RU1776691C - Strain of cultivated hybrid cells of animals -mus musculus -l-producer of monoclonal antibodies against -j@@@-e of man - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи , медицина . Сущность изобретени : штамм получают гибридизацией спленоцитов инбредных мышей SJLAT. иммунизированных миеломным IgE, с клетками миеломы 653.А. Клетки штамма поддерживают в культуре в среде ДМЕМ, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скога, или перевивают на мышах-гибридах F1 (SjL/Jlx BALB/c). Обратный титр МКА в культураль- ных жидкост х составл ет 1-21 тыс., а в асцитах - 100-600 тыс. Моноклональные антитела (МКА) относ тс  к lgG2a. При иммобилизации на твердой фазе МКА могут использоватьс  в паре с другими IgE - специфичными мечеными антителами в двухде- терминантном иммунометрическом тесте определени  содержани  IgE. МКА сохран ют антиген-распознающую способность при присоединении ферментной метки и пригодны в качестве меченого реагента дл  определени  концентрации IgE в двухцент- ровом методе иммуноанализа. Штамм обозначен РИ-8Е/5Д4 и депонирован под номером ВСКК (П) 403Д.Usage: biotechnology, medicine. SUMMARY OF THE INVENTION: A strain is obtained by hybridization of SJLAT inbred splenocytes. immunized with myeloma IgE, with myeloma cells 653.A. The cells of the strain are maintained in culture in DMEM medium containing 10% bovine serum, or inoculated on F1 hybrid mice (SjL / Jlx BALB / c). The reverse titer of MABs in culture fluids is 1-21 thousand, and in ascites, 100-600 thousand. Monoclonal antibodies (MABs) are IgG2a. When immobilizing on a solid phase, MCAs can be used in conjunction with other IgE-specific labeled antibodies in a two-determinant immunometric assay for determining IgE content. MCAs retain antigen-recognition ability upon attachment of an enzyme label and are suitable as a labeled reagent for determining the concentration of IgE in a two-center immunoassay method. The strain is designated RI-8E / 5D4 and deposited under the number VSCK (P) 403D.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и предназначено дл  производства мо- ноклональных антител (МКАТ) против эпсилон-цепи иммуноглобулина Е (IgE), которые используютс  в иммунохимической диагностике аллергических заболеваний человека .The invention relates to biotechnology and is intended for the production of monoclonal antibodies (MKAT) against the epsilon chain of immunoglobulin E (IgE), which are used in the immunochemical diagnosis of allergic diseases in humans.

Содержание IgE в крови человека в 10-50 тыс ч раз меньше уровн  иммуноглобулинов других классов (IgA, IgG, IgM). Селективность и чувствительность современных методов вы влени  аллерген-специфических lgE-анти- тел (аллергосорбентный тест) или определени  общего содержани  IgE (двухде- терминантный иммунометрический тест) обеспечиваютс  реализацией принципа твердофазного иммуно-анализа, согласноThe content of IgE in human blood is 10-50 thousand times lower than the level of immunoglobulins of other classes (IgA, IgG, IgM). The selectivity and sensitivity of modern methods for detecting allergen-specific IgE antibodies (allergensorbent test) or determining the total IgE content (two-determinant immunometric test) are ensured by the implementation of the principle of solid-phase immunoassay according to

которому IgE, содержащийс  в исследуемом образце, св зываетс  иммобилизованным на твердой фазе аллергеном или МКАТ, направленными к одной из антигенных детерминант эпсилон-цепи, после чего сформированный на твердой фазе иммунный комплекс вы вл етс  с помощью вторых МКАТ, несущих ферментную, изотопную или флуоресцентную метку 1.to which the IgE contained in the test sample is bound by a solid phase immobilized allergen or MKAT directed to one of the antigenic determinants of the epsilon chain, after which the immune complex formed on the solid phase is detected by the second MKAT carrying enzyme, isotopic or fluorescent mark 1.

В св зи с этим МКАТ, предназначенные дл  использовани  в аллергодиагностиче- ских методах твердофазного иммуноанализа , подвергаютс  отбору по критерию сохранени  функциональной активности при иммобилизации на твердой фазе и кова- лентном св зывании с маркерными молекулами . Кроме того, при этом отбирают МКАТ,In this regard, MKAT, intended for use in allergic diagnostic methods of solid-phase immunoassay, are selected according to the criterion of maintaining functional activity during immobilization on the solid phase and covalent binding to marker molecules. In addition, MKAT is selected,

XIXi

ч о оh about

специфичные к антигенным участкам эпсилон-цепи , которые,во-первых,не маскируютс  при формировании комплекса аллерген-lcE. а во-вторых пространственно удалены друг от друга, что исключает конкуренцию между ними за св зывание IgE при постановке двухдетерминантного иммуно- метрического теста. Перспективными дл  практического применени  считаютс  МКАТ, обладающие одним или несколькими из перечисленных свойств.specific to the antigenic regions of the epsilon chain, which, firstly, are not masked during the formation of the allergen-lcE complex. and secondly, they are spatially separated from each other, which excludes competition between them for IgE binding in the formulation of a two-determinant immunometric test. Promising for practical use are MKAT, possessing one or more of the listed properties.

Известны гибридомные штаммы 2, 3. 4, вырабатывающие МКАТ против IgE человека (табл. 1).Known hybridoma strains 2, 3.4, producing MKAT against human IgE (table. 1).

В числе аналогов описано семейство гибридомных клонов 15, при получении которых реализованы упом нутые выше принципы отбора продуцентов (ПРОТОТИП). Гибридомы получены на основе миеломной линии РЗХ63, Ад8.653 и лимфоцитов мышей линии BALB/c, иммунизированныхмиелом- ным IgE человека. 5 штаммов этого семейства продуцируют МКАТ, относ щиес  к lgG1, продукты двух других штаммов относ тс  к gG2a. Среди описываемых штаммов большинство продуцирует МКАТ, которые взаимодействуют как с гомогенным (мие- ломным), так и с поликлональным IgE человека , что дает основани  считать их специфичными в отношении константной области эпсилон-цепи. Продукты 2-х штаммов сохран ют антиген-св зывающую активность при иммобилизации на твердой фазе. МКАТ, способных вы вл ть аллерген- специфические lgE-антитела или служить основой меченого реагента дл  двухдетерминантного определени  концентрации IgE, среди продуктов данного семейства гибридом не описано.Among analogues, a family of hybridoma clones 15 was described, upon receipt of which the above mentioned principles of producer selection (PROTOTYPE) were implemented. Hybridomas were obtained on the basis of the PX63 63 myeloma line, Ad8.653 and lymphocytes of BALB / c mice immunized with human myeloma IgE. Five strains of this family produce MKAT related to IgG1, the products of two other strains belong to gG2a. Among the described strains, the majority produces MKAT that interact with both homogeneous (myeloma) and polyclonal human IgE, which suggests that they are specific for the constant region of the epsilon chain. The products of the 2 strains retain antigen-binding activity upon immobilization on the solid phase. MKAT, capable of detecting allergen-specific IgE antibodies or serving as the basis for a labeled reagent for two-determinant determination of IgE concentration, is not described among the products of this hybrid family.

Недостаток известных гибридом, в том числе и прототипа, состоит в том, что дл  их получени  в качестве родительских клеток использованы миеломные клеточные линии с низкой автономностью роста, требующие дл  размножени  ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Высока  зависимость от ростовых факторов ограничивает возможности эксплуатации таких гибридом в качестве производственных штаммов, особенно при использовании метода массового культивировани  в ферментерах, а также может служить причиной их недостаточной стабильности.A disadvantage of the known hybridomas, including the prototype, is that myeloma cell lines with low growth autonomy, which require embryonic growth factors to propagate, are used as parent cells to produce them. High dependence on growth factors limits the possibilities of using such hybridomas as production strains, especially when using the method of mass cultivation in fermenters, and can also cause their lack of stability.

