RU175461U1 - DEVICE FOR DETERMINING THE CONTENT OF GLUCOSE, LACTATE, ETHANOL AND STARCH IN THE JOINT PRESENCE - Google Patents

Abstract

Техническое решение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности, а именно, к биосенсорным аналитическим устройствам. Устройство может быть использовано для определения содержания глюкозы, лактата, этанола и крахмала при их совместном присутствии в образцах бродильных и ферментационных сред и готовой продукции ликероводочных, глюкозо-паточных и других производств. Задачей технического решения является повышение точности анализа глюкозы, лактата, этанола и крахмала и расширение диапазона определяемых концентраций данных веществ. Устройство для определения содержания глюкозы, лактата, этанола и крахмала при совместном присутствии, содержащее измерительную кювету и биосенсорную систему, включающую четыре графитовых печатных электрода с ферментными препаратами: глюкозооксидаза, алкогольоксидаза, лактатоксидаза, смесь глюкозооксидазы и γ-амилазы, причем рабочая поверхность графитовых печатных электродов модифицирована одностенными углеродными нанотрубками. 1 ил.The technical solution relates to the field of biotechnology and the food industry, namely, to biosensor analytical devices. The device can be used to determine the content of glucose, lactate, ethanol and starch when they are together in samples of fermentation and fermentation media and finished products of distillery, glucose-syrup and other industries. The objective of the technical solution is to increase the accuracy of the analysis of glucose, lactate, ethanol and starch and to expand the range of determined concentrations of these substances. A device for determining the content of glucose, lactate, ethanol and starch in a joint presence, containing a measuring cuvette and biosensor system, including four graphite printing electrodes with enzyme preparations: glucose oxidase, alcohol oxidase, lactic oxidase, a mixture of glucose oxidase and γ-amylase, and the working surface of graphite printing modified by single-walled carbon nanotubes. 1 ill.

Description

Техническое решение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности, а именно к биосенсорным аналитическим устройствам. Устройство может быть использовано для определения содержания глюкозы, лактата, этанола и крахмала при их совместном присутствии в образцах бродильных и ферментационных сред и готовой продукции ликероводочных, глюкозо-паточных и других производств.The technical solution relates to the field of biotechnology and the food industry, namely to biosensor analytical devices. The device can be used to determine the content of glucose, lactate, ethanol and starch when they are together in samples of fermentation and fermentation media and finished products of distillery, glucose-syrup and other industries.

Аналогами являются следующие приборы: поляриметр, газовый хроматограф, жидкостной хроматограф, система капиллярного электрофореза. К недостаткам поляриметра относится неселективность анализа, невозможность определения лактата и этанола, и необходимость предварительного гидролиза пробы, содержащей крахмал. Газовый хроматограф позволяет селективно определять содержание летучих веществ, в частности, этанола, но не способен определять содержание глюкозы, лактата и крахмала. Кроме этого к недостаткам газового хроматографа относятся высокая стоимость аппаратурного оформления и значительная продолжительность анализа. Жидкостной хроматограф позволяет определять содержание глюкозы, лактата и крахмала, но не предназначен для определения содержания этанола. Дополнительным недостатком прибора является необходимость пробоподготовки - предварительного гидролиза - пробы, содержащей крахмал. Система капиллярного электрофореза, как и жидкостной хроматограф, не способна определять содержание этанола, требует пробоподготовки крахмалсодержащих образцов, и индивидуальных параметров измерения для каждого определяемого вещества.The following instruments are analogs: polarimeter, gas chromatograph, liquid chromatograph, capillary electrophoresis system. The disadvantages of the polarimeter include the non-selectivity of the analysis, the inability to determine lactate and ethanol, and the need for preliminary hydrolysis of a sample containing starch. A gas chromatograph allows you to selectively determine the content of volatile substances, in particular ethanol, but is not able to determine the content of glucose, lactate and starch. In addition, the disadvantages of a gas chromatograph include the high cost of hardware design and a significant analysis time. A liquid chromatograph allows you to determine the content of glucose, lactate and starch, but is not intended to determine the content of ethanol. An additional disadvantage of the device is the need for sample preparation — preliminary hydrolysis — of a sample containing starch. The capillary electrophoresis system, like a liquid chromatograph, is not able to determine the ethanol content, it requires sample preparation of starch-containing samples, and individual measurement parameters for each substance to be determined.

Наиболее близким по своим признакам, принятым за прототип, является устройство для определения содержания компонентов бродильных и ферментационных сред (патент RU 155697, опубл. 20.10.2015).The closest in its features adopted for the prototype is a device for determining the content of components of fermentation and fermentation media (patent RU 155697, publ. 20.10.2015).

