированные векторами экспрессии, демонстрируют активность изопенициллин-М- синтетазы без предварительной обработки.

В результате трансформации Cephalosporlum векторами экспрессии In vivo получают более высокие уровни изопенициллин-N- синтетазы в трансформантах.

ДНК, кодирующую изопенициллин-N- синтетазу, выдел ют из Cephalosporlum acremonium. Данную ДНК используют дл  конструировани  векторов, которые обеспечивают экспрессию активности изопени- циллин- синтетазы в широком круге клеток реципиентов. Все организмы, которые продуцируют пенициллины и цефалсс- порины,используютобщие

предшественники д (L/a -аминоадипил) - L - цистеинил-Д-валин и изопенициллин.

Последовательности ДНК получают из геномной ДНК Cephalosporlum acremonlum. они  вл ютс  гомологичными с нуклеотид- ной последовательностью соединений ДИК, кодирующих активность синтетазы изопеХ| 00

СЛ

Јь

го

СА)

нициллина N в Streptomyces clavuligerus, Pentcllllum chrysogenum и других организмах , продуцирующих синтетазу изопени- циллина N.

Соединени  ДНК, кодирующие изопе- нициллин синтетазу, можно использовать дл скринировани  геномных библиотек организмов , которые продуцируют изопени- циллин-М-синтетазу.

ДНК, кодирующие изопенициллин-М- синтетазу. получают из геномной ДНК Cephalosporlum acremonium и выдел ют вместе с последовательностью, активирующей транскрипцию и трансл цию, котора  контролирует экспрессию геномной ДНК, кодирующей С.acremonium изопени- циллин-М-синтетазу. Последовательность ДНК, активирующую транскрипцию и трансл цию, используют дл  управлени 

экспрессией гетерологических генов в С.acremonium.

Данна  последовательность содержит регул торные сигналы IPS гена, которые расположены у з конца кодирующей нити кодирующего участка IPS гена. Эти 3 регул торные последовательности кодируют сигналы конца транскрипции и полиадени- лировани  мРНК и процессинга этого IPSrena. Наличие этих сигналов в соответствующем положении рекомбинантной ДНК повышает экспрессию целевого продукта, кодируемого вектором в Cephalosporlum acremonium.

Ниже приведена последовательность ДНК, кодирующа  активность синтетазы изопенициллина N и соответствующа  последовательность аминокислот

1010 203040

5 -АТС GGT ТСС GTT CCAGTT CCA GTG GCC ААС GTC CCC CGA АТС GAT GTC

MET GLY SER VAL PROVAL PRO VAL ALA ASN VAL PRO ARG ILE ASP VAL 51015

15 50 6070 80 90

TCG CCC СТА TTC GGCGAT GAC AAG GAG AAG MG CTC GAG GTA GCT CGC

SER PRO LEU PJE GLYASP ASP LYS GLU LYS LYS LEU GLU VAL ALA ARG 202530

20 100 110 120130 140

GCC АТС GAC GCC GCA TCG CGC GAC АСАGGC TTC TTT TAGGCG GTG AAC

ALA ILE ASP ALA ALA SER ARG ASP TILRGLY РНЕ РНЕ TYRALA VAL ASN 35 40 . 45

25 150 160 170 180 190 CAC GGT GTC GAC CTG CCG TGG CTC TCG CGC GAG ACG AAC AAA TTC CAC HIS GLY VAL ASP LEU PRO TRP LEU SER ARG GLU Т1Ш ASN LYS PHE HIS 505560

30200 210220 230 240

ATG AGC АТС ACG GAC GAG GAG AAG TGG CAG CTC GCC АТС CGG GCC TAC

MET тШ ASP GLU GLU LYS TRP GLN LEU ALA ILE ARG ALA TYR

65707580

35250 260 270280

AAC MG GAG CAC GAGTCC CAG АТС CGG GCG GGC TAC TACCTGCCG АТС

ASN LYS GLU HJS GLUSER GLN ILE ARG ALA GLY TYR TYRLEUPRO ILE

859095

40 290 300 310 320 330

CCG GGC AAG AAG GCG GTC GAA TCG TTC TGC TAC CTG AAC CCC TCC TTC PRO GLY LYS LYS ALA VAL GLU SER PHE CYS TYR LEU ASN PRO SEK PHE

100105110

340 350 360 370 380 AGC CCA GAC CAC CCG CGA АТС AAG GAG CCC ACC CCT ATG CAC GAG GTC

SER PRO ASP HIS PRO ARG ILE LYS GLU PRO Tim PRO MET HIS GLU VAL

1151201 5

5

390 400 410 420 430 АЛС GTC TGG CCG GAC GAG GCG AAG CAC CCG GGG TTC CGG GCC TTC GCC ASN VAL TRP PRO ASP GLU ALA LYS HIS PRO GLY PHE ARC ALA PHE ALA

130135140

10

440 450 460 470 480 GAG AAG TAG TAG TGG GAC GTC TTC GGC CTC TCC TCC GCG GTG CTG CGC GLU LYS TYR TYR TRP ASP VAL PHE GLY LEU SER SER ALA VAL LEU ARC 145150155 160

15

.490 500 510 520

GGC TAG GCT CTC GCC СТА GGT CGC GAC GAG GAC TTC TTC ACC CGC CAC GLY TYR ALA LEU ALA LEU GLY ARG ASP GLU ASP PHE PHE THR ARC HIS

165170 175

20

530 540 550 560 570 TCC CGC CGT GAC ACG ACG CTC TCG TCG GTC GTG CTC АТС CGT TAC CCG SER ARG ARG ASP THR THR LEU SER SER VAL VAL LEU ILE ARG TYR PRO

180185190

25

. 580 590 600 610 . 620 . TAC CTC GAC CCG TAC CCG GAG CCG GCC АТС AAG ACG GCC GAC GAC GGC TYR LEU ASP PRO TYR PRO GLU PRO ALA ILE LYS THR ALA ASP ASP GLY

195200 - 205

30

630 640 650 660 670 ACC AAG CTC AGC TTC GAG TGG CAC GAG GAC GTG TCC CTC АТС ACG GTG THR LYS LEU SER PHE GLU TRP HIS GLU ASP VAL SER LEU ILE THR VA1

210215220

35

680 690 700 710 720 . TTG TAC CAG TCC GAC GTG CAG AAT CTG CAG GTC AAG ACC CCG CAG GGC LEU TYR GLN SER ASP VAL GLN ASN LEU GLN VAL LYS THR PRO GLN GLY 225. 230235240

40

730 740 750 760

TGG CAG GAC АТС CAG GCT GAC GAC ACG GGC TTC CTC АТС ААС TGC GGC TRP GLN ASP ILE GLN ALA ASP ASP THR GLY PHE LEU ILE ASN CYS GLY

245250255

45

770 780 790 800 810 AGC TAC ATG GCC CAT АТС ACC GAC GAC TAC TAC CCG GCC CCG АТС CAC SER TYR MET ALA HIS ILE THR ASP ASP TYR TYR PRO ALA ,PRO ILE HIS

260265270

50

., 820 830 4 840 850 . 860 CGC GTC AAA TGG GTC АЛС GAG GAG CGC CAG TCA CTG CCC TTC TTC GTC ARG VAL LYS TRP VAL ASN GLU GLU ARG GLN-SER LEU PRO PHE PHE VAL

275280285

5

870 880 890 900 910 AAC CTG GGC TGG GAG GAC ACC АТС CAG CCG TGG GAC CCC GCG ACC GCC ASN LEU GLY TRP GLU ASP THR ILE GLN PRO TRP ASP PRO ALA THR ALA

290295300

10 ,

15

20

920 930940 950 960

AAG GAT GGG GCC AAG GAT GCC GCC AAGGACAAG CCG GCC АТС ТСС ТАС

LYS ASP GLY ALA LYS ASP ALA AM LYSASPLYS PRO ALA ILE SER TYR

305310315320

970 980 9901000

GGA GAG TAT CTG CAG GGG GGA CTG CGG GGC TTG АТС AAC AAG AAT GGT GLY GLU TYR LEU GLN GLY GLY LEU ARG GLY LEU ILE ASN LYS ASN GLY 325330335

1010

CAG ACC TAA-31 GLN TIIR

Вектор, кодирующий изопенициллин- N-синтетазу, модифицируют так. чтобы исключить фрагменты ДНК Cephalosporfum acremonium, имеющиес  в векторе и кодирующие фермент. Полученный вектор обозначают как , его трансформируют в клетки-реципиенты E.coli К 12JA221 и E.coll K12JA221/plT335. Трансформанты депонируют в коллекции Narthern Regional Research Laboratories,Peorid, Illlnolc под регистрационным номером № RRL B-15960.

Плазмиду выдел ют из E.coll K12JA221. Плазмиду используют в качестве исходного материала дл  конструировани  плазмиды, обозначенной , котора  обеспечивает экспрессию высокого уровн  изопенициллин-М-синтетазы. Плазмиду конструируют, лигиру  1.5 кв Ncol-BamHI рестрикционный фрагмент с 8,7 кв N col-N col и 1,6 кв N col-BamHI рестрикционными фрагментами плазмиды PCZ106.

Плазмида pCZ106 при низких температурах около 25°С, содержаща  репликон неорганического размножени , имеет число копий около 10-15 копий на клетку хоз ина Е.соН. При повышении температуры до около 37° число копий возрастает до около 1000 копий на клетку хоз ина Е.соН. Клетки хоз ева Е.соИ К12 PV308/pCZ106 депонируют в Nacthern Regional Research Laboratories, Peorid, Illlnolc под регистрационным номером № RRLB-15959.

1,5 KB NCO l-BamHI фрагмент плазмиды plT335 содержит полную последовательность , кодирующую изопенициллин-М-синтетазу, и сайт рестрикции Ncol. который представл ет собой,

54XATGG-3

3- GGTACC - 5 и

содержит последовательность

5 - АТС - з;

3 - ТАС - 5. котора  кодирует аминотер- минальный метиониловый остаток изопенициллин-М-синтетазы .

При температурах около 37° СЕ.col IK12 PV308 / NRR L В - 15624) клетки, содержащие плазмиду , экспрессируют изо- ленициллин-М-синтетазу с высоким

уровнем, достига  9% от полного числа клеток протеина. Неочищенные клеточные экстракты из этих Е. coll K12 PV308/plT337 трансформантов способны катализировать превращение б /L -а -аминоадипил -/L-цистеинил-Д-валина в изопенициллин N, тогда как клеточные экстракты из нетрансформированных Е.соИ К12 PV308 клеток не могут катализировать это превращение.

Трансформанты Е.соИ рГГ337 экспрессируют изопенициллин-М-синтетазу с высокими уровн ми, достигающими 9% от полного клеточного протеина. Благодар  тому , что культивирование Е.соИ менее сложно , чем культивирование природных

организмов, которые продуцируют данное вещество E.coll /plT337, трансформанты можно использовать дл  получени  изопенициллин-М-синтетазы более эффективно и экономично.

