RO137239A0 - Process for preparing a hydrogel from cardiac tissue functionalized with an anti-inflammatory agent - Google Patents

Abstract

The invention refers to a process for preparing a functionalized hydrogel to be used in the regenerative medicine of the myocardium damaged after myocardial infarction (MI). According to the invention, the process consists of the following steps: decellularization of murine or porcine myocardium by hypotonic shock, protein extraction with detergent, nuclease digestion with specific enzymes, freezing and lyophilization of the acellular matrix for 72 h at -48°C and 0.045 mBar, addition of an acid solution of 10 mM HCl and porcine pepsin at the final concentration of 160 U/mg of matrix, neutralization of the acidic pH with 1M NaOH solution, followed by incubation for 90 min in the incubator, resulting in a hydrogel containing glycosaminoglycans and proteins of extracellular matrix collagen I and IV, elastin, fibronectin and laminin, being functionalized with an anti-inflammatory compound of the S100A9 alarmin inhibitor type for intervention in the inflammatory phase of post MI pathological evolution.

Description

DESCRIEREA INVENȚIEIDESCRIPTION OF THE INVENTION

OFICIUL DE STAT PENTRU INVENȚII Șl MĂRCI Cerere de brevet de invențieSTATE OFFICE FOR INVENTIONS AND TRADEMARKS Patent application

Nr.....£.....2=22...............No.....£.....2=22...............

Data depozit...............Date of deposit...............

Descrierea stadiului actual - stadiu actual context științific actualDescription of the current state - current state current scientific context

a) Infarctul miocardic. Bolile cardiovasculare (BCV) reprezintă principala cauză de mortalitate la nivel global, cu aproximativ 18 milioane de victime numai în anul 2017 [Roth et al., 2017]. 85% din decese se datorează bolii cardiace ischemice și bolii cerebrovasculare. Deși programele de informare a populației cu privire la factorii de risc și modalitățile de prevenție au început să aiba un impact din ce în ce mai mare, incidența și răspândirea acestor patologii nu au scăzut, fiind înregistrată o creștere de peste 20% a numărului total de decese în perioada 2007-2017 [Roth et al., 2017], în timp ce progresele medicale recente au redus riscul de deces în timpul unui atac de cord, modificările structurale și deteriorarea inimii cauzate de moartea cardiomiocitelor și degradarea ulterioară a matricei extracelulare miocardice, caracterizată prin subțierea peretelui ventricular stâng și dilatarea camerei, pot duce la insufuciență cardiacă ulterior, post infarct miocardic (IM). Prin urmare, o problemă importantă a reparării post-infarct miocardic este de a minimiza daunele pe termen lung prin reducerea inflamației și generarea de noi celule miocardice funcționale și matrice extracelulară adecvată.a) Myocardial infarction. Cardiovascular diseases (CVD) are the main cause of mortality globally, with approximately 18 million victims in 2017 alone [Roth et al., 2017]. 85% of deaths are due to ischemic heart disease and cerebrovascular disease. Although programs to inform the population about risk factors and methods of prevention began to have an increasing impact, the incidence and spread of these pathologies did not decrease, with an increase of over 20% in the total number of deaths from 2007-2017 [Roth et al., 2017], while recent medical advances have reduced the risk of death during a heart attack, the structural changes and damage to the heart caused by cardiomyocyte death and subsequent degradation of the myocardial extracellular matrix, characterized by thinning of the left ventricular wall and dilation of the chamber, can lead to heart failure later, post myocardial infarction (MI). Therefore, an important issue of post-myocardial infarction repair is to minimize long-term damage by reducing inflammation and generating new functional myocardial cells and adequate extracellular matrix.

Regenerarea miocardului deteriorat post-IM rămâne o provocare importantă neabordată suficient.Regeneration of the damaged myocardium post-MI remains an important challenge not sufficiently addressed.

Infarctul miocardic are loc atunci când fluxul sangvin către mușchiul inimii este blocat sau redus semnificativ [Saleh & Ambrose, 2018], datorită unei ocluzii produse de un cheag de sânge format în lumenul arterelor coronare, ca urmare a leziunilor peretelui vascular coronarian. Destabilizarea plăcilor aterosclerotice prezente la nivelul arterelor coronare, fie prin ruptură fie prin eroziune, declanșează cascada trombotică și favorizează apariția unui aterotrombus dinamic care obturează artera și împiedică irigarea corespunzătoare a inimii, producând ischemia țesutului cardiac afectat. Ocluzia arterei coronare împiedică transportul de oxigen și nutrienți, conducând în cele din urmă la moartea a numeroase celulele miocardice, datorată ischemiei prelungite (Figura 1).Myocardial infarction occurs when blood flow to the heart muscle is blocked or significantly reduced [Saleh & Ambrose, 2018], due to an occlusion produced by a blood clot formed in the lumen of the coronary arteries, as a result of damage to the coronary vascular wall. Destabilization of the atherosclerotic plaques present in the coronary arteries, either by rupture or erosion, triggers the thrombotic cascade and favors the appearance of a dynamic atherothrombus that occludes the artery and prevents proper irrigation of the heart, producing ischemia of the affected cardiac tissue. Coronary artery occlusion prevents the transport of oxygen and nutrients, ultimately leading to the death of numerous myocardial cells due to prolonged ischemia (Figure 1).

Figura 1. Schematizare infarct miocardic. Infarctul miocardic apare atunci când un vas major care furnizează sânge către inimă (numit arteră coronară) este blocat, ceea ce duce la privarea de oxigen a unei părți din țesutului inimii. Lipsa de oxigen a țesutului inimii cauzează deteriorarea sau moartea zonei afectate. Blocarea vasului de sânge este un proces de durată înFigure 1. Myocardial infarction schematic. Myocardial infarction occurs when a major vessel that supplies blood to the heart (called a coronary artery) is blocked, depriving part of the heart tissue of oxygen. Lack of oxygen to the heart tissue causes damage or death to the affected area. Blood vessel blockage is a long-term process in

care factorii inflamatori și lipidele din organism se lipesc de pereții arterelor formând ceea ce se numește o placă ateromatoasa. Când o bucată din această placă este ruptă, se formează un cheag (numit tromb) care blochează vasul de sânge (sursa www.elitecardiovascular.com).which inflammatory factors and lipids in the body stick to the walls of the arteries forming what is called an atheromatous plaque. When a piece of this plaque is ruptured, a clot (called a thrombus) forms and blocks the blood vessel (source www.elitecardiovascular.com).

Capacitatea limitată de regenerare a cardiomiocitelor în țesutul miocardic adult conduce la remodelare dezadaptativă a ventriculului, inclusiv subțierea peretelui ventricular, formarea țesutului cicatricial și în cele din urmă insuficiență cardiacă [Wu T. & Liu W, 2022], Datorită capacitatii de regenerare neglijabile a inimii (un tum-over anual de doar 1-2% al cardiomiocitelor), oamenii de știință caută în permanență strategii care să inducă regenerarea și recuperarea funcțională a cordului [Hashimoto et al., 2018; Tumer et al., 2020]. De-a lungul timpului aceasta problemă a fost abordată din multiple direcții, una dintre cele mai promițătoare căi fiind terapia celulară. Având în vedere rezultatele contradictorii ale studiilor clinice care au folosit terapii celulare, nevoia de a dezvolta o terapie eficientă rămâne de actualitate. Mai mult decât atât, progresul recent al ingineriei tisulare, care presupune utilizarea în paralel a celulelor și biomaterialelor pentru reconstrucția tisulară, proiectează noi soluții pentru tratamentul afecțiunilor cardiovasculare.The limited regenerative capacity of cardiomyocytes in adult myocardial tissue leads to maladaptive remodeling of the ventricle, including thinning of the ventricular wall, the formation of scar tissue and ultimately heart failure [Wu T. & Liu W, 2022], Due to the negligible regenerative capacity of the heart (an annual tum-over of only 1-2% of cardiomyocytes), scientists are constantly looking for strategies to induce regeneration and functional recovery of the heart [Hashimoto et al., 2018; Tumer et al., 2020]. Over time, this problem has been approached from multiple directions, one of the most promising ways being cell therapy. Given the conflicting results of clinical trials using cell therapies, the need to develop an effective therapy remains urgent. Moreover, recent progress in tissue engineering, which involves the parallel use of cells and biomaterials for tissue reconstruction, is designing new solutions for the treatment of cardiovascular diseases.

b) Strategii terapeutice pentru infarctul miocardic: terapia celulară și ingineria tisulară Ischemia locală are consecințe celulare si locale grave, printre care: (i) activarea endoteliului și pierderea funcției sale de barieră selectivă, ceea ce duce la o creștere a permeabilității endoteliale și expresia crescută a moleculelor de adeziune care inițiază inflamația locală; (ii) necroza celulelor miocardice și dezintegrarea treptată a matricei extracelulare, producându-se astfel o pierdere ireversibilă a cardiomiocitelor viabile. Celulele necrotice, precum și matricea extracelulară afectată, eliberează molecule semnal (DAMPs - damage-associated molecular pattems) care sunt recepționate de către celulele sistemului imunitar prin receptorii specifici PRR (pattem recognition receptors) declanșând semnalizări celulare și supra-expresie a chemokinelor și citokinelor, care mai departe produc un proces inflamator (prin recrutarea celulelor sistemului imunitar înnăscut și reacții nespecifice ale celui adaptativ). Deși scopul recrutării acestor celule este de a înlătura resturile celulare din zona afectată in urma infarctului, această infiltrare leucocitară, contribuie însă la lezarea suplimentară a endoteliului și țesutului subendotelial, prin exacerbarea inflamației si a speciilor reactive de oxigen care se generează odată cu revenirea fluxului sangvin [Prabhu & Frangogiannis, 2016],b) Therapeutic strategies for myocardial infarction: cell therapy and tissue engineering Local ischemia has serious cellular and local consequences, including: (i) activation of the endothelium and loss of its selective barrier function, leading to an increase in endothelial permeability and increased expression of adhesion molecules that initiate local inflammation; (ii) necrosis of myocardial cells and gradual disintegration of the extracellular matrix, thus producing an irreversible loss of viable cardiomyocytes. Necrotic cells, as well as the affected extracellular matrix, release signal molecules (DAMPs - damage-associated molecular pattems) that are received by the cells of the immune system through the specific receptors PRR (pattern recognition receptors), triggering cellular signaling and over-expression of chemokines and cytokines, which further produce an inflammatory process (by recruiting the cells of the innate immune system and non-specific reactions of the adaptive one). Although the purpose of the recruitment of these cells is to remove cellular debris from the affected area after the infarction, this leukocyte infiltration contributes to additional damage to the endothelium and subendothelial tissue, by exacerbating inflammation and the reactive oxygen species that are generated with the return of blood flow [Prabhu & Frangogiannis, 2016],

RO 137239 AORO 137239 AO

Răspunsul inflamator post-infarct poate fi împărțit în trei etape: faza inflamatoare, faza proliferativă si faza de maturare și este definitoriu pentru evoluția ulterioară a IM și a remodelării ventriculare. Inflamația timpurie este necesară pentru a realiza înlăturarea celulelor necrotice și pentru repararea tisulară, însă la fel de importantă este stoparea stimulilor pro-inflamatori la timpul corespunzător.The post-infarction inflammatory response can be divided into three stages: the inflammatory phase, the proliferative phase and the maturation phase and is defining for the subsequent evolution of MI and ventricular remodeling. Early inflammation is necessary to achieve necrotic cell removal and tissue repair, but stopping pro-inflammatory stimuli at the appropriate time is equally important.

Medicina regenerativă are ca scop recuperarea funcției țesuturilor și organelor afectate în urma bolilor, îmbătrânirii sau traumelor. în cazul infarcului miocardic, terapiile celulare s-au făcut remarcate ca o soluție inovatoare și promițătoare, ele având la bază administrarea de celule vii pentru a induce și susține regenerarea țesutului necrozat in urma ischemiei. Față de tratamentele moleculare clasice, transplantul de celule vii are un avantaj semnificativ întrucât acestea sunt capabile să realizeze funcții biologice complexe și pot percepe și reacționa specific la stimulii prezenți în micromediul unde sunt transplantate. Totuși, încă de la primele tentative de a regenera inima prin intermediul diferitelor populații celulare problemele apărute au fost legate de ratele scăzute de grefare a celulelor și de supraviețuirea slabă a acestora după injectarea intramiocardică [Wollert et al., 2010], dar și de marea diversitate la nivel de modele experimentale, ceea ce a condus la rezultate greu de comparat și dificultatea de a trage concluzii vis-a-vis de eficiența terapiei. Astfel că deși promițătoare, rezultatele studiilor clinice care au folosit terapia cu celule vii a dat rezultate modeste sau neutre, sugerând nevoia de reîntoarcere la masa de lucru și de integrare a cunoștințelor dobândite astfel încât abordările terapeutice să poată fi îmbunătățite.Regenerative medicine aims to restore the function of tissues and organs damaged by disease, aging or trauma. in the case of myocardial infarction, cell therapies have been noted as an innovative and promising solution, based on the administration of live cells to induce and support the regeneration of necrotic tissue following ischemia. Compared to classical molecular treatments, the transplantation of live cells has a significant advantage as they are able to perform complex biological functions and can perceive and react specifically to the stimuli present in the microenvironment where they are transplanted. However, since the first attempts to regenerate the heart by means of different cell populations, the problems that arose were related to the low rates of cell engraftment and their poor survival after intramyocardial injection [Wollert et al., 2010], but also to the high diversity at the level of experimental designs, which led to results that are difficult to compare and the difficulty of drawing conclusions vis-à-vis the effectiveness of therapy. Thus, although promising, the results of clinical trials using live cell therapy have yielded modest or neutral results, suggesting the need to return to the work table and integrate the knowledge gained so that therapeutic approaches can be improved.

Astfel că, ingineria tisulară a apărut ca un domeniu interdisciplinar innovator, care in ultimul deceniu a dus la dezvoltarea a numeroase tehnologii și concepte terapeutice, făcând posibilă depășirea unor obstacole semnificative în medicina regenerativă. Printre aceste obstacole se numarau lipsa unor biomateriale cu proprietăți mecanice și chimice reglabile și imposibilitatea generării unor țesuturi vascularizate biocompatibile care să poată fi conectate la sistemul circulator al gazdei. în timp, aceste direcții au evoluat datorită reacțiilor chimice avansate de incorporare moleculară în structura biomaterialelor, care permit coordonarea biochimică a celulelor încapsulate, dar și dezvoltarea de noi tehnologii de biofabricare și bioprintare 3D, pentru obținerea unor structuri biologice complexe. Prin urmare, s-au făcut încercări extinse de a îmbunătăți retenția celulelor miocardice și rata de supraviețuire, prin implantarea de schele/suporturi populate cu celule [Godier-Fumemont et al, 2011].Thus, tissue engineering emerged as an innovative interdisciplinary field, which in the last decade led to the development of numerous technologies and therapeutic concepts, making it possible to overcome some significant obstacles in regenerative medicine. Among these obstacles were the lack of biomaterials with tunable mechanical and chemical properties and the impossibility of generating biocompatible vascularized tissues that could be connected to the host's circulatory system. over time, these directions have evolved thanks to the advanced chemical reactions of molecular incorporation into the structure of biomaterials, which allow the biochemical coordination of encapsulated cells, but also the development of new biofabrication and 3D bioprinting technologies, to obtain complex biological structures. Therefore, extensive attempts have been made to improve myocardial cell retention and survival rate by implanting cell-populated scaffolds/supports [Godier-Fumemont et al, 2011].