Цель насто щего изобретени  состо ла в получении гибридомного штамма, который:An object of the present invention was to provide a hybridoma strain that:

1) не требует дл  размножени  ростовых факторов эмбриональной сыворотки;1) does not require embryonic serum for propagating growth factors;

2) синтезирует МКАТ. пригодные дл  определени  концентрации IgE в сыворотке крови человека.2) synthesizes MKAT. suitable for determining the concentration of IgE in human serum.

Достижение поставленной цели было обеспечено:Achieving this goal was ensured by:

1)использованием при получении гибридом клеток миеломного штамма 653.А (ВСКК(П) N 7 D, а.с. № 1381982), размножение которого не требует ростовых факторов1) the use of myeloma strain 653.A when producing hybridomas, cells (HSCC (P) N 7 D, A.S. No. 1381982), the reproduction of which does not require growth factors

0 эмбриональной сыворотки;0 fetal serum;

2)отбором среди полученных гибридом штамма E/5D4, синтезирующего МКАТ, которые сохран ют антиген-св зывающую активность при иммобилизации на твердой2) selection among the obtained hybridomas of strain E / 5D4 synthesizing MKAT that retain antigen-binding activity upon immobilization on solid

5 фазе и при присоединении ферментной метки .5 phase and upon attachment of the enzyme label.

Описываемый штамм E/5D4 подобно ПРОТОТИПУ синтезирует МКАТ, специфичные к константной области IgE человека иThe described strain E / 5D4, similarly to PROTOTYPE, synthesizes MKAT specific for the constant region of human IgE and

0 способные в адсорбированном на твердой фазе состо нии извлекать IgE из раствора. В отличие от ПРОТОТИПА штамм E/5D4 получен на основе миеломной клеточной линии 653.А и не требует дл  размно5 жени  ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Синтезируемые штаммом E/5D4 МКАТ обладают свойством, наличие которого у прототипа неизвестно: в виде коныогата с ферментом они позхвол ют оп0 редел ть общее содержание IgE с помощью двухдетерминантного иммунометрического теста. Кроме перечисленного, штамм отличаетс  от ПРОТОТИПА генотипом животных-доноров иммунных лимфоцитов0 capable of adsorbing on a solid phase, to recover IgE from solution. In contrast to PROTOTYPE, strain E / 5D4 was obtained on the basis of myeloma cell line 653.A and does not require embryonic serum growth factors to reproduce. The MKAT synthesized by strain E / 5D4 possesses a property which is not known in the prototype: in the form of a konyogate with an enzyme, they allow the total IgE content to be determined using a two-determinant immunometric test. In addition to the above, the strain differs from PROTOTYPE in the genotype of animal donors of immune lymphocytes

5 (мыши линии SJL/J).5 (mice of the SJL / J line).

Совокупность описанных свойств позвол ет рассматривать предлагаемый гиб- ридомный штамм РИ-8-Е/504, как объект, обладающий существенными отличи ми отThe combination of the described properties allows us to consider the proposed hybridoma strain RI-8-E / 504, as an object that has significant differences from

0 прототипа.0 prototype.

Штамм депонирован в ВСКК(П) под номером 403Д.The strain is deposited in VSCK (P) under the number 403D.

Справка о депонировании прилагаетс . Штамму присвоено авторское наимено5 вание РИ-8-Е/5Д4.A certificate of deposit is attached. The strain is assigned the author's name RI-8-E / 5D4.

Получение гибридомного штамма. Донорами иммунных лимфоцитов служили сыши-масцы линии SJL/J, которых иммунизировали дважды с интервалом в 1Obtaining a hybridoma strain. The donors of immune lymphocytes were the SJL / J souse-muscles, which were immunized twice with an interval of 1

0 неделю подкожно препаратом миеломного 1дЕ/Ц40мкг) в полном адъювантеФрейнда, на 11 и 12 дни после этого давали бустер-иммунизации внутрибрюшинно по 10 мкг IgE в физиологическом растворе. Спленоциты0 week subcutaneously with a myeloma preparation 1de / C40 μg) in complete Freund's adjuvant; on 11 and 12 days after this, booster immunization was given intraperitoneally with 10 μg IgE in physiological saline. Splenocytes

5 дл  сли ни  получали через 24 часа после последней бустер-иммунизации от мышей, у которых титр анти- дЕ-антител превышал 1:20000. Партнерами дл  гибридизации служили клетки миеломного штамма 653.А, выращенные на питательной среде.5 for fusion was obtained 24 hours after the last booster immunization from mice in which the anti-E antibody titer exceeded 1: 20,000. Hybridization partners were cells of myeloma strain 653.A grown on culture medium.

содержащей модифицированную Дюльбек- ко среду Игла (90%) и сыворотку крупного рогатого скота (10%). Дл  сли ни  использовали 100 млн клеток селезенки и 50 млн клеток миеломы. Смесь клеток обрабатыва- ли раствором полиэтилен гликол  (50%) с молекул рной массой 1000. Дл  выращивани  гибридов использовали питающий слой из перитонеальных макрофагов мышей и питательную среду указанного выше соста- ва, содержащую в 100 мл (мкг): аминопте- рин-10, гипоксантин-500 и тимидин-500.containing Dulbecco's modified Eagle medium (90%) and cattle serum (10%). 100 million spleen cells and 50 million myeloma cells were used for fusion. The cell mixture was treated with a solution of polyethylene glycol (50%) with a molecular weight of 1000. For the cultivation of hybrids, a feed layer of mouse peritoneal macrophages and a culture medium of the above composition containing 100 ml (μg): aminopterin-10 were used , hypoxanthine-500 and thymidine-500.

Отбор и тестирование культуральных надосадков проводили трижды с 11 по 28 дни после сли ни . Вы вление МКАТ, спе- цифичных к константной области эпсилон- цепи вели с помощью твердофазного иммуноферментного анализа аналогично известному способу 3, 5, использу  в каче- стве антигенов миеломные IgE, препараты IgG, IgM, а также легкие цепи иммуноглобулинов человека каппа- и л мбда-типов (табл. 2).Culture supernatants were selected and tested three times from 11 to 28 days after fusion. The detection of MCATs specific for the constant region of the epsilon chain was carried out using an enzyme-linked immunosorbent assay similar to the known method 3, 5, using myeloma IgE, IgG, IgM preparations, as well as light chains of human immunoglobulins kappa- and l as antigens mbda types (table. 2).

Из 480 первичных культур 12 синтези- ровали антитела, св зывающие с lgE/L-им- муногеном. Среди них одна культура продуцировала антитела, направленные к легкой цепи каппа-типа.Of the 480 primary cultures, 12 synthesized antibodies that bind to the IgE / L immunogen. Among them, one culture produced antibodies directed to the kappa type light chain.

Продукты синтеза 5 культур св зыва- лисье lgE/L-иммуногеном, но не реагировали с миеломным lg.E/Ю. Наконец, 6 культур синтезировали антитела, взаимодействующие как с IgE/L, так и с lgE/Ю. Эти 6 культур , обозначенные как семейство гибридом РЙ-8, были подвергнуты дальнейшему изучению .The synthesis products of 5 cultures were bound by the IgE / L immunogen but did not react with myeloma Ig.E / 10. Finally, 6 cultures synthesized antibodies that interact with both IgE / L and lgE / 10. These 6 cultures, designated as the RY-8 hybrid family, were further studied.

Гибридомы клонировали 2-4 раза методом лимитирующих разведений на питающем слое из перитонеальных макрофагов мышей. Клоны, которые при двух последовательных клонировани х с плотностью посева , равной 1 клетке на 1 или 2 лунки, давали более 95% субклонов, синтезирующих анти- дЕ-антитела, переводили в мае- совую культуру. Выращенные в культуре клетки внутрибрюшинно прививали гисто- совместимым мышам (по 5 млн клеток на мышь), которым за 7-18 дней до этого также внутрибрюшинно был введен пристан (по 0,5 мл).Hybridomas were cloned 2-4 times by the method of limiting dilutions on the feeding layer from mouse peritoneal macrophages. Clones which, after two consecutive clonings with a seeding density of 1 cell per 1 or 2 wells, produced more than 95% of the subclones synthesizing anti-E antibodies, were transferred to the mass culture. Cells grown in culture were intraperitoneally inoculated into histocompatible mice (5 million cells per mouse), which were also given intravenous injection of prystan (0.5 ml each) 7-18 days earlier.

