RO132029A0 - Preparation and use of powder obtained from the shell membrane of hyperimmune egg hpc2 - Google Patents

Abstract

The invention relates to a process for preparing a powder from the shell membrane of the hyperimmune egg HPC2 and the use thereof in the preparation of a dietary supplement. According to the invention, the process comprises the immunization of Rhode Island Red hens, at the beginning of their egg-laying period, using an antigen prepared from inactivated bacterial and fungal strains. The blend is emulsified in an equal volume of adjuvant QS-21 and inoculated in the breast muscles, in four points (0.25 ml in each point). Booster inoculations are made after 14 days and 28 days, respectively, from the first inoculation. The hyperimmune eggs are collected daily, 14 days after the last inoculation. Then, the eggs are used for extraction of IgY from the yolk, protein fractions from the white and shell membranes which are processed for obtaining a powder. The shell membranes are separated from the eggshell by keeping them for 12 h in deionized water in which diluted acetic acid 4% is added, at a temperature of 4°C, then they are dried for 4 h at a temperature of 50°C and ground, to finally obtain a powder containing collagen, hyaluronic acid, chondroitin and other specific proteins. The shell membrane powder is then used to prepare a natural supplement, as tablets, by mixing it with ascorbic acid and usual tableting excipients.

Description

Domeniul tehnicTechnical field

Imunoiogie, medicină, tratamente, prevenție, aplicații în biotehnologie.Immunology, medicine, treatments, prevention, applications in biotechnology.

Prezenta invenție descrie prepararea și utilizarea pulberii din membrana cochilieră a oului hiperimun HPC2. Membrana cochilieră provine din ouă de la găini imunizate cu antigene bacteriene și fungice inactivate. Prezenta invenție se referă la izolarea membranei cochiliere și utilizarea acesteia în obținerea produsului ROdia-HPC2 comprimate. Prezenta invenție descrie separarea membranei cochiliere, deshidratarea și mărunțirea acesteia. Metoda de obținere a membranei cuprinde următoarele etape:The present invention describes the preparation and use of powder in the shell membrane of the HPC2 hyperimmune egg. The shell membrane comes from eggs from chickens immunized with inactivated bacterial and fungal antigens. The present invention relates to the isolation of the shell membrane and its use in obtaining ROdia-HPC2 tablets. The present invention describes the separation of the shell membrane, its dehydration and shredding. The method of obtaining the membrane comprises the following steps:

Etapa de separare: se face prin desprinderea membranelor de pe cojile în prealabil spălate și menținute într-o soluție de acid acetic 4%.Separation step: it is done by detaching the membranes from the shells previously washed and maintained in a 4% acetic acid solution.

Etapa de uscare: se realizează în etuvă la temperatura de 50°C timp de 4 ore.Drying stage: it is carried out in the oven at 50 ° C for 4 hours.

Etapa de mărunțire: se realizează cu ajutorul unei mori de măcinare; se obține o pulbere fină.The grinding step: it is made with the help of a grinding mill; a fine powder is obtained.

Prezenta invenție caracterizează și compoziția membranei cojii de ou hiperimun PC2. Membrana conține colagen, acid hialuronic, condroitină, glucozamină, ovotransferină, ovoalbumină, lizozim, ovomucină, aminoacizi etc. Produsul ROdia-HPC2 - comprimate, conține aceste ingrediente și acid ascorbic (factorul vitaminic), agenți de încărcare, agenți de îngroșare; agenți antiaglomeranți. Comprimatele sunt ambalate în flacoane de polietilenă cu 30 comprimate x 500 mg.The present invention also characterizes the composition of the PC2 hyperimmune eggshell membrane. The membrane contains collagen, hyaluronic acid, chondroitin, glucosamine, ovotransferin, ovoalbumin, lysozyme, ovomucin, amino acids, etc. The product ROdia-HPC2 - tablets, contains these ingredients and ascorbic acid (vitamin factor), fillers, thickening agents; anti-caking agents. The tablets are packed in polyethylene bottles with 30 x 500 mg tablets.

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Descrierea invențieiDescription of the invention

Prezentarea stadinini tehnic incluiv bibliografiePresentation of the technical staff including bibliography

Prezenta invenție se referă la prepararea pulberii din membrană cochilieră din ouăle hiperimune HPC2. Aceasta provine de ia găini imunizate cu antigene bacteriene și fungice (antigen multiplu). Membrana cochilieră este compusă din două straturi individuale situate între ovoalbumina și coaja de ou. Membranele sunt compuse din fibre de proteine sub forma unei rețele de colagen de tip I, încapsulate într-o manta continuă de proteoglicani și alte macromolecule. Grosimea celor două membrane este cuprinsă între 73-114 pm la ouăle de găini din rasa White Leghom [12]. Membrana externă are o grosime cuprinsă între 53,2 pm și 65,5 pm în timp ce membrana internă ajunge de la 19.5 pm până la 24,3 pm. Colagenul se regăsește în stare nativă, sub formă nedenaturată cu structura triplu helicală nedistrusă (tropocolagen)[19]. Membrana externă este formată din trei straturi de mucină, iar cea internă dintr-un strat de mucină și unul de cheratină. Acidul hialuronic este un alt component de o mare valoare prezent în membrană. Acesta poate fi utilizat în diferite domenii incluzând industria cosmetică, farmaceutică, nutraceutică și în alte aplicații medicale [3].The present invention relates to the preparation of shell membrane powder from HPC2 hyperimmune eggs. This comes from taking chickens immunized with bacterial and fungal antigens (multiple antigen). The shell membrane is composed of two individual layers located between the ovoalbumin and the egg shell. The membranes are composed of protein fibers in the form of a type I collagen network, encapsulated in a continuous layer of proteoglycans and other macromolecules. The thickness of the two membranes is between 73-114 pm in the eggs of hens of the White Leghom breed [12]. The outer membrane has a thickness between 53.2 pm and 65.5 pm, while the inner membrane reaches from 19.5 pm to 24.3 pm. Collagen is found in its native state, in undenatured form with the undisturbed triple helical structure (tropocolagen) [19]. The outer membrane consists of three layers of mucin, and the inner one of a layer of mucin and one of keratin. Hyaluronic acid is another component of great value present in the membrane. It can be used in various fields including the cosmetic, pharmaceutical, nutraceutical and other medical applications [3].

Britton și K. K. Hale jr. au demonstrat că proteinele din membrana cochilieră au un conținut ridicat de arginină, acid glutamic, metionină, histidină, cistină și prolină [5]. De asemenea, membrana conține hidroxiprolină, prolină și acid glucozaminic [15],Britton and K. K. Hale jr. have shown that the proteins in the shell membrane have a high content of arginine, glutamic acid, methionine, histidine, cystine and proline [5]. Also, the membrane contains hydroxyproline, proline and glucosaminic acid [15],

Cea mai importantă funcție a membranei este aceea de a acționa ca o structură de menținere pentru ou, înainte de depunerea calciului în coajă șî de a oferi o matrice organică pentru fixarea acestuia [8]. Membrana este necesară și în dezvoltarea embrionului prin secretarea unor factori de creștere; conține cantități ridicate de proteine și cantități moderate de glucozamină (până ia 1% din greutatea uscată), condroitina (până ia 1%), acid hialuronic (până la 2%) și colagen (până la 5%) [11 ].The most important function of the membrane is to act as a retaining structure for the egg, before the calcium is deposited in the shell and to provide an organic matrix for its attachment [8]. The membrane is also needed in the development of the embryo by secreting growth factors; contains high amounts of protein and moderate amounts of glucosamine (up to 1% by dry weight), chondroitin (up to 1%), hyaluronic acid (up to 2%) and collagen (up to 5%) [11].

Studiile iui Woung și colab. au demonstrat prezența tipului I și V de colagen în membrana cojii de ou [19]. Arias și colab. au identificat prezența colagenului de tip X în membranana cochilieră cu funcția de a inhiba mineralizarea și de a stabiliza zona de depunere a mineralelor [3j. Membrana cochilieră conține acid glucozaminoglican incluzând dermatan sulfat și condroitina [13]. Picard și colab. au izolat și caracterizat glicoproteinele din membranele cochiiiere. Acestea includ hexamine, hexose și fructoză [14], Recent, au fost a 2017 00042The studies of Woung et al. demonstrated the presence of type I and V collagen in the eggshell membrane [19]. Arias et al. identified the presence of type X collagen in the cochlear membrane with the function of inhibiting mineralization and stabilizing the mineral deposition area [3j. The cochlear membrane contains glucosaminoglycan acid including dermatan sulfate and chondroitin [13]. Picard et al. have isolated and characterized glycoproteins from the shell membranes. These include hexamines, hexoses and fructose [14]. Recently, they were of 2017 00042

26/01/2017 raportate cantități semnificative de acid hialuronic în membrana cochilieră (Brevet 6946551). Alte componente identificate în membrană sunt ovotransferină, desmozina și isodesmozina, lizil oxidază și lizozimul [7 și 9], Unele dintre acestea, de exemplu liz.oz.imul și ovotransferină sunt proteine specifice având proprietăți antibacteriene [10], Lizozimul scindează peretele celular al bacteriilor, iar ovotransferină acumulează fierul, facându-l inaccesibil dezvoltării microorganismelor [Brevet A00653/2014]. Membrana cochilieră acționează ca o veritabilă barieră antibacterienă.1/26/2017 Significant amounts of hyaluronic acid in the cochlear membrane (Patent 6946551) reported. Other components identified in the membrane are ovotransferin, desmozine and isodesmozine, lysyl oxidase and lysozyme [7 and 9], some of which, for example liz.oz.im and ovotransferin, are specific proteins with antibacterial properties [10], lysozyme cleaves the cell wall of bacteria, and ovotransferin accumulates iron, making it inaccessible to the development of microorganisms [Patent A00653 / 2014]. The cochlear membrane acts as a true antibacterial barrier.