Векторы, повышающие внутриклеточную активность изопёнициллин-М-синтета- зы в клетке реципиенте, трансформированной этой плаэмидой, содержат следующие элементы:

1) фрагмент ДНК, кодирующий активность изопенициллин-М-синтетазы;

2) последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию, котора  функционирует не только в клетке реципиенте и расположена в правильной ориентации и

положении, чтобы управл ть экспрессией ДНК, кодирующей фермент;

3) последовательности, обеспечивающие репликацию, интеграцию, обеспечивают сохранение вектора в клетке хоз ине. 5 Естественно, вышеописанный вектор может также содержать ген, придающий устойчивость к антибиотику или некоторые другие элементы, которые обеспечивают средство отбора клеток реципиентов.10

Плазмида pPS20  вл етс  примером типа вектора, сконструированного дл  повышени  внутриклеточной концентрации изопенициллин-М-синтетазы в клетке реципиенте , продуцирующего /3 -лактамовый ан- 15 тибиотик. Плазмиду pPS20 конструируют путем включени  2,7 KB Hind III рестрик- ционного фрагмента плазмиды в сайт рестрикции Hind III 2,7 KB Hind III рестрикционный фрагмент плазмиды 20 содержит последовательность активирующего транскрипцию и трансл цию ге- на фосфоглицераткиназы (PGK) дрожжей Saccharomyces cerevislae, лигированного в правильном положении и ориентации дл  25 правлени  экспрессией гена, придающего сопротивл емость к гидромицину. Так как 2,7 KB Hind- III рестрикционный фрагмент плазмиды 221 может быть включен в Hind-lll-расщепленную плазмиду в 30 любой из двух ориентации, в результате ли- гировани  получают плазмиду с pPS20 PPS20.1.

2.7 кВ Hind lll-рестрикционный фрагмент плазмиды содержит ген, прида- 35 ющий устойчивость к гидромицину, св занный с последовательностью, активирующей транскрипцию и трансл цию PGK рожжей в правильном положении и ориентации дл  экспрессии активности, придаю- 40 щей устойчивость к гидромицину (НмР).

Плазмида pPS20 содержит ген PGK- нМР и трансформанты Cephalosporium acremonlum (pPS20 отбирают по устойчивоти к гидромицину). Плазмида pPS20 содер- 45 ит также ДНК, кодирующую изопенициллин-М-синтетазу.

Плазмида pPS20 содержит почти 3 кв рагмент геномной ДНК, который располоен до ДНК, кодирующей изопенициллин 50

- 380 .

mm

CACTAAAAGC

N-синтетазу Cephalosporium acremonlum. Плазмида pPS20 об зательно должна содержать последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию данного фермента.

Плазмида pPS20 содержит последовательность активации транскрипции и трансл ции Cephalosporium acremonlum, котора  управл ет экспрессией ДНК, кодирующей активность изопенициллин-М-синтетазы при конструировании плазмиды pPS20. Она не содержит ни делеций, ни вставок, которые вли ли бы на последовательность, активирующую fр§нскр йгщи ю и Т 1нс Я цию в ДНК, расположенной с б конца кодирующей нити ДНК. Плазмиду pPS20 используют дл  повышени  способности продуцировани  антибиотика в клетках Cephalosporium acremonlum.

Плазмида pPS20 содержит также ген, придающий устойчивость к гидромицину, который функционирует в С.acremonlum, и позвол ет производить отбор С.acremonlum /pPS20 трансформантов.

Плазмида pPS20 трансформирует С.acremonlum через хромосомную интеграцию .

Плазмиды pPS20, pIT 335 содержат последовательность , активирующую трансл  цию и транскрипцию Cephalosporlun. acremonium. Так, последовательность, акти вирующа  транскрипцию и трансл цию .. C.acremonlum, расположена на плазмидах и pPS20 и может регулировать экспрессию широкого круга ДНК последовательностей . Активирующа  последовательность закодирована на 500 вр Sal 1-Ncol pe стрикционном фрагменте, расположенном непосредственно до и р дом с ДНК, кодирующей активность фермента на плазмиде и pPS20. Фрагмент , который включает вышеуказанный 500 вр Sal 1-N col рестрикционный фрагмент, содержит последовательность , активирующую транскрипцию и трансл цию C.acremonlum.

Частична  ДНК последовательность, активирующа  транскрипцию и трансл цию Cephalosporium acremonlum, закодирована на плазмиде .

ббААТАСГГб ААТАТТССТТ еСТГАТСААС ГГАТААСелА ССАОСвАбАА

сттстсс НИИ лелее

иле - б

Последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию Cephalosporlum acremonium, можно использовать дл  экспрессии любой ДНК последовательности, что иллюстрирует плазмида pPS 21. Плазми- да рР S21  вл етс  производной плазмиды PIT221, котора  получена в результате замены последовательности, активирующей транскрипцию и трансл цию PGK, на последовательность , активирующую транскрипцию и трансл цию С.acremonium насто щего изобретени .

Эту замену осуществл ют вначале, удал   30 вр Хма фрагмент из плазмиды до образовани  плазмиды pPS19. Плазмиду pPS19 расщепл ют BamHI, обрабатывают фрагментом Кленова полимеразы I ДНК Е.coll. В результате расщеплени  Ват I получают 230 вр BamHI рестрикционный фрагмент, содержащий последовательность , активирующую транскрипцию и трансл цию PGK, после обработки Кленова получают двунитевую ДНК вне перекрывани  однонитевой BamHI. Затем крупный 7,7 KB BamHI фрагмент плазмиды pPS19 лигируют с 0,8 кв после обработки фрагментом Кленова Ncol рестрикционного фрагмента плазмиды , который содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию С,acremonium.

Рестрикционный фрагмент Ncol после обработки фрагментом Кленова может быть включен в одной из двух ориентации, причем только одна из возможных ориентации достигает цели - правильного расположени  последовательности, активирующей транскрипцию и трансл цию Cephalosporium acremonfum дл  управлени  экспрессией гена , придающего устойчивость к гидромици- ну.

Плазмида pPS21A использует последовательность , активирующую транскрипцию и трансл цию IPS гена дл  экспрессии гена, придающего устойчивость к гидромицину в Cephalosporlum acremonium. Промежуточную плазмиду, обозначенную pPS23, используют при конструировании плазмиды pPS21A. Плазмиду pPS23 конструируют, выдел   850 вр Ncol рестрикционный фрагмент плазмиды , который содержит активирующую последовательность IPS гена , присоедин   линкер-совместимые с BamHI и Ncol-однонитевые перекрывани  с

850 Вр Ncol-фрагментом и лигиру  860 вр BamHI рестрикционный фрагмент с BamHI расщепленной плазмидой р VC8. Это приводит к двум плазмидам, обозначенным

pPS23 и pPS23.l. которые отличаютс  только по ориентации включенного BamHI рестрикционного фрагмента.

Плазмиду pPS23 гидролизуют рестрик- ционным ферментом BamHI и 860 вр

BamHI рестрикционный фрагмент, который содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию IPS, выдел ют и лигируют с BamHI обработанной плазмидой pPS19. В результате такого лигировани  получают р д нужных плэзмид. включа  плазмиду pPS21A . Плазмиду pPS21А получают при лигировании 0,86 кв BamHI рестрикционного фрагмента плазмиды pPS23 с 7,7 кв BamHI рестрикционным

фрагментом плазмиды pPS19. Она содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию IPS гена, расположенного в соответствующей ориентации дл  управлени  экспрессией гена,

придающего устойчивость к гидромицину. Линкеры, которые используют при конструировании плазмиды pPS23, обеспечивают сохранение соответствующего считывающего фрагмента в плазмиде pPS21A дл  экспрессии гена устойчивости к гидромицину.

Плазмида pPS22 содержит те же самые последовательности, что и плазмида pPS21A, но BamHI рестрикционный фрагмент , который содержит последовательности активации IPS гена, ориентирован в противоположном направлении по отношению к ориентации в плазмиде pPS21 А. Плазмида pPS22 не сообщает устойчивости к гидромицину Cephalosporium acremonfum

при высоких частотах, так что плазмида pPS22 служит удобным негативным контролем в трансформаци х С.acremonium.

Плазмида рР519 содержит последовательность , активирующую транскрипцию и

трансл цию PGK Saccharomyces cerevlslae в соответствующей ориентации дл  управлени  экспрессией гена, придающего устойчивость к гидромицину. Обработка плазмиды pPS19 рестрикционйым ферментом BamHI

приводит к получению двух фрагментов: один фрагмент 230 вр содержит последовательность активации PGK, а другой фрагмент 7,6 кв содержит большую часть

последовательности, кодирующей ген. придающий устойчивость к гидромицину.

В результате циркул ризации 7,6 кв BamHl рестрикционного фрагмента плаз- миды pPS19 получают плазмиду pPS24, в которой нет последовательности, активирующей транскрипцию и трансл цию дл  управлени  экспрессией гена, придающего устойчивость к гидромицину, имеющемус  на векторе,

Плазмиды pPS25 и pPS25.1 получают лигированием двух BamHl рестрикционных фрагментов плазмиды pPS19 с 860 врВаглН рестрикционным фрагментом плазмиды pPS23. В плазмиде pPS25 обе последовательности активировани  PGK и IPS наход тс  в нужной ориентации дл  управлени  экспрессией гена, придающего устойчивость к гидромицину Плазмида pPS25 содержит последовательность, активирую- щую IPS, расположенную непосредственно перед кодирующей последовательностью гена, придающего устойчивость к гидромицину , и последовательность, активирующую PGK и расположенную непосредственно пе- ред последовательностью, активирующей IPS. Плазмида pPS25 придает устойчивость к гидромицину Cephalosponum acremonium.

Плазмида pPS251 отличаетс  от плазмиды pPS25 только ориентацией 0,23 кв BamHl рестрикционного фрагмента, который содержит последовательность, активирующую PGK. В плазмиде pPS25.1 последовательность, активирующа  PGK, расположена не в той ориентации, котора  позволила бы последовательности, активирующей PGK, управл ть экспрессией гена, придающего устойчивость к гидромицину.

Плазмиду рР528 получают при исключении из плазмиды pPS 21А 1,85 кв Pst I рестрикционного фрагмента, который содержит источникрепликации Cephalosporium. Плазмиду pPS 29 получают в результате делеции из плазмиды pPS 21 А Pst I фрагмента дл  получени  плазмиды pPS 28 вместе с 0,49 кв Pst I рестрикционным фрагментом, который расположен между Cephalosporium источником репликации и последовательностью активации IPS гена на плазмиде рР S21А,

3,45 кв Hind III рестрикционный фрагмент плазмиды pPS 21А включают в Hind III сайт плазмиды до получени  плаз- мид pPS 26 и pPS 26.1, которые отличаютс  только в плане ориентации включенного Hind III рестрикционного фрагмента из плазмиды pPS21A. Плазмиды pPS26 и pPS26 Л содержат интактный IPS ген из Cephalosporium acremonium и ген, придающий устойчивость к гидромицину.