От мышей с растущими опухол ми на 14-21 дни получали асцитические жидкости. МКА из асцитов адсорбировали на твердой фазе и исследовали их способность св зы- вать IgE из раствора. Замен   растворы IgE на образцы сыворотки крови здоровых людей и больных аллергией, вы вл ли МКАТ, которые св зывают поликлональный сывороточный IgE, т.е. специфичны к константным эпитопам эпсилон-цепи. БылиMice with growing tumors received ascitic fluids on days 14-21. MCAs from ascites were adsorbed on the solid phase and their ability to bind IgE from solution was examined. Replacing IgE solutions with blood serum samples from healthy people and patients with allergies revealed MKAT that bind polyclonal serum IgE, i.e. specific to the constant epitopes of the epsilon chain. Were

отобраны 5 клонов-продуцентов МКАТ, удовлетвор ющих критери м селекции.5 clones producing MKAT that satisfy the selection criteria were selected.

МКАТ, специфичные к константным эпитопам IgE, исследовали на способность сохран ть иммунологическую активность при присоединении ферментной метки, Дл  этого МКАТ из асцитических жидкостей выдел ли осаждением сульфатом аммони  6 и методом периодатного окислени  к ним присоедин ли фермент - пероксидазу хрена 7. Иммунологическую активность пол- ученных конъюгатов исследовали в твердофазном иммуноанализе, адсорбиру  на твёрдой фазе миеломный IgE. Продукты п ти клонов после присоединени  ферментной метки сохран ли антиген-св зываю- щую активность.MCATs specific for constant IgE epitopes were tested for their ability to maintain immunological activity upon attachment of an enzyme label. For this purpose, MCATs were isolated from ascitic liquids by precipitation with ammonium sulfate 6 and the horseradish peroxidase enzyme 7 was attached to them by periodical oxidation. Immunological activity The studied conjugates were investigated in solid-phase immunoassay, adsorbing myeloma IgE on the solid phase. Five clone products retained antigen-binding activity after enzyme labeling.

Подбор МКАТ дл  двухдетерминатного иммунометрического теста определени  IgE проводили, испытыва  поочередно адсорбированные на твердой фазе МКАТ в сочетании с мечеными пероксидазой МКАТ в качестве вы вл ющих реагентов (табл. 3). Найдено несколько сочетаний иммобилизованных и меченых МКАТ, позвол ющих определ ть IgE в сыворотке крови. Оптимальный результат был получен при иммобилизации на твердой фазе МКАТ клона 5Д4 и вы влении фиксированного IgE с помощью меченых пероксидазой МКАТ клона 4Ф4. Удовлетворительный результат был получен также при использовании конъюга- та, приготовленного на основе МКАТ Е/5Д4.The selection of MKAT for a two-determinate immunometric IgE test was carried out by testing adsorbed alternately on the solid phase of MKAT in combination with peroxidase-labeled MKAT as detecting reagents (Table 3). Several combinations of immobilized and labeled MKAT have been found to allow determination of serum IgE. The optimal result was obtained by immobilizing clone 5D4 on the solid phase of MKAT and detecting fixed IgE using peroxidase-labeled MKAT clone 4F4. A satisfactory result was also obtained using a conjugate prepared on the basis of MKAT E / 5D4.

Таким образом, в результате ступенчатого отбора был получен штамм Е/5Д4, который обладает необходимой совокупностью свойств, т.е. способностью расти на среде, не содержащей эмбриональной сыворотки, и продуцировать МКАТ, пригодные дл  двухдетерминантного имму- нометрического метода определени  содержани  IgE в качестве меченого реагента или в качестве иммобилизованного антитела , извлекающего IgE из раствора.Thus, as a result of stepwise selection, the strain E / 5D4 was obtained, which possesses the necessary combination of properties, i.e. the ability to grow on a medium not containing fetal serum and to produce MKAT suitable for the two-determinant immunometric method for determining the content of IgE as a labeled reagent or as an immobilized antibody that extracts IgE from a solution.

Характеристика штамма.Characterization of the strain.

Штамм Е/5Д4 принадлежит к семейству гибридом РИ-8.Strain E / 5D4 belongs to the RI-8 hybrid family.

1)С момента получени  из родительских клеток штамм прошел 28 пассажей в культуре, включа  4 цикла клонировани  методом лимитирующих разведений на питающем слое из макрофагов мышей.1) From the time it was obtained from the parental cells, the strain went through 28 passages in culture, including 4 cloning cycles by the method of limiting dilutions on the supply layer from macrophages of mice.

2)Стандартными услови ми культивировани   вл ютс  следующие: питательна  среда состоит из среды Игла в оригинальной прописи или в модификации Дюльбекко (90%) и сыворотки крупного рогатого скота (10%). Клетки выращивают при +37°С в герметично закрытых флаконах или в открытой2) The standard cultivation conditions are as follows: the culture medium consists of the Eagle medium in the original recipe or in the Dulbecco modification (90%) and cattle serum (10%). Cells are grown at + 37 ° C in hermetically sealed vials or in open

системе - в планшетах, чашках Петри или флаконах в атмосфере с 7.5% углекислоты в воздухе при 100% влажности.system - in tablets, Petri dishes or bottles in the atmosphere with 7.5% carbon dioxide in air at 100% humidity.

3)Оптимальна  посевна  доза составл ет 200 тыс клеток в 1 мл среды. Дл  поддержани  клеток в пролиферирующем состо нии их рассевают 2 раза в неделю с коэффициентом 1:4 - 1:5 при использовании стандартного состава ростовой среды. Клетки сохран ют способность к пролиферации при снижении содержани  сыворотки до 2,5%, при этом кратность рассева составл ет 1:2. Максимальна  плотность культуры с сохранением жизнеспособности 1,2-1,4 млн клеток в 1 мл.3) The optimal seed dose is 200 thousand cells in 1 ml of medium. To maintain cells in a proliferating state, they are seeded 2 times a week with a ratio of 1: 4 - 1: 5 using a standard growth medium composition. Cells retain the ability to proliferate while decreasing the serum content to 2.5%, with a sieving ratio of 1: 2. The maximum density of the culture while maintaining viability of 1.2-1.4 million cells per 1 ml.

4)Культура описываемого штамма представл ет взвесь одиночных округлых прозрачных клеток, встречаютс  агрегаты из 4-х или более клеток, которые легко суспендируютс  пипетированием.4) The culture of the described strain is a suspension of single rounded transparent cells, aggregates of 4 or more cells are found which are readily suspended by pipetting.

5)Культура штамма Е/5Д4, посто нно выращиваема  без антибиотиков, не содержит бактерий, грибов, дрожжей и микоплаз- мы.5) The culture of strain E / 5D4, which is constantly grown without antibiotics, does not contain bacteria, fungi, yeast, and mycoplasma.

6)Клетки штамма перевивают в виде асцитических или солидных опухолей (в зависимости от способа прививки) на гисто- совместимыхмышах-гибридах F1(SJL/JxBALB/c). При внутрибрюшинной прививке 5 млн клеток животным в возрасте 1,5-3 мес ца, предобработанным за 7-18 дней до этого внутрибрюшинным введением пристана, асцит развиваетс  в течение 14-21 дн . От одной мыши получают при первой пункции 4-10 мл, суммарно в результате повторных пункций от одного животного получают 7-26 мл асцита.6) The cells of the strain are inoculated as ascitic or solid tumors (depending on the method of vaccination) on histocompatible F1 mice-hybrids (SJL / JxBALB / c). When intraperitoneal inoculation of 5 million cells in animals aged 1.5-3 months, pretreated 7-18 days before the intraperitoneal injection of pristan, ascites develops within 14-21 days. At the first puncture, 4-10 ml are obtained from one mouse; in total, as a result of repeated punctures, 7-26 ml of ascites are obtained from one animal.