Au fost descriese o serie de proteine obținute din surse naturale care au fost utilizate în aplicații terapeutice și cosmetice. Astfel, pudra obținută din corn de cerb a fost utilizată în aplicații nutraceutice. Aceasta a fost inclusă în capsule sau folosită ca ingredient în batoanele nutritive. Fracțiunea lipidică obținută din castravetele de mare poate fi folosită ca supliment nutraceutic pentru stimularea sistemului imun. Aceste fracțiuni izolate pot fi utilizate în tratamentul bolilor alergice, inflamatorii și de piele [18]. Preparatele pot fi administrate oral sau aplicate ca loțiuni topice. Proteina hidro!izată obținută din picioare de pui și procesată sub formă de pulbere sau gel, se folosește în tratamentul arsurilor, dezvoltarea musculaturii și pentru piele [16],A series of proteins obtained from natural sources have been described that have been used in therapeutic and cosmetic applications. Thus, the powder obtained from deer horn has been used in nutraceutical applications. It has been included in capsules or used as an ingredient in nutritional sticks. The lipid fraction obtained from sea cucumbers can be used as a nutraceutical supplement to stimulate the immune system. These isolated fractions can be used in the treatment of allergic, inflammatory and skin diseases [18]. The preparations can be administered orally or applied as topical lotions. Hydro! Protein obtained from chicken feet and processed in powder or gel form, is used in the treatment of burns, muscle development and for the skin [16],

Metodele de separare a membranei cochiliere de pe coaja oului pot fi mecanice prin desprinderea membranelor, după spălarea cojilor și înlăturarea albușului și gălbenușului [Brevet US7584.909]. O combinare a metodelor mecanice și chimice pentru separarea membranei, include agitarea cojilor cu membrane în prezența unui acid diluat până ce acestea se desprid [Brevet 258838], Metoda cea mai utilizată include mărunțirea membranelor sub formă de pudră cu particule cuprinse între 100-500 microni [Brevet 20140346261], în altă metodă, membranele mărunțite sunt supuse hidrolizei enzimatice folosind o enzimă din drojdie. Suspensia rezultată conține o fracțiune solubilă în care predomină acidul hialuronic și o altă fracțiune insolubilă conținând colagen [Brevet 496946551/Β2Ί. Extractele și hidrolizatele sunt obținute fără alterarea ingredientelor naturale prezente în membrana cochilieră, putând fi utilizate în aplicații biotehnologice.Methods of separating the shell membrane from the egg shell can be mechanical by detaching the membranes, after washing the shells and removing the egg white and yolk [Patent US7584,909]. A combination of mechanical and chemical methods for membrane separation includes shaking the membrane shells in the presence of dilute acid until they clear [Patent 258838], The most commonly used method includes shredding membranes in powder form with particles ranging from 100-500 microns. [Patent 20140346261], in another method, the crushed membranes are subjected to enzymatic hydrolysis using a yeast enzyme. The resulting suspension contains a soluble fraction in which hyaluronic acid predominates and another insoluble fraction containing collagen [Patent 496946551 / Β2Ί. The extracts and hydrolysates are obtained without altering the natural ingredients present in the shell membrane, and can be used in biotechnological applications.

Au fost descrise și aite preparate topice obținute din surse naturale pentru protecția, tratamentul și vindecarea rănilor [17]. De exemplu, un produs injectabil și oral cuprinde glucozamină, condroitin sulfat, colagen hidrolizat sau nativ, hialuronat de sodiu, ascorbat de mangan și acid malic. Produsul acționează ca un agent condroprotector, îmbunătățește sinteza condrocitelor, contribuie la vindecarea rănilor și la menținerea sănătății țesuturilor [Brevet a 2017 00042Topical preparations obtained from natural sources for the protection, treatment and healing of wounds have also been described [17]. For example, an injectable and oral product comprises glucosamine, chondroitin sulfate, hydrolyzed or native collagen, sodium hyaluronate, manganese ascorbate and malic acid. The product acts as a chondroprotective agent, improves the synthesis of chondrocytes, contributes to wound healing and maintaining tissue health [Patent 2017 00042

70078061. Dale Paul DeVore a descries beneficiile membranei cochiliere native și hidrolizate [Brevet US 8580,315 B2/2013],70078061. Dale Paul DeVore described the benefits of native and hydrolyzed shell membranes [US Patent 8580,315 B2 / 2013],

Un număr de mediatori ai inflamației acționează și ca mediatori ai durerii; o serie de autori prezintă mai multe citokine eliberate de celulele sistemului imunitar, care sunt capabile să inducă hiperalergie [17 și 20], Aceste citokine includ IL-10, IL-6, IL-8 și TNT co. Linele citokine activează inflamația (pro-inflamatorii), iar altele reduc inflamația și contribuie la vindecarea rănilor (anti-inflamatorii); citokineie pro-inflamatorii includ IL-loo, ÎL-1B, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, TNFoo, proteine monocitare chemoatractante (MCP-1, MCP-3, MCP-5) și proteine inflamatorii elaborate de macrophage (MIP-1B, MIP-2, MIP-3B)[Brevet UȘ 8580315 B2], Citokineie anti-inflamatorii includ IL-6, IL-10, IL-12 și IL-13 [Brevet UȘ 8580315 B2/].A number of inflammation mediators also act as pain mediators; a number of authors present several cytokines released by immune system cells that are capable of inducing hyperallergy [17 and 20], These cytokines include IL-10, IL-6, IL-8 and TNT co. Cytokine lines activate inflammation (pro-inflammatory), and others reduce inflammation and contribute to wound healing (anti-inflammatory); Pro-inflammatory cytokines include IL-loo, IL-1B, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, TNFoo, chemoattractant monocyte proteins (MCP-1, MCP-3, MCP-5) and inflammatory proteins developed by macrophage (MIP-1B, MIP-2, MIP-3B) [Patent UȘ 8580315 B2], Anti-inflammatory cytokines include IL-6, IL-10, IL-12 and IL-13 [Patent UȘ 8580315 B2 /] .

Tratamentul inflamației cuprinde o varietate de agenți anti-inflamatorii (inhibitori ai enzimei COX), care acționează lent, agenți de modificare a bolii, incluzând nutraceuticele cum ar fi glucozamin, condroitina și un număr de plante medicinale (Articulin F, Avocado, Capsaicini, ghimbir, Reumaiex, Gheara diavolului)[l71.The treatment of inflammation comprises a variety of anti-inflammatory agents (COX enzyme inhibitors), which act slow, disease-modifying agents, including nutraceuticals such as glucosamine, chondroitin and a number of medicinal plants (Articulin F, Avocado, Capsaicini, ginger). , Reumaiex, Devil's Ghea) [l71.

Brevetul US.Nr. 8580315 descrie o metodă și un produs pentru tratamentul și prevenirea inflamației și a tulburărilor asociate inflamației. Produsul conține glucozamină în combinație cu o proteină din ou. Acesta s-a obținut prin hiperimunizarea găinilor cu un imunogen care conține și/sau un antiinflamator. Invenția se referă ia o metodă de reducere a inflamației ia pacienți la care se administrează produsul. Acesta reduce durerea și inflamația articulară legată de osteoartrită, artita reumatoidă sau alte tulburări articulare.U.S. Pat. 8580315 describes a method and product for the treatment and prevention of inflammation and disorders associated with inflammation. The product contains glucosamine in combination with an egg protein. This was obtained by hyperimmunizing the hens with an immunogen containing and / or an anti-inflammatory. The invention relates to a method of reducing inflammation in patients receiving the product. It reduces joint pain and inflammation related to osteoarthritis, rheumatoid arthritis or other joint disorders.

NaKKarike și colab. [Brevet 258838] au obținut membrane din coji umede prin menținerea acestora în soluție EDTA-Na 5%, apoi Ia temperatura camerei (26±2°C) timp de 24h; s-a adăugat hexan și s-a omogenizat timp de 3 minute. Amestecul a fost lăsat în repaus timp de 5 minute pentru a separa stratul organic de cel apos. Stratul de hexan conținând membrane sub formă de emulsie a fost decantat și filtrat pentru a separa membranele ca reziduu. Reziduul a fost spălat cu apă deionizată timp de 5 minute, apoi cu acetonă, filtrat, deshidratat la 50°C timp de 30 minute, pentru a obține membrane uscate. Noutatea acestei invenții constă în separarea membranei de coaja oului, prin tratamente blânde cu EDTA și hexan. Acestea nu afectează calitatea proteinelor din membrane iar contaminarea cu particule din coajă este minimă.NaKKarike et al. [Patent 258838] obtained wet shell membranes by maintaining them in 5% EDTA-Na solution, then at room temperature (26 ± 2 ° C) for 24 hours; hexane was added and stirred for 3 minutes. The mixture was allowed to stand for 5 minutes to separate the organic layer from the aqueous layer. The hexane layer containing membranes in the form of emulsion was decanted and filtered to separate the membranes as a residue. The residue was washed with deionized water for 5 minutes, then with acetone, filtered, dehydrated at 50 ° C for 30 minutes to obtain dry membranes. The novelty of this invention consists in separating the membrane from the egg shell, by gentle treatments with EDTA and hexane. They do not affect the quality of membrane proteins and the contamination with shell particles is minimal.