Плазмида, обозначенна  pPS 6, обладает повышенной способностью к интеграции в хромосомную ДНК С. acremonium за счет присутстви  ДНК, кодирующей РНК

Плазмида pPS 6 содержит 3,7 кв Хма рестрикционный фрагмент гРНК с генами Cephalosporium acremonium. Присутствие этого Хма фрагмента на плазмиде повышает веро тность того, что плазмида интегрируетс  в С. acremonium гомологичной рекомбинацией при трансформации плазмиды в С acremonium. Плазмиды рРЗЗО и pPS30 I конструируют путем включени  3,7 кв Хма рестрикционного фрагмента пл чмиды oPS 6, который содержит часть генов гРНК С acremonium в единственном Хма сайте плазмиды pPS 21A. Плазмиды рРЗЗО и pPS30.l различаютс  только ориентацией Хма рестрикционного фрагмента. Плазмиды pPS31 и pPS31.1 конструируют путем включени  3,7 кв Хма рестрикционного фрагмента плазмиды pPS 6 в единственный Хма сайт плазмиды pPS 29.

Плазмидные векторы, использующие последовательность активации транскрипции и трансл ции гена IPS Cephalosporium acremonium дл  управлени  экспрессией гена , придающего устойчивость к гидромицину , значительно лучше плазмид, которые используют последовательность, активирующую PGKSaccharomyces cerevlslae дл  управлени  экспрессией гена, придающего устойчивость к гидромицину в C.acremonium. Преимущество векторов: 1 частота трансформации, которую измер ют по числу трансформантов Cephalosporium acremonium, устойчивых к гидромицину на микрограмм использованного при трансформации вектора ДНК, в 50-300 раз выше при использовании IPS последовательности и активации по сравнению с PGK дл  управлени  экспрессией гена, придающего устойчивость к гидромицину на вектор, 2 врем  регенерации, которое определ ют как врем , которое необходимо, чтобы колони  стала видимой невооруженным глазом после трансформации, примерно на 50% меньше при использовании активирующей последовательности в противоположность PGK, которую используют дл  управлени  экспрессией гена, придающего устойчивость к гидромицину на вектор.

Последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию Cephalosporium acremonium, используют дл  экспрессии последовательности ДНК в С. acremonium. Последовательность ,активирующа  транскрипцию и трансл цию C.acremonium, закодирована в 0,5 кв Sall-NCol рестрик- ционном фрагменте плазмиды .

Итак, осуществлено клонирование ин- тактной функциональной последовательности ДНК Cephalosporium acremonlum, котора  кодирует не только аминокислотную последовательность синтезазы изопе- нициллина N, но также последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию изопенициллин-М-синтетазы в С.acremonlum, IPS ген содержит последовательность , расположенную после клонирующего участка и ответственную за сигналы окончани  транскрипции мНРК полиадени- лировани  и процессинга. Обычно последовательности , ответственные за окончание транскрипции, полиаденилирование мРНК и процессинг содержатс  в участке 50 вр после стоп-кодона. 0,5 KB BamHI - Pst I фрагмент, который содержит IPS карбокси- терминальную, кодирующую ДНК и его последующие последовательности, также содержит сигналы окончани  транскрипции и мРНК полиаденилировани  и процессинга IPS гена.

Плазмиду pPS 27 конструируют путем объединени  1,4 KB BamHI -Xho I рестрик- ционного фрагмента плазмиды и Sal l-BamHI плазмиды pVC8 (перекрывани  Sal и Xhot совместимы) до получени  плазмиды рИЗЗб.

Плазмиду PIT336 расщепл ют рестрик- ционным ферментом Pstl и рециркул ризу- ют дл  исключени  всех последовательностей ДНК Cephalosporium из плазмиды за исключением 0,5 KB BamHI - Pst I рестрикцион- ного фрагмента, который содержит сигналы окончани  транскрипции и мРНК полиаденилировани  и процессинга IPS гена до получени  плазмиды pPS35.

Затем плазмиду pPS 35 расщепл ют ре- стрикционным ферментом Hind III и 2,3 кв Hind III рестрикционных фрагментом плазмиды pPS 29, который содержит последовательность , активирующую транскрипцию и трансл цию IPS гена, и ген, придающий устойчивость к гидромицину, включают в Hind III- гидролизованную плазмиду pPS 35 в нужной ориентации до получени  плазмиды pPS 27.

Производное плазмиды pPS 27 конструируют , выдел   2,3 KB Hind 111 и 0,5 кв Hind III- Bam HI рестрикционные фрагменты плазмиды pPS27, и объедин ют эти фрагменты с 5,9 кв Bg III - Hind III фрагментом плазмиды pIT 335 до получени  плазмиды pPS 34. Плазмида pPS 34 содержит как ген, придающий устойчивость к гидромицину, так и ген, кодирующий синтетазу изопени- циллина N, контролируемый регул торными элементами IPS гена.

Плазмиду PIT 356 используют п качестве исходного материала дл  конструировани  плазмиды, котора  интегрируетс  геном Cephalosporium acremonium в районе гена

изопенициллин-N- синтетазы.

Плазмиду pPS 37 используют дл  трансформации штамма С. acremonium, в результате получают мутанты этого штамма, дефектные по гену IPS, если плазмида pPS

0 37 интегрирует в кодирующий участок IPS гена. Плазмиду pPS 37 конструируют путем клонировани  3,45 кв Hind HI фрагмента плазмиды pPS 21 А, который содержит ген, придающий устойчивость к гидромицину,

5 под контролем последовательности IPS гена в плазмиду , обработанную Nru I. Плазмида рИЗЗб имеет единственный Nru I сайт, расположенный в участке IPS. Включение 3.45 кв Hind - III фрагмента, который

0 имеет тупой конец после обработки ферментом Кленова, в Nru l-гидролизованную плазмиду рИЗЗб приводит в действительности к получению двух плазмид, обозначенных как pPS 37 и pPS 37.1%которые отличаютс  толь5 ко по отношению к ориентации включенного фрагмента. Обе плазмиды - плазмида pPS 37 и плазмида pPS37.1 пригодны дл  трансформации С. acremonlum и получени  устойчивых к гидромицину и с нехваткой IPS

0 трансформантов.

Изобретение иллюстрируетс  следующими примерами.

П р и м е р 1. Культура Е. coll K12 J А 221/р1Т335 и выделение плазмиды .

5 А. Культура Е .coll K12JA221/p|T335.

Лиофильную E.coll K12 JA221/plT335 получают из Northern Regional Research Laboratories, Reoria, HHnois под регистрационным номером NRR L B-15960.

0 Один литр L-бульона (10 г триптона, 10 г NaCI и 5 г дрожжевого экстракта на литр), содержащий 50 мкг/мл ампициллина, засевают культурой E.coli K12 J А221/р1Т335 и инкубируют в воздушном шейкере при 37°С

5 до достижени  оптической плотности при 590 нм (О.Д. 59о) 1 единицы поглощени . В это врем  к культуре добавл ют 150 мг хло- рамфеникола. Инкубирование продолжают около 16ч, добавление хлорамфеникола ин0 гибирует синтез протеина, но не подавл ет плазмидную репликацию.

В. Выделение плазмиды . Культуру, полученную в примере IA, центрифугируют в роторе со скоростью 6000

5 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Полученную надосадочную жидкость сливают, а клеточный остаток промывают в 40 мл ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCI, рН 7,5 10 мМ NaCI и 1, мМ ЕДТА), а затем снова осаждают. После повторного сливани  надосадочной

жидкости клеточный остаток замораживают в бане со смесью сухой лед-этанол, а затем оттаивают. Отта вший клеточный сгусток повторно суспендируют в 10 мл раствора 25% сахарозы и 50 мМ ЕДТА. Затем добав- л ют и перемешивают 1 мл 5 мг/мл лизо- цимного раствора, 3 мл 0,25 М ЕДТА, рН 8,0 и 100 мкл 10 мг/мл R МАзы А, раствор инкубируют на льду в течение 15 мин. 3 мл лизи- рующего раствора, полученного при смешивании 3 мл 10% Тритон-Х 100, 75 мл 0,25 М ЕДТА, рН 8,15 мл 1М Трис-HCI, рН 8,0 и 7 мл воды, добавл ют к клеткам, обработанным лизоцимом, перемешивают и полученный раствор инкубируют на льду в течение еще 15 мин Лизированные клетки замораживают в бане со смесью сухой лед- этанол, а затем оттаивают.

Клеточные осколки удал ют из раствора центрифугированием при 25000 об/мин в течение 40 мин в SW 27 роторе и экстрагированием буферированным фенолом. После добавлени  30,44 г CSCI и 1 мл 5 мг/мл раствора этидиумбромида объем раствора устанавливают 40 мл и помещают в кювету VTi 50 ультрацентрифуги. После герметизации кюветы раствор центрифугируют в VTI 50 роторе при 42000 об/мин в течение 16ч. Полученную плазмидную полосу визуализируют , облуча  ультрафиолетовым светом, выдел ют, а затем помещают в VTi 75 кювету и ротор и центрифугируют при 50000 об/мин в течение 16 ч. Все необходимые изменени  в объеме осуществл ют, добавл   TES, содержащий 0,761 г/мл CSCI, Плаз- мидную полосу снова выдел ют, экстрагируют насыщенным солевым изо- пропанолом дл  удалени  этидиумбромида и разбавл ют 1 : 3 TES буфером. Затем к раствору добавл ют два объема этанола и инкубируют в течение ночи при -20°С. Плазмидную ДНК таблетируют центрифугированием раствора в SS 34 роторе в течение 15 мин при 10000 об/мин.

1 мг плазмидной ДНК получен- ной таким способом, суспендируют в 1 мл ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCI, рН 8,0 и 1 мМ ЕДТА) и хран т при -20°С.

П р и м е р 2. Конструирование плазми- ды . А, Культура Е соМ К12 PV308/pC Z106 и выделение плазмиды pCZ106.

Лиофил культуры E.coll K12 PV308/pCZ106 получают из Северных региональных исследовательских лабораторий, Пеори , Иллинойс, под регистрационным номером № RR LB-15959. Лиофил используют дл  инокулировани  1 л L-бульона, содержащего 50 мкг/мл канэмицина, а затем инокулированный бульон инкубируют при 25°С в воздушном шнейкере до О.Д. 590

между 0,5 и 1,0 ед. поглощени . Когда эти значени  дл  культуры достигает интервала 0,5-1,0 ед, поглощени  в оптической плотности , температуру повышают до 37°С и инкубирование продолжают в течение 2-6 ч. Репликон неограниченного размножени , как было указано ранее, чувствителен к температуре и тер ет контроль за числом копий при 37°С. Инкубировани  при 37°С в течение 2-6 ч достаточно дл  неконтролируемой репликации.

После инкубировани  при 37°С в течение 2-6 ч клетки собирают и выдел ют плаз- йиДную ДНК pCZ106. Получают около 5 мг плазмидной ДНК pCZ106 и суспендируют в 5 мл ТЕ буфера.

В. Ncol и BamHI расщепление плазмиды pCZ106 и выделение 8,7 KB Ncol-Ncol и 1,6 KB Ncol-BamH рестрикционных фрагментов плазмиды pCZ106.