7)Маркерные признаки штамма:7) Marker signs of the strain:

а)штамм синтезирует МКАТ против IgE человека. Антитела вы вл ютс  в культу- ральной жидкости при поддержании клеток in vitro и в сыворотке или в асцитической жидкости при прививке животным;a) the strain synthesizes MKAT against human IgE. Antibodies are detected in the culture fluid by maintaining cells in vitro and in serum or ascitic fluid when vaccinated in animals;

б)штамм обладает онкогенностью, котора  выражаетс  в росте солидных или асцитических опухолей у гистосовместимых мышей-гибридов F1(SJL/JxBALB/c) при прививке им клеток гибридомb) the strain has oncogenicity, which is expressed in the growth of solid or ascitic tumors in histocompatible F1 hybrid mice (SJL / JxBALB / c) when they are inoculated with hybrid cells

8)Характеристика МКАТ. продуцируемых штаммом гибридомы Е/5Д4. Клетки гибридомы продуцируют МКАТ субкласса lgG2a. Антитела специфичны к константной области эпсилон-цепи IgE человека. Специфичность МКАТ может быть проверена в твердофазном иммуноферментном анализе с помощью IgE, адсорбированного на твердой фазе. МКАТ св зываютс  с белком А стафилококка, что может быть использовано при их очистке. При адсорбции на твердои фазе МКАТ способны св зывать сывороточный IgE и могут использоватьс  в качестве захватывающих антител в системе двухдетерминантного иммуноанализа(в паре с мечеными lgE-специфичными антителами ) или при афинном извлечении IgE из сывороточных препаратов. МКАТ Е/5Д4, сохран   антиген-распознающие свойства после присоединени  ферментной метки,8) Description of MKAT. produced by the hybridoma strain E / 5D4. Hybridoma cells produce MKAT subclass lgG2a. Antibodies are specific for the constant region of the human IgE epsilon chain. The specificity of MKAT can be verified by enzyme-linked immunosorbent assay using IgE adsorbed on the solid phase. MKAT binds to staphylococcus A protein, which can be used in their purification. When adsorbed on the solid phase, MKATs are capable of binding serum IgE and can be used as capture antibodies in a two-determinant immunoassay system (paired with labeled IgE-specific antibodies) or in the affinity extraction of IgE from serum preparations. MKAT E / 5D4, retaining antigen-recognizing properties after attachment of the enzyme label,

могут также служить вы вл ющим реагентом в двухдетерминантном иммуноанализе. Антитела специфичны в отношении эпитопа на IgE, который не экспрессируетс  при образовании комплекса IgE с антигеном (аллергеном ), и не могут использоватьс  дл  вы влени  фракции специфического IgE в аллергосорбентном тесте.can also serve as a reagent in a two-determinant immunoassay. Antibodies are specific for an IgE epitope that is not expressed during the formation of an IgE complex with an antigen (allergen), and cannot be used to detect a specific IgE fraction in an allergic sorbent assay.

9)Продуцируемый штаммом иммуног- лобулин вы вл етс  в культуральной среде9) The immunoglobulin produced by the strain is detected in the culture medium

при культивировании клеток. Обратный титр МКАТ в переросших культурах при выращивании клеток в стандартных услови х составл ет 1000-21000. Такой же титр можетwhen culturing cells. The reverse titer of MKAT in overgrown cultures when growing cells under standard conditions is 1000-21000. The same caption may

быть получен при снижении содержани  сыворотки в ростовой среде с 10% до 1,2%. При росте гибридомных клеток в мышах обратный титр МКАТ в асцитической жидкости составл ет 100000-600000. Среднее содержание иммуноглобулина в асците составл ет 8 мг/мл.be obtained by reducing the serum content of the growth medium from 10% to 1.2%. When hybridoma cells grow in mice, the inverse titer of MKAT in ascitic fluid is between 100,000-600,000. The average immunoglobulin content in ascites is 8 mg / ml.

10)Стабильность продукции МКАТ оценивали при пассировании клеток на мышах в течение 7 пассажей. За этот период клетки10) The stability of MKAT production was evaluated by passage of cells in mice for 7 passages. During this period the cells

сохран ли исходную продуктивность. В культуре сохранение уровн  МКАТ прослежено в течение 24 пассажей.retained original productivity. In culture, the maintenance of the level of MKAT was traced for 24 passages.

11)Услови  криоконсервации. Криосре- да состоит из 45% среды Игла, 45% сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида. Ампулы, содержащие 1-10 млн клеток в криосреде помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,5 см и выдерживают в нем при -70С в11) Cryopreservation conditions. The cryo-medium consists of 45% Eagle medium, 45% serum of cattle and 10% dimethyl sulfoxide. Ampoules containing 1-10 million cells in a cryomedium are placed in a foam container with a wall thickness of 1.5 cm and kept in it at -70 ° C

течение суток, затем хран т при -70С или перенос т в жидкий азот. Дл  размораживани  клеток ампулы извлекают из низкотемпературного хранилища и на 3 минуты погруж-ж  в воду с температурой МО С.overnight, then stored at -70 ° C or transferred to liquid nitrogen. To defrost the cells, the ampoules are removed from the low-temperature storage and for 3 minutes immersed in water with a temperature of MO C.

Затем центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин, убирают надосадок, а клетки суспендируют в ростовой среде и рассевают в платы при концентрации 500 тыс клеток в 1 мл. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составл ет 60-70% поданным пробы с 0,5% трипановым синим. Через 1 сутки клетки повторно рассевают с концентрацией 200 тыс клеток в 1 мл ростовой среды.Then it is centrifuged for 3 min at 1000 rpm, the supernatant is removed, and the cells are suspended in a growth medium and scattered into plates at a concentration of 500 thousand cells in 1 ml. Cell viability after cryopreservation is 60-70% of the submitted sample with 0.5% trypan blue. After 1 day, the cells are re-seeded with a concentration of 200 thousand cells in 1 ml of growth medium.

МАТЕРИАЛЫ, ПОЯСНЯЮЩИЕ СУЩНОСТЬ ПРЕДЛАГАЕМОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ Схема 1. Вы вление IgE с помощью двухде- терминантного иммунометрического теста. Схема 2. Вы вление аллерген-специфиче- ского Ig E с помощью аллерго-сорбентноготеста. Таблица 1. Гибридомные штаммы-продуценты МКАТ против IgE человека. Таблица 2. Результат тестировани  специфичности антител, продуцируемых первич- ными культурами гибридом. Таблица 3. Вы вление IgE с помощью двух- детерминантного твердофазного иммуно- ферментного анализа.MATERIALS EXPLAINING THE INVENTION OF THE INVENTION Scheme 1. Detection of IgE using a two-determinant immunometric test. Scheme 2. Detection of allergen-specific Ig E using an allergy-sorbent test. Table 1. Hybridoma strains producing MKAT against human IgE. Table 2. Test result of the specificity of antibodies produced by primary hybridoma cultures. Table 3. Detection of IgE using a two-determinant enzyme-linked immunosorbent assay.

Таблица 4. Титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма 8Е/5Д4 при выращивании в среде с низким содержанием сыворотки .Table 4. Titers of MKAT produced by cells of strain 8E / 5D4 when grown in a medium with a low serum content.