RO 137239 AORO 137239 AO

Strategiile utilizate în ingineria tisulară pot fi simple, precum încorporarea de biomolecule în rețeaua hidrogelului și eliberarea in vivo a acestora, sau complexe, precum reconstrucția țesutului miocardic uman sau generarea organelor bioartificiale [Pakulska et al., 2016; Salani et al., 2018; Tiburcy et al., 2017]. Diversitatea materialelor, a celulelor și a dispozitivelor care pot fi utilizate permit ca aplicabilitatea ingineriei tisulare să fie extrem de largă, putându-se adresa regenerării diverselor țesuturi ale corpului uman. în ceea ce privește abordările tridimensionale complexe de inginerie tisulară, cele mai reprezentative exemple sunt bioprintarea 3D și decelularizarea organelor reprezentate de alogrefe si xenogrefe pentru repopularea lor ulterioară cu celule.The strategies used in tissue engineering can be simple, such as the incorporation of biomolecules into the hydrogel network and their in vivo release, or complex, such as the reconstruction of human myocardial tissue or the generation of bioartificial organs [Pakulska et al., 2016; Salani et al., 2018; Tiburcy et al., 2017]. The diversity of materials, cells and devices that can be used allow the applicability of tissue engineering to be extremely broad, addressing the regeneration of various tissues of the human body. Regarding complex three-dimensional tissue engineering approaches, the most representative examples are 3D bioprinting and decellularization of organs represented by allografts and xenografts for their subsequent repopulation with cells.

c) Hidrogeluri folosite in modelele in vivo pentru tratamentul infarctului miocardic. Hidrogelurile sunt materiale moi, umede, cu proprietăți similare cu cele ale țesuturilor moi umane si sunt intens utilizate în ingineria țesuturilor. în ultimii ani există un interes din ce în ce mai crescut pentru ingineria hidrogelurilor în vederea obținerii de țesuturi și de modele 3D pentru studiul diferitelor boli. Motivația majoră este că astfel de hidrogeluri pot imita mai bine micromediul fiziologic al diferitelor țesuturi umane. Mai mult, modelele de țesuturi 3D realizate cu celulele proprii ale pacienților pot revoluționa modul de tratament și pot dezvolta alternative de diagnostic. Un țesut cardiac ideal va fi implantat eficient în organism, regenerând țesutul și îmbunătățind funcționalitatea inimii fără a provoca efecte secundare, cum ar fi imunogenitatea. Până in prezent, modelele dezvoltate au fost proiectate în principal pe baza biomaterialelor naturale și sintetice [Lewis et al., 2016], care imită componentele biochimice și proprietățile structurale ale matricei extracelulare miocardice native. Biomaterialele nu abordează doar problema grefării celulare, ci ajută și la traducerea clinică a terapiilor bazate pe molecule bioactive. Administrarea sistemică a acestor molecule bioactive are dezavantajul unui timp scurt de înjumătățire in vivo, necesitatea unor injecții repetate și costul ridicat al tratamentului. Deși implantarea biomaterialelor disponibile în prezent, crește într-o oarecare măsură grosimea peretelui ventriculului stâng (VS) și previne dilatarea VS în modelele experimentale de IM, problema fundamentală asociată cu bioactivitatea acestor biomateriale rămâne încă nerezolvată [Badylak et al., 2012], Rezultate bune s-au obținut cu hidrogelurile derivate din matrici extracelulare (ECM) naturale obținute prin decelularizarea țesutului miocardic, deoarece aceste modele imită proprietățile țesutului (de exemplu arhitectura ECM, indicii biochimici și integritatea mecanică) similare cu inima nativă și favorizează atașarea, creșterea, infiltrarea și diferențierea celulelor [Pawan et al., 2019],c) Hydrogels used in in vivo models for the treatment of myocardial infarction. Hydrogels are soft, moist materials with properties similar to those of human soft tissues and are extensively used in tissue engineering. in recent years there is a growing interest in engineering hydrogels in order to obtain tissues and 3D models for the study of various diseases. The major motivation is that such hydrogels can better mimic the physiological microenvironment of various human tissues. Moreover, 3D tissue models made with patients' own cells can revolutionize treatment and develop diagnostic alternatives. An ideal heart tissue will be effectively implanted in the body, regenerating the tissue and improving the functionality of the heart without causing side effects such as immunogenicity. To date, the developed models have been mainly designed based on natural and synthetic biomaterials [Lewis et al., 2016], which mimic the biochemical components and structural properties of the native myocardial extracellular matrix. Biomaterials not only address the issue of cell engraftment, but also help in the clinical translation of therapies based on bioactive molecules. Systemic administration of these bioactive molecules has the disadvantage of a short half-life in vivo, the need for repeated injections and the high cost of treatment. Although the implantation of currently available biomaterials increases to some extent the thickness of the left ventricular (LV) wall and prevents LV dilatation in experimental models of MI, the fundamental issue associated with the bioactivity of these biomaterials still remains unsolved [Badylak et al., 2012], Results good results have been obtained with natural extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels obtained by decellularization of myocardial tissue, as these models mimic tissue properties (eg ECM architecture, biochemical cues, and mechanical integrity) similar to the native heart and promote attachment, growth, infiltration and cell differentiation [Pawan et al., 2019],

RO 137239 AORO 137239 AO

In ceea ce privește hidrogelurile funcționalizate pentru ingineria țesutului cardiac, in ultimii ani au fost concepute diferite tipuri: i) hidrogeluri sensibile la metaloproteinaze, ii) hidrogeluri de captare a speciilor reactive de oxigen, iii) hidrogeluri imunomodulatoare, iv) hidrogeluri pro-angiogenice și iv) hidrogeluri conductive care pot restabili semnalul electric în zonele de infarct.Regarding functionalized hydrogels for cardiac tissue engineering, different types have been designed in recent years: i) hydrogels sensitive to metalloproteinases, ii) reactive oxygen species capture hydrogels, iii) immunomodulatory hydrogels, iv) pro-angiogenic hydrogels and iv) conductive hydrogels that can restore the electrical signal in infarct areas.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția prezentă este dezvoltarea unui hidrogel funcționalizat cu un agent anti-inflamator care sa imite structura miocardului natural pentru a înlocui țesutul necrotic, sa faciliteze repopularea celulara a zonei infarctate si sa limiteze inflamatia, pentru recuperarea cardiacă post-infarct. Invenția rezolvă posibilitatea de generare in vitro printr-un procedeu netoxic, a unui hidrogel din țesut cardiac compatibil cu celule cardiace precum: fibroblaști cardiaci, cardiomiocite sau celule endoteliale. Astfel, conform invenției s-a dezvoltat un hidrogel din tesut cardiac in care au fost testate celule umane cardiace (cardiomiocite murine și fibroblaști umani), în dorința de a crea un hidrogel care nu doar să asigure matrice extracelulară nativă zonei necrozate post infarct, dar care să poată fi și funcționalizat cu un agent anti-inflamator care să limiteze inflamația post-infarct. Procedeul permite studierea interacțiunii celulelor cardiace cu elementele matriceale din compoziția hidrogelului dar si studiul efectelor agentului anti-inflamator ABR-238901 (sau a altor medicamente si inhibitori), în condiții in vitro, diminuând folosirea/costurile necesare unor studii efectuate pe modele in vivo, oferind totodată condiții de răspuns celular similare cu acestea.The technical problem that the present invention solves is the development of a hydrogel functionalized with an anti-inflammatory agent that mimics the structure of the natural myocardium to replace necrotic tissue, facilitate cellular repopulation of the infarcted area and limit inflammation, for post-infarction cardiac recovery. The invention solves the possibility of in vitro generation through a non-toxic process, of a hydrogel from cardiac tissue compatible with cardiac cells such as: cardiac fibroblasts, cardiomyocytes or endothelial cells. Thus, according to the invention, a hydrogel was developed from cardiac tissue in which human cardiac cells (murine cardiomyocytes and human fibroblasts) were tested, in the desire to create a hydrogel that would not only provide extracellular matrix native to the necrotic post-infarction area, but which would can also be functionalized with an anti-inflammatory agent to limit post-infarction inflammation. The procedure allows the study of the interaction of cardiac cells with the matrix elements in the composition of the hydrogel, but also the study of the effects of the anti-inflammatory agent ABR-238901 (or other drugs and inhibitors), in vitro conditions, reducing the use/costs required of studies carried out on in vivo models, while providing cellular response conditions similar to these.

Hidrogelul obtinut din tesut cardiac nativ poate fi injectat si folosit în viitor în studiul terapiilor de diminuare sau contracarare a mecanismelor celulare și moleculare care duc la insuficiență cardiacă post infarct.The hydrogel obtained from native cardiac tissue can be injected and used in the future in the study of therapies to reduce or counteract the cellular and molecular mechanisms that lead to heart failure after a heart attack.

Noutatea procedeului propus în această aplicație constă în folosirea de țesut cardiac porcin sau murin pentru obținerea unui hidrogel cu structură similară țesutului nativ și functionalizarea lui cu un inhibitor anti-inflamator pentru a înlocui țesutul necrotic, pentru a facilita repopularea celulară a zonei infarctate și pentru a limita inflamația, procese esențiale pentru recuperarea cardiacă post-infarct.The novelty of the process proposed in this application consists in the use of porcine or murine heart tissue to obtain a hydrogel with a structure similar to the native tissue and its functionalization with an anti-inflammatory inhibitor to replace the necrotic tissue, to facilitate cellular repopulation of the infarcted area and to limit inflammation, essential processes for post-infarction cardiac recovery.

Procedeul de obținere a unui hidrogel din tesut cardiac înlătură dezavantajele soluțiilor cunoscute și rezolvă problema tehnică astfel: hidrogelul sub forma de gel vâscos este obținut din țesut miocardic nativ pentru o biocompatibiltate maxima cu celulele cardiace, care prin amestecul cu un agent terapeutic (inhibitor de alarmina S100A9), devine hidrogel funcționalizat cu efecte anti-inflamatoare, prin diminuarea recrutării celulelor inflamatoare circulante.The process of obtaining a hydrogel from cardiac tissue removes the disadvantages of known solutions and solves the technical problem as follows: the hydrogel in the form of a viscous gel is obtained from native myocardial tissue for maximum biocompatibility with cardiac cells, which by mixing with a therapeutic agent (alarmin inhibitor S100A9), becomes a functionalized hydrogel with anti-inflammatory effects, by reducing the recruitment of circulating inflammatory cells.

RO 137239 AORO 137239 AO

Hidrogelurile sunt materiale moi, umede, cu proprietăți similare cu cele ale țesuturilor moiHydrogels are soft, moist materials with properties similar to those of soft tissues

umane și sunt utilizate pe scară largă în ingineria țesuturilor [Wang et al., 2017). Studiile din ultimii ani au arătat că hidrogelurile nu oferă doar suport mecanic pentru repararea țesutului miocardic [Wall et al., 2006; Zhu et al., 2017] dar pot servi și ca purtători pentru transportul de celule sau medicamente [Park et al., 2019; Huang et al., 2020], Hidrogelurile injectabile sunt considerate o tehnologie minim invazivă care pot depăși limitările clinice și chirurgicale ale stentului tradițional, printr-o tranziție controlată din soluție in gel și prin transportul localizat a diferiți compuși sau celule încapsulate, ceea ce duce la o eficiență terapeutică sporită și îmbunătățirea confortului pacientului. Deși in ultimii ani, hidrogelurile injectabile dezvoltate pentru regenerarea țesuturilor au devenit din ce în ce mai sigure, mai inteligente și multifuncționale, inca le mai lipsește unele dintre proprietățile necesare pentru a imita țesutul miocardic. Un hidrogel injectabil ideal pentru repararea cardiacă ar trebui să dețină următoarele proprietăți: i) biocompatibilitate; ii) biodegradabilitate; iii) propritetăți mecanice; iv) conductivitate electrică.human and are widely used in tissue engineering [Wang et al., 2017). Studies in recent years have shown that hydrogels not only provide mechanical support for myocardial tissue repair [Wall et al., 2006; Zhu et al., 2017] but can also serve as carriers for the transport of cells or drugs [Park et al., 2019; Huang et al., 2020], Injectable hydrogels are considered a minimally invasive technology that can overcome the clinical and surgical limitations of the traditional stent, through a controlled transition from solution to gel and localized transport of various encapsulated compounds or cells, leading to to increased therapeutic efficiency and improved patient comfort. Although in recent years, injectable hydrogels developed for tissue regeneration have become increasingly safer, smarter and multifunctional, they still lack some of the properties needed to mimic myocardial tissue. An ideal injectable hydrogel for cardiac repair should possess the following properties: i) biocompatibility; ii) biodegradability; iii) mechanical properties; iv) electrical conductivity.

Materialele biologice utilizate în ingineria țesuturilor sunt diverse și pot fi în general clasificate ca materiale naturale (hidrogeluri derivate din surse naturale), materiale sintetice (hidrgeluri obținute prin sinteză - sintetice) sau un amestec de ambele tipuri (hidrogeluri hibride), în general, odată ce biomaterialele sunt implantate în corpul uman, pot apărea unul sau mai multe reacții pozitive sau negative, inclusiv interacțiuni cu sânge (hemoliză), interacțiunea celulelor inflamatorii, formarea țesutului de granulație, reacții cu corpuri străine și stres oxidativ [Anderson et al., 2008; Sheikh et al., 2015]. Materiale naturale pe bază de proteine, polizaharide și țesuturi decelularizate sunt adesea folosite pentru ingineria țesuturilor miocardice din cauza biocompatibilității lor inerente, bioactivitate și imunogenitatea scăzută. Cu toate acestea, ele au, de obicei, proprietăți mecanice slabe și dificultăți în modificarea structurală.The biological materials used in tissue engineering are diverse and can generally be classified as natural materials (hydrogels derived from natural sources), synthetic materials (hydrogels obtained by synthesis - synthetic) or a mixture of both types (hybrid hydrogels), generally once when biomaterials are implanted in the human body, one or more positive or negative reactions may occur, including interactions with blood (hemolysis), inflammatory cell interaction, granulation tissue formation, foreign body reactions, and oxidative stress [Anderson et al., 2008 ; Sheikh et al., 2015]. Natural materials based on proteins, polysaccharides, and decellularized tissues are often used for myocardial tissue engineering because of their inherent biocompatibility, bioactivity, and low immunogenicity. However, they usually have poor mechanical properties and difficulties in structural modification.