Приблизительно 25 мкг, что соответст- вует25 мкл, плазмидной ДНК pCZ106 добавл ют и перемешивают с 10 мкг 10Х BamHI реакционного буфера - 1,5 М NaCt, 60 мМ трис-HCI, рН 7,9, 60 мМ MgChz мг/мл бычьей сыворотки альбумина (BSA). 5 мкл (50 единиц) рестрикционного фермента BamHI, 5 мкл (50единиц)рестрикционного фермента Ncol и 55 мкл Й20. Полученный реакционный раствор инкубируют при 37°С в течение 4 ч, после чего реакци  практически завершаетс .

Ncol-BamHI реакционную смесь обрабатывают электрофоретически на 1%-ном агарозном геле до четкого отделени  целевых фрагментов 1,6 KB llcol-BamHI и 8,7 KB Ncol-Ncol от другого продукта расщеплени  , 0,3 кв рестрикционного фрагмента. Визуализацию обработанной электрофорезом ДНК осуществл ют подкрашиванием гел  в разбавленном растворе (0,5 мкг/мл) этидиумбромида и экспонированием подкрашенного гел  длинноволновым ультрафиолетом . После определени  положени  целевых фрагментов в геле делают небольшую щель перед каждым из целевых фрагментов и в каждую щель помещают небольшие кусочки мембраны. При продолжении электрофореза ДНК нековалентно св зываетс  с ДЕАЕ мембраной. После того как целевые фрагменты св зывают с ДЕАЕ мембраной, эти мембраны извлекают и промывают буфером с малым содержанием соли (100 мМ KCI, 0,1 МЕДТАи20мМ Трис-HCi, рН 8). Затем каждую мембрану помещают в небольшую ампулу и погружают в буфер с высоким содержанием соли (1М NaCI, 0,1 мМ ЕДТА и 20 мМ Трис-HCI, рН 8) и инкубируют при 65°С в течение 1 ч дл  удлинени  ДНК из ДЕАД бумаги После инкубировани  при 65°С инкубационный буфер собирают и мембрану промывают концентрированным солевым раствором. Промывочный раствор сливают с инкубационным буфером перед сбором целевых фрагментов ДНК.

Обьем раствора ДНК с высоким содержанием соли устанавливают так, чтобы концентраци  NaCI была 0.25 М и затем добавл ют три объема холодного абсолютированного этанола. Затем полученные растворы смешивают и помещают при -70°С на 10-20 мин. После охлаждени  растворы центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. После еще одного осаждени  дл  удалени  остаточной соли ДНКтаблетки промывают этанолом, сушат, повторно суспендируют в 20 мкл буфера ТЕ и они содержат 5,0 мкг целевых 1,6 KB Ncol-BamHI и 8,7 KB Ncol-Ncol рестрикционных фрагментов плазмиды pCZ106. Полученные очищенные фрагменты отдельно раствор ют в 25 мкл ТЕ буфера и хран т при -20°С.

C.Ncol и BamHI гидролиз плазмиды PIT335 и выделение 1,5 KB Ncol-BamHI фрагмента, который кодирует изопеницил- лин-М-синтетазу,

Приблизительно 25 мкг соответствующих 25 мкл ДНК плазмиды расщепл ют рестриктазами Ncol и BamHI.

Nco -BamHI, обработанную ДНК, помещают на 1 %-ный агарозный гель и выдел ют целевой 1,5 KB Ncol-BamHI фрагмент. Получают приблизительно 5 мкг целевого фрагмента, суспендированного в 25 мкл ТК буфера, и хран т при -20°С.

Д. Окончательное конструирование плазмиды р1Т337.

5 мкл 1,6 KB Ncol-BamHI и 2,5 мкл 8,7 Ncol-Ncol фрагментов плазмиды рС1106ли- гируют с 5 мкл 1,5 KB Ncol-BamHI фрагмента плазмиды до получени  плазмиды . Реакционный объем составл ет 30 мкл и включает указанные фрагменты ДНК, 1,1 мкл ( 100 ед) Т4 ДНКлигазы, 3 мкл 10Х лигирующего буфера (0,05М Трис-HCI, рН 7,8, 100 мМ MgCb. 200 мМ дитиотреитола ДТТ, 10 мМ АТР, и 1 мг/мл BSA) и 13,4 мкл Й20. Реакционную смесь инкубируют при 15°С в течение 2 ч, после чего реакци  практически завершаетс . Лигированна  ДНК составл ет целевую плазмидную ДНК .

ПримерЗ. Конструирование E.coll К12 PV308/plT337 и анализ E.coli продуцирующей изопенициллин- синтетазы.

А. Конструирование Е .coll K12 PV308/plT337.

50 мл культуры E.coll K12 PV308/N;RR LB-15624/ в L-бульоне выращивают до

О.Д. ,5 единиц поглощени , Культуру охлаждают на льду в течение 10 мин и клетки собирают центрифугированием. Клетки повторно суспендируют в 25 мл

холодного 100 мМ СаС12 и инкубируют на льду в течение 25 мин. Клетки еще раз осаждают центрифугированием, повторно суспендируют в 2,5 мл холодного 100 мМ CaCl2 и инкубируют на льду в течение ночи. 200

0 мкл этой клеточной суспензии смешивают с легированной ДНК и инкубируют на льду в течение 20 мин, а затем клетки собирают центрифугированием. Клетки повторно суспендируют в 1 мл L-бульона и эту суспензию

5 инкубируют при 25° С в течение часа. Алик- вотные части смеси клеток помещают на L-агарные (L-бульон с 15 г/л агара) пластины , содержащие 50 мкг/мл канамицина и эти пластины инкубируют при 25°С. Транс0 форманты E.coli K12 PV308/plT337 провер ют отбором на устойчивость к канамицину и рестрикционным ферментным анализом плазмидной ДНК трансформантов . Плазмидную ДНК получают из

5 E.coll K12 PV308-plT337 трансформантов, но в меньшем количестве и опускают стадии CSCI-градиента.

В. Культура E.coll K12 PV308/plT337 дл  экспрессии активности синтетазы изопени0 циллина N.

Некоторые изол ты E.coll K12 PV308/plT337 инокулируют в 5 мл аликвот- ных частей L -бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, и эти культуры инкуби5 руют в воздушном шейкере при 25°С до тех пор, пока О.Д.590 не составил 0,2 ед. поглощени . Затем культуры перенос т в воздушный шейкер при 37°С и инкубируют в течение приблизительно б ч.

0 Спуст  6 ч инкубировани  при 37°С собирают по 1 мл каждой культуры и клетки спрессовывают центрифугированием. Клеточные лепешки по отдельности промывают 1 мл 10 мМ NaCI, а затем повторно суспен5 дируют в 1 мл IPS экстракционного буфера (0,05 М Трис-HCI, рН 8.00,01 М KCI и 0,01 М МдЗСм). Затем клетки обрабатывают ультразвуком импульсами по 5,6 с. Врем  между импульсами облучени  ультразвуком со0 ставл ет 60 с и полученную смесь выдерживают в бане лед-этанол во врем  этой процедуры. После обработки ультразвуком клеточную смесь центрифугируют дл  удалени  осколков, а затем используют непос5 редственно в анализе.

С. Анализ активности пенициллин-N- синтетаэы.

Реакцию контрол  фермента провод т в полном объеме 500 мкл. Дл  начала реакции 1 мл раствора 1,4 мМ д (L - а аминоадипил)

- L -цистеинил-Д-валина и 3,75 мМ ДТТ оставл ют реагировать при комнатной температуре в течение 30-60 мин дл  приведени  любых димерных трипептидов в мономерную форму. 50 мкл каждого из последующих исходных растворов помещают аликвотны- ми част ми в каждую контрольную ампулу (стерильные, стекл нные ампулы 13 х 100 мм):

500 мМТрис-HCI.pH 7.4, 100 мМ KCI, 100 мМ MgS04, 2 мМ FeSO-j и 6,7 мМ аскорбиновой кислоты. Затем добавл ют различные количества экстракта, разбавленного водой до объема 150 мкл. Около 100 мкл аликвотных частей раствора трипептида до- бавл ют затем в каждую ампулу, добавлением трипептида начинают реакцию. Каждую ампулу вращают после добавлени  субстрата . Ампулы с реакционной смесью помещают затем в шейкерную баню при вращении со скоростью 250 об/мин при температуре инкубировани  25°С. Врем  реакции составл ет 45 мин.

После продолжени  реакции 45 мин отбирают 2 образца по 100 мкл каждый и ка- пают в выемки в пластинах дл  биоанализа, а к остальному добавл ют 100 единиц пени- циллиназы А . Пенициллиназу А продают в ампулах по 100000 единиц, которые затем регидратируют до 5 мл. добавл   НаО. В каждую реакционную смесь добавл ют по 5 мкл (100 ед) регидратированной пеницилли- назы А , оставл ют реагировать в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем по 100 мкл каждого экстракта, обработанного пенициллиназой А, помещают в углубление на пластинке дл  биоанализа. Такую обработку пенициллиназой А провод т дл  проверки того, чтобы уверитьс , что зоны на пластине дл  биоан ализа св заны с наличи- ем пенициллина, а не цефалоспорина или других примесей.

Стандартную кривую пенициллина N получают, добавл   0,5, 2,0, 5,0, 10,0 и 20,0 мкг пенициллина N в углубление на пла- стинках дл  биоанализа. Активность пени- циллиназы А провер ют также добавл   5 мкл ферментного препарата к 200 мкл 0,2 мкг/мл пенициллина N,

Пластины дл  биоанализа состо т из К131 питательного агара, который получа-, ют, раствор   30,5 ВВ L Antibiotic Medium Б 1 литре деионизированной воды, довод  раствор до кипени , охлажда  до 70°С, а затем выдержива  в автоклаве 35 мин при 121°С и давлении 1,055 кг/см2. Далее пластины засевают 4 мл свежей ночной культуры Mlcrococcus luteus ATCC 9341/ на 700 мл агара. М. luteus выращивают в К544 питательном бульоне, который состоит из Difco

пептона 5 г, Difco дрожжевого экстракта 1,5 г, хлористого натри  3,5 г, безводного дву- замещенного калий фосфата 3,7 г, монокалий фосфата 1,3 г, Difco бычьего экстракта 1,5 в 1 л деионизированной воды. Раствор довод т до кипени , охлаждают до 25°С, довод т до рН 71н.НС1 или1н, NaOH.a затем выдерживают в автоклаве в течение 20 мин при 121°С и давлении 1,055 кг/см2 перед употреблением. Засе нный агар помещают в пластины 100 х 15 мм в количестве 15 мл засеваемого агара на пластину. Углублени  получают отсасыванием 5 мл пипеткой, каждое углубление было 10 мм диаметром.

После подготовки пластин образцы помещают в эти углублени , пластины помещают в инкубатор при 37°С на 18 ч.

Результаты анализа определ ют, измер   диаметр чистых поверхностей вокруг каждого углублени  с образцом, которое образовывалось из-за того, что М. luteus не могут расти в присутствии пенициллина.

Результаты этого анализа приведены ниже.