Таблица 5, Титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма Е/5Д4, в культуральной среде и в асцитической жидкости. Таблица 6. Содержание IgE в образцах сыворотки крови человека, определенное в двухсайтовом иммуноанализе с помощью иммобилизованных МКАТ Е/5Д4,Table 5, Titers of MKAT produced by cells of strain E / 5D4, in culture medium and in ascitic fluid. Table 6. The IgE content in samples of human blood serum, determined in a two-site immunoassay using immobilized MKAT E / 5D4,

Таблица 7. Вы вление IgE в образцах сыворотки крови в двухсайтовом иммуноанализе с помощью меченых МКАТ Е/5Д4. Фиг. 1. Калибровочна  крива  дл  определени  содержани  IgE в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммуно- метрическом тесте с помощью иммобилизованных МКАТ Е/5Д4.Table 7. Detection of IgE in blood serum samples in a two-site immunoassay using labeled MKAT E / 5D4. FIG. 1. Calibration curve for determining IgE in human serum in a two-determinant immunometric assay using immobilized MKAT E / 5D4.

Фиг. 2. Калиибровочна  крива  дл  определени  содержани  IgE в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммуно- метрическом тесте с помощью меченых МКАТЕ/5Д4.FIG. 2. Calibration curve for the determination of serum IgE in a two-determinant immunometric assay using labeled MKATE / 5D4.

Примеры получени  и использовани  МКАТ, синтезируемых штаммом Е/5Д4. Examples of the preparation and use of MKAT synthesized by strain E / 5D4.

I. Выращивание культуры гибридомы дл  последующей поививки мышам.I. Cultivation of hybridoma culture for subsequent inoculation to mice.

Посевным материалом служат гибри- домные клетки, хран щиес  в жидком азоте. Дл  размораживани  пробирку, содержа- щую 5 млн клеток, извлекают из сосуда с жидким азотом, погружают на 3 минуты в воду с температурой +40 С, после полного оттаивани  пробирку центрифугируют 3 минуты при 1000 об/мин, удал ют надосадок, клетки ресуспендируют в 10 мл ростовой среды (модифицированна  Дюльбекко среда Игла-90%, сыворотка крупного рогатого скота-10%) и помещают в культуральный флакон (объем 25 мл). Флакон помещают в инкубатор с температурой +37 С, 100% влажности и 7,5% углекислоты в воздухе, Через сутки провод т визуальный контроль состо ни  клеток с помощью инвертированного микроскопа и к содержимому флаконаHybridoma cells stored in liquid nitrogen serve as seed. To defrost a test tube containing 5 million cells, it is removed from a vessel with liquid nitrogen, immersed for 3 minutes in water at + 40 C, after complete thawing, the tube is centrifuged for 3 minutes at 1000 rpm, the supernatant is removed, the cells are resuspended in 10 ml of growth medium (Dulbecco's modified medium Needle-90%, cattle serum-10%) and placed in a culture bottle (volume 25 ml). The vial is placed in an incubator with a temperature of +37 C, 100% humidity and 7.5% carbon dioxide in the air. After a day, the cells are visually checked using an inverted microscope and the contents of the vial

прибавл ют 15 мл ростовой среды. На 4 сутки после размораживани  клетки пересевают в разведении 1:5 и перенос т во флакон объемом 250 мл. Через 2 суток берут пробу дл  подсчета клеток - в 1 мл суспензии содержитс  800 тыс гибридомных клеток . Суммарное содержание клеток в культуре 100 млн, что составл ет 20 прививочных доз. Клетки осаждают центрифугированием (1000 об/мин, 20 мин), суспензируют в среде Хенкса и ввод т по 5 млн в объеме 2 мл внутрибрюшинно мышам- межлинейным гибридам F1(SJL/JxBALB/c), получившим за 11 дней до прививки внутри- брюшинную инъекцию пристана.15 ml of growth medium are added. On day 4 after thawing, the cells are reseeded in a 1: 5 dilution and transferred to a 250 ml vial. After 2 days, a sample is taken to count the cells - 800 ml of hybridoma cells are contained in 1 ml of suspension. The total cell content in the culture is 100 million, which is 20 vaccination doses. Cells are pelleted by centrifugation (1000 rpm, 20 min), suspended in Hanks medium and 5 ml in volume are injected 2 ml intraperitoneally to F1 interline hybrids mice (SJL / JxBALB / c), which received intraperitoneal administration 11 days before vaccination. injection pristan.

II.Получение гибридомных асцитиче- ских жидкостей и выделение из них глобули- новой фракции, содержащей МКАТ.II. Obtaining hybridoma ascitic fluids and isolating from them a globulin fraction containing MKAT.

Накопление асцита в брюшной полости мышей начинаетс  на 11-й день после прививки клеток гибридомы. На 14-й день провод т первую пункцию. При этом получают от каждых 10 мышей 45-50 мл асцита. На 17 день повторно пунктируют оставшихс  в живых мышей и получают еще 40-45 мл асцита . К 20-му дню остаетс  около 50% привитых сышей. В результате третьей пункции получают 10-15 мл асцита. Общее количество асцита, получаемое от 10 мышей, составл ет 105-110 мл.The accumulation of ascites in the abdominal cavity of mice begins on the 11th day after inoculation of hybridoma cells. On the 14th day, the first puncture is performed. In this case, 45-50 ml of ascites are obtained from every 10 mice. On day 17, the surviving mice are re-punctured and another 40-45 ml of ascites are obtained. By day 20, about 50% of vaccinated seys remain. As a result of the third puncture, 10-15 ml of ascites are obtained. The total amount of ascites obtained from 10 mice is 105-110 ml.

После образовани  фибринового сгустка и отделени  его от клеточной массы с помощью центрифугировани  из 110 мл асцита получают 100мл надосадочной жидкости , из которой выдел ют глобулиновую фракцию. Дл  этого к жидкости приливают по капл м в услови х непрерывного перемешивани  равный объем насыщенного раствора сульфата аммони  с рН-7,0. Осадок отдел ют центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин), надосадок отбрасывают, а осадок раствор ют в дистиллированной воде , довод  объем раствора до исходного. Процедуру высаливани  повтор ют, полученный осадок суспендируют в половинном объеме полунасыщенного сульфата аммони  и в таком виде хран т при +4С.After the fibrin clot is formed and separated from the cell mass by centrifugation from 110 ml of ascites, 100 ml of the supernatant are obtained, from which the globulin fraction is isolated. For this, an equal volume of a saturated solution of ammonium sulfate with a pH of 7.0 is added dropwise to the liquid under continuous stirring. The precipitate was separated by centrifugation (6000 rpm, 15 min), the supernatant was discarded, and the precipitate was dissolved in distilled water, adjusting the volume of the solution to the original. The salting out procedure is repeated, the resulting precipitate is suspended in half the volume of semi-saturated ammonium sulfate and stored in this form at + 4C.

III.Получение содержащих МКАТ куль- туральных жидкостей при выращивании клеток гибридом на среде с низким содержанием сыворотки.III. Preparation of MKAT-containing culture fluids by growing hybridoma cells in a medium with a low serum content.

Источником клеток служит гибридом- ный штамм, хран щийс  в жидком азоте. Клетки размораживают и высевают как описано в примере 1, Через сутки контролируют состо ние клеток с помощью инвертированного микроскопа и определ ют их содержание в культуре с помощью камеры Гор ева. Суспензи  содержит 400 тыс клеток в 1 мл. При первом пересеве к 10 мл культуры добаол ют 10мл ростовой среды, содержащей 10% сыворотки. Через 1 сутки культуру раздел ют на 2 части: первую оставл ют без пересевов до перероста дл  определени  титра МКАТ. Ко второй прибавл ют 10 мл бессывороточной среды, в результате концентраци  сыворотки снижаетс  до 5%. Через 2 суток взвесь клеток, выросших на среде с 5% сыворотки, раздел ют на 3 части . Первую оставл ют без рассева до перероста дл  определени  титра МКАТ. Вторую часть четырехкратно пересевают на среде с 5% сыворотки (каждые 3 дн  с коэффициентом 1:4) и затем оставл ют до перероста дл  определени  титра МКАТ. Третью часть пересевают с одновременным снижением концентрации сыворотки до 1,5%. На 3 сутки культуру раздел ют на 2 части: первую оставл ют до перероста, во второй содержание сыворотки снижают до 1.25% и спуст  6 дней из нее берут пробу дл  определени  титра МКАТ. Данные определени  титров МКАТ на всех стади х процесса приведены в таблице 4.The cell source is a hybridoma strain stored in liquid nitrogen. Cells are thawed and plated as described in Example 1. After a day, the state of the cells is monitored using an inverted microscope and their content in the culture is determined using a Gorev camera. The suspension contains 400 thousand cells in 1 ml. At the first pass, 10 ml of growth medium containing 10% serum is added to 10 ml of culture. After 1 day, the culture was divided into 2 parts: the first was left without reseeding until overgrowing to determine the titer of MKAT. 10 ml of serum-free medium are added to the second, as a result, the serum concentration is reduced to 5%. After 2 days, the suspension of cells grown on medium with 5% serum is divided into 3 parts. The former is left without sieving until overgrowth to determine the MKAT titer. The second part is four times subcultured on medium with 5% serum (every 3 days with a ratio of 1: 4) and then left until overgrowth to determine the titer of MKAT. The third part is subcultured with a simultaneous decrease in serum concentration to 1.5%. On day 3, the culture is divided into 2 parts: the first is left until overgrowth, in the second the serum content is reduced to 1.25% and after 6 days a sample is taken from it to determine the titer of MKAT. MKAT titer determination data at all stages of the process are shown in Table 4.