In ceea ce privește invazivitatea minimă, un hidrogel injectat in situ este mai avantajos decât un hidrogel în formă de plasture, deoarece primul se dispersează uniform după injectare pentru a oferi suport mecanic peretelui infarctului. în prezent, hidrogelurile sunt injectate în țesutul miocardic prin trei abordări: injectare epicardică directă, injectare intracoronară transcateter și injectare trans-endocardică printr-un cateter combinat cu tehnologia imagistică [Strauer & Steinhoff, 2015]. Timpul de tranziție din soluție în gel este un factor important pentru realizarea tratamentului minim invaziv al miocardului cu hidrogeluri, iar hidrogelul trebuie să treacă iară probleme printr-un ac de dimensiunea 27G pentru a reduce zona traumatismului [Reis et al., 2016].In terms of minimal invasiveness, a hydrogel injected in situ is more advantageous than a hydrogel in the form of a patch, as the former disperses uniformly after injection to provide mechanical support to the infarct wall. Currently, hydrogels are injected into myocardial tissue by three approaches: direct epicardial injection, transcatheter intracoronary injection, and transendocardial injection through a catheter combined with imaging technology [Strauer & Steinhoff, 2015]. The transition time from solution to gel is an important factor for achieving minimally invasive treatment of the myocardium with hydrogels, and the hydrogel must again pass through a 27G needle to reduce the area of trauma [Reis et al., 2016].

RO 137239 AORO 137239 AO

Rezultatele studiilor de cercetare clinică au furnizat dovezi solide care confirmă eficacitatea hidrogelurilor acelulare injectabile, fără biomolecule, în repararea țesutului miocardic și protecția funcțională [Anker et al., 2015; Frey et al., 2014], într-un astfel de studiu, peretele miocardic al ventriculului stâng a 11 pacienți cu insuficiență cardiacă a fost injectat cu hidrogelul AlgisylLVR™ constând în Ca2+-alginat si Na+-alginat, printr-o o intervenție chirurgicală de bypass coronarian. La 3 luni de la tratament, volumele finale diastolice și sistolice au scăzut semnificativ, iar fracția de ejecție a crescut semnificativ la toți pacienții [Lee et al., 2013 ; Lee et al., 2015], Un alt hidrogel - IK 5001, alcătuit dintr-o soluție de 1% alginat de sodiu plus 0.3% gluconat de calciu - a fost introdus in aria infarctată prin cateter la 27 de pacienti, iar la 6 luni după injectare, pacienții au tolerat bine gelul fără complicații legate de implantare, aritmii grave sau deces; ecografia cardiacă a arătat o reducere a dimensiunii infarctului și a dilatației ventriculare, funcția cardiacă rămânând la niveluri preoperatorii, confirmând că IK-5001 este sigur și eficient pentru tratamentul IM [Frey et al., 2014], Astfel că, deși cu pacienți puțini, studiile clinice au început să apară. Recent, un studiu care a folosit VentriGel - provenit din matrice celulara cardiacă, a demonstrat siguranța și fezabilitatea injectării transendocardice de VentriGel la pacienții post-IM cu disfuncție ventriculară stângă [Traverse et al., 2019], Matrigelul este un hidrogel care imită matricea extracelulară, fiind compus din proteine ale membranei bazale și factori de creștere. Datorită capacității sale de a promova angiogeneza, Matrigelul a fost injectat în inimi de șobolan infarctat și s-a arătat o îngroșare semnificativă a peretelui infarctat ventricular stâng, densitatea capilară crescută și dimensiunea redusă a infarctului în comparație cu șobolanii cu infarct, netratati [Copland et al; 2008].Results of clinical research studies have provided strong evidence confirming the efficacy of biomolecule-free injectable acellular hydrogels in myocardial tissue repair and functional protection [Anker et al., 2015; Frey et al., 2014], in such a study, the myocardial wall of the left ventricle of 11 heart failure patients was injected with AlgisylLVR™ hydrogel consisting of Ca2+-alginate and Na+-alginate, through a surgical intervention of coronary bypass. At 3 months after treatment, end-diastolic and systolic volumes decreased significantly and ejection fraction increased significantly in all patients [Lee et al., 2013 ; Lee et al., 2015], Another hydrogel - IK 5001, composed of a solution of 1% sodium alginate plus 0.3% calcium gluconate - was introduced into the infarcted area through the catheter in 27 patients, and at 6 months after injection, patients tolerated the gel well without implantation-related complications, serious arrhythmias, or death; cardiac ultrasound showed a reduction in infarct size and ventricular dilatation, with cardiac function remaining at preoperative levels, confirming that IK-5001 is safe and effective for the treatment of MI [Frey et al., 2014], Thus, although with few patients, clinical trials have begun to appear. Recently, a study using VentriGel - derived from cardiac cellular matrix, demonstrated the safety and feasibility of transendocardial injection of VentriGel in post-MI patients with left ventricular dysfunction [Traverse et al., 2019], Matrigel is a hydrogel that mimics the extracellular matrix , being composed of basement membrane proteins and growth factors. Due to its ability to promote angiogenesis, Matrigel was injected into infarcted rat hearts and showed significant thickening of the infarcted left ventricular wall, increased capillary density and reduced infarct size compared to untreated infarcted rats [Copland et al; 2008].

în prezent, limitările majore ale unor agenți biologici pentru tratamentul preclinic al IM sunt efectele secundare toxice și biodisponibilitatea scăzută la doza eficientă. De exemplu, unii factori de creștere pro-angiogeni (de exemplu, bFGF, VEGF și factorul de creștere a hepatocitelor - HGF) sunt ușor de îndepărtat de sistemul imunitar după administrarea vasculară, ducând la concentrații insuficiente sau sunt predispuși la efecte secundare toxice, cum ar fi anevrismele, datorită administrării de doze mari [Mahmarian et al., 2006]. Astfel, încapsularea agenților biologici în hidrogeluri are următoarele avantaje: i) protejează activitatea agenților încapsulați de mediul extern advers [Oliva et al., 2017; Dimatteo et al., 2018; Gradinaru et al., 2018], ii) permite încărcarea medicamentelor cu forme și dimensiuni diferite prin interacțiuni fizice și cuplarea chimică, care este esențială pentru realizarea eliberării controlate a medicamentelor la locul țintăCurrently, the major limitations of some biological agents for the preclinical treatment of MI are toxic side effects and low bioavailability at the effective dose. For example, some pro-angiogenic growth factors (eg, bFGF, VEGF, and hepatocyte growth factor - HGF) are easily removed by the immune system after vascular administration, resulting in insufficient concentrations, or are prone to toxic side effects such as would be aneurysms, due to the administration of high doses [Mahmarian et al., 2006]. Thus, the encapsulation of biological agents in hydrogels has the following advantages: i) it protects the activity of the encapsulated agents from the adverse external environment [Oliva et al., 2017; Dimatteo et al., 2018; Gradinaru et al., 2018], ii) allows the loading of drugs with different shapes and sizes through physical interactions and chemical coupling, which is essential for achieving controlled release of drugs at the target site

RO 137239 AORO 137239 AO

[Rufaihah & Seliktar 2016; Bhattarai et al., 1010] și iii) asigură concentrații eficiente de medicament la locul infarctului după injectare, evitând reacțiile adverse datorate administrării sistemice [Anugrah et al., 2019; Qian et al., 2019],[Rufaihah & Seliktar 2016; Bhattarai et al., 1010] and iii) provides effective drug concentrations at the infarct site after injection, avoiding adverse reactions due to systemic administration [Anugrah et al., 2019; Qian et al., 2019],

Reglarea inflamației·. recrutarea leucocitelor la locul leziunii miocardice infarctate de către debriurile necrotice și resturile de matrice degradată marchează inițierea răspunsului inflamator [Buckley & Abbate, 2018], Deși răspunsul inflamator curăță resturile celulare și activează semnalele de reparare, inflamația prelungită accelerează fibroza și ruptura cardiacă [Frangogiannis, 2018 ; Swirski &Nahrendorf, 2019], Prin urmare, este necesar să se moduleze spațial răspunsul inflamator pentru a împiedica răspândirea factorilor inflamatori dincolo de regiunile infarctate. Unele materiale naturale care compun hidrogelurile sunt în mod inerent antiinflamatoare; de exemplu, acidul hialuronic cu greutate moleculară mare elimină speciile reactive de oxigen (ROS) in vivo, ceea ce poate explica îmbunătățirea funcției cardiace după injectarea cu hidrogel pe bază de acid hialuronic [Nakamura et al., 2004], Totuși, pentru majoritatea hidrogelurilor care țintesc inflamația, este necesară încapsularea factorilor imunomodulatori pentru a interfera cu micromediul inflamator al infarctului. Un astefel de hidrogel din alginat, încapsulat cu interleukinele antiinflamatorii IL-4/10/13 și a factorului de stimulare a coloniilor (CSF-1) a demonstrat că poate induce polarizarea macrofagelor către fenotipurile de vindecare, accelerând astfel vindecarea leziunilor și reducând zona fibrotică [Bloise et al., 2020]. Astfel, proiectarea hidrogelurilor injectabile pentru repararea miocardului și identificarea mecanismelor de acțiune al hidrogelurilor încărcate cu substanțe bioactive pentru repararea MI rămâne o provocare.Regulation of inflammation·. recruitment of leukocytes to the site of infarcted myocardial injury by necrotic debris and degraded matrix debris marks the initiation of the inflammatory response [Buckley & Abbate, 2018], Although the inflammatory response clears cellular debris and activates repair signals, prolonged inflammation accelerates fibrosis and cardiac rupture [Frangogiannis, 2018; Swirski &Nahrendorf, 2019], Therefore, it is necessary to spatially modulate the inflammatory response to prevent the spread of inflammatory factors beyond the infarcted regions. Some natural materials that make up hydrogels are inherently anti-inflammatory; for example, high molecular weight hyaluronic acid scavenges reactive oxygen species (ROS) in vivo, which may explain the improvement in cardiac function after hyaluronic acid hydrogel injection [Nakamura et al., 2004], However, for most hydrogels that target inflammation, encapsulation of immunomodulatory factors is required to interfere with the inflammatory microenvironment of the infarct. Such an alginate hydrogel encapsulated with the anti-inflammatory interleukins IL-4/10/13 and colony-stimulating factor (CSF-1) has been shown to induce macrophage polarization towards healing phenotypes, thereby accelerating wound healing and reducing the fibrotic area. [Bloise et al., 2020]. Thus, designing injectable hydrogels for myocardial repair and identifying the mechanisms of action of hydrogels loaded with bioactive substances for MI repair remains a challenge.

Hidrogelul dezvoltat in procedeul de față combină furnizarea elementelor naturale de matrice extracelulară în scopul refacerii țesutului necrozat cu terapia anti-inflamatoare pentru a limita inflamația și a favoriza rezoluția acesteia. în prezent nu există un hidrogel derivat din țesut miocardic, funcționalizat cu blocant de S100A9, în scopul terapiei post-IM.The hydrogel developed in the present process combines the provision of natural extracellular matrix elements for the purpose of restoring necrotic tissue with anti-inflammatory therapy to limit inflammation and promote its resolution. there is currently no myocardial tissue-derived hydrogel functionalized with S100A9 blocker for the purpose of post-MI therapy.

Procedeul descris în această invenție permite obținerea unei formule hidrogel cu compoziție matriceală similară miocardului nativ, funcționalizat cu un agent anti-inflamator-ABR25757, un inhibitor specific de S100A9 - o alarmină produsă în exces de neutrofilele infiltarate în zona infarctată, imediat post-IM. Tehnica folosită pentru obținerea formulei de hidrogel cu compoziție matriceală similară miocardului nativ implică, într-o etapă inițială, decelularizarea inimilor miocardului murin sau porcin prin șoc hypotonic, extracție proteică cu detergent și digestieThe process described in this invention allows obtaining a hydrogel formula with matrix composition similar to the native myocardium, functionalized with an anti-inflammatory agent - ABR25757, a specific inhibitor of S100A9 - an alarmin produced in excess by neutrophils infiltrated in the infarcted area, immediately post-MI. The technique used to obtain the hydrogel formulation with matrix composition similar to native myocardium involves, in an initial step, decellularization of murine or porcine myocardial hearts by hypotonic shock, protein extraction with detergent and digestion

RO 137239 AO nucleazică cu enzime specifice. La finalul procedeului se obține matrice acelulară, care este înghețată și liofilizată timp de 72h la -48 grade Celsius și 0.045 mBar, în vederea determinării conținutului masic. Hidrogelul se obține prin adăugarea unei soluții acide de lOmM HC1 și pepsină porcină la concentrația finală de 160U/mg matrice. înainte de folosire, se va efectua neutralizarea ph-ului acid pe gheață, folosind soluție de IM NaOH, urmată de incubarea hidrogelului timp de 90 min în incubator.RO 137239 Nuclease AO with specific enzymes. At the end of the procedure, acellular matrix is obtained, which is frozen and lyophilized for 72 hours at -48 degrees Celsius and 0.045 mBar, in order to determine the mass content. The hydrogel is obtained by adding an acidic solution of 10mM HCl and porcine pepsin to a final concentration of 160U/mg matrix. before use, acid ph neutralization will be performed on ice, using IM NaOH solution, followed by incubation of the hydrogel for 90 min in the incubator.

Pentru hidrogelul obținut - MIGEL- a fost mai întâi caracterizat pentru a identifica prezența glicozaminoglicanilor si a proteinelor matriceale. Glicozaminoglicanii, alături de proteoglicani și proteine matriceale care se găsesc în țesutul nativ, influențează creșterea și funcțiile specifice ale celulei, necesare pentru funcționarea corectă a țesuturilor, precum și regenerarea și repararea miocardului deteriorat. Conform rezultatelor prezentei invenții, hidrogelul dezvoltat prezintă în compoziția sa, atât glicozaminoglicani - evidențiati prin colorația Alcian blue și cuantificați prin tehnica ELISA, cât și proteinele de matrice extracelulară colagen I si IV, elastina, fibronectina si laminina - identificate prin Western Blot.For the obtained hydrogel - MIGEL - it was first characterized to identify the presence of glycosaminoglycans and matrix proteins. Glycosaminoglycans, along with proteoglycans and matrix proteins found in native tissue, influence specific cell growth and functions required for proper tissue function, as well as regeneration and repair of damaged myocardium. According to the results of the present invention, the developed hydrogel has in its composition both glycosaminoglycans - highlighted by Alcian blue staining and quantified by the ELISA technique, as well as the extracellular matrix proteins collagen I and IV, elastin, fibronectin and laminin - identified by Western Blot.