Хот  линейность анализа по измерению размера зон заметно падает, когда размер зоны превышает 21 мм, результаты анализа четко показывают, что E.coll K12 PV308/plT337 трансформанты экспресси- руют активность изопенициллин-М-синтета- зы, тогда как трансформанты E.coli K12 PV308/pCZ106 этого не делают.

Материал, продуцируемый E.coli, существенно более стабилен, нежели синтетаза изопенициллина N, полученна  из Cephalosporium acremonlum. Эта более высока  стабильность была впервые обнаружена в экспериментах по замораживанию и оттаиванию. Активность изопенициллин-М- синтетазы С aremqnium быстро инактивиру- етс  при замораживании и оттаивании, но фермент, продуцированный E.coli, достаточно устойчив к замораживанию и оттаива- нию. Веро тно, что более высока  стабильность св зана с разницей в обработке фермента между C.acremonium и E.coli. Так, изопенициллин-М-синтетаза, выделенный из C.acremonium, по-видимому, не содержит первых двух аминотерминальных аминокислотных остатков, метионина и глицина . E.coll продуцирует пептидазу, котора  отщепл ет аминотерминальный метиониновый остаток протеина, когда последующий остаток имеет относительно небольшую боковую цепь. В протеине IPS за аминотерминальным метионином следует остаток глицина, поэтому аминотерминальный метионин отщепл етс .

П р и м е р 4. Конструирование плазми- ды pPS20.

A.Получение Hlnd-lll гидролизованной плазмиды .

5 мкл ДНК плазмиды , что соответствует 5 мкг плазмидной ДНК, добавл ют и перемешивают с 5 мкл 10Х Hlnd-ll реакционного буфера (500 мМ Трис-НС, рН 8,0, 100 мМ MgCla. и 1 мг/мл BSA), 5 мкл ( 50 единиц) рестрикционного фермента Hind- ll и 35 мкл НаО. Полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 4 ч. Расщепленную Hlnd-lll плазмидную ДНК экстрагируют один раз фенолом , а затем экстрагируют один раз СНС1з. После этих экстракций расщепленную Hind-Ill плазмидную ДНК довод т до 0,25 М в NaCJ, разбавл ют двум  объемами абсолютированного этанола, охлаждают в бане сухой лед-этанол и затем осажденную ДНК собирают центрифугированием. В результате этой процедуры получают 5 мкг расщепленной Hlnd-lll плазмидкой ДНК, которую раствор ют в 10 мкл ТЕ буфера и хран т при -20°С.

B.Hlnd-lll обработка плазмиды и выделение 2,7 кв.

Hlnd-IM фрагмента плазмиды , который содержит ген, придающий устойчивость к гидромицину.

Выдел ют плазмиду PIT221 из E.cofi К12 А221/р1Т221. Около 50 мкг плазмиды расщепл ют в 100 мкл Х Hlnd-lll реакционного буфера со 100 единицами ре- стриктазы, После экстрагировани , осажде- ни  и повторного растворени  гмдролизованной Hind-Ill плазмиднсй ДНК, ДНК помещают на 1 %-ный ага- розный гель и осуществл ют электрофорез. Выдел ют целевой 2,7 KB Hlnd-Ш pe- стрикциоиный фрагмент плазммды , который содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию фосфоглицераткмназыдрожжей

Saccharomyces cerevlslae и кодирует фос- фотрансферазный фермент, который придает устойчивость к гидромицмну, и очищают от гел  и других продуктов расщеплени .

Описанным способом выдел ют около 5 мкг целевого 2.7 KB Hind-III рестрикционного фрагмента. Полученный очищенный фрагмент раствор ют в 10 мкл ТЕ буфера и хран т при -20°С.

C.Окончательное конструирование плазмиды pPS20.

Около 1 мкл Hlnd-il гидролизоваиной плазмидной ДНК и 4 мкл 2,5 KB Hind- III рестрикционного фрагмент плазмиды лигируют в 30 мкл лигирующего буфера со 100 единицами Т4 ДНК лигазы. Ли- гированна  ДНК составл ет целевую плазмиду pPS20.

2.7 KB Hind-lit рестрикционный фрагмент может включатьс  в плазмиду в любой из двух ориентации, так что лигиро- ванна  ДНК представл ет также и другую

плазмиду, обозначенную как плазмида pPS 20.1. Плззмида pPS20.1 функционально эквивалентна плазмиде pPS20 и отличаетс  от плазмиды pPS20 только в отношении ориентации 2,7 KB Hind-ill рестрикционного

0 фрагмента.

Д. Конструирование Е .coll K12 JA221/pPS20 и выделение ДНК плазмиды PPS20.

50 мл культуры E.coll K12 JA221(NRR

5 LB-15211) в L-бульоне выращивают до О.Д.590 пор дка 0,2, Культуру охлаждают на льду в течение 10 мин, а затем клетки собирают центрифугированием. Клеточный осадок повторно суспендируют в 25 мл

0 холодного 100 мМ CaClz и инкубируют на льду в течение 25 мин, Клетки еще раз выдел ют центрифугированием, осадок повторно суспендируют в 2,5 мл холодного 100 мМ СаСЬ и инкубируют на льду в течение ночи.

5 200 мкл этой клеточной суспензии смешивают с лигированной ДНК и инкубируют на льду в течение 20 мин. Затем полученную смесь инкубируют при 40°С в течение 2 мин, а затем 10 мин при комнатной температуре.

0 К клеточной смеси добавл ют 3 мл L-бульо- на и затем клетки инкубируют в воздушном шсйкере при 37°С в течение 2 ч. Аликвотные части клеточной смеси помещают на L-arap- ные (L-бульон с 15 г/л бульона) пластины,

5 содержащие 100 мкг/мл ампициллина, а затем пластины инкубируют при 37°С E.coli К12 J A221/pPS20трансформанты провер ют рестрикционным ферментным анализом плазмидной ДНК устойчивых к ампицилли0 ну трансформантов. Плазмидную ДНК получают из Е, coll K12JA221/pPS 20 и E.coll К12 J221/ppS20.1.

П р и м е р 5, Конструирование плазмиды pPS21.

5 А. Гидролиз Nco и обработка Кленова плазмиды ДН К и выделение полученного 0,85 кч фрагмента, который кодирует последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию Cephalosporlum

0 acremonium.

Приблизительно 50 мкл, что соответствует 50 мкг плозмидной ДНК, смешивают с 10 мкл ЮХВагпЖ буфера, 5 мкл (50 единиц) рестрикционного фермента Ncol и

5 35 мкл Н20. Полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 4 ч. Затем реакционную смесь довод т до 0,25 М в NaCI, разбавл ют двум  объемами абсолютированного этанола, охлаждают в течение 10 мин в бане со смесью сухой

лед-этанол и центрифугируют до получени  лепешки осажденной ДНК.

Плазмиду , расщепленную Ncol, раствор ют в 50 мкл IX буфера Кленова (40 мМ КР04 рН 7.5, 6,6 мМ MgCl2, 1,0 мМ 2-мер- каптоэтанола, 33 мкм dATP, 33 мкм dCTP, 33 мкМ dGTP и 33 мкМ dTTP, 2 мкл (10 единиц) крупного фрагмента E.coll ДНК полимеразы I, известной как полимераза Кленова, добавл ют и смешивают с ДНК, а полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение одного часа. Реакцию заканчивают экстрагированием буферированным фенолом . Плазмидную ДНК, обработанную Ncol и фрагментом Кленова, помещают затем на 1%-ный агарозный гель дл  обработки электрофорезом. Из гел  выдел ют 0,85 кв рестрикционный фрагмент, который содержит последовательность, активиру- ющую транскрипцию и трансл цию Cephalosporiumacremonium гена IPS. Получают около 4 мкг целевого фрагмента и суспендируют в 10 мкл ТЕ буфера.

B.Конструирование промежуточной плазмиды pPS 19.

Один мкг плазмиды р(Т221 раствор ют в 5 мкл 10 X Xmal буфера (250 мМ NaCI, 60 мМ Трис-HCI, рН 7,5, 60 мМ MgCl2, 60 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл BSA), 43 мкл НаО и 2 мкл (10 единиц) рестрикционно- го фермента Xmal, Полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 4 ч. Реакцию заканчивают экстракцией фенолом . После следующей экстракции реакционной смеси Xmal эту смесь довод т до 0,25 М в NaCI, разбавл ют двум  объемами этанола, охлаждают в течение 10 мин в бане сухой лед-этанол и осаждают, Xmal- гидролизованную плазмидную ДНК собирают центрифугированием.

Xmal расщепленную плазмидную 221 ДНК повторно раствор ют в 100 мкл IX легирующего буфера, содержащего 500 единиц Т4 ДНК лигазы. Реакционную смесь ли- гировани  инкубируют в течение приблизительно 16ч при 12°С, а затем используют дл  трансформации Е coli K12 J А 221. Устойчивые к ампициллину плазмид- ные pPS 19 трансформанты идентифицируют рестрикционным фермент ным анализом плазмидной ДНК трансформантов,

C.BamHI расщепление и обработка Кленова плазмидной pPS19 ДНК и выделение фрагмента 7,7 кв.

50 мкг плазмидной pPS 19 ДНК расщеп- л ют рестрикционным ферментом BamHI и обрабатывают ферментом Кленова за исключением того, что используют рестриктазу BamHI вместо Ncol рестриктазы дл  расщеплени  ДНК плазмиды pPS 19.

Расщепленную BamHI. обработанную по Кленову ДНК плазмиды pPS 19, помещают на 1%-ный агарозный гель и 7,7 кв фрагмент выдел ют и очищают Получают около 5 мкг целевого фрагмента, раствор ют его в 10 мкл ТЕ буфера и хран т при температуре около -20°С.

Д. Окончательное конструирование плазмиды pPS 21.

2 мкл 0,85 кв фрагмента лигируют с 2 мкл 7,7 кв фрагмента в 30 мкл IX буфера лигировани , содержащего 500 единиц Т4 ДНК лигазы. Реакционную смесь дл  лигировани  инкубируют при 12°С в течение 16 ч и лигированна  ДНК представл ет ДНК плазмиды pPS 21.

Е. Конструирование E.coli K12 J A221/pPS21.

Лигированную ДНК используют дл  трансформации Е .coli K12 JA221. Устойчивые к ампициллину трансформанты скрини- руют по наличию плазмиды pPJ21 рестрикционным ферментным анализом плазмидной ДНК трансформантов. Так как 0,8 кв фрагмент включает 7 7 кв фрагмент плазмиды pPS 19 в одной из двух ориентации и так как только одна ориентаци  правильно располагает последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию Cephalosporlum acremonlum дл  экспрессии гена, придающего устойчивость к гидромицину, только половина трансформантов будет целевой E.coli K12 JA221/pPS 21. Один такой Е .coll K12 J A221/pPS 21 трансформант используют дл  получени  плазмидной pPS 21 ДНК.

Пр и м е р 6 Генетическа  трансформаци  Cephalosporium acremonium плазмида- ми рР 520и рР S21.