Metoda elaborată de Snyder [Brevet 20140346261] constă în ajustarea umidității cojilor cu membrane înainte de procesul de separare. Ajustarea include uscarea cojilor la un conținut a 2017 00042The method developed by Snyder [Patent 20140346261] consists in adjusting the humidity of the membrane shells prior to the separation process. The adjustment includes drying the shells to a content of 2017 00042

26/01/2017 de umiditate mai mic de 24% din greutatea lor. Uscarea cojilor se produce la temperatura de26/01/2017 of humidity less than 24% of their weight. The drying of the shells occurs at a temperature of

48-77°C, timp de 60-90 min.48-77 ° C, for 60-90 min.

Pătrașcu și colab. a demonstarat capacitatea de modulare a ovotransferinei PC2 pentru a răspunde imun față de antigenele cu care au fost imunizate găinile [Brevet A/00008]. Invenția caracterizează răspunsul imun specific al ovotransferinei PC2 în funcție de structura antigenului monospecifîc sau polispecific folosit. Aceiași autori au caracterizat oui hiperimun Ovopach, care are capacitatea de a reacționa specific cu epitopii bacteriilor și fungilor cu care au fost imunizate găinile [Brevet A00810].Pătrașcu et al. demonstrated the modulation ability of PC2 ovotransferin to respond immune to the antigens with which the chickens were immunized [Patent A / 00008]. The invention characterizes the specific immune response of PC2 ovotransferin depending on the structure of the monospecific or polypecific antigen used. The same authors characterized Ovopach hyperimmune eggs, which have the ability to react specifically with the epitopes of the bacteria and fungi with which the chickens were immunized [Patent A00810].

BibliografieBibliography

1. Arias JL, Fernândez MS, Dennis JE, Caplan AI (1991), Collagens of the chicken eggshell membranes, Connect Tissue Research 26(1-2):37-45.1. Arias JL, Fernândez MS, Dennis JE, Caplan AI (1991), Collagens of the chicken eggshell membranes, Connect Tissue Research 26 (1-2): 37-45.

2. Arias JL, Fernândez MS, Dennis JE, Caplan AI (1991), The fabrication and coilagenous substructure of the eggshell membrane în the isthmus of the hen oviduct, 11(5):313-2.2. Arias JL, Fernândez MS, Dennis JE, Caplan AI (1991), The fabrication and coilagenous substructure of the eggshell membrane in the isthmus of the hen oviduct, 11 (5): 313-2.

3. Arias JL, Nakamnra O, Fernândez MS, Wu JJ, Knigge P, Eyre DR&Caplan AI (1997), Role of Type X Coilagen an Experimental Mineralization of Eggshell Membranes, Connective Tissue Research Overseas Publishers Association 36(1):21-32.3. Arias JL, Nakamnra O, Fernândez MS, Wu JJ, Knigge P, Eyre DR & Caplan AI (1997), Role of Type X Coilagen in Experimental Mineralization of Eggshell Membranes, Connective Tissue Research Overseas Publishers Association 36 (1): 21-32 .

4. Baker JR, Balch DA (1962), A Study of the Organic Material of Hen’s-Egg Shell Biochem. J, 82: 352-61,4. Baker JR, Balch DA (1962), A Study of the Organic Material of Hen's-Egg Shell Biochem. J, 82: 352-61,

5. Britton WM, Hale JJ Jr. (1997), Amino Acid Analysis of Shell Membranes of Eggs from Young and Old Hens Varying în Shell Quality, Poultry Science, 56:865-871.5. Britton WM, Hale JJ Jr. (1997), Amino Acid Analysis of Shell Membranes of Eggs from Young and Old Hens Varying in Shell Quality, Poultry Science, 56: 865-871.

6. Carrino DA, Dennis JE, Wu TM, Arias JL, Fernândez MS, Rodrignez JP, Fink DJ, Hener AH, Caplan AI (1996), The Avian Eggshell Extracellular Matrix aș a Model Biomineralization, Connective Tissue Research, 35(1-4):325-29.6. Carrino DA, Dennis JE, Wu TM, Arias JL, Fernândez MS, Rodrignez JP, Fink DJ, Hener AH, Caplan AI (1996), The Avian Eggshell Extracellular Matrix as a Model Biomineralization, Connective Tissue Research, 35 (1- 4): 325-29.

7. Ganiron J, Hinke MT, Panhelenx M, Gareia-Rniz JM, Boldieke T, Nys Y (2001), Ovotransferrin îs a matrix protein of the eggshell membranes and basal calcified layer, Connective Tissue Research, 42:255-67.7. Ganiron J, Hinke MT, Panhelenx M, Gareia-Rniz JM, Boldieke T, Nys Y (2001), Ovotransferrin îs a matrix protein of the eggshell membranes and basal calcified layer, Connective Tissue Research, 42: 255-67.

8. Gantron J, Baiu M, Solomon S, Nys Y (1996), Soluble matrix of hen’s eggshell extracts changes în vitro the rate of calcium carbonate precipitation and crystal morphology, British Poultry Science, 37:853-66.8. Gantron J, Baiu M, Solomon S, Nys Y (1996), Soluble matrix of hen's eggshell extracts changes in vitro the rate of calcium carbonate precipitation and crystal morphology, British Poultry Science, 37: 853-66.

9. Harris ED, Blount JE, Leaeh RM Jr. (1980), Localization of lysyl oxidase în hen oviduct: implication în egg shell membrane formation and composition, Science 208(4439):55-6.9. Harris ED, Blount JE, Leaeh RM Jr. (1980), Localization of lysyl oxidase in hen oviduct: involvement in egg shell membrane formation and composition, Science 208 (4439): 55-6.

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

INVENȚIA PE SCURTBRIEF INVENTION

Formularea pe scurt a soluțiilor tehniceBriefly formulate technical solutions

Prezenta invenție se referă la producerea unei pulberi din membrana cochilieră, obținută printr-un proces de producție natural tară utilizare de substanțe chimice, fiind extrasă din ouă hiperimune HPC2. Membrana conține ingrediente importante (colagen, acid hialuronic, condroitină, glucozamină, aminoacizi, ovotransferină, lizozim etc.), care contribuie la funcționarea normală a'sistemului osos. Pentru prepararea pulberii s-a realizat un program de cercetare care a urmărit prepararea antigenului multiplu (obținut din tulpini bacteriene și fungice) imunizarea găinilor convenționale sau SPF, controlul răspunsului imun al găinilor ouătoare prin testele ELISA și IDGA, separarea membranelor cochiliere, obținerea pulberii din membrane și utilizarea acesteia în realizarea produsului ROdia-HPC2 comprimate. Evaluarea principalelor componente active prezente în membrane se face prin identificarea colagenului și a fracțiunilor cu activitate antibacteriană (OTf, lizozim, OVA, ovomucina) față de antiseruri specific prin testul IDGA.The present invention relates to the production of a powder from the shell membrane, obtained through a natural production process using chemical substances, being extracted from hyperimmune HPC2 eggs. The membrane contains important ingredients (collagen, hyaluronic acid, chondroitin, glucosamine, amino acids, ovotransferin, lysozyme, etc.), which contribute to the normal functioning of the bone system. For the preparation of the powder a research program was carried out which aimed at preparing the multiple antigen (obtained from bacterial and fungal strains) immunization of conventional hens or SPF, controlling the immune response of laying hens by ELISA and IDGA tests, separating the shell membranes, obtaining the dust from the membranes and its use in the manufacture of ROdia-HPC2 tablets. The evaluation of the main active components present in the membranes is done by identifying the collagen and the fractions with antibacterial activity (OTf, lysozyme, OVA, ovomucin) against specific antisera by IDGA test.

Produsul ROdia-HPC2 comprimate x 500 mg conține ingredientele active din membrana cochilieră, care împreună cu acidul ascorbic asigură buna funcționare a sistemului osteo-articular.The product ROdia-HPC2 x 500 mg tablets contains the active ingredients in the shell membrane, which together with ascorbic acid ensure the smooth functioning of the osteo-articular system.

DESCRIEREA SUMARĂ A PROCEDURILORSUMMARY OF PROCEDURES

Obiectele acestui brevet se vor evidenția în baza descrierii de mai jos:The objects of this patent will be highlighted based on the description below:

Acest brevet se referă la obținerea pulberii din membrane cochiliere a ouăleior hiperimune și utilizarea acesteia la obținerea unui produs biologic ROdia-HPC2 comprimate. Produsul conține componente active din membrana cochilieră (colagen, acid hialuronic, glucozamină, condroitină, ovotransferină, lizozim, ovomucina și ovoalbumină) obținută în mod natural, la care se adaugă acid ascorbic (vitamina C).This patent relates to obtaining the powder from the shell membranes of hyperimmune eggs and its use to obtain a biological product ROdia-HPC2 tablets. The product contains active components of the shell membrane (collagen, hyaluronic acid, glucosamine, chondroitin, ovotransferin, lysozyme, ovomucin and ovoalbumin), which are naturally added, to which is added ascorbic acid (vitamin C).

Pentai obținerea membranei cochiliere, utilizată ia prepararea produsului ROdia-HPC2, se imunizează găini ouătoare, din rasa Rhode-Island Red, aflate la începutul perioadei de ouat în vârstă de 23 de săptămâni. Antigenul cu care se face imunizarea reprezintă un amestec de tulpini bacteriene și fungice, inactivate cu formol, în amestec cu adjuvant QS-21. Antigenul se inoculează intramuscular. Cantitatea de proteine în amestec cu adjuvantul este de 200 mg/ml. Imunizarea fiecărei găini se face cu 2 mi inocul în 4 puncte diferite în musculatura pectorală.While obtaining the shell membrane, used in the preparation of the ROdia-HPC2 product, the laying hens, of the Rhode-Island Red breed, are at the beginning of the 23-week-old egg period. The immunization antigen represents a mixture of bacterial and fungal strains, inactivated with formol, in combination with QS-21 adjuvant. The antigen is inoculated intramuscularly. The amount of protein mixed with the adjuvant is 200 mg / ml. Immunization of each hen is done with 2 mi inoculum at 4 different points in the pectoral musculature.