Pentru studiul de biocompatibilitate, celulele cardiace de tip cardiomiocite sau fibroblaști au fost cultivate pe MIGEL apoi, după 48h a fost evaluată viabilitatea și morfologia acestora. Pentru obținerea hidrogelului funcționalizat inhibitorul ABR25757 s-a dizolvat in prealabil in DMSO și s-a adaugat ulterioar la soluția de hidrogel - MIGEL. Astfel, formarea rețelei de hidrogel și încapsularea medicamentului au fost realizate simultan, inhibitorul fiind încapsulat uniform in hidrogel. Studiul asupra eliberării compusului încapsulat s-a realizat printr-o cinetică de eliberare unde s-a efectuat incubarea hidrogelului funcționalizat cu mediu de cultură pentru diferite perioade de timp, la 37°C în tampon fosfat salin (TFS) și s-a determinat spectofotometric concentrația compusului eliberat din hidrogel. Eliberarea medicamentului poate avea loc prin difuzie pasivă, prin rețeaua polimerică a hidrogelului, interacțiuni reversibile medicament-polimer sau degradarea legăturilor labile.For the biocompatibility study, cardiac cells of the cardiomyocyte or fibroblast type were cultured on MIGEL then, after 48h, their viability and morphology were evaluated. To obtain the functionalized hydrogel, the ABR25757 inhibitor was previously dissolved in DMSO and subsequently added to the hydrogel solution - MIGEL. Thus, the formation of the hydrogel network and the encapsulation of the drug were carried out simultaneously, the inhibitor being uniformly encapsulated in the hydrogel. The study on the release of the encapsulated compound was carried out through a release kinetics where the functionalized hydrogel was incubated with culture medium for different periods of time, at 37°C in saline phosphate buffer (TFS) and the concentration of the compound released from the hydrogel was determined spectrophotometrically. Drug release can occur by passive diffusion, through the polymer network of the hydrogel, reversible drug-polymer interactions, or degradation of labile bonds.

Efectul anti-inflamator al hidrogelului funcționalizat s-a urmărit prin cuantificarea transmigrării prin hidrogelul funcționalizat sau nu, a leucocitelor (monocite și neutrofile) atât prin camere duble boyden de chemotaxie, cât și cu sistemul care masoară cinetica transmigrăriixCELLigence.The anti-inflammatory effect of the functionalized hydrogel was monitored by quantifying the transmigration of leukocytes (monocytes and neutrophils) through the functionalized hydrogel, both by means of double boyden chemotaxis chambers and with the xCELLigence transmigration kinetics measuring system.

Prin utilizarea hidrogelului obținut din țesut cardiac, funcționalizat cu inhibitorul de alarmină S100A9, obținut folosind procedeul descris în această invenție, se intervine în fazaBy using the hydrogel obtained from heart tissue, functionalized with the alarmin inhibitor S100A9, obtained using the process described in this invention, it intervenes in the phase

RO 137239 AO inflamatorie de evoloție patologică post IM, a cărei prelungire conduce la insuficiența cardiacă, oferindu-se astfel o oportunitate terapeutică promițătoare.RO 137239 inflammatory AO of pathological evolution post MI, the prolongation of which leads to heart failure, thus offering a promising therapeutic opportunity.

Procedeul de obținere a unui hidrogel cu structură similară țesutului nativ, funcționalizat cu un compus anti-inflamator, prezintă următoarele avantaje :The process of obtaining a hydrogel with a structure similar to the native tissue, functionalized with an anti-inflammatory compound, presents the following advantages:

1. Hidrogelul dezvoltat are structură similară țesutului nativ, furnizând astfel elemente specifice de matrice extracelulară pentru a înlocui țesutul necrotic post infarct, în cazul injectării.1. The developed hydrogel has a structure similar to the native tissue, thus providing specific extracellular matrix elements to replace necrotic post-infarct tissue, in case of injection.

2. Oferă o biocompatibilitate mare cu celulele cardiace, putând astfel facilita repopularea celulară a zonei infarctate.2. It provides high biocompatibility with cardiac cells, thus being able to facilitate cellular repopulation of the infarcted area.

3. Poate fi funcționalizat pentru a limita inflamația, proces esențial pentru evoluția pozitivă și recuperarea cardiacă post-infarct.3. It can be functionalized to limit inflammation, an essential process for positive evolution and post-infarction cardiac recovery.

4. Această invenție prezintă potențial pentru a fi implementată și aplicată în: dezvoltarea de terapii țintite pentru rezoluția inflamatiei post-infarct; verificarea unor compuși activi existenți cu potențial farmacologic, eliminarea parțială a numărului mare de modele in vivo folosite în studii și în dezvoltarea terapiilor pentru prevenirea insuficienței cardiace.4. This invention has potential to be implemented and applied in: the development of targeted therapies for the resolution of post-infarction inflammation; verification of existing active compounds with pharmacological potential, partial elimination of the large number of in vivo models used in studies and in the development of therapies for the prevention of heart failure.

Exemple de realizare a procedeului conform invenției:Examples of carrying out the process according to the invention:

în cele ce urmează sunt date exemple concrete care arată cum poate fi implementată și aplicată invenția astfel:In the following, concrete examples are given that show how the invention can be implemented and applied as follows:

Intr-o prima etapa este necesar a se stabili materialele si echipamentele necesare procedeului.In a first stage, it is necessary to establish the materials and equipment necessary for the procedure.

1) Materiale si echipamente folosite pentru obținerea invenției1) Materials and equipment used to obtain the invention

i) Materiale:i) Materials:

Substanțele folosite in studii au fost achiziționate de la următoarele companii:The substances used in the studies were purchased from the following companies:

- Merk-Sigma: Fibroblaștii cardiaci, mediul pentru fibroblaștii cardiaci, enzime pentru decelularizare, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), albumina serică bovină (BSA), acrilamida/bis-acrilamida, dimetil sulfoxid (DMSO), glicina, ABR-25757, RNAse Away pentru biologie moleculară, Dimethylmethylene Blue (DMMB), Tampon fosfat lOOmM pH 9, HC1 IM, Antibiotic penicilină și streptomicină 5x;- Merk-Sigma: Cardiac fibroblasts, cardiac fibroblast medium, decellularization enzymes, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), bovine serum albumin (BSA), acrylamide/bis-acrylamide, dimethyl sulfoxide (DMSO), glycine, ABR-25757, RNAse Away for Molecular Biology, Dimethylmethylene Blue (DMMB), lOOmM Phosphate Buffer pH 9, HC1 IM, Antibiotic Penicillin and Streptomycin 5x;

- Nordic BioSite: kit cuantificare GAG;- Nordic BioSite: GAG quantification kit;

RO 137239 AORO 137239 AO

- Thermo Scientific - Anticorpi: Colagen 1-PA5-29569, Elastina- MA1-27129, FibronectinaMA5-11981, Laminina-MABT39, Colagen 3-PA5-278281, Colagen 4-SC-59814; DMEMImg/ml glucoza (Gibco) suplimentat cu penicilină, streptomicină și 10% ser fetal vițel, DAPI, paraformaldehidă, Tampon fosfat salin - TFS și consumabile și reactivi pentru culturi celulare;- Thermo Scientific - Antibodies: Collagen 1-PA5-29569, Elastin- MA1-27129, FibronectinMA5-11981, Laminin-MABT39, Collagen 3-PA5-278281, Collagen 4-SC-59814; DMEMImg/ml glucose (Gibco) supplemented with penicillin, streptomycin and 10% fetal calf serum, DAPI, paraformaldehyde, Phosphate buffer saline - TFS and cell culture supplies and reagents;

- Agilrom: camere CIM plate pentru chemotaxie.- Agilrom: flat CIM chambers for chemotaxis.

- Abcam: colorantul fluorescent - Cell Tracking Dye Kit - Red - Cytopainter.- Abcam: fluorescent dye - Cell Tracking Dye Kit - Red - Cytopainter.

- Promega: kit de extracție ADN „ADN genomic Wizard”.- Promega: "Genomic DNA Wizard" DNA extraction kit.

- Inimile porcine au fost achiziționate de la Abatorul Periș.- Pig hearts were purchased from Periș Slaughterhouse.

- Alți reactivi și consumabile au fost achiziționate de la: Sigma Aldrich - Merk, Thermo Scientific, Laboratorium, Vetro design, Elta, Biomedica etc. Camerele duble de chemotaxie boyden, de la Costar sau Thermo Fisher Scientific.- Other reagents and consumables were purchased from: Sigma Aldrich - Merk, Thermo Scientific, Laboratorium, Vetro design, Elta, Biomedica, etc. Boyden dual chemotaxis chambers, from Costar or Thermo Fisher Scientific.

ii) Echipamente folosite:ii) Equipment used:

- Pentru întreținerea culturilor a fost utilizat un incubator - Thermo Scientific cu umidificare și o concentrație a CO2 de 5% și o hotă de flux laminar pentru lucru în condiții aseptice.- An incubator - Thermo Scientific with humidification and a CO2 concentration of 5% and a laminar flow hood for working under aseptic conditions was used to maintain the cultures.

- Pentru pregătirea hidrogelului a fost utilizată o plită termostatată cu agitare magnetică.- A thermostated hotplate with magnetic stirring was used to prepare the hydrogel.

- Pentru cuantificarea cantității de ADN din țesut s-a utilizat aparatul NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).- The NanoDrop 2000 device (Thermo Scientific) was used to quantify the amount of DNA in the tissue.

- pentru studii de imagistică - microscopul de fluorescentă 1X81 Olimpus.- for imaging studies - the fluorescence microscope 1X81 Olimpus.

- pentru studii de chemotaxie - xCELLigence System RTCA (Roche, Basel, Elveția),- for chemotaxis studies - xCELLigence System RTCA (Roche, Basel, Switzerland),

2) într-o succesiune de etape de început ale procedeului are loc decelularizarea țesutului miocardic si obținerea matricei extracelulare cardiace2) in a sequence of initial stages of the process, the decellularization of the myocardial tissue and the obtaining of the cardiac extracellular matrix takes place

Etapa 2.1- Decelularizarea miocardului murin si porcinStage 2.1- Decellularization of murine and porcine myocardium

Tehnica folosită pentru decelularizarea inimilor miocardului murin sau porcin implică șocul hipotonic, extracția proteică cu detergent și digestia nucleaziăa cu enzime specifice: Ziua 1: Miocardul porcin a fost obținut din inimi de porc proaspăt sacrificați iar inimile murine din șoareci C57BL, proaspăt sacrificați. Țesturile au fost tăiate în bucăți mici de 3-7mm/3-7mm (Figura 2), au fost spălate de 3 ori în apă dublu distilată, si apoi incubate la 4°C peste noapte, pentru realizarea șocului hipotonic.The technique used to decellularize murine or porcine myocardial hearts involves hypotonic shock, detergent protein extraction and nuclease digestion with specific enzymes: Day 1: Porcine myocardium was obtained from freshly sacrificed pig hearts and murine hearts from freshly sacrificed C57BL mice. The testes were cut into small pieces of 3-7mm/3-7mm (Figure 2), were washed 3 times in double-distilled water, and then incubated at 4°C overnight, to achieve the hypotonic shock.

Ziua 2: în ziua 2 după alte 3 spălări în apă dublu distilată (ddH2O), bucățile din țesutul cardiac au fost incubate în soluție 0,05M NaOH pentru 2 ore. Sunt clătite și incubate pentru 15 minute de 3 ori în ddH2O pentru eliminarea urmelor de hidroxid de sodiu. După aceste spălări au fost incubate pe un agitator, pentru 48 de ore la temperatura camerei, în soluția de decelularizare: 50mM TRIS; 0,25% SDS; 0,5% DOC; 0,5% Triton XI00; 0,2% EDTA; pH 7,4.Day 2: On day 2 after 3 more washes in doubly distilled water (ddH2O), the heart tissue pieces were incubated in 0.05M NaOH solution for 2 hours. They are rinsed and incubated for 15 minutes 3 times in ddH2O to remove traces of sodium hydroxide. After these washes, they were incubated on a shaker, for 48 hours at room temperature, in the decellularization solution: 50mM TRIS; 0.25% SDS; 0.5% DOC; 0.5% Triton XI00; 0.2% EDTA; pH 7.4.

Ziua 4: După terminarea celor 48 de ore (±3 ore) țesuturile decelularizate rezultate (Figura 3) au fost spălate și incubate 5 minute, în apă dublu distilată. Spălarea se repetă de 5 ori pentru îndepărtarea soluției de decelularizare si apoi sunt incubate peste noapte în azidă de sodiu 0,02%, la temperatura camerei, pe agitator.Day 4: After the end of 48 hours (±3 hours) the resulting decellularized tissues (Figure 3) were washed and incubated for 5 minutes, in double distilled water. The washing is repeated 5 times to remove the decellularization solution and then they are incubated overnight in 0.02% sodium azide, at room temperature, on a shaker.

Ziua 5: Au fost realizate 3 clătiri în apă dublu distilată apoi au fost incubate in etanol 70% pentru 2 ore la temperatura camerei pe agitator. La sfârșitul celor 2 ore au fost spălate și incubate 15 minute, în ddH2O de trei ori. Au fost lasate peste noapte în azidă de sodiu 0,02% pe agitator.Day 5: 3 rinses were made in double distilled water then they were incubated in 70% ethanol for 2 hours at room temperature on a shaker. At the end of 2 hours they were washed and incubated for 15 minutes in ddH2O three times. They were left overnight in 0.02% sodium azide on a shaker.

Ziua 6: Au fost realizate 3 incubări a câte 5-minute în IX DTFS (TFS distilat) după care au fost incubate din nou peste noapte în azidă de sodiu 0,02% preparată în IX DTFSDay 6: 3 5-min incubations were performed in IX DTFS (distilled TFS) followed by overnight incubation again in 0.02% sodium azide prepared in IX DTFS

Ziua 7: S-au efectuat 3 incubări a câte 5-minute în IX DTFS. După care bucățile de țesut matriceal rezultat au fost imersate într-o soluție enzimatica preîncălzită (37°C) de DNază/RNază și au fost incubate peste noapte la 37°C.Day 7: 3 5-minute incubations were performed in IX DTFS. After which the resulting matrix tissue pieces were immersed in a pre-warmed (37°C) DNase/RNase enzyme solution and incubated overnight at 37°C.

Ziua 8: Soluțiile de DNază/RNază au fost schimbate și incubarea s-a realizat pentru încă 24 de ore.Day 8: DNase/RNase solutions were changed and incubation was carried out for another 24 hours.

Ziua 9: Următoarea etapă a presupus spălarea și incubarea în IX DTFS pentru 15-minute și o incubare în azidă de sodiu 0,02% preparată în IX DTFS.Day 9: The next step involved washing and incubation in IX DTFS for 15-minutes and an incubation in 0.02% sodium azide prepared in IX DTFS.

Ziua 10: Utilizând metode, unelte și soluții sterile, bucățile de țesut miocardic decelularizat au fost transferate în tuburi sterile de 50 mL cu PBS distilat IX și au fost păstrate la 4°C.Day 10: Using sterile methods, tools, and solutions, pieces of decellularized myocardial tissue were transferred to sterile 50 mL tubes with IX distilled PBS and stored at 4°C.