Ампулу спор (ппиблизительно 109 конидий в 1,5 мл консервирующей среде: 5% лактозы, 10% глицерина и 0,1% Твин 80) либо лиофилизируют, либо берут из хранилища в жидком ачоте и оттаивают при комнатной температуре, разбавл ют в 5 мл стерильного физиологического раствора. Около 0,1 мл этой суспензии используют дл  инокулировани  каждого из приблизительно 50 слантов, содержащих 20 мл соевого агара с Триптиказой в качестве среды. Перед инокулированием среде дают подсохнуть до тех пор, пока влага на поверхности уже не будет видна. Инокулированные клетки инкубируют в течение около 4 дней при 25°С, Около 10 мл консервирующей среды добавл ют дл  роста мицели , который покрывает поверхность среды. Клетки выращивают дл  суспендировани  конидий и конидиальную суспензию собирают и аликвотные части по 10 мл замораживают при -80°С. Замороженна  конидиальна  суспензи  медленно тер ет жизнеспособность и ее не следует использовать после 3 мес цев хранени  при - 80°С.

Выращивание клеток дл  получени  протопластов.

Приблизительно 106 мл водной среды в 500 мл шейкере инокулируют клетками от 10 мл замороженной конидиальной суспензии. Клетки получают центрифугированием (10 мин х 2600 об/мин), а затем непосредственно суспендируют в водной культуральной среде. Декантирование надосадочной жидкости провод т перед суспендированием, так как лактоза и глицерин вредно вли ют на рост клеток. Колбу, содержащую суспендированные клетки, помещают в гироскопический шейкер с вод ной баней и инкубируют при 29-30°С в течение 24 ч при 285 об/мин. Рекомендуема  температура 29-30°С на стадии культивировани  особенно предпочтительна дл  получени  трансформируемых протопластов, но возможны также и более низкие температуры 25°С.

Водную культуральную среду получают следующим образом.

100 мл раствора А помещают в 500 мл шейкер, колбу закрывают коммерческой пробкой и помещают в автоклав при 121°С на 20 мин. 2 мл раствора В и 4 мл раствора С добавл ют затем к раствору А дл  получени  водной культуральной среды.

Раствор А. Сахароза, 36 г/л, L - аспара- гин 7,5 г/л, КН2Р04 15 г/л, К2НР04 21 г/л, Na2S04 0,75 г/л, MgS04 7Н20 18 г/л, 0,06 г/л, солевой раствор 1 мл/л, природный рН. Солевой раствор: Fe/NH4//SCM/2 хбНаО 15г/л, MgSCM 4НаО Зг/л, ZnSCM х7Н20 3 г/л, CuSCM 5 Н20 0.8 г/л.

Раствор В. Глюкоза 108 г/л (автоклав пои 121°С, 30 мин)

Раствор С. Сахароза 25 г/л, жидкость от замочки зерна (4% вес/объем /азот) 12,5 мл, ацетат аммони  5,5 г/л, СаСОз 5 г/л, рН устанавливают 6,5 КОН, и автоклав при 121°С в течение 30 мин.

Получение Cephalosporium протопластов .

Клетки 24-часовой культуры собирают фильтрованием с подсосом и суспендируют е буфере рН 7,1 0,1 М лимонной кислоты и 0.2 М двухосновного натрийфосфата, к ним добавл ют дитиотреитол до концентрации 0.01-М. Добавл ют достаточно буфера дл  получени  окончательной концентрации 1 г (взвешивают после фильтровани  с подсосом ) клеточной массы на 20 мл буфера. Клеточную суспензию помещают в

гироскопический шейкер с вод ной баней в 50 мл колбу и инкубируют при 29-30°С в течение 90 мин при(140 об/мин. Клетки, обработанные дитиот реитолом, промывают водой, а затем повторно суспендируют в растворе фермента (25 мг/мл бета-глюкуро- нидазы в буфере рН 6,35, дополненном 0,8 М NaCI и 0,02 М МдЗСм). Окончательна  клеточна  концентраци  составл ет 1 г обработанной клеточной массы на 10 мл раствора фермента. Затем клеточную суспензию помещают в гироскопический шейкер с вод ной баней при 29-30°С на 3 ч при 120 об/мин, Суспензию протопластов разбавл ют 4 объемами промывочного раствора (0,8 М NaCI и 0,02 М MgS04), а затем фильтруют под действием силы т жести через два сло  бумажного полотенца. Фильтрат , содержащий протопласты, центрифугируют при комнатной температуре в течение 5 мин при 2600 об/мин. На- досадочную жидкость декантируют и протопласты суспендируют в 10 мл раствора. После повторени  процедуры промывки дважды, протопласты повторно суспендируют в достаточном количестве 0,8 М NaCI до достижени  концентрации от 2 до 3 х 108 протопластов на мл по гемацитометру.

Трансформируют 1 мл суспензии Cephalosporium протопластов (от 2 доЗх 108 на мл) в 0,8 М NaCI, добавл ют к 0,005 мл свежеперегнанного ДМСО, а затем довод т до 80 М CaCl2. Около 20 мкг трансформированных плазмид либо pPS 20, либо pPS 21 в зависимости оттрансформации и полиэти- ленгликоль 4000 (20% вес/объем в воде) добавл ют к суспензии протопластов до достижени  объема смеси 10 мл. Полученную смесь инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 700 об/мин в течение 5 мин, после чего центрифугируют со скоростью 2500 об/мин в течение 10 мин. Лепешку протопластов суспендируют в 1 мл 0,8 М NaCI. Аликвотные части (0,1 мл) помещают на поверхность среды соевый агар-трипти- каза (BBL), котора  была обогащена 10,8% сахарозы дл  осмотической стабилизации протопластов. Затем чашки Петри инкубируют при 15°С в течение 24 ч, в каждую чашку Петри добавл ют 4 мл ожиженного агара (0,41 % вес/объем при 43°С), содержащего 0,8 М хлористого натри  и достаточно гидромицина дл  достижени  окончательной концентрации 100 мкг/мл. После отверждени  поверхностного сло  чашки Петри инкубируют при 25°С в увлажненной камере . Хот  колонии трансформантов достаточного размера дл  субкультуры наблюдают через 12 дней после трансформации, более

медленный рост трансформантов может зан ть и 60 дней дл  достижени  подход щего размера субкультуры. Абортивные трансформанты легко отличимы от стабильных трансформантов, так как абортивные трансформанты не растут в субкультуре в свежей среде, содержащей 100 мкг/мл гидромици- на. Cephalosporium acremonlum pPS 20 трансформанты экспрессируют активность фермента с гораздо более высоким уровнем по сравнению с С. acremonlum трансформированными плазмидзми .

Cephalosporium acremonlum pPS 21 трансформанты устойчивы к гидромицину, что указывает на функциональность последовательности , активирующей транскрит цию и трансл цию С. acremonlum насто щего изобретени .

Пример. Конструирование плазмид pPS21A, pPS22, PPS23, pPS23.1, pPS24, pPS25npPS25.1.

А. Конструирование промежуточных плазмид pPS23 и pPS23.1.

Получение BamHI - гидролизованной плазмиды pPUCS.

Около 5 мкг плазмиды pUC8 раствор ют вбмкл 10Х BamHI рестрикционногобуфера и 40 мкл НзО. Около 5 мкл ( 50 единиц) рестрикционного фермента BamHI добавл ют к раствору ДНК, а полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Реакцию заканчивают экстрагированием буферированным фенолом с последующей экстракцией хлороформом. BamHI - расщепленную плазмидную pUC8 ДНК осаждают при добавлении №CI до концентрации 0,25 м, добавлени  2 объемов этанола и охлаждени  до -70°С на 10 мин. BamHI - гидролизованную плазмидную pUC8 ДНК собирают центрифугированием и повторно суспендируют в 5 мкл НаО.

Выделение 0,85 KB Ncol фрагмента плазмиды .

Около 10 мкг плазмиды р)Т335 раствор ют в 5 мкл 10 X BamHI буфера и 40 мкл НаО. Около 5 мкл ( 50 единиц) рестрикционного фермента Ncol добавл ют к раствору ДНК и полученный реакционный раствор инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Затем реакционную смесь помещают на 1 %-ный агарозный гель и выдел ют целевой 0,85 KB Ncol рестрикционный фрагмент, который содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансл цию IPS гена.

Около 1 мкг целевого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкг Н20.

Получение линкера, используемого при конструировании плазмиды pPS 23.

Синтезируют одиночные нити следующих линкеров в автоматизированном ДНК синтезаторе:

5 - CATGAACAAG - 3 53-TTCTTCCTAG-5

Около 75 пикомолей каждой одиночной нити линкера отдельно раствор ют в 22,5 мкл НаО и 2,5 мкл лигазного буфера. Около 1 мкл ( 10 единиц) Т4 ДНК киназы добавл 0 ют к каждому раствору однонитевой ДНК и реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 10 мин. После реакции киназы реакционные смеси инкубируют при 70°С в течение 15 мин. Затем дл  отжига однони5 тевой ДНК до образовани  линкера смешивают две реакционные смеси, инкубируют при 65°С в течение 10 мин, инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем инкубируют при 4°С в течение ночи.

0 Окончательное конструирование плазмид pPS 23 и pPS23.1.

Один мкл BamHI расщепленной плаз- мидной pUC8 ДНК добавл ют к смеси 4 мкл 0,85 KB Ncol рестрикционного фрагмента

5 плазмиды и 10 мкг отожженного линкера . Около 4 мкл 10Х лигазного буфера, 2 мкл (1500 единиц) Т4 ДНК лигазы и 29 мкл Н20 добавл ют к смеси ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 4°С в

0 течение ночи. Лигированна  ДНК составл ет целевые плазмиды pPS 23 и pPS 23.1.

50 мл культуры E.coli K12 М109, доступных из Pharmacia P-L Biochemical, в L-буль- оне выращивают до значени  О.Д.590

5 приблизительно 0,5 единиц поглощени . Культуру охлаждают на льду в течение 10 мин и клетки собирают центрифугированием . Клеточный осадок повторно супендиру- ют в 25 мл холодной 100 мМ CaCte и

0 инкубируют на льду в течение 25 мин. Клетки еще раз осаждают центрифугированием и повторно суспендируют в 2,5 мл холодного 100 мМ CaCl2 и инкубируют на льду в течение ночи.

5 200 мкл этой клеточной суспензии смешивают с лигированной ДНК. полученной ранее, и инкубируют на льду в течение 20 мин. В конце этого периода клетки помещают в вод ную баню при 42°С в течение 2

0 минут, а затем возвращают на лед еще на 10 мин. Клетки собирают центрифугированием , повторно суспендируют в одном мл L- бульона и инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Аликвотные части клеточной смеси поме5 щают на 1 -эгарные(1--бульон с 15 г/л агара) пластины, содержащие 100 мкг ампициллина (мл, 40 мкг и 40 мкг IPTG/мл. Пластины инкубируют при 37°С в течение ночи. Колонии, которые содержат плазмиду без пставки. такие, как Е. coll K12 JM109/p

U68, про вл ютс  синими на этих пластинах . Колонии, которые содержат плазмиду со вставкой, такой, как Е. coll K12 JM109/pPS23, - белого цвета. Некоторые белые колонии отбирают и скринируют ре- стрикционным анализом их плазмидной ДНК на наличие 0,85 KB BamHI рестрикци- онного фрагмента, содержащего IPS активирующую последовательность. Получают плазмиднуюДНКизЕ.соП К12 JM109/pPS 23 и E.col K12 JM109/pPS23.1.

