RO115444B1 - Procedeu pentru izolarea lovastatinului - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la un procedeu pentru izolarea lovastatinului, compus cu acțiune lipidemică.

Este cunoscut faptul că lovastatinul rezultă ca produs metabolic secundar al fungilor Aspergillus terreus depus în Colecția Americană a tipurilor de culturi sub nr. ATCC 20541, ATCC 20542 [US 4231938] și al Monascus ruber înregistrat la Agenția de tehnologie și știință industrială a Institutului de cercetări pentru fermentație, Ministerul industriei și comerțului, Japonia [DE 30 6216A1] sub număr Ferm. 4822.

Sunt cunoscute și alte tipuri de microorganisme care pot produce lovastatin, de exemplu, cum ar fi, un mutant al microorganismului Aspergillus terreus și Aspergillus oryzae înregistrat sub nr. ATCC 74135.

Din punct de vedere chimic, lovastatinul este o 5-lactonă a acidului T,2',6',7',8a’-hexahidro-3,5-dihidroxi-2',6'-dimetil-8'-2-metil-1 -oxobutoxi ]-1 -naftalen heptanoic [Stubbs și col., 1986],avînd formula structurală I [EP 0033537 A1):

□ altă formă activă a lovastatinului este, de asemenea, un acid, care din punct de vedere chimic este acid 1,2,6,8,8a- haxahidro-β,δ -dihidroxi-1 -naftalen heptanoic [Albert și col., 1980], avînd formula structurală II (EP 0022478 A1).

Forma de lactonă a lovastatinului este utilizată ca agent pentru reducerea nivelului de colesterol din sînge (Scott M.G. și Vega G.L.,1985). Aceasta inhibă biosinteza acidului mevalonic, prin inhibarea coenzimei 3-hidroxi-3-metilglutaril A reductazei (HMG -CoA reductaza, E.C. 1.1.1.34 (Zubay și col., 1984).

După ce fermentarea este completă, lovastatinul este prezent în mediul de cultură sub formă de lactonă (formula I) și sub formă de acid (formula II).

Se cunoaște un procedeu de izolare a lovastatinului, prin extracție din mediul de cultură, folosind acetat de etil [EP 0033536 A2],

RO 115444 Bl

Extractul este concentrat prin distilare în vid. Deoarece, lovastatinul este 50 prezent sub formă de lactonă, precum și sub formă de acid, forma lactonică fiind importantă din punct de vedere comercial, forma acidă trebuie transformată în lactonă. Lactonizarea se realizează prin refluxarea concentratului în toluen, la 106°C, timp de 2h. După ce lactonizarea este completă, soluția este concentrată la un volum mic. Se obține o substanță pură, de exemplu, prin purificarea concentratului, folosind 55 o coloană umplută cu silicagel, în prezența unor solvenți, ca acetat de etil sau n-hexan. Fracțiunile colectate sunt concentrate din nou în vid și apoi, lovastatinul pur cristalizează în formă de lactonă.Acest procedeu prezintă dezavantaje, prin faptul că, este laborios, decurgînd în mai multe faze,cu aplicare de condiții drastice în timpul izolării, randamentele în lovastatin sunt, în general, reduse.De asemenea,sunt utilizați diferiți 60 solvenți precum, benzen, toluen, acetonitril sau acetatul de etil, care contribuie la creșterea toxicității,influențînd sănătatea persoanelor implicate și periclitînd mediul înconjurător.

Prezenta invenție furnizează un procedeu pentru izolarea lovastatinului constînd în extracția lovastatinului din mediul, miceliul sau filtratul de la fermentarea unui micro- 65 organism capabil de a produce lovastatin, cu acetat de butii,urmată de concentrarea soluției de lovastatin obținută, sub presiune redusă la o temperatură de peste 40°C și de cristalizare.

Prin aplicarea prezentei invenții se obțin avantaje care decurg din faptul că, printr-un procedeu simplificat, se izolează lovastatinul cu randamente bune, cu scur- 70 tarea timpului aferent operațiilor respective și care, se prezintă în mod exclusiv, sub formă de lactonă.