Comparativ cu țesutul de miocard murin sau porcin inițial (figura 1 a si b), la sfârșitul procesului de decelularizare (după 10 zile) se obțin structuri acelulare (Figura 3 a si b).Compared to the initial murine or porcine myocardial tissue (Figure 1 a and b), acellular structures are obtained at the end of the decellularization process (after 10 days) (Figure 3 a and b).

Etapa 2.2- Evaluarea eficienței decelularizăriiStage 2.2- Evaluation of the efficiency of decellularization

Eficiența procesului de decelularizare s-a investigat prin două metode: i) s-a efectuat extracție de ADN din țesutul decelelularizat și din cel intact și s-a măsurat cantitatea de DNA obținută in ambele probe; si ii) au fost obținute secțiuni din bucăți din țesutul intact sauThe efficiency of the decellularization process was investigated by two methods: i) DNA extraction was performed from the decellularized and from the intact tissue and the amount of DNA obtained in both samples was measured; and ii) sections were obtained from pieces of intact tissue or

RO 137239 AO decelularizat și s-a efectuat colorația cu hematoxilină- eozină pentru detectarea celulelor din țesuturi.RO 137239 AO decellularized and hematoxylin-eosin staining was performed to detect cells in the tissues.

i) Evaluarea eficienței decelularizării prin analiza ADNi) Evaluation of decellularization efficiency by DNA analysis

ADN-ul a fost izolat din miocard proaspăt și din probe de țesut decelularizat. Purificarea a fost efectuată utilizând kitul de purificare ADN genomic Wizard (Promega) și cantitatea de ADN din probe a fost cuantificată prin citirea absorbanțelor la 260 iun pe un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). ADN-ul a fost normalizat la greutatea țesutului hidratat și exprimat ca ng / mg de țesut. Rezultatele obținute au arătat că țesutul proaspăt, nedecelularizat conține 177.5 ng /mg ADN, in timp ce țesutul decelularizat conține 0.456 ng /mg ADN, rezultate care indică o reducere de 99% a conținutului de ADN in țesutul decelularizat, comparativ cu țesutul intact, confirmând eficienta decelularizarii țesutului miocardic.DNA was isolated from fresh myocardium and from decellularized tissue samples. Purification was performed using the Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) and the amount of DNA in the samples was quantified by reading absorbances at 260 Iun on a NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). DNA was normalized to hydrated tissue weight and expressed as ng/mg tissue. The results obtained showed that the fresh, non-cellularized tissue contains 177.5 ng/mg DNA, while the decellularized tissue contains 0.456 ng/mg DNA, results indicating a 99% reduction of DNA content in the decellularized tissue, compared to the intact tissue, confirming efficiency of myocardial tissue decellularization.

ii) Evaluarea eficienței decelularizării prin coloratii cu hematoxilina-eozinaii) Evaluation of the efficiency of decellularization by staining with hematoxylin-eosin

Țesutul miocardic intact sau decelularizat așa cum a fost descris mai sus, a fost mai intai fixat în soluție 4% PFA (paraformaldehida) preparată în tampon fosfat 0.1 M, pH 7.4, timp de 24h la 4°C. A urmat crioprotecția in soluții succesive de glicerol: 5% (15 minute, temperatura camerei), 10% (Ih, 4°C), 20% (peste noapte, 4°C), 50% (Ih, 4°C) si stocarea in glicerol 50% la -20°C până la includerea în OCT și secționarea la criotomul Leica CM1850. în vederea secționării, au fost parcurse următoarele etape: aducerea la 4°C a țesutului, 6 spălări a cate 15 minute in soluție 3% sucroză preparată in tampon fosfat 0.1M, includerea in OCT timp de 30 minute, la temperatura camerei si înghețarea rapidă in azot lichid. Pentru obținerea secțiunilor pe lame, blocurile înghețate au fost montate pe holder. Secțiunile în care a fost observata prezența țesuturilor, intact sau decelularizat, au fost colectate pe lame la o grosime de 5 pm, incubate timp de 30 minute la o temperatura de 37°C si păstrate in cutii speciale la -20°C, pana la analiza microscopică.Intact or decellularized myocardial tissue as described above, was first fixed in 4% PFA (paraformaldehyde) solution prepared in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, for 24 h at 4°C. Cryoprotection followed in successive glycerol solutions: 5% (15 minutes, room temperature), 10% (Ih, 4°C), 20% (overnight, 4°C), 50% (Ih, 4°C) and storage in 50% glycerol at -20°C until inclusion in OCT and sectioning on a Leica CM1850 cryotome. in order to section, the following stages were completed: bringing the tissue to 4°C, 6 washes of 15 minutes each in 3% sucrose solution prepared in 0.1M phosphate buffer, inclusion in OCT for 30 minutes, at room temperature and quick freezing in liquid nitrogen. To obtain the sections on the slides, the frozen blocks were mounted on the holder. The sections in which the presence of tissues, intact or decellularized, was observed, were collected on slides at a thickness of 5 µm, incubated for 30 minutes at a temperature of 37°C and kept in special boxes at -20°C, until microscopic analysis.

Pentru confirmarea/infirmarea prezentei celulelor in secțiunile obținute de la tesut intact / tesut decelularizat secțiunile rezulate au fost colorate cu hematoxilina - eozina (H&E).To confirm/deny the presence of cells in the sections obtained from intact tissue / decellularized tissue, the resulting sections were stained with hematoxylin-eosin (H&E).

Lamele cu secțiunile obținute au fost mai intai aduse la temperatura camerei, timp de 5-10 minute. A urmat uscarea secțiunilor la 37°C timp de Ih și fixarea în acetona rece (-20°C) timp de 5 minute. Secțiunile au fost spălate în TFS în atmosfera umeda (3 spalari/5 minute) si apoi incubate in soluție de hematoxilina timp de 30 de minute, apoi spălarea excesului cu apa de la robinetThe slides with the obtained sections were first brought to room temperature for 5-10 minutes. This was followed by drying the sections at 37°C for 1h and fixing in cold acetone (-20°C) for 5 minutes. The sections were washed in TFS in humid atmosphere (3 washes/5 minutes) and then incubated in hematoxylin solution for 30 minutes, then washing the excess with tap water

RO 137239 AO („blueing”). Pentru vizualizarea nucleilor celulari, după colorarea cu hematoxilina, lamele au fost colorate cu soluție alcoolica de 1% eozina (15 secunde) pentru evidențierea citoplasmei celulare. După colorare, lamele au fost spălate cu apa distilată, incubate în soluții crescătoare de etanol: 50% (5 minute), 70% (5 minute), 90% (30 secunde), 100% (1 minut), apoi incubate in xilen (5 minute).RO 137239 AO ("blueing"). To visualize cell nuclei, after hematoxylin staining, slides were stained with 1% alcohol eosin solution (15 seconds) to highlight cell cytoplasm. After staining, slides were washed with distilled water, incubated in increasing ethanol solutions: 50% (5 minutes), 70% (5 minutes), 90% (30 seconds), 100% (1 minute), then incubated in xylene (5 minutes).

Colorarea cu hematoxilină și eozină a confirmat absența nucleilor celulari după procesul de decelularizare, atât in țesutul porcin (Figura 4 b si b’) cât si in țesutul murin (Figura 4 c si c’), comparativ cu țesutul nativ unde nucleii sunt bine reprezentați (Figura 4 a si a’).Staining with hematoxylin and eosin confirmed the absence of cell nuclei after the decellularization process, both in the porcine tissue (Figure 4 b and b') and in the murine tissue (Figure 4 c and c'), compared to the native tissue where the nuclei are well represented (Figure 4 a and a').

3) Urmează o altă serie de etape în vederea dezvoltării si caracterizării hidrogelului miocardic injectabil.3) Another series of steps follows in order to develop and characterize the injectable myocardial hydrogel.

Miocardul porcin sau murin decelularizat așa cum s-a descris mai sus a fost folosit pentru obținerea hidrogelului. Hidrogelul obținut a fost caracterizat structural în ceea ce privește prezența glicozaminoglicanilor (GAG) si a proteinelor matriceale.Decellularized porcine or murine myocardium as described above was used to obtain the hydrogel. The obtained hydrogel was characterized structurally regarding the presence of glycosaminoglycans (GAG) and matrix proteins.

Etapa 3.1 Obținerea hidrogeluluiStep 3.1 Obtaining the hydrogel

Bucățile de miocard porcin sau murin decelularizate au fost înghețate și ulterior liofilizate (72h la -48 grade Celsius si 0.045 mBar), în vederea determinării conținutului masic. După determinarea masei de matrice uscată, a fost adăugată soluție acidă de lOmM HC1 și pepsină porcină la concentrația finală de 160U/mg matrice. Suspensia obținută a fost transferată în condiții sterile în vas cu capac și omogenizată, folosind plita cu agitare magnetică timp de 4 zile la TC, până la dizolvarea aproape completă a pieselor de țesut. Conținutul sub formă de gel vâscos (Figura 5) a fost centrifugat timp de 30min, 3000g, 4°C și a fost păstrat la frigider.Pieces of decellularized porcine or murine myocardium were frozen and later lyophilized (72h at -48 degrees Celsius and 0.045 mBar), in order to determine the mass content. After determination of dry matrix mass, acidic solution of 10mM HCl and porcine pepsin was added to the final concentration of 160U/mg matrix. The resulting suspension was transferred under sterile conditions to a capped vessel and homogenized using a magnetic stir plate for 4 days at RT, until almost complete dissolution of the tissue pieces. The viscous gel contents (Figure 5) were centrifuged for 30min, 3000g, 4°C and stored in the refrigerator.

înainte de folosire, s-a efectuat neutralizarea ph-ului acid pe gheața, folosind soluție de IM NaOH, urmată de incubarea hidrogelului timp de 90 min în incubator. Hidrogelul astfel obținut - MIGELa fost mai întâi caracterizat apoi folosit la studii de bio-compatibilitate cu celule fibroblast-like.before use, acid pH neutralization was performed on ice, using IM NaOH solution, followed by incubation of the hydrogel for 90 min in the incubator. The thus obtained hydrogel - MIGEL was first characterized and then used in bio-compatibility studies with fibroblast-like cells.

Etapa 3.2 Evalarea prezenței glicozaminoglicanilor în hidrogelul MIGELStage 3.2 Evaluation of the presence of glycosaminoglycans in the MIGEL hydrogel

Pentru a verifica dacă în urma procesului de decelulaizare și a digestiei enzimatice a țesutului miocardic, GAG sunt încă prezente în hidrogelul dezvoltat, s-a cuantificat nivelul deIn order to verify whether, following the process of decellularization and enzymatic digestion of the myocardial tissue, GAGs are still present in the developed hydrogel, the level of

GAG prin metoda ELISA. S-a obținut o concentrație de 20.15ng/ml GAG (Figura 6) in hidrogelul MIGEL, rezultat care evidențiază menținerea acestor componente in hidrogelul dezvoltat, în urma procesului de decelularizare. Aceste rezultate au fost confirmate și prin coloratii cu Alcian blue pe secțiuni obținute din țesutul nativ sau decelularizat. Astfel, se observă o colorație relativ similară (Figura 7) a glicozamino-glicanilor în secțiunile cu sau fără celule.GAG by ELISA method. A concentration of 20.15ng/ml GAG was obtained (Figure 6) in the MIGEL hydrogel, a result that highlights the maintenance of these components in the developed hydrogel, following the decellularization process. These results were also confirmed by staining with Alcian blue on sections obtained from native or decellularized tissue. Thus, relatively similar staining (Figure 7) of glycosaminoglycans is observed in sections with or without cells.

Etapa 3.3 Identificarea proteinelor matriceale din MIGELStage 3.3 Identification of matrix proteins from MIGEL

Pentu a caracteriza hidrogelul MIGEL din punct de vedere al compoziției proteinelor extracelulare, hidrogelul a fost denaturat si încărcat pe gel poliacrilamidă de concentrație 8% și a fost efectuată elecroforeza. După liza hidrogelului in tampon Lamelli, omogenatul obținut a fost supus determinării proteice prin metoda Bradford. Probele conținând 30-40 pg proteină au fost separate pe geluri de 10% SDS-PAGE și apoi transferate pe membrane de nitroceluloză. Pentru o bună evaluare a prezentei proteinelor matriceale, au fost încărcate 2 concentrații diferite de lizat de hidrogel, 3.125ug/ml (lane 1) si 6.25ug/ml (lane 2, Fig 7). Pentru colagen 1 și fibronectina, pe lane-ul 3 a fost încărcată proteina respectivă, recombinată comercială. Membranele au fost incubate peste noapte la 4°C cu anticorpi primari monoclonali pentru fibronectina, collagen I si IV, elastină, laminină și actină (pentru normalizare) urmat de al doilea anticorp conjugat cu HRP, timp de o ora. Semnalul a fost vizualizat folosind un substrat chemiluminiscent de la Pierce si Analizorul de Imagine LAS 4000 (Fujifilm) și analizat cu ajutorul softwear-ului - Image reader LAS 4000.In order to characterize the MIGEL hydrogel from the point of view of the composition of extracellular proteins, the hydrogel was denatured and loaded onto an 8% polyacrylamide gel and electrophoresis was performed. After hydrogel lysis in Lamelli buffer, the obtained homogenate was subjected to protein determination by the Bradford method. Samples containing 30–40 μg protein were separated on 10% SDS-PAGE gels and then transferred to nitrocellulose membranes. For a good evaluation of the presence of matrix proteins, 2 different concentrations of hydrogel lysate were loaded, 3.125ug/ml (lane 1) and 6.25ug/ml (lane 2, Fig 7). For collagen 1 and fibronectin, lane 3 was loaded with the respective commercial recombinant protein. Membranes were incubated overnight at 4°C with monoclonal primary antibodies for fibronectin, collagen I and IV, elastin, laminin and actin (for normalization) followed by HRP-conjugated second antibody for one hour. The signal was visualized using a chemiluminescent substrate from Pierce and the Image Analyzer LAS 4000 (Fujifilm) and analyzed with the software - Image reader LAS 4000.

Rezultatele arata ca MIGEL conține proteinele matriceale investigate: colagen I si IV, elastina, fibronectina si laminina (Figura 8), proteine existente in tesutul nativ cardiac.The results show that MIGEL contains the investigated matrix proteins: collagen I and IV, elastin, fibronectin and laminin (Figure 8), proteins existing in native cardiac tissue.

4) Studiul biocompatibilității hidrogelului dezvoltat- MIGEL, cu celule cardiace.4) Biocompatibility study of the developed hydrogel - MIGEL, with cardiac cells.