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Inoculările de rapel se fac la 14 zile, respectiv 28 de zile de la prima inoculare. în toată această perioadă găinile sunt hrănite cu furaje combinate în care se adaugă 0.5 g imunomodulator uscat la 1000 g furaj, amestecat uniform. Evaluarea răspunsului imun se face direct prin controlul ouălor recolatate de la găinile imunizate, prin testele ELISA și de imunodifuzie în gel de agar. La un interval de 14 zile de la ultima inoculare se începe colectarea de ouă hiperimune. De la acestea se înlătură conținutul oului, se rețin cojile care se spală din abundență cu apă deionizată. Se separă membranele cochillere de coji prin menținerea într-un volum mare de apă deionizată, care conține acid acetic 4%, se deshidratează în etuvă la 50°C, timp de 3 ore și se mărunțesc cu ajutorul unei mori de măcinare; se depozitează în sticle etanș și se condiționează sub formă de comprimate ROdia-HPC2. Carecterizarea pulberii obținute se face prin următoarele teste:The booster inoculations are made at 14 days, respectively 28 days after the first inoculation. During this period the chickens are fed with compound feed in which 0.5 g of dry immunomodulator is added to 1000 g of feed, evenly mixed. Evaluation of the immune response is done directly by controlling the eggs collected from the immunized hens, by the ELISA and agar gel immunodiffusion tests. At 14 days after the last inoculation, the collection of hyperimmune eggs begins. The contents of the egg are removed from them, the shells washed with plenty of deionized water are retained. Separate the shell membranes from the shells by maintaining in a large volume of deionized water, which contains 4% acetic acid, dehydrate in the oven at 50 ° C for 3 hours and grind with a grinding mill; it is stored in watertight bottles and packaged as ROdia-HPC2 tablets. The characterization of the obtained powder is done by the following tests:

a) metoda colorimetrică pentru identificarea colagenului;a) the colorimetric method for identifying collagen;

b) identificarea componentelor active din pulberea de membrană cochilieră prin testul IDGA față de antiseruri specifice;b) identification of the active components of the shell membrane powder by the IDGA test against specific antisera;

c) determinarea cantitativă a OTf HPC2 prin testul ELISA direct;c) quantitative determination of HPf2 OTf by direct ELISA test;

d) contaminarea microbiană se efectuează conform standardelor prevăzute de Farmacopeea Europeană ediția 7 (capitolele 2.6.12.2,6.13.5.1,4 preparate orale neapoase).d) microbial contamination is performed according to the standards provided by the European Pharmacopoeia edition 7 (chapters 2.6.12.2,6.13.5.1,4 non-aqueous oral preparations).

Produsul ROdia-HPC2 conținând puibere din membrană cochilieră și vitamina C se procesează sub formă de comprimate x 500 mg și se ambalează în flacoane de polietilenă x 50 ml.ROdia-HPC2 product containing cochlear membrane vitamins and vitamin C is processed as tablets x 500 mg and packed in polyethylene bottles x 50 ml.

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENȚIEIDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Pulberea din membrana cochilieră a ouălor hiperimune HPC2 se obține printr-un proces de producție natural, fără utilizare de substanțe chimice. în acord cu prezența invenție, prepararea pulberii din membrană cochilieră cuprinde o serie de etape: prepararea antigenului (1), imunizarea găinilor ouătoare convenționale sau SPF (2), controlul răspunsului imun al găinilor imunizate (3), extragerea și prepararea membranei eoehiliere din ouă hiperimune (4), evaluarea componentelor prezente în pulberea obținută din membrană cochilieră (5), procesarea pulberii sub formă de comprimate ROdia-HPC2 (6).The powder in the shell membrane of HPC2 hyperimmune eggs is obtained through a natural production process, without the use of chemicals. In accordance with the present invention, the preparation of the powder from the shell membrane comprises a series of steps: preparation of the antigen (1), immunization of conventional laying hens or SPF (2), control of the immune response of the immunized hens (3), extraction and preparation of the cochlear egg membrane. hyperimmune (4), evaluation of the components present in the powder obtained from the shell membrane (5), processing of the powder as ROdia-HPC2 tablets (6).

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

1. Prepararea antigenului1. Antigen preparation

In acord cu prezenta invenție, antigeneie s-au preparat din tulpini bacteriene din colecția ROMVAC COMPANY S.A. (Salmonella enteritidis Ro-TL 248, Salmonella typhimurium RO05 TL 312014) sau obținute în Spitale din România (Streptococcus pneumoniae, Clostridium difficiie, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli și Candida albicans). Tulpinile de referință au fost Streptococcus mutans ATCC 55677 și Helicobacter pylori ATCC 49503. Tulpinile bacteriene s-au cultivat pe bulion nutritiv, iar Candida albicans pe mediu Sabourand lichid. Clostridium difficiie (anatoxina) s-a obținut pe mediu Thioglycollate. Culturile s-au incubat la 37°C timp de 24-48 h, s-au spălat de două ori cu PBS steril, pH = 7.2 și s-au inactivat cu formaldehidă 0.5% timp de 18 h; suspensiile s-au ajustat la valoarea 0.05 la DO 600, corespunzând unei densități celulare de aproximativ Ix IO⁵ UFC/ml.In accordance with the present invention, antigens were prepared from bacterial strains from the collection of ROMVAC COMPANY SA (Salmonella enteritidis Ro-TL 248, Salmonella typhimurium RO05 TL 312014) or obtained in Hospitals of Romania (Streptococcus pneumoniae, Clostridium difficiie, Staphylococcusure a Staphylococcusure a aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli and Candida albicans). The reference strains were Streptococcus mutans ATCC 55677 and Helicobacter pylori ATCC 49503. The bacterial strains were grown on a nutrient broth and Candida albicans on liquid Sabourand medium. Clostridium difficiie (anatoxin) was obtained on Thioglycollate medium. Cultures were incubated at 37 ° C for 24-48 h, washed twice with sterile PBS, pH = 7.2, and inactivated with 0.5% formaldehyde for 18 h; the suspensions were adjusted to 0.05 at DO 600, corresponding to a cell density of approximately Ix IO ⁵ CFU / ml.

2. Imunizarea găinilor ouătoare convenționale sau SPF2. Immunization of conventional laying hens or SPF

S-au format loturi de găini ouătoare convenționale sau SPF din rasa Rhode Isiand Red, aflate la începutul perioadei de ouat, în vârstă de 23 săptămâni. S-a preparat un amestec de antigene bacteriene și fungice, conform pct.l (antigen multiplu), care a fost emulsifiat în adjuvant QS 21. Găinile s-au inoculat de 3 ori cu antigenul multiplu în patru locuri diferite în musculatura pieptului (0.25 ml în fiecare punct), inoculările de rapel s-au făcut la 14 zile, respectiv la 28 zile de la inocularea inițială. Colectarea ouălor se face la un interval de 14 zile de la ultima inoculare, iar în titrul anticorpilor s-a evaluat periodic prin testele ELISA și IDGA.Bundles of conventional laying hens or SPF from the Rhode Isiand Red breed were formed, at the beginning of the egg-laying period, aged 23 weeks. A mixture of bacterial and fungal antigens was prepared, according to pt.1 (multiple antigen), which was emulsified in adjuvant QS 21. The hens were inoculated 3 times with the multiple antigen in four different places in the breast musculature (0.25 ml in each point), the booster inoculations were made at 14 days, respectively 28 days after the initial inoculation. The eggs are collected 14 days after the last inoculation, and the antibody titration was evaluated periodically by ELISA and IDGA tests.

Utilizarea adjuvantului QS 21 în amestec cu antigenul multiplu, crește răspunsul imun, nu produce reacții locale și s-a dovedit foarte eficient în producerea și menținerea unui titru mare de anticorpi, pentru o lungă perioadă de timp. Pe toată perioada experimentului s-au administrat furaje combinate în care s-a adaugat 0,5 g imunomodulator uscat la 1000 g furaj.The use of QS 21 adjuvant in combination with multiple antigen, increases the immune response, does not produce local reactions and has been shown to be very effective in producing and maintaining a high antibody titer for a long time. Combined feed was administered throughout the experiment, with 0.5 g of dry immunomodulator added to 1000 g of feed.

3. Controlul răspunsului imun al găinilor ouătoare imunizate eu antigen multiplu3. Control of the immune response of laying hens immunized multiple antigen

Controlul răspunsului imun s-a tăcut prin colectare de ouă la un interval de 14 zile de la ultima inoculare. Acestea s-au testat prin ELISA și IDGA. Gălbenușul recoltat individual s-a precipitat cu polietilenglicol 6000 pentru extragerea imunoglobulinei (IgY). S-au identificat găinile al căror răspuns imun s-a situat la un nivel de peste 1.500 DO în testul ELISA. AcesteControl of the immune response was silenced by collecting eggs at 14 days after the last inoculation. These were tested by ELISA and IDGA. The individually harvested yolk was precipitated with 6000 polyethylene glycol for immunoglobulin (IgY) extraction. Chickens whose immune response was at a level of over 1,500 DO in the ELISA test were identified. These

26/01/2017 ouă se pot folosi pentru obținerea IgY și a fracțiunilor din albuș. Din aceste ouă hiperimune se extrage membrana cochilieră care se prelucrează în vederea obținerii pulberii.26/01/2017 eggs can be used to obtain IgY and fractions from egg white. From these hyperimmune eggs, the shell membrane is extracted and processed in order to obtain the powder.