IV. Определение титра мышиных антител против IgE человека.IV. Determination of the titer of murine antibodies against human IgE.

Источником мышиных антител против IgE служат:The source of murine antibodies against IgE are:

а)сыворотка крови мышей, иммунизированных IgE человека,a) the serum of mice immunized with human IgE,

б)культуральна  жидкость от растущих гиб- ридомных клеток,b) culture fluid from growing hybridoma cells,

в)асцитическа  жидкость мышей с растущими гибридомными опухол ми,c) ascites fluid of mice with growing hybridoma tumors,

г)глобулинова  фракци  содержащих МКАТ асцитических жидкостей.d) globulin fraction of ascitic liquids containing MKAT.

Титр антител против IgE человека определ ют с помощью твердофазного иммуно- ферментного анализа. Реакцию провод т в 4 этапа. На всех этапах дл  промывани  и разбавлени  реагентов используют раствор , содержащий 0,85% хлористого натри , 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,4 и 0,05% твина-20.The titer of antibodies against human IgE is determined by enzyme-linked immunosorbent assay. The reaction is carried out in 4 steps. At all stages, a solution containing 0.85% sodium chloride, 0.01 M phosphate buffer with a pH of 7.4 and 0.05% Tween-20 is used to wash and dilute the reagents.

На первом этапе на твердую фазу адсорбируют антиген. Дл  этого в  чейки планшетов дл  иммуноанализа внос т по 100 мкл раствора, содержащего 10 мкг IgE/L в 1 мл карбонзт-бикарбонатного буфера (0.01 М, рН-9,5). Инкубируют не менее 10 часов при +4С. Удал ют антиген из  чеек и однократно промывают.At the first stage, antigen is adsorbed onto the solid phase. For this, 100 µl of a solution containing 10 µg of IgE / L in 1 ml of carbonate-bicarbonate buffer (0.01 M, pH-9.5) is added to the cells of the immunoassay plates. Incubate for at least 10 hours at + 4C. Remove antigen from cells and rinse once.

На втором этапе в лунках планшетов готов т серийные разведени  исследуемых образцов объем по 100 мкл, инкубируют 1 час при +37 С, лунки освобождают от проб и трижды промывают.At the second stage, serial dilutions of the test samples prepared in 100 μl volumes are prepared in the wells of the plates, incubated for 1 hour at +37 C, the wells are freed from the samples and washed three times.

На третьем этапе к св занным на твердой фазе мышиным антителам присоедин ют меченые пероксидэзой кроличьиIn a third step, peroxidase-labeled rabbits are attached to solid phase-bound murine antibodies

антитела против иммуноглобулинов мышей. 8 лунки внос т по 100 мкл рабочего разведени  коньюгата, инкубируют 45 мин при +37 С, удал ют конъюгат и 5-кратно промывают .antibodies against mouse immunoglobulins. Eight wells were added with 100 µl of working dilution of the conjugate, incubated for 45 min at +37 C, the conjugate was removed and washed 5 times.

На последнем этапе с помощью цветной реакции вы вл ют активность перокси- дазы, св завшейс  с твердой фазой. В лунки внос т по 100 мкл субстратной смеси (1 мгAt the last stage, the color reaction reveals the activity of peroxidase bound to the solid phase. 100 μl of substrate mixture (1 mg

0 орто-фенилендиамина и 2 мкл 33% перекиси водорода в 10 мл« 0,05 М цитратного буфера с рН-4,7), инкубируют 30 минут при комнатной температуре в темноте и затем реакцию останавливают добавлением 500 ortho-phenylenediamine and 2 μl of 33% hydrogen peroxide in 10 ml of “0.05 M citrate buffer with pH-4.7), incubated for 30 minutes at room temperature in the dark and then the reaction was stopped by adding 50

5 мкл 2Н серной кислоты. Оптическую плотность проб регистрируют на фотометре Мультискан-МС при длине волны 492 нм. Результаты представлены в таблице 5.5 μl of 2N sulfuric acid. The optical density of the samples is recorded on a Multiscan-MS photometer at a wavelength of 492 nm. The results are presented in table 5.

V, Использование иммобилизованныхV, use of immobilized

0 на твердой фазе МКАТ Е/5Д4 дл  количественного определени  содержани  IgE в сыворотке крови человека0 on the solid phase MKAT E / 5D4 to quantify the content of IgE in human serum

Концентрацию IgE в сыворотке крови определ ют с помощью двухдетерминант5 ного твердофазного иммуноанализа, Адсорбированные на твердой фазе МКАТ 8У/5Д4 служат дл  захвата антигена из образца. Дл  вы влени  IgE, включенного на твердой фазе в иммунный комплекс, используют ме0 ченые ферментом специфичные к IgE поли- клональные антитела, изготовл емые НПО АЛЛЕРГЕН (г. Ставрополь), или монокло- нальные антитела, например, МКАТ продуцируемые клоном РИ-8-Е/4Ф4. РеакциюSerum IgE concentration was determined using a two-determinant solid-state immunoassay. Adsorbed on the solid phase MKAT 8U / 5D4 serve to capture antigen from the sample. For the detection of IgE incorporated in the solid phase into the immune complex, enzyme-labeled IgE-specific polyclonal antibodies manufactured by NPO ALLERGEN (Stavropol) or monoclonal antibodies, for example, MKAT produced by RI-8- clone, are used E / 4F4. Reaction

5 провод т в полистироловых планшетах фирмы NUNC. Дл  разбавлени  реагентов и отмывани  планшетов используют раствор того же состава, что в примере IV.5 are carried out on NUNC polystyrene plates. A solution of the same composition as in Example IV was used to dilute the reagents and wash the plates.

На первом этапе в лунки планшета вно0 с т раствор МКАТ Е/5Д4, содержащий 5 мкг белка в 1 мл 0,01 М карбонат-бикарбонатно- го буфера. рН-9,5. Инкубируют в течение ночи при +4С, раствор удал ют и лунки однократно промывают.At the first stage, MKAT E / 5D4 solution containing 5 μg of protein in 1 ml of 0.01 M carbonate-bicarbonate buffer is added to the wells of the plate. pH 9.5. Incubated overnight at + 4C, the solution was removed and the wells were washed once.

5 На втором этапе в лунки внос т образцы исследуемых сывороток и растворы с известным содержанием IgE, предназначенные дл  построени  калибровочной кривой (калибраторы фирмы Pharmacia). Инкубируют5 In a second step, samples of test sera and solutions with known IgE content are added to the wells for constructing a calibration curve (Pharmacia calibrators). Incubate

0 при +37 С 1 час, образцы удал ют и лунки трехкратно промывают.0 at +37 ° C for 1 hour, the samples were removed and the wells washed three times.