Etapa 4.1 Viabilitatea celulelor cardiace cu MIGELStage 4.1 Viability of cardiac cells with MIGEL

Pentru exemplificare, s-au utilizat fibroblasti umani si cardiomiocite murine din linia HL1 în care s-a urmărit viabilitatea acestor celule pe MIGEL. Hidrogelul obținut așa cum a fost descris mai sus, a fost transferat în tub cu NaOH. După neutralizarea ph-ului, hidrogelul a fost omogenizat cu pipeta și incubat timp de 15min pe gheață. Ulterior s-a tamponat amestecul cu soluția de lOx TFS până la lx, și s-a omogenizat. A urmat o centrifugare la lOOOg timp de 15min la 4°C (pentruFor example, human fibroblasts and murine cardiomyocytes from the HL1 line were used in which the viability of these cells was monitored on MIGEL. The hydrogel obtained as described above was transferred to the tube with NaOH. After pH neutralization, the hydrogel was homogenized with a pipette and incubated for 15 min on ice. The mixture was then buffered with lOx TFS solution to lx, and homogenized. This was followed by a centrifugation at lOOOg for 15 min at 4°C (for

RO 137239 AO degazare). După centrifugare hidrogelul a fost turnat în formă la volumul dorit, de preferat în vas cu aderență scăzută pentru ușurarea manevrelor ulterioare. Constructul 3D fabricat din MIGEL a fost incubat la 37°C în incubatorul pentru culturi celulare timp de 2h. După incubare, peste constructul 3D obținut au fost cultivate celule cardiace fibroblaste sau cardiomiocite si s-a adăugat mediu de cultură DMEM complet.RO 137239 AO degassing). After centrifugation, the hydrogel was molded into the desired volume, preferably in a vessel with low adhesion to facilitate subsequent manipulations. The 3D construct made of MIGEL was incubated at 37°C in the cell culture incubator for 2h. After incubation, cardiac fibroblasts or cardiomyocytes were cultured over the obtained 3D construct and complete DMEM culture medium was added.

Evaluarea viabilității celulelor crescute pe MIGEL s-a făcut prin teste “live/dead” (Figura 9) folosind iodura de propidiu (PI) - Img/ml și soluție Hoechst 33342 - lOmg/ml (2pg/ml și 5pg/ml concentrație finală). S-a preparat soluția de colorare cu PI/Hoechst în mediu fără ser și fără roșu fenol, a fost substituit mediu, iar probele au fost incubate în incubator pentru 20 min. Imaginile au fost făcute la microscopul de fluorescență 1X81 Olimpus folosind cubul de filtre de ex/em 360/420 (pentru UV -nudei) si 565/610 (faloidină - roșu). Cuantifcarea celulelor moarte în mai multe câmpuri vizuale de pe mai multe probe arată o viabilitate de aproximativ 98% a celulelor crescute pe MIGEL (Figura 9), evidențiind astfel o compatibilitate foarte bună a hidrogelului cu celulele umane.The evaluation of the viability of cells grown on MIGEL was done by "live/dead" tests (Figure 9) using propidium iodide (PI) - Img/ml and Hoechst 33342 - lOmg/ml solution (2pg/ml and 5pg/ml final concentration). The PI/Hoechst staining solution was prepared in serum-free and phenol red-free medium, the medium was replaced, and the samples were incubated in the incubator for 20 min. Images were taken on a 1X81 Olimpus fluorescence microscope using the ex/em filter cube 360/420 (for UV - nude) and 565/610 (phalloidin - red). Quantification of dead cells in multiple fields of view on multiple samples shows approximately 98% viability of cells grown on MIGEL (Figure 9), thus highlighting a very good compatibility of the hydrogel with human cells.

Etapa 4.2 Morfologia celulelor cardiace cultivate pe MIGELStage 4.2 Morphology of cardiac cells cultured on MIGEL

Pentru exemplificare, s-au utilizat fibroblaste umane cultivate la suprafața hidrogelului, care au fost colorate cu faloidină (pentru vizulaizarea filamentelor de actină ale celulelor cultivate) și hoechst (pentru evidențierea nucleilor celulari), urmată de vizualizarea la microscopul de fluorescență.For example, human fibroblasts cultured on the surface of the hydrogel were used, which were stained with phalloidin (to visualize actin filaments of cultured cells) and hoechst (to highlight cell nuclei), followed by visualization under a fluorescence microscope.

Protocol colorare: celulele crescute pe hidrogel au fost incubate cu Hoechst 5μ/ιη1 timp de 15min, apoi spălate in TFS de 2 ori, fixate in 4% PFA timp de 7min 37°C, și in final spălate de 3 ori cu TFS. A urmat incubarea cu faloidină (l:100x cu 0.3% TritonX-100 in TFS timp de 45min, la 37°C) și 3 spălări in TFS, la întuneric. Celulele marcate fluorescent au fost urmărite la microscop, unde s-a observat că la numai 24h după cultivare, celulele au aderat, au proliferat, au adoptat fenotipul specific fibroblsatelor și s-au interconectat (Figura 10).Staining protocol: the cells grown on the hydrogel were incubated with Hoechst 5μ/ιη1 for 15min, then washed in TFS 2 times, fixed in 4% PFA for 7min at 37°C, and finally washed 3 times with TFS. This was followed by incubation with phalloidin (l:100x with 0.3% TritonX-100 in TFS for 45 min, at 37°C) and 3 washes in TFS, in the dark. Fluorescently labeled cells were observed under a microscope, where it was observed that only 24h after cultivation, the cells adhered, proliferated, adopted the fibroblast-specific phenotype and interconnected (Figure 10).

5) Functionalizarea hidrogelului obtinut cu un agent antiinflamator.5) Functionalization of the obtained hydrogel with an anti-inflammatory agent.

Pentru exemplificare s-au utilizat: hidrogelul MIGEL obținut așa cum s-a descris mai sus și ABR25757 - un inhibitor specific de alarmina S100A9. Pentru funcționalizare, inhibitorulFor example, the following were used: MIGEL hydrogel obtained as described above and ABR25757 - a specific inhibitor of alarmin S100A9. For functionalization, the inhibitor

RO 137239 AORO 137239 AO

ABR25757 s-a dizolvat în prealabil in DMSO (3.5mg/ml, echivalent 10 mM) și s-a adăugat ulterioar la soluția de hidrogel - MIGEL, într-o concentrație finală de ΙΟΟμΜ. Astfel, formarea rețelei de hidrogel și încapsularea medicamentului au fost realizate simultan, inhibitorul fiind încapsulat uniform in hidrogel. Hidrogelul astfel funcționalizat a fost mai întâi testat pentru biocompatibilitatea cu fibroblastele umne și apoi a fost folosit pentru realizarea studiului de eliberare si pentru evaluarea efectelor asupra transmigrării leucocitelor.ABR25757 was previously dissolved in DMSO (3.5mg/ml, equivalent to 10 mM) and subsequently added to the hydrogel solution - MIGEL, in a final concentration of ΙΟΟμΜ. Thus, the formation of the hydrogel network and the encapsulation of the drug were carried out simultaneously, the inhibitor being uniformly encapsulated in the hydrogel. The functionalized hydrogel was first tested for biocompatibility with human fibroblasts and then used to perform the release study and to evaluate the effects on leukocyte transmigration.

i) Evaluarea citotoxicitătii hidrogelului funcționalizati) Evaluation of the cytotoxicity of the functionalized hydrogel

Funcționalizarea hidrogelului cu inhibitorul ABR25757 nu a avut efect citotoxic asupra fibroblastelor murine, dimpotrivă nivelul de toxicitate a fost mai mic decât cel al celulelor control, cultivate in condiții bidimensionale (2D) (Figura 11).Functionalization of the hydrogel with the inhibitor ABR25757 had no cytotoxic effect on murine fibroblasts, on the contrary, the level of toxicity was lower than that of control cells, grown in two-dimensional (2D) conditions (Figure 11).

ii) Studiu asuprara eliberării compusului încapsulat în hidrogelul MIGEL.ii) Study on the release of the compound encapsulated in the MIGEL hydrogel.

Caracterizarea stabilității gelului și cinetica de eliberare a compusului încapsulat ABR25757, au fost realizate prin incubarea hidrogelului funcționalizat cu mediu de cultură pentru diferite perioade de timp, la 37°C în TFS. Eliberarea compusului încapsulat a fost evaluată la 2h, 4h și 24h de la incubare. Cuantificarea compusului eliberat s-a efectuat in mediul de incubare colectat la diferite intervale de timp, prin măsurători spectofotometrice, cu ajutorul spectrofotometrului TECAN în domeniul UV-VIS (312nm), utilizând o curbă etalon a compusului în tampon fosfat salin (Figura 12). Inhibitorul încapsulat are o cinetica de eliberare relativ rapidă, cu un procent de eliberare de 91% după 24h (Figura 12), sugerând o rețea poroasă destul de laxă/permisivă a hidrogelului dezvoltat.Characterization of the gel stability and release kinetics of the encapsulated compound ABR25757 were performed by incubating the functionalized hydrogel with culture medium for different periods of time at 37°C in TFS. The release of the encapsulated compound was evaluated at 2h, 4h and 24h after incubation. The quantification of the released compound was carried out in the incubation medium collected at different time intervals, through spectrophotometric measurements, with the help of the TECAN spectrophotometer in the UV-VIS range (312nm), using a standard curve of the compound in saline phosphate buffer (Figure 12). The encapsulated inhibitor has a relatively fast release kinetics, with a release percentage of 91% after 24h (Figure 12), suggesting a rather loose/permissive porous network of the developed hydrogel.

6) Evaluarea efectului antiinflamator al hidrogelului funcționalizat6) Evaluation of the anti-inflammatory effect of the functionalized hydrogel

Pentru exemplificare, s-au utilizat hidrogelul MIGEL funcționalizat cu ABR25757, obținut așa cum s-a descris mai sus si celule inflamatoare circulante, neutrofile si monocite. Efectul antiinflamator al hidrogelului funcționalizat, a fost investigată prin cuantificarea transmigrarii leucocitelor atât prin camere duble de chemotaxie (i), cât și cu sistemul xCELLigence (ii), unde neutrofilele /monocitele au transmigrat prin MIGEL sau MIGEL funcționalizat cu ABR.For example, MIGEL hydrogel functionalized with ABR25757, obtained as described above, and circulating inflammatory cells, neutrophils and monocytes were used. The anti-inflammatory effect of the functionalized hydrogel was investigated by quantifying leukocyte transmigration both through double chemotaxis chambers (i) and with the xCELLigence system (ii), where neutrophils/monocytes transmigrated through MIGEL or MIGEL functionalized with ABR.

i) Transmigrarea leucocitelor prin camere duble boydeni) Transmigration of leukocytes through double boyden chambers

Transmigrarea monocitelor si neutrofilelor către diferiti chemoatractanți, în prezența sau absența hidrogelului dezvoltat - MIGEL s-a efectuat flosind camerele boyden de chemotaxie (i), în care monocitele/neutrofilele au fost adăugate în compartimentul de sus al camerei duble, chemoatractantul în compartimentul de jos, iar hidrogelul pe membrana din policarbonat cu pori de 8pm ai camerei duble. Monocitele/neutrofilele colorate fluorescent au fost adăugate în concentrație de 500 000/ml, iar după 2h de incubare la 37°C, numărul de monocite transmigrate în compartimentul de jos a fost cuantificat la microscopul de fluorescență, în mai multe câmpuri. S-a obținut că S100A9 are efect chemoatractant asupra leucocitelor și că în prezența hidrogelului aceste celule prezintă o transmigrare diminuată. Astfel, în cazul monocitelor, s-a observat ca aceastea transmigrează în număr foarte mare către S100A9, comparativ cu chemoatractantul clasic N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) (Figura 13). Deasemenea, în prezența hidrogelului, numărul de monocite care transmigrează în compartimentul de jos al camerei duble este diminuat (Figura 13).The transmigration of monocytes and neutrophils to different chemoattractants, in the presence or absence of the developed hydrogel - MIGEL was performed by floating the boyden chemotaxis chambers (i), in which the monocytes/neutrophils were added to the upper compartment of the double chamber, the chemoattractant to the lower compartment, and the hydrogel on the polycarbonate membrane with 8pm pores of the double chamber. Fluorescently stained monocytes/neutrophils were added at a concentration of 500,000/ml, and after 2h of incubation at 37°C, the number of transmigrated monocytes in the lower compartment was quantified under a fluorescence microscope, in several fields. It was found that S100A9 has a chemoattractant effect on leukocytes and that in the presence of the hydrogel these cells show a diminished transmigration. Thus, in the case of monocytes, it was observed that they transmigrate in very large numbers to S100A9, compared to the classic chemoattractant N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) (Figure 13). Also, in the presence of the hydrogel, the number of monocytes that transmigrate into the lower compartment of the double chamber is diminished (Figure 13).

i) Chemotaxia leucocitelor prin sistemul xCELLigencei) Chemotaxis of leukocytes through the xCELLigence system

Transmigrarea în timp real a leucocitelor (monocite si neutrofile) a fost monitorizată folosind CIM-plate-16 și sistemul xCELLigence RTCA DP (Roche). S-au folosit plăci cu 16 godeuri, compuse dintr-o cameră superioară (UC) și o cameră inferioară (LC). UC constă dintr-o membrană microporoasă de polietilen tereftalat-PET care permite translocarea celulelor din partea superioară în partea inferioară. Migrarea celulelor a fost monitorizată de senzori cu microelectrozi de aur interdigitați care generează un semnal de impedanță prin contactul cu celulele migrate care traversează membrana. In LC s-a adăugat S100A9 (5-10 pg/ml) care sa servească drept chemoatractant pentru monocite si neutrofile. Neutro filele sau monocitele (4x10⁵) au fost adăugate în UC al plăcii CIM-16 în mediu RPMI fără ser. Migrarea celulelor a fost monitorizată timp de până la 20 de ore.Real-time transmigration of leukocytes (monocytes and neutrophils) was monitored using CIM-plate-16 and the xCELLigence RTCA DP system (Roche). 16-well plates composed of an upper chamber (UC) and a lower chamber (LC) were used. The UC consists of a microporous polyethylene terephthalate-PET membrane that allows cells to translocate from the top to the bottom. Cell migration was monitored by sensors with interdigitated gold microelectrodes that generate an impedance signal by contacting migrating cells crossing the membrane. S100A9 (5-10 pg/ml) was added to LC to serve as a chemoattractant for monocytes and neutrophils. Neutrophils or monocytes (4x10 ⁵ ) were added to the UC of the CIM-16 plate in serum-free RPMI medium. Cell migration was monitored for up to 20 hours.

Atunci când transmigrarea monocitelor a fost evaluată cu xCELLigence, s-a observat că prezența hidrogelului funcționalizat are ca efect reducerea numărului de monocite care transmigrează prin hidrogel (Figura 14), deci reducerea inflamației.When monocyte transmigration was assessed with xCELLigence, it was observed that the presence of the functionalized hydrogel had the effect of reducing the number of monocytes transmigrating through the hydrogel (Figure 14), thus reducing inflammation.