В.Выделение 0,85 KB BamHI рестрик- ционного фрагмента плазмиды pPS 23.

Около 50 мкг плазмидной ДНК раствор ют в 15 мкл 10Х ВатН реакционного бу- фера и 125 мкл НаО. Около 10 мкл (100 единиц) рестрикционного фермента BamHI добавл ют к раствору ДНК, и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. BamHI - расщепленную плаз- мидную pPS 23 ДНК помещают на 1% ага- розный гель и 0,85 KB BamHI рестрикционный фрагмент, который содержит активирующую последовательность IPS гена. Около 5 мкг целевого фрагмента пол- учают и суспендируют в 10 мкл НгО.

С. Получение BamHI - расщепленной плазмидной pPS 19 ДНК.

Около 5 мкл плазмидной pPS 19 ДНК раствор ют в 10 мкл 10Х BamHI реакцией- ного буфера и 35 мкл НаО. Около 5 мкл (50 единиц) рестрикционного фермента BamHI добавл ют к раствору плазмидной pPS 19 ДНК и полученный реакционный раствор инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Реакци- онную смесь BamHI-расщепленной плазмидной pPS 19 ДНК экстрагируют 1 раз буферированным фенолом, а затем дважды фенолом. Затем ДНК осаждают, собирают центрифугированием и повторно суспенди- руют в 10 мкл Н20.

Д. Окончательное конструирование плазмид pPS 21 A, pPS22, pPS24, pP25 и pPS 25.1.

Около 1 мкл 0,86 KB BamHI рестрикци- онного фрагмента добавл ют к 1 мкл BamHI - расщепленной плазмидной pPS 19 ДНК, 3 мкл 10Х лигазного буфера, 2 мкл Т4 ДНК лигазы и 23 мкл НаО. Полученную смесь реакции лигировани  инкубируют при 15°С в течение ночи. Лигированна  ДНК составл ет целевые плазмиды pPS21A, pPS24, рР825ирР825.1.

Лигированную ДНК используют дл  трансформации E.coli K12 С600 штамма, до- ступного из Американской коллекции типовых культур, Роквил, МД 20852 под регистрационным номером АТСС 33525. Трансформированные клетки помещают на L-агарные пластины, содержащие 100

мкг/мл ампициллина, и эти пластины инкубируют при 37°С в течение ночи.

Отдельные колонии снимают с трансформированных пластин, культивируют и используют дл  получени  плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК анализируют ре- стрикционным ферментным анализом. Нижеприведенна  схема демонстрирует соответствующие рестрикционные ферментные расщеплени , которые можно использовать дл  определени  плазмид.

Плазмиды pPS 21A, pPS25.1 и pPS 25 используют дл  трансформировани  Cephalosporlum acremonium.

C.acremonlum pPS21A, C acremonium pPS 25.1 и С. acremonium pPS25 трансформанты устойчивы к гидромицину. Плазмиды pPS 22 и pPS 24 используют дл  трансформации С. acremonium, но эти плазмиды трансформируют C.acremonlun в устойчивые к гидромицину с гораздо меньшей частотой , чем это делают плазмиды pPS 21 А, pPS 25.1 и pPS 25 потому, что плазмиды pPS 22 и pPS 24 должны интегрировать в C.acremonlum геном в нужном положении дл  геномной последовательности активирующей С. acremonium дл  управлени  экспрессией гена, придающего устойчивость к гидромицину,

ПримерЗ Конструирование плазмид pPS 28 и pPS 29.

Около 20 мкг плазмидной pPS 21А ДНК раствор ют в 10 мкл 10Х Pst I реакционного буфера(1.0 М NaCI, ЮОмМТрис-HCI, рН 7,5, 100 мМ MgCl2 и 1 мг/мл BSA/ и 88 мкл НаО. Около 2 мкл (150 единиц) рестрикционного фермента Pst I добавл ют к раствору ДНК и реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 5 мин, а затем реакцию завершают инкубированием при 70°С в течение 10 мин. Частично расщепленную Pst I плазмидную

pPS 21A ДНК помещают на агарозный гель и после электрофореза и подкрашивани  гел  наблюдают следующие фрагменты: 8,5 KB (линеаризированна  плазмида), 8,0 кв, 7,5 кв, 7,0 кв, 6,6 кв, 6,1 кв, 5,2 кв, 3,3 кв, 2,3 кв, 1,9 кв, 1,5 кв, 1,0 кв, 0,5 кв, 6,6 кв и 6 ,1 кв Pst I рестрикционные фрагменты, выдел ют около 0,5 мкг каждого фрагмента.

6,6 кв Pst I рестрикционный фрагмент раствор ют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и

25мкл НаО. Около 2 мкл Т4 ДНК лигазы добавл ют к раствору ДНК и полученный реакционный раствор инкубируют при 15°С в течение ночи. Лигированна  ДНК составл ет целевую плазмидную ДНК, которую используют дл  трансформации Е .coll K12 С 600. Аналогичным образом 6,2 кв Pst I рестрикционный фрагмент циркул ризуют лй- гированием до получени  плазмиды pPS29, которую также трансформируют в E.coll K12 С600.

Плазмиды pPS 28 и pPS 29 используют дл  трансформации Cephalosporlum acremonlum.

C.acremonlum pPS 28 и C.acremonium pPS 29 трансформанты демонстрируют фенотип , устойчивый к гидромицину. и плаз- мидные pPS 28 и pPS 29 ДНК трансформируют C.acremonlum устойчивый к гидромицину с высокой частотой.

П р и м е р 9. Конструирование плазмид рР526ирР526.1.

Около 20 мкг плазмиды pPS 21А раствор ют в 10 мкл 10Х Hind - III реакционного буфера и 85 мкл . Около 5 мкл (50 единиц ) рестрикционного фермента Hind-Ill добавл ют к раствору ДНК и полученный раствор инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Hind-Ill - расщепленную плазмидную pPS21A ДНК помещают на 1% агарозный гель и провод т электрофорез до тех пор, пока 3,45 кв, 3,16 кв, 1,2 кв и 69 кв Hlnd-lll рестрикционные фрагменты не станов тс  четко выделенными на геле. Выдел ют Hind-Ill рестрикционный фрагмент. Около 5 мкг целевого 3,45 кв Hind-Ill рестрикционного фрагмента получают и суспендируют в 10 мкл Н20.

Около 2 мкл 3,45 кв Hind-lll рестрикционного фрагмента плазмиды pPS 21А добавл ют к 1 мкл Hlnd-lll расщепленной плазмидной ДНК, 3 мкл 10Х лигазного буфера, 22 мкл Н20 и 2 мкл Т4 ДНК лигазы . Полученный раствор реакции лигировани  инкубируют при 15°С в течение ночи. Лигированные ДНК составл ют целевые плазмиды pPS 26 и pPS 26.1. Лигированные ДНК используют дл  трансформации E.coll K12 С600.Е. coll К 12 С600/ pPS

26и E.coll с К12 С 600/pPS 26.1 трансформанты идентифицируют по их фенотипу, устойчивому к ампициллину и рестрикцион- ным ферментным анализом их плазмидной ДНК.

5Плазмиды pPS 26 и pPS 26.1 используют дл  трансформации Cephalosporlum acremonlum. Плазмиды pPS26 и pPS 26.1 трансформируют C.acremonlum в устойчивый к гидромицину с высокой частотой, а С.

0 acremonium pPS 26 и С, acremonlum pPS 26.1 трансформанты продуцируют значительно больше фермента по данным, полученным при измерении зон подавлени  роста Mlcrococcus luteus, нежели их нетрас5 формированные дубликаты/

Пример 0. Конструирование плазмид pPS 30. pPS 30.1, pPS 31 и pPS 31.1.

A.Выделение 3,7 ХтА I рестрикционного фрагмента из плазмиды pPS6.

0 Около 10 мкг плазмиды pPS 6 раствор ют в 20 мкг ЮХта I реакционного буфера (250 мМ NaCI, 100 мМ Трис-HCI рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 100 мМ 2-меркаптоэтанола и Г мг/мл BSA) и 165 мкл Н20, Около 15 мкл (30

5 единиц) рестрикционного фермента Xma I добавл ют к раствору плазмидной pPS 6 и полученный реакционный раствор инкубируют при 37°С в течение 4 ч. Xma I - расщепленную плазмидную pPS б ДНК помещают

0 на 1 % агарозный гель и обрабатывают элек- трофоретически до тех лор, пока 3,7 Xma I рестрикционный фрагмент четко не выделитс  от остальных продуктов расщеплени . Около 5 мкг целевого 3,7 Xma / рестрикци5 онного фрагмента получают и суспендируют в 10 мкл Н20.

B.Окончательное конструирование плазмид pPS 30 и pPS 30.1.

0 Около 1 мкг плззмидной ДНК раствор ют в 2 мкл 10Х Xma I рестрикционного буфера и б мкл Н20. Около 2 мкл (6 единиц) рестрикционного фермента Xma I добавл ют к раствору плазмидной ДНК и получен5 ный реакционный раствор инкубируют при 37°С в течение 4 ч. Реакцию заканчивают экстрагированием буферированным фенолом с последующими двум  экстракци ми хлороформом. Затем реакционную смесь

0 осаждают, собирают центрифугированием и повторно суспендируют в 23 мкл Н20. Около 2 мкл этого 3.7 кв Xma I рестрикционного фрагмента плазмиды pPS 6.3 мкл 10Х лигазного буфера и 2 мкл Т4 ДНК лигазы

5 добавл ют к раствору Xma (-расщепленной плазмидной pPS21 А ДНК и полученный раствор дл  реакции лигировани  инкубируют при 15°С в течение ночи. Лигированна  ДНК составл ет целевые плазмиды рР S30 и pPS 30.1, которые отличаютс  только в отношении ориентации 3,7 KB Xma I рестрикцион- ного фрагмента.

E.coll K12 СбОО/pPS 30 и E.coll K12 C600/pPS 30.1 трансформанты идентифицируют по их фенотипу, устойчивому к ампициллину и рестрикционным ферментным анализом их плазменной ДНК.

Плазмиды рР530ирР530.1 используют также дл  трансформации Cephalosporium acremonium С. acremonlun (pPS 30 и С. acremonlum) pPS 30.1 трансформанты устойчивы к гидромицину.

С. Окончательное конструирование плазмид pPS31 и pPS31.1.

Плазмиды pPS 31 и pPS 31.1 конструируют , а затем трансформируют в E.coll K12 С600 и Cephalosporium acremonlum за исключением того, что в .качестве исходного материала используют плазмиду pPS 29, а не плазмиду pPS21A.

ПримерИ. Конструирование плазми- ды pPS 27.