4, Prepararea membranei cochiliere în acest brevet s-a aplicat o procedură simplă care să permită obținerea unei pulberi din membrana cochilieră 100% naturală, provenită din ouă de la găini imunizate cu un antigen multiplu (tulpini bacteriene și fungice). Obținerea membranelor cochiliere cuprinde următoarele etape:4, The preparation of the shell membrane in this patent has been applied a simple procedure to obtain a powder from the 100% natural shell membrane, derived from eggs from chickens immunized with a multiple antigen (bacterial and fungal strains). Obtaining the shell membranes comprises the following steps:

Etapa de separare: în prezenta invenție, cojile de ou se separă de conținutul oului. Acestea se spală de trei ori cu apă deionizată din abundență. Metoda de separare a membranelor este manuală. Se desprind ușor prin menținerea cojilor într-un volum mare de acid acetic diluat 4%, timp de 12 ore la 4°C,Separation step: In the present invention, the egg shells are separated by the egg content. They are washed three times with abundant deionized water. The membrane separation method is manual. They are easily detached by maintaining the shells in a large volume of 4% diluted acetic acid, for 12 hours at 4 ° C,

Etapa de deshidratare: membranele cochiliere se usucă în etuvă timp de 4 ore la temperatura de 50°C. Din 2000 ouă hiperimune s-au obținut 900 g membrane umede, respectiv 250 g membrane uscate.Dehydration step: the shell membranes are dried in the oven for 4 hours at 50 ° C. From 2000 hyperimmune eggs were obtained 900 g of moist membranes, respectively 250 g of dry membranes.

Etapa de mărunțire: membranele deshidratate se mărunțesc cu ajutorul unei mori de măcinare până la obținerea unei pulberi fine (schema î).Crushing stage: Dehydrated membranes are ground using a grinding mill until a fine powder is obtained (Scheme I).

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

SCHEMA 1: OBȚINEREA PULBERII DIN MEMBRANE COCHILIERESCHEME 1: OBTAINING POWDER FROM COCHILIER MEMBRANES

Prepararea antigenuluiAntigen preparation

Amestecare antigen eu adjuvant QS-21Adjuvant antigen mixing QS-21

Imunizarea găinilor te te .teteThe immunization of chickens will make you sick

Controlul răspunsului imun la găină și ou te Control of the immune response to chicken and egg

Colectare ouăEgg collection

W teYou were

Separarea cojilor de conținutul ouluiSeparation of shells from egg content

Recoltarea membranelor de pe coajă te βThe harvesting of the membranes from the shell is β

♦♦

Deshidratarea membranelorDehydration of membranes

W te teteYou breastfed

Mărunițirea membranelorMembrane grinding

Siii;SIII;

te tetea

Depozitarea pulberii la 2-8°CPowder storage at 2-8 ° C

IIII

Control final, emitere certificate de calitate i -?Final control, issuance of quality certificates and -?

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Evaluarea principalelor componente prezente în pulberea de membrană cochilieră se face prin următoarele teste:The evaluation of the main components present in the shell membrane powder is performed by the following tests:

a) Identificarea colagenului prin metoda colorimetricăa) Identification of collagen by colorimetric method

b) Determinarea calitativă a componentelor active din membrană (ovotranferina, ovoalbumina, lizozim și ovomucina) față de antiseruriie specific prin testul IDGAb) Qualitative determination of the active components in the membrane (ovotranferin, ovoalbumin, lysozyme and ovomucin) against specific antiserum by IDGA test

c) Determinarea cantitativă a OTf HPC2 prin testul Elisa directc) Quantitative determination of HPf2 OTf by direct Elisa test

d) Controlul contaminării microbiened) Control of microbial contamination

5. Utilizarea pulberii în realizarea produsului ROdia-HJO comprimate5. Use of powder in making ROdia-HJO tablets

Produsul ROdia-HPC2 comprimate este un supliment alimentar ce conține pulbere din membrana cochilieră provenită din ouă hiperimune la care se adaugă acid ascorbic. Vitamina C intervine în producția de colagen care grăbește cicatrizarea plăgilor, favorizează depunerea calciului în oase și vindecarea fracturilor, crește rezistența capilarelor, mărește rezistența la infecții. Vitamina C este un puternic antioxidant, înlătură radicalii liberi și previne astfel, oxidarea membranelor celulare. Este esențială pentru sinteza colagenului, a matricei oaselor și dinților și în creșterea rezistenței peretelui vaselor capilare. în plus, vitamina C este implicată în biosinteza hormonilor de tip catecolamine și steroizi, în conversia acidului folie în acid folinic și în metabolismul tirosinei. Membrana conține colagen, acid hialuronic, condroitină, glucozamină, ovotranferina, ovomucina, lizozim, ovoalbumina etc. Acestea sunt ingredientele active care contribuie ia funcționarea normală a sistemului osteo-articular.The product ROdia-HPC2 tablets is a dietary supplement containing powder from the shell membrane derived from hyperimmune eggs to which ascorbic acid is added. Vitamin C is involved in the production of collagen that speeds up wound healing, promotes calcium deposits in bones and heals fractures, increases capillary resistance, increases resistance to infections. Vitamin C is a powerful antioxidant, removes free radicals and thus prevents oxidation of cell membranes. It is essential for the synthesis of collagen, of the matrix of bones and teeth and in increasing the strength of the capillary vessel wall. In addition, vitamin C is involved in the biosynthesis of catecholamine and steroid hormones, in the conversion of folic acid into folinic acid and in tyrosine metabolism. The membrane contains collagen, hyaluronic acid, chondroitin, glucosamine, ovotranferin, ovomucin, lysozyme, ovoalbumin, etc. These are the active ingredients that contribute to the normal functioning of the osteo-articular system.

Produsul este recomandat ca supliment alimentar, în medicina clasică, la pacienții cu afecțiuni osteo-articular și ale țesutului conjunctiv. Se condiționează în flacoane de propilenă care conțin 30 comprimate x 500 mg sau 60 comprimate x 500 mg.The product is recommended as a dietary supplement, in classical medicine, in patients with osteo-articular and connective tissue disorders. It is packaged in propylene vials containing 30 x 500 mg tablets or 60 x 500 mg tablets.

1.3 a 2017 000421.3 to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

MODELE RECOMANDATE DE FOLOSIRE ȘI DE CARACTERIZARE A INVENȚIEIRECOMMENDED MODELS FOR USE AND CHARACTERIZATION OF THE INVENTION

Exemplele de mai jos au drept scop ilustrarea și nu au intenția de a limita scopul prezenței invenții.The examples below are for illustration purposes and are not intended to limit the scope of the invention.

Exemplul 1Example 1

Prepararea antigenphn în prezenta invenție, antigenul s-a preparat dintr-un amestec de tulpini bacteriene și fungice. Celulele bacteriene și ciupercile s-au cultivat pe medii selective, s-au incubat la 37°C timp de 24-48 ore, s-au spălat de două ori cu PBS steril, pH=7.2 și s-au inactivat cu formaidehidă 0.5% timp de 18 h; suspensiile obținute s-au ajustat 1a valoarea 0.05 la DO 600, corespunzând unei densități celulare de aproximativ 1 x lO’UFC/ml. Sedimentul s-a folosit ca imunogen (antigen multiplu) în amestec cu adjuvantul QS 21, pentru inocularea găinilor.Antigen preparation In the present invention, the antigen was prepared from a mixture of bacterial and fungal strains. Bacterial cells and fungi were cultured on selective media, incubated at 37 ° C for 24-48 hours, washed twice with sterile PBS, pH = 7.2, and inactivated with 0.5% formideide for 18 hours; the obtained suspensions were adjusted to the value of 0.05 at OD 600, corresponding to a cell density of approximately 1 x 1'UFC / ml. The sediment was used as an immunogen (multiple antigen) in combination with QS 21 adjuvant, for inoculation of chickens.

Imunizarea găinilor onătoare convenționale sau SPFImmunization of conventional hens or SPF hens

Găinile aflate la începutul perioadei de ouat din rasa Rhode Island Red, s-au imunizat prin administrare pe cale intramu seu Iară a 2 ml antigen, în patru locuri, în musculatura pectorală. Se fac trei inoculări la interval de 14 zile, respectiv 28 zile. La 14 zile de la ultima inoculare, se colectează ouă pentru extragerea îmunoglobulinelor (IgY) din gălbenuș, a fracțiunilor proteice din albuș și a membranelor cochiliere.Chickens at the beginning of the Rhode Island Red egg period were immunized by intravenous administration of 2 ml of antigen, in four places, in the pectoral musculature. Three inoculations are made at 14 days and 28 days respectively. At 14 days after the last inoculation, eggs are collected for the extraction of the immunoglobulins (IgY) from the yolk, the protein fractions from the egg white and the shell membranes.

Exemplul 2Example 2

Prepararea membranelor cochilierePreparation of shell membranes

Cojile de ou se separă de conținutul oului, apoi se spală de trei ori cu apă deionizată din abundență. Membranele se separă manual, se desprind ușor prin menținerea cojilor într-un volum mare de apă deionizată în care s-a adăugat acid acetic diluat 4%, timp de 12 ore la 4°C; se usucă în etuvă timp de 4 ore la temperatura de 50°C, se mărunțesc cu ajutorul unei mori de măcinare până la obținerea unei pulberi fine.The eggshells are separated from the egg content, then washed three times with abundant deionized water. The membranes are separated by hand, they are easily detached by maintaining the shells in a large volume of deionized water in which 4% dilute acetic acid was added, for 12 hours at 4 ° C; dry in the oven for 4 hours at 50 ° C, grind with a grinding mill until a fine powder is obtained.