Prezentarea pe scurt a figurilor:Brief presentation of the figures:

Figura 1. Schematizare infarct miocardic. Infarctul miocardic apare atunci când un vas major care furnizează sânge către inimă (numit arteră coronară) este blocat, ceea ce duce la privarea de oxigen a unei părți din țesutul inimii. Lipsa de oxigen a țesutului inimii cauzează deteriorarea sau moartea zonei afectate. Blocarea vasului de sânge este un proces de durată in care factorii inflamatori și lipidele din organism se lipesc de pereții arterelor formând ceea ce se numește o placă ateromatoasă. Când o bucată din această placă este ruptă, se formează un cheag (numit tromb) care blochează vasul de sânge.Figure 1. Myocardial infarction schematic. Myocardial infarction occurs when a major vessel that supplies blood to the heart (called a coronary artery) is blocked, depriving part of the heart tissue of oxygen. Lack of oxygen to the heart tissue causes damage or death to the affected area. Blockage of the blood vessel is a long-term process in which inflammatory factors and lipids in the body stick to the walls of the arteries forming what is called an atheromatous plaque. When a piece of this plaque is broken, a clot (called a thrombus) forms and blocks the blood vessel.

Figura 2. Inimi murine (a) și miocard porcin obținut din inimi de porc (b), inițiale, nedecelualrizate.Figure 2. Murine hearts (a) and porcine myocardium obtained from pig hearts (b), initial, non-decalcified.

Figura 3. Inimi murine (a) și miocard porcin (b) decelularizate; (c) inimi murine in pașii intermediari de decelularizare.Figure 3. Decellularized murine hearts (a) and porcine myocardium (b); (c) murine hearts in the intermediate steps of decellularization.

Figura 4. Figura 3. Colorație cu hematoxilină eozină a secțiunilor obținute din a) țesut nativ porcin, b) țesut decelularizat porcin și c) țesut decelularizat murin (5x, 20x).Figure 4. Figure 3. Hematoxylin-eosin staining of sections obtained from a) porcine native tissue, b) porcine decellularized tissue, and c) murine decellularized tissue (5x, 20x).

Figura 5. Higrogel - MI GEL obtinut din miocard porcin decelularizat, liofilizat si rehidratat Figura 6. Curba logaritmica de etalonare a concentrație de GAG; concentrația de GAG determinată în hidrogelul MIGEL.Figure 5. Hygrogel - MI GEL obtained from decellularized, lyophilized and rehydrated porcine myocardium Figure 6. Logarithmic calibration curve of GAG concentration; the concentration of GAG determined in the MIGEL hydrogel.

Figura 7. Colorație Alcian blue pe secțiuni obținute din a) țesut nativ porcin, b) țesut decelularizat porcin și c) țesut decelularizat murin (5x).Figure 7. Alcian blue staining on sections obtained from a) native porcine tissue, b) decellularized porcine tissue, and c) decellularized murine tissue (5x).

Figura 8. Compoziția biochimică a hidrogelului derivat din miocard porcin investigată prin SDSPAGE - Western Blot, folosind anticorpi specifici proteinelor matriceale: colagen I, colagen IV, eleastină, fibronectină și laminină.Figure 8. Biochemical composition of the hydrogel derived from porcine myocardium investigated by SDSPAGE - Western Blot, using antibodies specific to matrix proteins: collagen I, collagen IV, elastin, fibronectin and laminin.

Figura 9. Imagine reprezentativă compozită folosind obiectiv lOx în contrast de fază (gri), fluorescentă Hoechst (cian) și PI (roșu) a fîbrobalstelor la 24h după cultivarea la suprafața gelului în concentrație de 3x104 celule/cm2 (stanga). Cuantifcarea celulelor moarte pe mai mite câmpuri vizuale (dreapta).Figure 9. Representative composite image using phase-contrast lOx objective (gray), Hoechst fluorescence (cyan) and PI (red) of fibroblasts 24h after cultivation on the gel surface at a concentration of 3x104 cells/cm2 (left). Quantification of dead cells in smaller fields of view (right).

Figura 10. Imagine reprezentativă pentru morfologia celulelor crescute în MIGEL folosind obiectiv lOx sus si 20x, în contrast de fază (gri) sau fluorescentă Hoechst (cian) și Phalloidin (roșu). Celule la densitate de 3xl04/cm2 au fost cultivate timp de 18h pe suprafața gelului.Figure 10. Representative image for the morphology of cells grown in MIGEL using lOx up and 20x objective, in phase contrast (gray) or fluorescent Hoechst (cyan) and Phalloidin (red). Cells at a density of 3x104/cm2 were cultured for 18h on the gel surface.

RO 137239 AORO 137239 AO

Figura 11. Cuantificarea citotoxicitatii induse de inhibitorul ABR25757 asupra fibroblastelor umane, evaluată utilizând testul Toxi-Light.Figure 11. Quantification of the cytotoxicity induced by the inhibitor ABR25757 on human fibroblasts, evaluated using the Toxi-Light assay.

Figura 12. Curba etalon de absorbantă (stânga) a inhibitorului de A100A9 - ABR-25757, la diferite concentrații. Garficul din dreapta reprezintă eliberarea în timp (2h, 4h, 24h) a compusului încapsulat calculată atât ca procent din concentrația maximă (verde) dar și concentrația eliberată exprimată în μΜ (albastru).Figure 12. Absorbance standard curve (left) of A100A9 inhibitor - ABR-25757, at different concentrations. The fork on the right represents the release over time (2h, 4h, 24h) of the encapsulated compound calculated both as a percentage of the maximum concentration (green) and also the released concentration expressed in μΜ (blue).

Figura 13. Transmigrarea monocitelor prin camere duble către fMLP sau S100A9.Figure 13. Transmigration of monocytes through dual chambers to fMLP or S100A9.

Figura 14. Transmigrarea monocitelor măsurată cu sistemul xCellicence prin hidrogelul nativ (roșu) sau prin hidrogelul funcționalizat cu ABR (verde).Figure 14. Transmigration of monocytes measured with the xCellicence system through the native hydrogel (red) or through the ABR-functionalized hydrogel (green).

RO 137239 AORO 137239 AO

BibliografieBibliography

Anderson J.M., A. Rodriguez, D.T. Chang, Foreign body reaction to biomaterials, Semin. Immunol. 20(2008) 86-100.Anderson J.M., A. Rodriguez, D.T. Chang, Foreign body reaction to biomaterials, Semin. Immunol. 20(2008) 86-100.

Anker S.D., A.J. Coats, G. Cristian, D. Dragomir, E. Pusineri, M. Piredda, L. Bettari, R. Dowling, M. Volterrani, B.A. Kirwan, G. Filippatos, J.L. Mas, N. Danchin, S.D. Solomon, R.J. Lee, F. Ahmann, A. Hinson, H.N. Sabbah, D. L. Mann, A prospective comparison of alginate-hydrogel with standard medical therapy to determine impact on funcțional capacity and clinical outcomes in patients with advanced heart failure (AUGMENT-HF trial), Eur. Heart J. 36 (2015) 2297-2309.Anker S.D., A.J. Coats, G. Cristian, D. Dragomir, E. Pusineri, M. Piredda, L. Bettari, R. Dowling, M. Volterrani, B.A. Kirwan, G. Filippatos, J.L. Mas, N. Danchin, S.D. Solomon, R.J. Lee, F. Ahmann, A. Hinson, H.N. Sabbah, D. L. Mann, A prospective comparison of alginate-hydrogel with standard medical therapy to determine impact on functional capacity and clinical outcomes in patients with advanced heart failure (AUGMENT-HF trial), Eur. Heart J. 36 (2015) 2297-2309.

Anugrah D.S.B., K. Ramesh, M. Kim, K. Hyun, K.T. Lim, Near-infrared lightresponsive alginate hydrogels based on diselenide-containing cross-linkage for on demand degradation and drug release, Carbohydr. Polym. 223 (2019) 115070.Anugrah D.S.B., K. Ramesh, M. Kim, K. Hyun, K.T. Lim, Near-infrared lightresponsive alginate hydrogels based on diselenide-containing cross-linkage for on demand degradation and drug release, Carbohydr. Polym. 223 (2019) 115070.

Badylak, S. F., Weiss, D. J., Caplan, A. & Macchiarini, P. Engineered whole organs and complex tissues. Lancet 379, 943-952 (2012).Badylak, S. F., Weiss, D. J., Caplan, A. & Macchiarini, P. Engineered whole organs and complex tissues. Lancet 379, 943-952 (2012).

Bhattarai N., J. Gunn, M. Zhang, Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery, Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (2010) 83-99Bhattarai N., J. Gunn, M. Zhang, Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery, Adv. Deliv drug. rev. 62 (2010) 83-99

Bloise N., I. Rountree, C. Polucha, G. Montagna, L. Visai, K.L.K. Coulombe, F. Munarin, Engineering immunomodulatory biomaterials for regenerating the infarcted myocardium, Fron. Bioeng. Biotechnol. 8 (2020) 292.Bloise N., I. Rountree, C. Polucha, G. Montagna, L. Visai, K.L.K. Coulombe, F. Munarin, Engineering immunomodulatory biomaterials for regenerating the infarcted myocardium, Fron. Bioeng. Biotechnol. 8 (2020) 292.

Buckley L.F., A. Abbate, Interleukin-1 blockade in cardiovascular diseases: a clinical update, Eur. Heart J. 39 (2018) 2063-2069.Buckley L.F., A. Abbate, Interleukin-1 blockade in cardiovascular diseases: a clinical update, Eur. Heart J. 39 (2018) 2063-2069.

Copland I.B., E.M. Jolicoeur, M.A. Gillis, J. Cuerquis, N. Eliopoulos, B. Annabi, A. Calderone, J.F. Tanguay, A. Ducharme, J. Galipeau. Coupling erythropoietin secretion to mesenchymal stromal cells enhances their regenerative properties, Cardiovasc. Res. 79 (2008) 405-415.Copland I.B., E.M. Jolicoeur, M.A. Gillis, J. Cuerquis, N. Eliopoulos, B. Annabi, A. Calderone, J.F. Tanguay, A. Ducharme, J. Galipeau. Coupling erythropoietin secretion to mesenchymal stromal cells enhances their regenerative properties, Cardiovasc. Res. 79 (2008) 405-415.

DimatteR. o, N. J. Darling, T. Segura, In situ forming injectable hydrogels for drug delivery and wound repair, Adv. Drug Deliv. Rev. 127 (2018) 167-184.DimatteR. o, N. J. Darling, T. Segura, In situ forming injectable hydrogels for drug delivery and wound repair, Adv. Deliv drug. rev. 127 (2018) 167-184.

Frangogiannis N.G., Cell biological mechanisms in regulation of the postinfarction inflammatory response, Curr. Opin.Physiol. 1 (2018) 7-13.Frangogiannis N.G., Cell biological mechanisms in regulation of the postinfarction inflammatory response, Curr. Opin.Physiol. 1 (2018) 7-13.

Frey N., A. Linke, T. Suselbeck, J. Muller-Ehmsen, P. Vermeersch, D. Schoors, M. Rosenberg, F. Bea, S. Tuvia, J. Leor, Intracoronary delivery of injectable bioabsorbable scaffold (IK-5001) to treat left ventricular remodeling after STelevation myocardial infarction: a first-in-man study, Circulation. Cardiovascular Interv. 7 (2014) 806-812.Frey N., A. Linke, T. Suselbeck, J. Muller-Ehmsen, P. Vermeersch, D. Schoors, M. Rosenberg, F. Bea, S. Tuvia, J. Leor, Intracoronary delivery of injectable bioabsorbable scaffold (IK -5001) to treat left ventricular remodeling after STelevation myocardial infarction: a first-in-man study, Circulation. Cardiovascular Interv. 7 (2014) 806-812.

Godier-Fumemont AF, Martens TP, Koeckert MS, Wan L, Parks J, Arai K, Zhang G, Hudson B, Homma S, Vunjak-Novakovic G. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascularGodier-Fumemont AF, Martens TP, Koeckert MS, Wan L, Parks J, Arai K, Zhang G, Hudson B, Homma S, Vunjak-Novakovic G. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular

RO 137239 AO repair. Proc Natl Acad Sci USA. 2011 May 10; 108(19):7974-9. doi: 10.1073/pnas.l 104619108. Epub 2011 Apr 20.RO 137239 AO repair. Proc Natl Acad Sci USA. 2011 May 10; 108(19):7974-9. doi: 10.1073/pnas.l 104619108. Epub 2011 Apr 20.

Gradinaru V., J. Treweek, K. Overton, K. Deisseroth, Hydrogel-tissue chemistry: principles and applications, Annu. Rev. Biophys. 47 (2018) 355-376.Gradinaru V., J. Treweek, K. Overton, K. Deisseroth, Hydrogel-tissue chemistry: principles and applications, Annu. rev. Biophys. 47 (2018) 355-376.

Hashimoto, H., Olson, E. N., & Bassel-Duby, R. (2018). Therapeutic approaches for cardiac regeneration and repair. Nature Reviews Cardiology, 75(10), 585-600.Hashimoto, H., Olson, E. N., & Bassel-Duby, R. (2018). Therapeutic approaches for cardiac regeneration and repair. Nature Reviews Cardiology, 75(10), 585-600.

Huang, K. et al. An off-the-shelf artificial cardiac patch improves cardiac repair after MI in rats and pigs. Sci. Transl. Med. 12, eaat9683 (2020).Huang, K. et al. An off-the-shelf artificial cardiac patch improves cardiac repair after MI in rats and pigs. Sci. Transl. Med. 12, eaat9683 (2020).

Lee R.J., A. Hinson, R. Bauemschmitt, K. Matschke, Q. Fang, D.L. Mann, Dowling R., N. Schiller, H.N. Sabbah, The feasibility and safety of Algisyl-LVR™ as a method of left ventricular augmentation in patients with dilated cardiomyopathy: inițial first in man clinical results, Int. J. Cardiol. 199 (2015) 18-24.Lee R.J., A. Hinson, R. Bauemschmitt, K. Matschke, Q. Fang, D.L. Mann, Dowling R., N. Schiller, H.N. Sabbah, The feasibility and safety of Algisyl-LVR™ as a method of left ventricular augmentation in patients with dilated cardiomyopathy: initial first in man clinical results, Int. J. Cardiol. 199 (2015) 18-24.

Lee R. J., A. Hinson, S. Helgerson, R. Bauemschmitt, H.N. Sabbah, Polymer-based restoration of left ventricular mechanics, Cell Transplant. 22 (2013) 529-533.Lee R.J., Hinson A., Helgerson S., Bauemschmitt R., H.N. Sabbah, Polymer-based restoration of left ventricular mechanics, Cell Transplant. 22 (2013) 529-533.

Lewis A. Reis, Loraine L. Y. Chiu, Nicole Feric, Lara Fu, Milica Radisic. Biomaterials in myocardial tissue engineering J Tissue Eng Regen Med. J Tissue Eng Regen Med. 2016 Jan; 10(1): 11-28.Lewis A. Reis, Loraine L. Y. Chiu, Nicole Feric, Lara Fu, Milica Radisic. Biomaterials in myocardial tissue engineering J Tissue Eng Regen Med. J Tissue Eng Regen Med. 2016 Jan; 10(1): 11-28.