Устройство включало в себя измерительную кювету и четыре графитовых печатных рабочих электрода, каждый из которых состоял из хлоридсеребряного электрода сравнения и графитовых рабочего и вспомогательного электродов. Каждый рабочий электрод был покрыт слоем Берлинской лазури, поверх которой располагался ферментный препарат: иммобилизованные глюкозооксидаза, лактатоксидаза, алкогольоксидаза или смесь глюкозооксидазы и γ-амилазы, в зависимости от требуемой селективности электрода.The device included a measuring cell and four graphite printed working electrodes, each of which consisted of a silver chloride reference electrode and graphite working and auxiliary electrodes. Each working electrode was coated with a layer of Prussian blue on top of which an enzyme preparation was placed: immobilized glucose oxidase, lactic oxidase, alcohol oxidase or a mixture of glucose oxidase and γ-amylase, depending on the required electrode selectivity.

Недостатком описанного устройства является недостаточная точность анализа, т.к. для определения концентрации субстрата оно использует косвенный метод, основанный на детекции пероксида водорода, образующегося в ходе течения ферментативных реакций, что негативно сказывается на стабильности ответов сенсора.The disadvantage of the described device is the lack of accuracy of the analysis, because To determine the concentration of the substrate, it uses an indirect method based on the detection of hydrogen peroxide formed during the course of enzymatic reactions, which negatively affects the stability of the sensor responses.

Задачей технического решения является повышение точности анализа глюкозы, лактата, этанола и крахмала и расширение диапазона определяемых концентраций данных веществ.The objective of the technical solution is to increase the accuracy of the analysis of glucose, lactate, ethanol and starch and to expand the range of determined concentrations of these substances.

Поставленная задача решается заменой покрытия Берлинской лазури на рабочих электродах биосенсоров на одностенные углеродные нанотрубки, которые увеличивают площадь контакта ферментного препарата с электродом и исключают промежуточное звено (химическую реакцию на электроде), что создает условия для прямого (неосложненного) переноса электронов в ходе ферментативной реакции.The problem is solved by replacing the coating of Berlin blue on the working electrodes of biosensors with single-walled carbon nanotubes, which increase the contact area of the enzyme preparation with the electrode and exclude the intermediate link (chemical reaction on the electrode), which creates the conditions for direct (uncomplicated) electron transfer during the enzymatic reaction.

На фиг. 1 показано устройство для определения содержания глюкозы, лактата, этанола и крахмала при совместном присутствии. Устройство состоит из следующих элементов: четырех графитовых печатных электродов 1, модифицированных одностенными углеродными нанотрубками, на которых размещены рецепторные элементы 2, 3, 4, 5. Графитовые печатные электроды 1, модифицированные одностенными углеродными нанотрубками, с ферментными препаратами 2, 3, 4, 5 помещены в измерительную кювету 6, в которой размещен буферный раствор объемом 4 мл. Ферментные препараты 2, 3, 4, 5 имеют следующий состав:In FIG. 1 shows a device for determining the content of glucose, lactate, ethanol and starch in a joint presence. The device consists of the following elements: four graphite printing electrodes 1, modified with single-walled carbon nanotubes, on which receptor elements 2, 3, 4, 5 are placed. Graphite printing electrodes 1, modified with single-walled carbon nanotubes, with enzyme preparations 2, 3, 4, 5 placed in a measuring cell 6, in which a 4 ml buffer solution is placed. Enzyme preparations 2, 3, 4, 5 have the following composition:

2 - глюкозооксидаза, иммобилизованная в гель бычьего сывороточного альбумина, поперечно-сшитого глутаровым альдегидом;2 - glucose oxidase immobilized in a gel of bovine serum albumin cross-linked with glutaraldehyde;

3 - лактатоксидаза, иммобилизованная в гель бычьего сывороточного альбумина, поперечно-сшитого глутаровым альдегидом;3 - lactic oxidase immobilized in a gel of bovine serum albumin cross-linked with glutaraldehyde;

4 - алкогольоксидаза, иммобилизованная в гель бычьего сывороточного альбумина, поперечно-сшитого глутаровым альдегидом;4 - alcohol oxidase immobilized in a gel of bovine serum albumin cross-linked with glutaraldehyde;

5 - смесь глюкозооксидазы и γ-амилазы, иммобилизованная в гель бычьего сывороточного альбумина, поперечно-сшитого глутаровым альдегидом.5 - a mixture of glucose oxidase and γ-amylase immobilized in a gel of bovine serum albumin cross-linked with glutaraldehyde.

Принцип работы устройства для определения содержания глюкозы, лактата, этанола и крахмала при совместном присутствии заключается в следующем.The principle of operation of the device for determining the content of glucose, lactate, ethanol and starch in the joint presence is as follows.