Exemplul 3Example 3

Condiționarea pulberii de membrana cochilierăConditioning of the shell membrane powder

Produsul ROdia-HPC2 conține pulbere din membrana cochilieră provenită din ouă hiperimune la care se adaugă acid ascorbic, pulberea se condiționează în flacoane din polietilena x 50 ml. Cantitatea per flacon este 30 comprimate x 500 mg pulbere sau 60 comprimate x 500 mg pulbere. Comprimatele sunt neacoperite, rotunde, de culoare albă, cu miros slab caracteristic.ROdia-HPC2 product contains powder from the cochlear membrane derived from hyperimmune eggs to which ascorbic acid is added, the powder is conditioned in polyethylene x 50 ml vials. The amount per bottle is 30 tablets x 500 mg powder or 60 tablets x 500 mg powder. The tablets are uncoated, round, white in color, with a slight characteristic odor.

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Acestea conțin pe lângă ingrediente active (pulbere din membrane eochilieră, acid ascorbic) și excipienți de tabletare.They contain in addition to active ingredients (eyelid membrane powder, ascorbic acid) and tablet excipients.

Identificarea colagenului din membrana eochilieră prin metoda colorimetricăIdentification of the collagen in the eyelid membrane by the colorimetric method

Principiu: proba de analizat evidențiază o reacție de culoare violetă în prezența soluțiilor de sulfat de cupru și hidroxid de sodium. Absorbanta probei se citește la un spectrofotometru în domeniul vizibil (400-800 nm). Intensitatea colorației violet a probei este direct proporțională cu cantitatea de colagen.Principle: The sample to be analyzed shows a purple reaction in the presence of copper sulphate and sodium hydroxide solutions. The absorbance of the sample is read at a spectrophotometer in the visible range (400-800 nm). The intensity of the violet coloration of the sample is directly proportional to the amount of collagen.

sulfat de cupru (II) 50 g/l (R)copper sulphate (II) 50 g / l (R)

- hidroxid de sodiu 100 g/l (R)- 100 g / l sodium hydroxide (R)

Mod de lucruProcedure

Proba de testat: la 0,25 g membrană eochilieră se adaugă 20 mi apă MiliQ; amestecul se încălzește la 60°C, timp de 30 minute; soluția se filtrează prin filtru Millex de 0.45pm; 2 ml filtrat se amestecă cu 0,05 ml soluție sulfat de cupru (II). Se adaugă 0,5 ml soluție hidroxid de sodiu; după agitare, trebuie să apară o colorație violet.Test sample: 20 ml MiliQ water is added to 0.25 g of the eyelid membrane; the mixture is heated to 60 ° C for 30 minutes; the solution is filtered through a 0.45pm Millex filter; 2 ml of the filtrate is mixed with 0.05 ml of copper (II) sulphate solution. Add 0,5 ml of sodium hydroxide solution; after stirring, a purple color must appear.

Proba martor: la 2 ml apă MiliQ se adaugă 0.05 ml soluție sulfat de cupru și 0 5 ml soluție hidroxid de sodiu (Fig.l).Control sample: To 2 ml of MiliQ water add 0.05 ml of copper sulphate solution and 0 5 ml of sodium hydroxide solution (Fig. 1).

ί 2ί 2

Fig.l: Figs: 1. Proba Martor: 2 ml apă MiliQ + 1. Control sample: 2 ml of MiliQ + water 0.05 ml sol. CuSCri + 0.5 ml sol. 0.05 ml sol. CuSCri + 0.5 ml sol. _ss 4^ 4 ^ NaOH (tub 1) NaOH (tube 1) 2. Proba de testat: 2 ml amestec 2. Test sample: 2 ml mixture (0.25 mg membrană + 20 ml apă (0.25 mg membrane + 20 ml water MiliQ) + 0.05 ml sol, CuSO₄ +MiliQ) + 0.05 ml sol, CuSO ₄ + tiu* know * 0.5 ml sol. NaOH (tub 2) 0.5 ml sol. NaOH (tube 2)

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Interpretare:Interpretation:

In proba de testat apare culoarea violet, ceea ce indică prezența colagenului comparativ cu proba martor, care este de culoare bleu pal. Absorbanta probei de testat se măsoară la spectrofotometru în domeniul vizibilIn the test sample appears the color purple, which indicates the presence of collagen compared to the control sample, which is pale blue. The absorbance of the test sample is measured at the spectrophotometer in the visible range

Rezultate:Results:

Pentru a vedea dacă intensitatea colorației probei este direct proporțională cu cantitatea de membrană din probă, respectiv concentrația de colagen regăsibilă, s-au luat în testare mai multe probe obținute astfel:To see if the color intensity of the sample is directly proportional to the amount of membrane in the sample, respectively the concentration of collagen reachable, several samples were obtained tested as follows:

1. 0.25 mg pulbere membrană + 6 mL apă Mi 1 iQ1. 0.25 mg membrane powder + 6 mL water Mi 1 iQ

2. 0.50 mg pulbere membrană + 6 mL apă MiiiQ2. 0.50 mg membrane powder + 6 mL MiiiQ water

3. 0.75 mg pulbere membrană + 6 mL apă MiiiQ3. 0.75 mg membrane powder + 6 mL MiiiQ water

4. 1.00 mg pulbere membrană + 6 mL apă MiiiQ4. 1.00 mg membrane powder + 6 mL MiiiQ water

Probele au fost centrifugate timp de 20 minute la 6000 rpm și filtrate prin filtre Millex de 0.45um. S-a măsurat spectrul de absorbție în domeniul vizibil pentru fiecare probă în parte, față de o probă martor care conține toată matricea probei, cu excepția pulberii de membrana cochilieră. (Fig.2)The samples were centrifuged for 20 minutes at 6000 rpm and filtered through 0.45um Millex filters. The absorption spectrum in the visible range was measured for each sample separately from a control sample containing the entire sample matrix, except for the shell membrane powder. (Fig.2)

iungime de unda [nm) a 2017 00042wavelength [nm] to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Fig. 2 Spectrul de absorbție pentru probe de membrană cochilieră (0.25,0.50,0.75,1.00 rag/6mL)Fig. 2 Absorption spectrum for cochlear membrane samples (0.25.0.50.0.75.1.00 rag / 6mL)

Absorbanta probelor diferă în funcție de cantitatea de pulbere de membrane din probele de testat. Spectrul de absorbție în vizibil este diferit pentru complexul colagen - sulfat de cupru, comparativ cu soluția de sulfat de cupru - martor. Maximul de absorbție aî complexului colagen - sulfat de cupru este la lungimea de undă de 550 nm (Fig. 3 și fig. 4).The absorbance of the samples differs depending on the amount of membrane powder in the test samples. The absorption spectrum in the visible is different for the complex collagen - copper sulphate, compared to the solution of copper sulphate - control. The maximum absorption of the complex collagen - copper sulphate is at the wavelength of 550 nm (Fig. 3 and Fig. 4).

Fig. 3 Măsurarea intensității absorbantei la 550 nm pentru probele din membrană (godenrile A și B proba martor; godenrile C, D, E, F, G probele din membrana cochilieră)Fig. 3 Measurement of absorbance intensity at 550 nm for membrane samples (godenes A and B control sample; godenes C, D, E, F, G shell membrane samples)

S-a măsurat intensitatea absorbantei la 550 nm pentru toate probele de testat și s-a reprezentat grafic variația acesteia în funcție de cantitatea de pulbere de membrană cântărită per probă.The absorbance intensity was measured at 550 nm for all test samples and its variation was plotted according to the amount of membrane powder weighed per sample.

b·· sb ·· s

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Fig. 4 Reprezentarea grafică a dependenței liniare dintre intensitatea absorbantei măsurată la 550 nm și cantitatea de pulbere din probeFig. 4 Graphical representation of the linear dependence between the absorbance intensity measured at 550 nm and the amount of sample powder

Dependența dintre cele două mărimi măsurate este liniară.The dependence between the two measured sizes is linear.

Exemplul 5Example 5

Testul de imunodifuzie în gel de agar (IDGA)Agar gel immunodiffusion test (IDGA)

Principiu: testul se bazează pe migrarea într-un gel de agar a antigenului și a anticorpului, care la locul de contact se combină specific și formează o linie de precipitatre. Aceasta se vizualizează prin proiectarea unui fascicul de lumină puternic pe fundul plăcii de reacție. Testul se utilizează în mod obișnuit pentru detectarea anticorpilor serici la animalele infectate, precum în caracterizarea anticorpilor de tip IgY și a fracțiunilor proteice conținute de ou.Principle: The test is based on the migration in an agar gel of the antigen and the antibody, which at the point of contact specifically combines and forms a precipitate line. This is visualized by designing a strong light beam on the bottom of the reaction plate. The assay is commonly used to detect serum antibodies in infected animals, such as in the characterization of IgY antibodies and egg fractions.

Modul de lucruWay of working

Prepararea gelului de agarAgar gel preparation

Se prepară un gel de agar 1% în soluție (tampon borat). Amestecul se fierbe pe baie Mărie până la completa dizolvare a agarului.Prepare 1% agar gel in solution (borate buffer). The mixture is boiled in the Mărie bath until the agar is completely dissolved.