На третьем этапе в лунки внос т рабочее разведение конъюгата, инкубируют 1 час при +37 С, раствор удал ют, планшетAt the third stage, the working dilution of the conjugate is introduced into the wells, incubated for 1 hour at +37 C, the solution is removed, the plate

5 промывают п тикратно.5 washed five times.

На четвертом этапе в лунки внос т субстратную смесь дл  вы влени  активности пероксидазы. Состав смеси приведен в примере IV. Инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре, реакцию останавливают серной кислотой и измер ют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по примеру IV). На основании полученных данных стро т калибровочную кривую. По оси абсцисс откладывают концентрацию IgE в МЕ/мл, по оси ординат - оптическую плотность проб {фиг. 1). Пользу сь калибровочной кривой и учитыва  коэффициент раз- ведени  исследуемых сывороток, определ ют содержание в них IgE (таблица 6).In a fourth step, a substrate mixture is added to the wells to detect peroxidase activity. The composition of the mixture is shown in example IV. Incubated for 30 minutes in the dark at room temperature, the reaction was stopped with sulfuric acid and the absorbance of the samples was measured at a wavelength of 492 nm (as in Example IV). Based on the data obtained, a calibration curve is constructed. The IgE concentration in IU / ml is plotted along the abscissa, and the optical density of the samples is plotted along the ordinate (Fig. 1). Using the calibration curve and taking into account the dilution coefficient of the test sera, the IgE content in them is determined (Table 6).

VI. Использование МКАТ Е/5Д4 в качестве меченого реагента дл  количественного определени  содержани  IgE в сыворотке крови человека.VI. Use of MKAT E / 5D4 as a labeled reagent for the quantification of human serum IgE.

Концентрацию IgE в сыворотке крови определ ют с помощью двухсайтового варианта твердофазного иммуноанализа. Адсорбированные на твердой фазе lgE-специфические антитела служат дл  захвата антигена из образца. Дл  вы влени  IgE, включенного на твердой фазе в иммунный комплекс используют меченые перок- сидазой МКАТ 8Е/5Д4. Реакцию провод т в полистироловых планшетах фирмы NUNC. Дл  разбавлени  реагентов и отмывани  планшетов от несв завшихс  компонентов используют раствор того же состава, что в примере IV.Serum IgE concentration was determined using a two-site solid-state immunoassay. Solid phase adsorbed IgE-specific antibodies capture antigen from a sample. Peroxidase-labeled MKAT 8E / 5D4 is used to detect IgE incorporated on a solid phase in the immune complex. The reaction is carried out on NUNC polystyrene plates. A solution of the same composition as in Example IV was used to dilute the reagents and wash the tablets from unbound components.

На первом этапе в лунки планшета внос т раствор МКАТ-8Е/4Ф4, содержащий 5 мкг белка в 1 мл 0,01 М карбонат-бикарбо- натного буфера, рН-9,5. Инкубируют в течение ночи при +4С, затем раствор удал ют и лунки однократно промывают.At the first stage, MKAT-8E / 4F4 solution containing 5 μg of protein in 1 ml of 0.01 M carbonate-bicarbonate buffer, pH-9.5, is added to the wells of the plate. Incubated overnight at + 4C, then the solution was removed and the wells were washed once.

На втором этапе разведени  исследуемых сывороток и растворы с известным содержанием IgE, предназначенные дл  построени  калибровочной кривой (калибраторы фирмы Pharmacia) внос т в лунки планшетов, инкубируют при +37 С 1 час, затем лунки освобождают от раствора и промывают трехкратно.At the second stage of dilution of the test sera and solutions with a known IgE content intended for constructing a calibration curve (Pharmacia calibrators), they are introduced into the wells of the plates, incubated at +37 ° C for 1 hour, then the wells are freed from the solution and washed three times.

На третьем этапе рабочее разведение коньюгата МКАТ 8Е/5Д4 с пероксидазой внос т в лунки, инкубируют 1 час при+37С, раствор удал ют, планшет промывают 5 раз.At the third stage, a working dilution of MKAT 8E / 5D4 conjugate with peroxidase is added to the wells, incubated for 1 hour at + 37 ° C, the solution is removed, the plate is washed 5 times.

На четвертом этапе в лунки внос т субстратную смесь дл  вы влени  активности пероксидазы. Состав смеси приведен в примере IV. Инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре, затем останавливают реакцию добавлением серной кислоты и измер ют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по примеру IV). НаIn a fourth step, a substrate mixture is added to the wells to detect peroxidase activity. The composition of the mixture is shown in example IV. Incubated for 30 minutes in the dark at room temperature, then stop the reaction by adding sulfuric acid and measure the optical density of the samples at a wavelength of 492 nm (as in Example IV). On the

основании полученных данных стро т калибровочную кривую. По оси абсцисс (лога- рифмическа  шкала) откладывают концентрацию IgE в МЕ/мл, а по оси ординат - оптическую плотность соответствующих проб (фиг. 2). Пользу сь калибровочной кривой и учитыва  коэффициент разведени  исследуемых сывороток, определ ют содержание в них IgE (таблица 7).Based on the data obtained, a calibration curve is constructed. On the abscissa axis (logarithmic scale), the IgE concentration in IU / ml is plotted, and on the ordinate axis, the optical density of the corresponding samples (Fig. 2). Using the calibration curve and taking into account the dilution coefficient of the test sera, the IgE content in them is determined (Table 7).

Технико-экономическа  эффективность изобретени .Feasibility of the invention.

Преимущество предлагаемого гибри- домного штамма РИ-8-Е/5Д4 определ етс  тем, что дл  поддержани  его в культуре неThe advantage of the proposed hybrid strain RI-8-E / 5D4 is determined by the fact that to maintain it in culture

требуютс  ростовые факторы эмбриональной сыворотки. Поскольку примен ема  в работе с полученным штаммом сыворотка крупного рогатого скота в 50-100 раз дешевле эмбриональной сыворотки, затраты приfetal serum growth factors are required. Since the bovine serum used in the work with the obtained strain is 50-100 times cheaper than fetal serum, the costs for

наработке МКАТ в услови х культивировани  и при наращивании клеточной массы дл  прививки животным существенно снижаютс .the production of MKAT under culturing conditions and when the cell mass for vaccination with animals is increased is significantly reduced.

Преимущества МКАТ, продуцируемыхAdvantages of MKAT Produced

предложенным штаммом, в сравнении с по- ликлональными антителами состо т, во- первых, в том, что дл  получени  каждой новой партии антител не требуетс  повторени  цикла иммунизации и расхода очищенного IgE человека,, который из-за редкой встречаемости больных с lgE-продуцирую- щей миеловой чрезвычайно малодоступен. Во-вторых, иммунохимические тесты, основанные на применении МКАТ против IgE,the proposed strain, in comparison with polyclonal antibodies, consists, firstly, in order to obtain each new batch of antibodies, the immunization cycle and the consumption of purified human IgE are not required, which, due to the rare occurrence of patients with IgE-producing - The myeloid is extremely inaccessible. Secondly, immunochemical tests based on the use of MKAT against IgE,

обладают абсолютной специфичностью, тогда как специфичность поликлональных сывороток может варьировать в широких пределах.have absolute specificity, while the specificity of polyclonal sera can vary within wide limits.