Mahmarian J.J., H.A. Dakik, N.G. Filipchuk, L.J. Shaw, S.S. Iskander, T.D. Ruddy, F. Keng, M.J. Henzlova, A. Allam, L.A. Moye, C.M. Pratt, An inițial strategy of intensive medical therapy is comparable to that of coronary revascularization for suppression of scintigraphic ischemia in high-risk but stable survivors of acute myocardial infarction, J. Am. Coli. Cardiol. 48 (2006) 2458-2467.Mahmarian J.J., H.A. Dakik, N.G. Filipchuk, L.J. Shaw, S.S. Iskander, T.D. Ruddy, F. Keng, M.J. Henzlova, A. Allam, L.A. Moye, C.M. Pratt, An initial strategy of intensive medical therapy is comparable to that of coronary revascularization for suppression of scintigraphic ischemia in high-risk but stable survivors of acute myocardial infarction, J. Am. Coli. Cardiol. 48 (2006) 2458-2467.

NakamurK. a, S. Yokohama, M. Yoneda, S. Okamoto, Y. Tamaki, T. Ito, M. Okada, K. Aso, I. Makino, High, but not low, molecular weight hyaluronan prevents Tcell-mediated liver injury by reducing proinflammatory cytokines in mice, J. Gastroenterol. 39 (2004) 346-354.NakamurK. a, S. Yokohama, M. Yoneda, S. Okamoto, Y. Tamaki, T. Ito, M. Okada, K. Aso, I. Makino, High, but not low, molecular weight hyaluronan prevents Tcell-mediated liver injury by reducing proinflammatory cytokines in mice, J. Gastroenterol. 39 (2004) 346-354.

Oliva N., J. Conde, K. Wang, N. Artzi, Designing hydrogels for on-demand therapy, Acc. Chem. Res. 50 (2017) 669-679.Oliva N., J. Conde, K. Wang, N. Artzi, Designing hydrogels for on-demand therapy, Acc. Chem. Res. 50 (2017) 669-679.

Pakulska, Μ. M., Miersch, S., & Shoichet, M. S. (2016). Designer protein delivery: From natural to engineered affinity-controlled release systems. Science, 351(6219), aac4750-aac4750.Pakulska, M. M., Miersch, S., & Shoichet, M. S. (2016). Designer protein delivery: From natural to engineered affinity-controlled release systems. Science, 351(6219), aac4750-aac4750.

Park, S. J. et al. Dual stern cell therapy synergistically improves cardiac function and vascular regeneration following ML Nat. Commun. 10, 3123 (2019).Park, S.J. et al. Dual stern cell therapy synergistically improves cardiac function and vascular regeneration following ML Nat. Commun. 10, 3123 (2019).

Pawan KC, Yi Hong, Ge Zhang. Cardiac tissue-derived extracellular matrix scaffolds for myocardial repair: advantages and challenges. Regenerative Biomaterials, Volume 6, Issue 4, 2019, Pages 185-199.Pawan KC, Yi Hong, Ge Zhang. Cardiac tissue-derived extracellular matrix scaffolds for myocardial repair: advantages and challenges. Regenerative Biomaterials, Volume 6, Issue 4, 2019, Pages 185-199.

Prabhu, S. D., & Frangogiannis, N. G. (2016). The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research, 119(Y}, 91-112.Prabhu, S. D., & Frangogiannis, N. G. (2016). The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research, 119(Y}, 91-112).

RO 137239 AORO 137239 AO

Qian C., T. Zhang, J. Gravesande, C. Baysah, X. Song, J. Xing, Injectable and selfhealing polysaccharide-based hydrogel for pH-responsive drug release, Int. J. Biol. Macromol. 123 (2019) 140148.Qian C., T. Zhang, J. Gravesande, C. Baysah, X. Song, J. Xing, Injectable and self-healing polysaccharide-based hydrogel for pH-responsive drug release, Int. J. Biol. Macromol. 123 (2019) 140148.

Reis L.A., L.L. Chiu, N. Feric, L. Fu, M. Radisic, Biomaterials in myocardial tissue engineering, J. Tissue Eng. Regen. Med. 10 (2016) 11-28.Reis L.A., L.L. Chiu, N. Feric, L. Fu, M. Radisic, Biomaterials in myocardial tissue engineering, J. Tissue Eng. Reg. Med. 10 (2016) 11-28.

Roth, G. A., Abate, D., Abate, K. H., Abay, S. M., Abbafati, C., Abbasi, N., Abbastabar, H., AbdAllah, F., Abdela, J., Abdelalim, A., Abdollahpour, I., Abdulkader, R. S., Abebe, Η. T., Abebe, M., Abebe, Z., Abejie, A. N., Abera, S. F., Abil, O. Z., Abraha, Η. N.,... Murray, C. J. L. (2018). Global, regional, and național age-sex-specific mortality for 282 causes of death in 195 countries and temtories, 1980-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet, 392(10159), 1736-1788.Roth, G. A., Abate, D., Abate, K. H., Abay, S. M., Abbafati, C., Abbasi, N., Abbastabar, H., AbdAllah, F., Abdela, J., Abdelalim, A., Abdollahpour, I ., Abdulkader, R. S., Abebe, Η. T., Abebe, M., Abebe, Z., Abejie, A. N., Abera, S. F., Abil, O. Z., Abraha, Η. N.,... Murray, C. J. L. (2018). Global, regional, and national age-sex-specific mortality for 282 causes of death in 195 countries and territories, 1980-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet, 392(10159), 1736-1788 .

Rufaihah A.J., D. Seliktar, Hydrogels for therapeutic cardiovascular angiogenesis, Adv. Drug Deliv. Rev. 96(2016)31-39.Rufaihah A.J., D. Seliktar, Hydrogels for therapeutic cardiovascular angiogenesis, Adv. Deliv drug. rev. 96(2016)31-39.

Salarii, M., Roy, S., & Fissell, W. H. (2018). Innovations in Wearable and Implantable Artificial Kidneys. 98 American Journal of Kidney Diseases, 72(5), 745-751.Salarii, M., Roy, S., & Fissell, W. H. (2018). Innovations in Wearable and Implantable Artificial Kidneys. 98 American Journal of Kidney Diseases, 72(5), 745-751.

Saleh, M., & Ambrose, J. A. (2018). Understanding myocardial infarction. FlOOOResearch, 7(0), 1378.Saleh, M., & Ambrose, J. A. (2018). Understanding myocardial infarction. FLOOResearch, 7(0), 1378.

Sheikh Z., P.J. Brooks, O. Barzilay, N. Fine, M. Glogauer, Macrophages, foreign body giant cells and their response to implantable biomaterials, Mater. (Basel, Switzerland) 8 (2015) 5671-5701.Sheikh Z., P.J. Brooks, O. Barzilay, N. Fine, M. Glogauer, Macrophages, foreign body giant cells and their response to implantable biomaterials, Mater. (Basel, Switzerland) 8 (2015) 5671-5701.

StraueB.E. r, G. Steinhoff, 10 years of intracoronary and intramyocardial bone marrow stern cell therapy of the heart: from the methodological origin to clinical practice, J. Am. Coli. Cardiol. 58 (2011) 1095-1104.StraueB.E. r, G. Steinhoff, 10 years of intracoronary and intramyocardial bone marrow stern cell therapy of the heart: from the methodological origin to clinical practice, J. Am. Coli. Cardiol. 58 (2011) 1095-1104.

Swirski F.K., M. Nahrendorf, Cardioimmunology: the immune system in cardiac homeostasis and disease, Nat. Rev. Immunol. 18 (2018) 733-744.Swirski F.K., M. Nahrendorf, Cardioimmunology: the immune system in cardiac homeostasis and disease, Nat. rev. Immunol. 18 (2018) 733-744.

Tiburcy, M., Hudson, J. E., Balfanz, P., Schlick, S., Meyer, T., Chang Liao, M.-L., Levent, E., Raad, F., Zeidler, S., Wingender, E., Riegler, J., Wang, M., Gold, J. D., Kehat, L, Wettwer, E., Ravens, U., Dierickx, P., van Laake, L. W., Goumans, M. J., Zimmermann, W.-H. (2017). Defined Engineered Human Myocardium With Advanced Maturation for Applications in Heart Failure Modeling and Repair. Circulation, 135(19), 1832-1847.Tiburcy, M., Hudson, J. E., Balfanz, P., Schlick, S., Meyer, T., Chang Liao, M.-L., Levent, E., Raad, F., Zeidler, S., Wingender, E., Riegler, J., Wang, M., Gold, J. D., Kehat, L, Wettwer, E., Ravens, U., Dierickx, P., van Laake, L. W., Goumans, M. J., Zimmermann, W.- H. (2017). Defined Engineered Human Myocardium With Advanced Maturation for Applications in Heart Failure Modeling and Repair. Circulation, 135(19), 1832-1847.

Traverse JH, Henry TD, Dib N, Patel AN, Pepine C, Schaer GL, DeQuach JA, Kinsey AM, Chamberlin P, Christman KL. First-in-Man Study of a Cardiac Extracellular Matrix Hydrogel in Early and Late Myocardial Infarction Patients. JACC Basic Transl Sci. 2019 Sep 11;4(6):659-669.Traverse JH, Henry TD, Dib N, Patel AN, Pepine C, Schaer GL, DeQuach JA, Kinsey AM, Chamberlin P, Christman KL. First-in-Man Study of a Cardiac Extracellular Matrix Hydrogel in Early and Late Myocardial Infarction Patients. JACC Basic Transl Sci. 2019 Sep 11;4(6):659-669.

Tumer, D., Rieger, A. C., Balkan, W., & Hare, J. M. (2020). Clinical-based Cell Therapies for Heart Disease—Current and Future State. Rambam Maimonides Medical Journal, 11(2), e0015.Tumer, D., Rieger, A. C., Balkan, W., & Hare, J. M. (2020). Clinical-based Cell Therapies for Heart Disease—Current and Future State. Rambam Maimonides Medical Journal, 11(2), e0015.

RO 137239 AORO 137239 AO

Wall, S. T., Walker, J. C., Healy, K. E., Ratcliffe, Μ. B. & Guccione, J. M. Theoretical impact of the injection of material into the myocardium. Circulation 114, 2627-2635 (2006).Wall, S.T., Walker, J.C., Healy, K.E., Ratcliffe, Μ. B. & Guccione, J. M. Theoretical impact of the injection of material into the myocardium. Circulation 114, 2627-2635 (2006).

Wang, L. L. et al. Sustained miRNA delivery from an injectable hydrogel promotes cardiomyocyte proliferation and funcțional regeneration after ischaemic injury. Nat. Biomed. Eng. 1, 983-992 (2017).Wang, L. L. et al. Sustained miRNA delivery from an injectable hydrogel promotes cardiomyocyte proliferation and functional regeneration after ischemic injury. Nat. Biomed. Eng. 1, 983-992 (2017).

Wollert, K. C. & Drexler, H. Cell therapy for the treatment of coronary heart disease: a criticai appraisal. Nat. Rev. Cardiol. 7, 204-215 (2010).Wollert, K. C. & Drexler, H. Cell therapy for the treatment of coronary heart disease: a critical appraisal. Nat. rev. Cardiol. 7, 204-215 (2010).

Wu, T., Liu, W. Funcțional hydrogels for the treatment of myocardial infarction. NPG Asia Mater 14, 9 (2022).Wu, T., Liu, W. Functional hydrogels for the treatment of myocardial infarction. NPG Asia Mater 14, 9 (2022).

Zhu, Y., Matsumura, Y. & Wagner, W. R. Ventricular wall biomaterial injection therapy after MI: advances in material design, mechanistic insight and early clinical experiences. Biomaterials 129, 37-53 (2017).Zhu, Y., Matsumura, Y. & Wagner, W. R. Ventricular wall biomaterial injection therapy after MI: advances in material design, mechanistic insight and early clinical experiences. Biomaterials 129, 37-53 (2017).

Claims (6)

Revendicăridemand 1. Hidrogel din țesut cardiac murin sau porcin caracterizat de o compoziție asemănătoare cu cea a țesutului cardiac nativ, conținând principalele molecule de matrice extracelură: colagen I, collagen IV, elastina, fibronectină, laminină și glicozaminoglicani (GAGs);1. Hydrogel from murine or porcine heart tissue characterized by a composition similar to that of native heart tissue, containing the main extracellular matrix molecules: collagen I, collagen IV, elastin, fibronectin, laminin and glycosaminoglycans (GAGs); 2. Hidrogelul din țesut cardiac conform revendicării 1 este compatibil cu celulele cardiace umane si murine, atât fibroblastele umane cardiace cât și cardiomiocitele murine prezentând morfologie specifică și o viabilitate de peste 95% atunci când sunt cultivate pe hidrogelul dezvoltat;2. The cardiac tissue hydrogel according to claim 1 is compatible with human and murine cardiac cells, both human cardiac fibroblasts and murine cardiomyocytes showing specific morphology and a viability of over 95% when cultured on the developed hydrogel; 3. Hidrogelul din țesut cardiac conform revendicărilor 1 și 2 este caracterizat de o capacitate chemoatractantă redusă, numărul de neutrofile și monocite transmigrate fiind redus semnificativ ca răspus la diferiți chemoatractanți, în prezența hidrogelului;3. The cardiac tissue hydrogel according to claims 1 and 2 is characterized by a reduced chemoattractant capacity, the number of transmigrated neutrophils and monocytes being significantly reduced in response to different chemoattractants, in the presence of the hydrogel; 4. Hidrogelul din țesut cardiac conform revendicărilor 1 - 3 este caracterizat de posibilitatea de a fi funcționalizat cu inhibitorul alarminei S100A9 sau alți agenti anti-inflamatori pentru terapia infarctului miocardic.4. The heart tissue hydrogel according to claims 1 - 3 is characterized by the possibility of being functionalized with the alarmin inhibitor S100A9 or other anti-inflammatory agents for the therapy of myocardial infarction. 5. Hidrogelul din țesut cardiac conform revendicărilor 1 - 4, funcționalizat cu inhibitorul de S100A9 este caracterizat de capacitatea de a fi utilizat în blocarea procesului inflamator, reducând semnificativ transmigrarea monocitelor către alarmina S100A9.5. The cardiac tissue hydrogel according to claims 1 - 4, functionalized with the S100A9 inhibitor is characterized by the ability to be used in blocking the inflammatory process, significantly reducing monocyte transmigration to the S100A9 alarmin. 6. Hidrogelul din țesut cardiac conform revendicărlor 1 - 5, folosit pentru utilizare rezoluției inflamației post infarct miocardic.6. The cardiac tissue hydrogel according to claims 1 - 5, used for use in the resolution of inflammation after myocardial infarction.