Pregătirea plăcilor pentru reacțiePreparation of the reaction plates

Testul de imunodifuzie se execută în plăci Petri, cu diamentrul de 90 mm, în care se repartizează 17 ml agar la t° de 45-60°C. Plăcile se lasă cu capacul întredeschis pe o suprafață orizontală, aproximativ I oră pentru solidificare. Cu o matriță se taie seturi de câte 7 godeuri (1 central și 6 periferice), cu diametrul de 6 mm la o distanță de 3 mm între ele. Se îndepărtează rondelele de agar din fiecare godeu cu ajutorul unei pipete Pasteur montată la o trompă de vid;The immunodiffusion test is performed in Petri dishes, with a diameter of 90 mm, in which 17 ml of agar is distributed at a temperature of 45-60 ° C. The plates are left with the lid open on a horizontal surface, about 1 hour for solidification. With a mold are cut sets of 7 wells (1 central and 6 peripherals), with a diameter of 6 mm at a distance of 3 mm between them. The agar washers are removed from each well using a Pasteur pipette mounted on a vacuum tube;

Obținerea extractului apos din membrana cochilieră: la 2 g pulbere membrană cochilieră se adaugă 20 ml apă deionjzată, se menține la 4°C, sub agitare, timp de 24 ore; se centrifughează ia 3500 rpm și se testează supernatantul rezultat.Obtaining the aqueous extract from the shell membrane: to 2 g of shell membrane powder add 20 ml deionised water, keep at 4 ° C, stirring for 24 hours; centrifuge at 3500 rpm and test the resulting supernatant.

Repartizarea reagenților și incubarea plăcilor de agarDistribution of reagents and incubation of agar plates

Se repartizează câte 40 μΐ în godeurile: 1, 4 și central din serurile anii Ovotransferină (OTf), anti lizozim, anti ovomucină (OVM), anti ovoalbumina (OVA) și anti IgY, în godeurile 2 și 6 se repartizează câte 40 μ] probă subetalon (martor), iar în godeurile 3 și 5, câte 40 μ! extract apos din membrană cochilieră de testat. Plăcile sunt menținute la temperatura camerei (20-25°C) în atmosfera umedă, timp de 24-48 ore.40 μΐ are distributed in the wells: 1, 4 and centrally of the serum of the years Ovotransferin (OTf), anti lysozyme, anti ovomucin (OVM), anti ovoalbumin (OVA) and anti IgY, in wells 2 and 6 are distributed 40 μ each] sub-standard sample (control), and in wells 3 and 5, each 40 μ! aqueous extract from the test cochlear membrane. The plates are kept at room temperature (20-25 ° C) in the humid atmosphere for 24-48 hours.

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Interpretarea rezultatelorInterpretation of results

La 24 ore liniile de precipitare sunt examinate cu ajutorul unui fascicul intens de lumină, pe un fond Întunecat. Reacțiile de precipitare date de probele subetaloan trebuie să fie clar vizibile. Reacția pozitivă se evidențiază printr-o linie de precipitare clară, obținută între proba subetalon (martor) și antiserul corespunzător.At 24 hours the precipitation lines are examined by means of an intense light beam, on a dark background. The precipitation reactions given by the sub-standard samples must be clearly visible. The positive reaction is evidenced by a clear precipitation line, obtained between the sub-standard sample (control) and the corresponding antiserum.

Reacția slab pozitivă se evidențiază printr-o linie de precipitare tangentă la proba de analizat.The weak positive reaction is evidenced by a precipitation line tangent to the sample to be analyzed.

Reacția negativă se consideră atunci când între godeu! cu antiser și godeuriie cu probele de testat nu apar linii de precipitare.The negative reaction is considered when entering the well! with antiserum and wells with test samples no precipitation lines appear.

Rezultate:Results:

Evidențierea ovotransferinei din membrană cochilieră: în godeuriie 2 și 6 s-a repartizat OTf subetalon, în godeuriie 3 și 5 extract apos din pulberea de membrană cochilieră; în godeuriie 1, 4 și central s-a repartizat serul anti OTf (Fig.l).Highlighting of the ovotransferin from the shell membrane: in wells 2 and 6, subfocal OTf was distributed, in wells 3 and 5 aqueous extract of the shell membrane powder; In wells 1, 4 and centrally, anti-OTf serum was distributed (Fig. 1).

Fig. 1: Evidențierea prin IDGA a OTf din extractul apos obținut din pulberea de membrană cochilieră (godeuriie 3 și 5), comparativ cu OTf subetalon (godeuriie 2 și 6), față de ser anti OTf (godeuriie 1, 4 și central)Fig. 1: IDGA highlighting of OTf from the aqueous extract obtained from the shell membrane powder (wells 3 and 5), compared with subfocal OTf (wells 2 and 6), compared with anti-OTf serum (wells 1, 4 and central)

Evidențierea ovomueinei din membrana cochilieră: în godeuriie 2 și 6 s-a repartizat OVM subetalon (martor), în godeuriie 3 și 5 extract apos din pulberea de membrană cochilieră; în godeuriie 1, 4 și central s-a repartizat serul anti OVM (Fig.2).Highlighting of ovomuein from the shell membrane: in wells 2 and 6, sublethal (control) OVM was distributed, in wells 3 and 5 aqueous extract of the shell membrane powder; In wells 1, 4 and centrally, the anti-LMO serum was distributed (Fig. 2).

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Fig. 2: Evidențierea prin IDGA a OVM din extract apos obținut din pulberea de membrană cochilieră (godeurile 3 și 5), comparativ cu OVM subetalon (godeurile 2 și 6), față de ser anti OVM (godeurile 1, 4 și centrai)Fig. 2: Evidence by IDGA of the LMO from aqueous extract obtained from the shell membrane powder (wells 3 and 5), compared to the sub-level LMO (wells 2 and 6), compared to the anti-LMO serum (wells 1, 4 and center).

Evidențierea lizozimului din membrană cochilieră: în godeurile 2 și 6 s-a repartizat lizozim subetalon (martor), în godeurile 3 și 5 extract apos din pulberea de membrană cochilieră; în godeurile 1, 4 și central s-a repartizat serul anti lizozim (Fig.3).Highlighting of lysozyme from the cochlear membrane: in wells 2 and 6, sub-level lysozyme (control) was distributed, in wells 3 and 5 aqueous extract of the cochlear membrane powder; In wells 1, 4 and centrally, the anti-lysozyme serum was distributed (Fig. 3).

Fig. 3: Evidențierea prin IDGA a lizozimului din extractul apos obținut din pulberea de membrană cochilieră (godeurile 3 și 5), comparativ cu lizozim (subetalon) (godeurile 2 și 6), fața de ser anti lizozim (godeurile 1, 4 și central)Fig. 3: Evidence by IDGA of the lysozyme from the aqueous extract obtained from the shell membrane powder (wells 3 and 5), compared to lysozyme (subetalon) (wells 2 and 6), against the anti-lysozyme serum (wells 1, 4 and central)

Evidențierea ovoalbuminei din membrană cochilieră: în godeurile 2 și 6 s-a repartizat ovoalbumina subetalon (martor), în godeurile 3 și 5 extract apos din pulberea de membrană cochilieră; în godeurile 1, 4 și central s-a repartizat serul anti ovoalbumina (Fig.4).Highlighting the ovoalbumin from the shell membrane: in wells 2 and 6, the subetalon (control) ovoalbumin was distributed, in the wells 3 and 5 aqueous extract of the shell membrane powder; In wells 1, 4 and centrally, anti-ovalbumin serum was distributed (Fig. 4).

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Fig,4: Evidențierea prin IDGA a OVA din extractul apos obținut din pulberea de membrană eoehilieră (godeurile 3 și 5), comparativ eu ovoalbumiua subetalon (godeurile 2 și 6), față de ser antă ovoaibumină (godeurile 1, 4 și central)Fig. 4: Evidence by IDGA of the OVA from the aqueous extract obtained from the cochlear membrane powder (wells 3 and 5), compared to the subetalon ovoalbumin (wells 2 and 6), compared to the antoahoaibumin serum (wells 1, 4 and central).

Evidențierea nnunoglobulinei Y(IgY) din membrană eoehilieră: în godeurile 2 și 6 s-a repartizat IgY subetalon, în godeurile 3 și 5 extract apos din pulberea de membrană eoehilieră; în godeurile 1, 4 și central s-a repartizat serul anti IgY (Fig. 5).Highlighting of nnunoglobulin Y (IgY) from the cochlear membrane: sublycall IgY was distributed in wells 2 and 6, in the wells 3 and 5 aqueous extract of the cochlear membrane powder; In wells 1, 4 and centrally, anti-IgY serum was distributed (Fig. 5).

Fig. 5: Evidențierea prin IDGA a IgY⁷ din extractul apos obținut din pulberea de membrană eoehilieră (godeurile 3 și 5), comparativ cu subetalon IgY (godeurile 2 și 6), față de ser anti IgY⁷ (godeurile 1, 4 și central) a 2017 00042Fig. 5: Evidence by IDGA of IgY ⁷ from the aqueous extract obtained from the cochlear membrane powder (wells 3 and 5), compared to the sub-level IgY (wells 2 and 6), compared with anti-IgY ⁷ serum (wells 1, 4 and central). 2017 00042

26/01/201701/26/2017

EXEMPLUL 6EXAMPLE 6

Determinarea cantitativă a ovotransferinei (OTf) din probe de membrană cochilieră prin testul ELISAQuantitative determination of ovotransferin (OTf) from cochlear membrane samples by ELISA test