Графитовые печатные электроды 1 с размещенными на них ферментными препаратами 2, 3, 4, 5 помещают в измерительную кювету 6. В кювету 6 добавляют 4 мл 30 мМ фосфатного буферного раствора (pH 6, 8), содержащего хлорид калия в концентрации 0,1 М, и регистрируют фоновую силу тока, проходящего через каждый печатный электрод. Затем вводят пробу, содержащую смесь анализируемых веществ (100 мкл). Все измерения проводят при комнатной температуре. После регистрации сигнала печатных электродов (зависимость силы тока от времени), измерительную кювету промывают буферным раствором. Для каждого печатного электрода с рецепторным элементом рассчитывают амплитуду изменения силы тока, произошедшего в результате введения пробы в измерительную кювету (ответ биосенсора, ΔI, нА) и определяют содержание глюкозы, лактата, этанола и крахмала с использованием предварительно составленных градуировочных зависимостей ответа биосенсора от содержания определяемого вещества. Для регистрации ответа биосенсора предлагается использовать многоканальный потенциостат MultiEmStat (PalmSens, Нидерланды), либо одноканальный потенциостат EmStat (PalmSens, Нидерланды) с приставкой-мультиплексором EmStatMUX8 (PalmSens, Нидерланды), подключаемые к графитовым печатным электродам и персональному компьютеру.Graphite printing electrodes 1 with the enzyme preparations 2, 3, 4, 5 placed on them are placed in the measuring cell 6. In the cell 6 add 4 ml of 30 mM phosphate buffer solution (pH 6, 8) containing potassium chloride at a concentration of 0.1 M , and record the background current passing through each printing electrode. Then enter the sample containing a mixture of analytes (100 μl). All measurements are carried out at room temperature. After recording the signal of the printing electrodes (current versus time), the measuring cell is washed with a buffer solution. For each printed electrode with a receptor element, the amplitude of the change in the current strength that occurred as a result of introducing the sample into the measuring cuvette (biosensor response, ΔI, nA) is calculated and the content of glucose, lactate, ethanol and starch is determined using pre-compiled calibration dependences of the biosensor response on the content determined substances. To register the response of the biosensor, it is proposed to use a multi-channel potentiostat MultiEmStat (PalmSens, Netherlands), or a single-channel potentiostat EmStat (PalmSens, Netherlands) with an EmStatMUX8 multiplexer attachment (PalmSens, Netherlands), connected to graphite printed electrodes and a personal computer.

Длительность единичного измерения с использованием устройства для определения содержания глюкозы, лактата, этанола и крахмала при совместном присутствии составляет 2-3 минуты. Диапазон определяемых значений концентраций компонентов составляет 0,75-3,38 мМ глюкозы, 5,0-80,46 мМ лактата, 1,1-27 мМ этанола и 0,6-21 г/л крахмала. Стандартное отклонение по 10 последовательным измерениям составляет до 5%. Ошибка измерения содержания крахмала, глюкозы, лактата и этанола составляет не более 10%.The duration of a single measurement using a device for determining the content of glucose, lactate, ethanol and starch in the joint presence is 2-3 minutes. The range of determined concentrations of the components is 0.75-3.38 mm glucose, 5.0-80.46 mm lactate, 1.1-27 mm ethanol and 0.6-21 g / l starch. The standard deviation for 10 consecutive measurements is up to 5%. The error in measuring the content of starch, glucose, lactate and ethanol is not more than 10%.

Таким образом, устройство для определения содержания глюкозы, лактата, этанола и крахмала при совместном присутствии позволило расширить диапазон определяемых концентраций субстратов и значительно улучшить точность анализа.Thus, the device for determining the content of glucose, lactate, ethanol and starch in the joint presence allowed to expand the range of detectable concentrations of substrates and significantly improve the accuracy of the analysis.

Claims (1)

Устройство для определения содержания глюкозы, лактата, этанола и крахмала при совместном присутствии, содержащее измерительную кювету и биосенсорную систему, включающую четыре графитовых печатных электрода с ферментными препаратами: глюкозооксидаза, алкогольоксидаза, лактатоксидаза, смесь глюкозооксидазы и γ-амилазы, отличающееся тем, что рабочая поверхность графитовых печатных электродов модифицирована одностенными углеродными нанотрубками.A device for determining the content of glucose, lactate, ethanol and starch in the joint presence, containing a measuring cuvette and biosensor system, including four graphite printing electrodes with enzyme preparations: glucose oxidase, alcohol oxidase, lactic oxidase, a mixture of glucose oxidase and γ-amylase, characterized in that the working surface graphite printing electrodes modified with single-walled carbon nanotubes.

Images