К преимуществам описываемого штамма относитс  то, что синтезируемые им МКАТ, иммобилизованные на твердой фазе, могут в сочетании с мечеными lgE-специ- фичными моно- или поликлональными антителами обеспечивать определение общегоThe advantages of the described strain include the fact that the synthesized by it MKAT, immobilized on the solid phase, in combination with labeled IgE-specific mono- or polyclonal antibodies, can determine the total

IgE в сыворотке крови человека. МКАТ, продуцируемые штаммом, сохран ют антиген- распознающую способность при присоединении ферментной метки и могут также служить вы вл ющим реагентом приIgE in human serum. MKAT produced by the strain retain antigen-recognition ability upon attachment of the enzyme label and can also serve as a reagent when

Claims (1)

определении IgE методом двухдетерминан- тного твердофазного иммуноанализа. Формула изобретени  Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (П) №determination of IgE by the method of two-determinant solid-phase immunoassay. The formula of the invention The strain of hybrid cultured animal cells Mus musculus L. VSCK (P) No. 403Д - продуцент моноклональных антител против IgE человека.403D is a producer of monoclonal antibodies against human IgE. Таблица 1Table 1 Гибридомные штамма-продуценты МКА.Т ПРОТИВ IgE человекаHybridoma-producing strains of MKA.T AGAINST human IgE № No. Характеристика штаммов .Characterization of strains. продуцентов ЩЩшифр штамма партнеры в сли нииproducers of cipher strain strain partners in fusion шеломаshelloma лимфоцитыlymphocytes 1. H4.4ES, NSI R4. ЕС10.1. H4.4ES, NSI R4. EC10. Balb/cBalb / c нкг/1nkg / 1 НЕЗ НЕ4УЗNEZ NE4UZ РЗхбЗ Ва1Ь/с Ag8.653Rzkhbz Ba1b / s Ag8.653 3. HI-BL- РЗхбЗ A/J IgE/1-10 Ag8.6533. HI-BL- Rhzbz A / J IgE / 1-10 Ag8.653 4, IgE/11-l Р3х853 Balb/04, IgE / 11-l P3x853 Balb / 0 применени application Биб- лш- гра- фи Biblsh-grafi Шлуколичвствввный одноступенчатый двухсай- товьй ишлуноферментный тест вщвленкк общэго IgESingle-stage, two-site, two-site enzyme-linked immunosorbent assay Твердофазный аллергосор- бентный радиоиммуноана- Л113 дл  вы влени  аллер- гвнсшцифического IgE Количественное определение обшэго IgE в радио- или иммунофершнтном анализеSolid-phase allergenic sorbent radioimmuno-L113 for the detection of allergic immunoglobulin IgE Quantitative determination of total IgE in a radio or immunoassay analysis Определение обшрго IgE с помощью двухсайтово- го иммутюфермвнтного анализаDetermination of Extensive IgE Using a Two-Site Immune Analysis Результат тестировани  специфичности антител, продуцируемых первичными культурами гибридом.The result of testing the specificity of antibodies produced by primary hybridoma cultures. Примечани : + антитела св зываютс  с антигеномNotes: + antibodies bind to the antigen - отсутствие реакции между антителами и антигеном- lack of reaction between antibodies and antigen Вы вление igE с помен ю двухдетерминантного твердофазного шмуноферментного анализа.Detection of igE with changes in the two determinant enzyme linked immunosorbent assay. Примечание. Определение IgE проводилось в пуле иэ 13 сывороток от аллергических больных. Разведение образца 1:10.Note. IgE determination was carried out in a pool of 13 sera from allergic patients. Dilution of the sample 1:10. Таблица .Table. Таблица 3Table 3 Титры ШАТ, продуцируемых клетками штамма 8Е/5Д4 .при выращивании в низкосывороточной среде.Titers of SHAT produced by cells of strain 8E / 5D4. When grown in low-serum medium. Примечание. В таблице представлены средние и предельные ( в скобках) значени  обратных титров, полученные дл  6-9 отдельных культур.Note. The table shows the average and limit (in parentheses) values of the inverse titers obtained for 6-9 individual cultures. Таблица 5Table 5 Титры МШ, продуцируемых клетками шташа Е/5Д4 в культуральной среде и в асцитической жидкости.The titers of MB produced by cells of staff E / 5D4 in the culture medium and in ascitic fluid. Примэчан э.1 В таблице представлены средние показатели обратных титров МШ, полученные при анализе 4-6 образцов.Primechan e. 1 The table shows the average values of the reverse titers of MSH obtained in the analysis of 4-6 samples. Таблица 4Table 4 2121 Содержание IgE в образцах сыворотки крови Человека, определенное в двухсайтовом иммуноанализе с помощью иммобилизованных МКАТ Е/5Д4.The IgE content in human serum samples determined in a two-site immunoassay using immobilized MKAT E / 5D4. NN образцаNN sample Оптическа  плотностьOptical density 0,955 0,775 1,190 0,681 1,166 0,600 0,884 0,9980.955 0.775 1.190 0.681 1.166 0.600 0.884 0.998 Примечание. Определение содержани  IgE в сыворотке проведено с помощью калибровочной кривой, ФЯГ. 1.Note. Serum IgE was determined using a calibration curve, VFG. 1. Таблица 7Table 7 Вы вление IgE в образцах сыворотки крови в двухсайтовом иммуноанализе с помощью меченых МШ Е/5Д4.Detection of IgE in blood serum samples in a two-site immunoassay using labeled MS E / 5D4. Примечание. Определение содержани  ItfE в МЕ/мд в сыворотках проведено с помощью калибровочной кривой, представленной на ФИГ. 2.Note. The ItfE content in IU / ppm in the sera was determined using the calibration curve shown in FIG. 2. 17766911776691 2222 Таблица 6Table 6 Количество IgE -ME/MIThe number of IgE-ME / MI 42 18 103 21 92 10 28 5042 18 103 21 92 10 28 50 Ветвление UE с помощью двухдвтериинант ого пкму оютричвского теста.UE branching using the two-do-the-second PCM of the Oytrich test. NN I Сущность этапа анализа втвлаNN I The essence of the analysis phase ЯшюОш аашп URAT-IYashyu Osh aashp URAT-I Про вление реакции - вы в- ленив метки, фиксированной на фазе.Manifestation of the reaction - having removed the label fixed on the phase. Примечание после каждого из указанных этаповNote after each of these steps производитс  отшвание от компонентов, не св завшихс  с твердой фазой.segregation from components not related to the solid phase occurs. Вы вление аллерген-специфичного IgE с помощью аллергосорбентного теста.Detection of allergen-specific IgE using an allergy sorbent test. NN этапаNn stage Сущность этапа анализаThe essence of the analysis phase 1. Иммобилизаци  аллергена твердой фаза.1. Immobilization of a solid phase allergen. Инкубаци  с сывороткой, тестируемой на присутствие. IgE-антител. Формирование иммунных комплексов сывороточных антител с аллергеном. Incubation with serum tested for presence. IgE antibodies. The formation of immune complexes of serum antibodies with an allergen. Инкубаци  с МКАТ против IjE, мечеными ферментом или изотопом . Формирование иммунного комплекса UKAT И 1еЕ, св занного с аллергеном.Incubation with MKAT against IjE labeled with an enzyme or isotope. Formation of the UKAT AND 1eE Immune Complex Associated with the Allergen. 4. Вы вление ферментной или изотопной метки, св занной из твердой фазе.4. Detection of an enzyme or isotope tag bound from a solid phase. Примечание. После каждого из указанных этап-Vпроизводитс  отмывание от компонентов, не св завшихс  с твердой фазой.Note. After each of the aforementioned step V, washing is carried out from components that are not bound to the solid phase. Схеиатическое изображениеSchematic image V V VV v v Схема 2.Scheme 2. Схематическое изображениеSchematic image ММMM OD/«2 mOD / "2 m г.ълgl .в .at IBIB вкг. 1 vkg. 1 Штамп гиврид чх культивируемы кгеток животных Ша msculus L., (BCMflV No 403Д). используемый дм получени  ионбхлоаалышхThe Stamp Hyvrid ch. Cultivated animal petlets Sha msculus L., (BCMflV No. 403D). used to obtain ionic acid антител против юыу огловуво Е чвдоавка. Ось абсцисс - концентраци  IgE в UE/ita, ос ординат - оптичвсчка  плотность при диве вол и «2 ни. antibodies against yuyu oglovuvo E chvdoavka. The abscissa axis is the concentration of IgE in UE / ita, the ordinate is the optical density at a diva and 2 ni. 01/492 ш 2.8-101/492 w 2.8-1 8.85В 18B8.85V 18B UU U/ilU / il S8 18ВS8 18V