Testul imunoenzimatic (ELISA) s-a folosit în controlul cantitativ ai OTf din membrană cochilieră, utilizând kitul de reagenți pentru ovotransferină (Chicken Ovotransferrin ELISA Kit - Abcam). Testul se realizează prin comparație cu etalonul OTf internațional (400-6.25mg/ml) sau cu subetalon intern OTfImmunoenzymatic assay (ELISA) was used in the quantitative control of OTf from the shell membrane, using the Chicken Ovotransferrin ELISA Kit - Abcam) reagent kit. The test is performed by comparison with the international OTf standard (400-6.25mg / ml) or with the internal OTf sub-standard

a) Se repartizează câte 100 μΙ/ godeu OTf standard, respectiv probe de extract apos obținut din membrană cochilieră de testat seria 1, seria 2, seria 3) în diluții zecimale (1/10 1/10000) în tampon carbonat- bicarbonate, comform configurației plăcii (Fig. î)a) Distribute 100 μΙ / well OTf standard, respectively samples of aqueous extract obtained from cochlear membrane to test series 1, series 2, series 3) in decimal dilutions (1/10 1/10000) in carbonate-bicarbonate buffer, according to plate configuration (Fig. Î)

b) Godeurile Al-HI reprezintă standardul OTf din kit (400ng/ml - 6.25ng/ml)b) Al-HI wells represent the OTf standard of the kit (400ng / ml - 6.25ng / ml)

c) Godeurile A3- D3 și A4-D4 reprezintă OTf subetalonc) The wells A3- D3 and A4-D4 represent subfocal OTf

d) Godeurile Ε3-Ή3 și E4-H4 reprezintă extract apos membrană cochilieră seria 1d) The wells Ε3-Ή3 and E4-H4 represent aqueous shell membrane extract series 1

e) Godeurile A5- D5 și E5-H5 reprezintă extract apos membrană cochilieră seria 2e) The wells A5- D5 and E5-H5 represent aqueous extract of shell membrane series 2

f) Godeurile A5- D5 și E5-H5 reprezintă extract apos membrană cochilieră seria 3f) The wells A5- D5 and E5-H5 represent aqueous extract of shell membrane series 3

g) Placa se spală de 3 x cu tampon de spălareg) The plate is washed 3 x with a wash pad

h) Se adaugă 100 μί conjugat imunoenzimatic marcat cu peroxidază (Abcam) diluat de lOOx.h) Add 100 μί peroxidase-labeled immunoenzymatic conjugate (Abcam) diluted with lOOx.

i) Placa se incubează timp de 20 minute la temperatura camerei, acoperită și la întunerici) The plate is incubated for 20 minutes at room temperature, covered and in the dark

j) După îndepărtarea lichidului, placa se spală de 3 x cu tampon de spălare diluat de 20 xj) After removing the liquid, the plate is washed 3 x with diluted wash buffer 20 x

k) Se adaugă 100 μΐ TMB și se lasă 10 minute la temperatura camereik) Add 100 μΐ TMB and leave for 10 minutes at room temperature

l) Se adaugă 100 μΙ soluție de stopare.l) Add 100 μΙ stop solution.

m) Se citește absorbanta reacției ia un spectrofotometru cu filtru de 450 nmm) The absorbance of the reaction is read by taking a 450 nm filter spectrophotometer

n) Se consideră reacție pozitivă pentru prezența OTf diluția la care DO450 este de 0.200 față de OTf standart internațional.n) The dilution at which DO450 is 0.200 compared to international standard OTf is considered to be a positive reaction for the presence of OTf.

o) Conținutul în pg/ml OTf de referință se face în raport cu OTf standard, ținând cont de faptul că testul ELISA decelează minim 10 ng/ml.o) The content in pg / ml of the reference OTf is made in relation to the standard OTf, taking into account that the ELISA test detects a minimum of 10 ng / ml.

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Fig. 1 Configurare placă - Determinare cantitativă OTF în figura 2 sunt prezentate valorile densității optice la lungimea de undă 450 nm pentru standardul OTf (Abcam), subetalonul OTf intern cât și pentru probele, reprezentând extractele apoase obținute din membranele cochiliere (seriile 1, 2 și 3). In figura 3 este evidențiată imaginea plăcii.Fig. 1 Plate configuration - Quantitative OTF determination in figure 2 shows the optical density values at 450 nm wavelength for the standard OTf (Abcam), the sub-standard OTf as well as for the samples, representing the aqueous extracts obtained from the shell membranes (series 1, 2 and 3 ). Figure 3 shows the image of the plate.

a 2017 00042to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Fig. 2 Determinare cantitativă OTF - Valori ale DOFig. 2 Quantitative OTF determination - DO values

Fig. 3 Determinare cantitativă OTf-imagine plaeăFig. 3 Quantitative determination of OTf-flat image

Godeurile Al-HI OTf standard (Abcam)Al-HI OTf standard wells (Abcam)

Godeurile A3- D3 și A4-D4 OTf subetalonThe wells A3- D3 and A4-D4 OTf sub-level

Godeurile E3- H3 și E4-H4 extract apos membrană cochilieră seria 1 Godeurile A5- D5 și E5-H5 extract apos membrană cochilieră seria 2 Godeurile A5- D5 și E5-H5 extract apos membrană cochilieră seria 3Wells E3- H3 and E4-H4 aqueous membrane membrane extract series 1 A5- D5 and E5-H5 aqueous membrane membrane extract series 2 A5- D5 and E5-H5 aqueous membrane membrane extract series 3

S-a realizat curba de calibrare pentru OTf standard reprezentând grafic valoarea absorbantei măsurate în funcție de concentrația acestuia ( Fig. 4)The calibration curve was performed for the standard OTf graphically representing the value of the absorbance measured according to its concentration (Fig. 4)

Curba ca li bra re .OTf..............Curve that it arm re .OTf ..............

3.000 - ......................................................3,000 - ................................................ ......

2.500 o 2Ό00 i A in ^îd 1.500 ;2,500 or 2Ό00 i A in ^ îd 1,500;

Q : /Q: /

1.000 ț'F 0.500 T1,000 tF 0.500 T

0.000 '0.000 '

100 200 300 400 500100 200 300 400 500

C OTf (ng/mL) a 2017 00042C OTf (ng / mL) to 2017 00042

26/01/201701/26/2017

Fig. 4 Curba de calibrare pentru standardul OTf (Abcam)Fig. 4 Calibration curve for the OTf standard (Abcam)

Determinarea cantitativă a OTF din extractele apoase obținute din membranele cochiliere seriile 1, 2 și 3 este prezentată în figura 5.The quantitative determination of OTF from the aqueous extracts obtained from the shell membranes series 1, 2 and 3 is shown in Figure 5.

4.0004,000

3.5003,500

3.000 g 2.5GO g î™ < 1.5003,000 g 2.5GO g ≤ <1,500

i.seoi.seo

9.5009,500

0.000 kit OTf »· O F Rt SJ ΐ :pitl sutetaisn0.000 kit OTf »· O F Rt SJ ΐ: pitl sutetaisn

Eșțrșci apos âîs MC. Saris iYou are a watery man - MC. Saris i

Extract apaș sâîs MC Seria 2 îxtFîCS SpOS ăis MC Seria 3Extract sâsa sâîc MC Series 2 xttFîCS SpOS as well as MC Series 3

33

Log (factor dslidîe)Log (slip factor)

Fig. 5 Determinarea cantitativă (DO) a OTf din probe din extract apos din membraneFig. 5 Quantitative determination (DO) of OTf from samples from aqueous membrane extracts

Se remarcă prezența unui răspuns pozitiv în ceea ce privește conținutul OTf al probelor testate. Cele mai evidente sunt reprezentate de OTf subetalon (concentrația = 36.49 mg/100 ml la diluția 1/1000) și extract apos seria 1 (concentrația = 3.15 mg/100 ml la diluția 1/100)There is a positive response regarding the OTf content of the tested samples. The most obvious are represented by subfocal OTf (concentration = 36.49 mg / 100 ml at 1/1000 dilution) and 1 series aqueous extract (concentration = 3.15 mg / 100 ml at 1/100 dilution)

Seria 2 prezintă un răspuns pozitiv de 1.69 mg/100 ml la diluția 1/100), iar seria 3 de 1.57 mg/100 .ml la diluția 1/100.Series 2 shows a positive response of 1.69 mg / 100 ml at dilution 1/100) and series 3 of 1.57 mg / 100 ml at dilution 1/100.

Claims (1)

Prezenta invenție descrie o metodă de separare, prelucrare și utilizare a membranei cochiliere obținută din ouă hiperimune HPC2.The present invention describes a method for separating, processing and using the shell membrane obtained from HPC2 hyperimmune eggs. Revendicarea metodei de la punctual 1 se caracterizează prin obținerea membranei din ouă hiperimune (HPC2), provenind de la găini imunizate cu un amestec de tulpini bacteriene și fungice inactivate în amestec cu adjuvant QS21.The claim of the method from point 1 is characterized by obtaining the membrane of hyperimmune eggs (HPC2), from chickens immunized with a mixture of bacterial and fungal strains inactivated in mixture with adjuvant QS21. Revendicarea metodei de la punctul 1 se referă la faptul că pulberea obținută din membrana cochilieră conține ingrediente active de mare valoare biologică (colagen, acid hialuronic, glucozamină, condroidină, ovotransferină, lizozim, ovoalbumină, ovomucină).The claim of the method of item 1 refers to the fact that the powder obtained from the shell membrane contains active ingredients of high biological value (collagen, hyaluronic acid, glucosamine, chondroidine, ovotransferin, lysozyme, ovoalbumin, ovomucine). Revendicarea metodei de la punctual 1 se referă la faptul că pulberea obținută din membrana cochilieră reprezintă componentele active ale produsului ROdia-HPC2 comprimate. Acest produs conține și acid scorbic (Vitamina C), un puternic antioxidant care grăbește vindecarea plăgilor și recuperarea în cazul fracturilor.The claim of the method of item 1 refers to the fact that the powder obtained from the shell membrane represents the active components of the ROdia-HPC2 compressed product. This product also contains scorbic acid (Vitamin C), a powerful antioxidant that speeds up wound healing and recovery in the case of fractures. Revendicarea metodei de la punctual 1 se caracterizează prin faptul că, se identifică colagenul și proteinele specifice din membrana cochilieră.The claim of the method from point 1 is characterized by the fact that, the specific collagen and proteins in the shell membrane are identified.