А. Конструирование плазмиды рИЗЗб,

Около 1 мкг плазмиды pUC8 раствор ют в 2 мкл 10Х BamHI реакционного буфера и 16 мкл НаО. Около 2 мкл (20 единиц) ре- стрикционного фермента BamHI добавл ют к раствору плазмидной pUC8 ДНК, полученный реакционный раствор инкубируют при 37°С в течение 2 ч. BamHI - расщепленную плазмидную pUC8 ДНК осаждают, собирают центрифугированием и повторно суспендируют в 2 мкг 10Х Хва II реакционного буфера (1,5 М NaCI, 60 мМ Трис-HCI, рН 7,9. 60 мМ MgCI, 60 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл BSA) и 16 мкл Н20. Около 2 мкл (20 единиц) рестрикционного фермента Хва II добавл ют к раствору BamHI- расщепленной плазмидной pUC8 ДНК и полученный реакционный раствор инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Реакцию заканчивают, экстрагиру  фенолом с последующими двум  экстракци ми хлороформом. ХваП-BamHI - расщепленную плазмидную pSM8 осаждают , собирают центрифугированием и повторно суспендируют в 5 мкл НгО.

Около 10 мкг плазмиды р|Т355 раствор ют в 10 мкл 10Х BamHI реакционного буфера и 80 мкл НаО. Около 5 мкл (50 единиц) каждого из рестрикционных ферментов Xho I и BamHI добавл ют к раствору плазмидной р Т355ДНК| и полученный реакционный раствор инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Затем реакционную смесь помещают на 1 %-ный агарозный гель и провод т электрофорез до тех пор, пока 1,4 кв BamHI - Хва рестрикционный фрагмент не выделитс  от остальных продуктов реакции, которыми  вл ютс  5,6 KB, 1,3 кв и 0,01 кв фрагменты. 1,4 KB BamHI - Xeal рестрикционный фрагмент , который содержит сигналы окончани  транскрипции мРНК полиаленилировани  и процессинга IPS гена, выдел ют. Получают около 2 мкг целевого продукта и его суспендируют в 5 мкл Н20.

5мкл Sail-BamHI расщепленной плазмиды pUC8 добавл ют к 2 мкл 1,4 кв BamHI- Xho I рестрикционного фрагмента плазмиды ,3 мкл 10Х лигазного буфера , 18 мкл НаО и 2 мкл Т4 ДНК лигазы. Полученный реакционный раствор инкубируют при 15°С в течение ночи. Sail - Xhol перекрывани  совместимы с лигированием, но будучи один раз лигированы, ни Sail, ни

Xhol не будут отщепл ть ДНК по соединению . Лигированна  ДНК составл ет целевую плазмиду и ее используют дл  трансформации E.coll K12 RRIA M15 доступной из №RRL под регистрационным номером №RRLB-15440. Трансформированные клетки помещают на L-агарные пластины, содержащие 100 мкг ампициллина, 40 мкг/мл X - gal и 40 мкг/мл IPTG. Колонии, которые не показывают синего цвета на

трансформированных пластинах, культивируют , используют дл  получени  плазмидной ДНК и плазмидную ДНК анализируют рестрикционным ферментным анализом дл  идентификации E.coll K12 RRI

M15/plT336 трансформантов.

В. Конструирование плазмиды pPS 35. Около 2 мкг плазмиды рГГЗЗб раствор - ют в 2 мкл 10Х Pstl реакционного буфера и 17 мкл НаО. Около 1 мкл (10 единиц) рестрикционного фермента Pst I добавл ют к раствору ДНК и полученный реакционный раствор инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Реакцию заканчивают экстрагированием фенолом с последующими двум 

экстракци ми хлороформом. Pst I - расщепленную плазмидную рПГЗЗб ДНК осаждают, собирают центрифугированием и повторно суспендируют в 86 мкл НаО.

Около 10, мкл 10Х лигазного буфера и 4 мкл Т4 ДНК лигазы добавл ют к раствору Pst I - расщепленной плазмидной ДНК и полученный реакционный раствор инкубируют при 15°С в течение ночи. Лигированна  ДНК составл ет целевую плазмиду pPS 35 и ее используют дл  трансформации E.coll K12JA221, доступный из №RRL под регистрационным номером 1 Ь 1-В-15211.Трансформированныеклетки помещают на L-агарные пластины, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Выдел ют некоторые устойчивые к ампициллину колонии и используют дл  получени  плазмидной ДНК. Целевые E.coll K12 JA221/pPS35 трансформанты идентифицируют рестрикционным ферментным анализом их плаз- мидной ДНК.

С.Окончательное конструирование плазмиды pPS 27.

Около 2 мкг плазмиды pPS 35 раствор - ют в 2 мкл 10Х Hind III реакционного буфера и 17 мкл НаО. Около 1 мкл (10 единиц) ре- стрикционного фермента Hind III добавл ют к раствору плазмиды pPS 35 ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Реакцию заканчивают экстрагированием фенолом с последующими двум  экстракци ми хлороформом. Hind III - расщепленную плазмидную ДНК, осаждают , собирают центрифугированием и по- вторно суспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 23 мкл Н20. Получают около 2 мкл 2,3 KB Hind III рестрикционного фрагмента плазмиды pPS29, использу  в качестве исходного материала плазмиду pPS 29 вместо плазмиды pPS 21A, который содержит ген. придающий устойчивость к гидромицину, управл емый активирующей последовательностью IPS гена, и 2 мкл Т4 ДНК лигазы добавл ют к раствору Hind III расщеплен- ной плазмидной pPS 35 ДНК. Полученную смесь лигируют при 15°С в течение ночи. Лигированна  ДНК составл ет целевую плазмиду pPS27 и ее используют дл  трансформации E.coli K12 JA221.

Трансформанты, устойчивые к ампициллину , культивируют и используют дл  получени  плазмидной ДНК, которую анализируют рестрикционным ферментным анализом дл  идентификации целевых Е.

5 -АТС CGT ТСС СТТ CCA GTT CCA GTG GCC АЛС СТС ССС CGA АТС CAT GTC ТСС ССС СТА ТТС GGC CAT GAC AAG GAG AAG ЛАС

CTC CAC СТЛ CCT CGC GCC АТС GAC CCC CCA TCG CGC GAC АСЛ GGC TTC TTT ТЛС GCG СТО АЛС CAC CGT GTC GAC CTG CCG TGG,. CXC TCG ССС СЛГ, ACG ЛЛС АЛЛ TTC CAC ATG AGC АТС ACG CAC GAG СЛО АЛС. ТСС СЛС CTC GCC АТС CGG GCC TAC ЛЛС AAG GAG CAC GAG ТСС СЛГ, АТС C( G GCG GGC TAC TAC CTG CCG АТС CCG

5 CGC AAG ЛЛГ: CCC CTC СЛА TCG TTC TGC TAC CTG A AC ССС ТСС

TTC AGC ССЛ GAC СЛС CCC CGA АТС AAG GAG CCC ACC CCT ATG

.CAC GAG GTC ЛЛС СГС ТГ.С CCG СЛГ СЛО GCG AAG CAC CCG GGG

TTC CGG GCC TTC GCC OAU AAG TAC TAC TGG GAC GTC GCC

CTC TCC TCC GCG GTG CTC CGC GGC TAC GCT CTC CCC СТА GGT

0 CGC GAC GAG GAC TTC TTC ACC CGC CAC TCC CGC CCT GAC ACG

ACG CTC TCG TCG GTC GTG CTC АТС CGT TAC CCG TAC CTC GAC

CCG TAC CCG GAC CCG CCC АТС ЛЛС ACG GCC ОЛС CAC GGC ACC

AAG CTC ЛСС T lC GAG GAC GTG TCC CTC АТС ACG

GTG TTG ТЛС CV .; TCC GAC GTG CAG AAT CTG СЛС GTC AAG ACC

CCG CAG CCC TGtt CAC GAC АТС САС ССТ CAC CCC TTC

. CTC АТС ЛЛС TGC С.СЛ ДОС ТЛС ATG GCC CAT АТС ЛСГ ПЛС

ТЛС ТЛС CCC Г.;с CCG АТС СЛС CGC GTC АЛА TGG CTC ЛЛС GAQ

5 GAG CGC jV/Ч C.; CVC TTC TTC CTC АЛС CTC GGC TCG CAG

СЛС ЛСС АТС Г. ч-; CCG ПС GAC CCC GCG ACC GCC AAG GAT CGG

GCC ллс -.-.. f;rt. ,;,-,; Av; OAC AAG CCG лтс тсс „дс ссл «ли тлт г; -о с- .; ; .3 о ,л стг; CCG GGC TTG лтс ллс АЛС; ЛАТ с:-;т О ,% с: гл-.-т

coli K12 JA221/pPS 27 трансформантов. Только одна ориентаци  вставленного 3.45 KB Hind III рестрикционного фрагмента приводит к получению целевой плазмиды pPS 27.

Плазмиды pPS 27 трансформируют Cephalosporium acremonlun в фенотип, устойчивый к гидромицину с высокой частотой .

Claims (2)

1.Способ конструировани  рекомби- нантной плазмидной ДНК pPS20, кодирующей изопенициллин-М-синтетазу, заключающийс  в том. что осуществл ют инкубирование рестрикционного фрагмента Hind III размером 2,5 кв плазмиды plT221 Hind III фрагмента плазмиды и ДНК - лигазы в 50 мм трис - HCI рН 7,8 СЮ мМ MgCl2, 20 мМ ДТТ, 10 мМ АТФ и 1 мг/мл БСО при 15°С до завершени  реакции лиги- ровани , трансформацию полученными ДНК штаммов бактерий Escherlchla coli с последующим отбором клонов, содержащих целевую плазмиду.

2.Способ получени  штамма Cephalosporium acremonium, обладающего активностью изопенициллин-N- синтетазы, заключающийс  в том, что осуществл ют трансформацию C.acremonium А ТСС 11550 плазмидой pPS20, причем трансформирующа  плазмида содержит рестрикционный фрагмент Nco1 BamH1 размером 1,5 кв плазмиды , кодирующей изопенициллин-М- синтетазу, при этом кодирующа  нить ДНК последовательности представл ет собой:

с Пбс л едукЗщИ м кулыивированием трансфер-среде с триптиказосоевым агаром и гигромированной клетки-реципиента при 25 С намицином в концентрации 100 мкг/мл.

Активность изопенициллин-М-синтетазиз клеточных экстрактов из E.coll K12 PV308/plT337

Образец

2 мкг пенициллина N стандарт 5 мкг пенициллина N стандарт 10 мкг пенициллина N стандарт 20 мкг пенициллина N стандарт 25 мкл клеточного экстракта Е.

coll K12 PV308/plT337 50 мкл клеточного экстракта E.coll

К12 PV308/plT337 100 мкл клеточного экстракта E.coll

К12 PV308/plT337 150 мкл клеточного экстракта E.coll

К12 PV308/plT337

се обработанные пенициллином образцы Контроль клеточный экстракт E.coll

К12 PV308/pCZ106 Контрольна  реакци  без субстрата

Размер зоны, мм

16 18 27 31

10 22 27

29 О

О О