într-o realizare preferată concentrarea soluției se efectuează sub presiune redusă. într-o realizare mai preferată a invenției,concentrarea se realizează la o temperatură, de peste 4D°C, cu sau fără presiune redusă. 75 într-o altă realizare preferată,proba de lovastatin este deivată de la un microorganism, de preferință, de la un fung capabil să producă lovastatin.în acest caz, proba poate fi mediul de fermentație, în care microorganismul sau respectiv, fungul a fost cultivat, miceliul de fung sau filtratul.

Nu este limitată natura fungului utilizat, putînd fi folosit orice fung care este 80 capabil de a produce lovastatin, cu cei care aparțin genului Aspergillus, fiind preferați Aspergillus oryzae sau Aspergillus terreus.

într-o realizare mai preferată fungul este Aspergillus oryzae (ATCC 20542) sau Aspergillus terreus (ATCC 74135 ].

în concordanță cu procedeul conform invenției, lovastatinul poate fi obținut 85 exclusiv sub formă de lactonă. în mod surprinzător, solventul utilizat în acest procedeu, de exemplu, acetatul de butii, favorizează atingerea acestui scop. Aceasta poate fi explicată prin faptul că, în procedeele de lactonizare, apa este eliberată și trebuie îndepărtată din mediul de reacție. Deoarece, acetatul de butii are un punct de fierbere mai înalt și nu poate forma amestecuri azeotrope, în mod substanțial cu apa, în con- 90 dițiile date, este esențial ca toată apa formată, în timpul procesului de lactonizare, să fie îndepărtată.

Prin procedeul, conform invenției, devine posibilă scurtarea timpului de izolare a lovastatinului. Deoarece acetatul de butii poate fi utilizat, atit pentru extracția lovastatinului dintr-o probă, cit și pentru efectuarea lactonizării, efectele toxice ale 95 altor solvenți sunt evitate. Procedeul poate fi reprodus industrial, cu un randament final, în jur de 60%, independent de faptul că lovastatinul a fost produs din microorganisme intracelulare sau extracelulare, sub formă de lactonă sau sub formă de

RO 115444 Bl acid. Substanța izolată este similară cu substanța izolată prin procedeele cunoscute în practică. Structura substanței obținute a fost confirmată prin spectroscopie IR (fig. 1), spectroscopie de masă (fig. 2 ], RMN (fig. 3) și spectroscopie UV (fig. 4).

Se dau, în continuare, 3 exemple de realizare a invenției.

Exemplul 1. 1000 ml mediu de fermentație obținut prin fermentarea Aspergillus terreus (ATCC 20542) sau Aspergillus oryzae (ATCC 74135) și avînd o valoare a pH- ului=4,8, o vîrstă de 120 h și un conținut de lovastatin de 300 pg /ml (lactonă + acid) se acidulează cu HCI (36%), pînă la un pH, de 3-5. Mediul de fermentație este apoi răcit sub 20°C, se adaugă 500 ml acetat de butii și se efectuează extracția, timp de 4 h, la această temperatură. După ce extracția este completă, se centrifughează soluția și se separă faza organică de faza apoasă. Miceliul și faza apoasă sunt separate și faza organică este apoi tratată. Aceasta este concentrată prin distilare în vid, la o temperatură, de circa 40°C, la un volum de 50 ml. Simultan cu concentrarea are loc și procesul de lactonizare. Concentratul este apoi răcit la o temperatură, de 20°C, după care se menține în stare de repaus, timp de cîteva ore, astfel, încit să se poată produce cristalizarea lovastatinului. Produsul brut astfel obținut este apoi recristalizat. Se obțin 170 mg de lovastatin sub formă de lactonă, avînd o puritate de peste 90%.

Exemplul 2. 1000 ml mediu de fermentație obținut prin fermentarea Aspergillus terreus (ATCC 20542) sau Aspergillus oryzae (ATCC 74135) și avînd o valoare a pH- ului=4,73, o vîrstă de 120 h și un conținut de lovastatin de 190 pg /ml (lactonă + acid) în filtrat și 15 pg /ml de lovastatin în miceliu.se acidulează cu HCI (36%) pînă la un pH, de 3-5.Mediul de fermentație este apoi filtrat printr-un filtru Oliver. Miceliul se îndepărtează, filtratul se răcește la o temperatură sub 20°C și se adaugă jumătate din volumul de acetat de butii.

Se efectuează apoi extracția, timp de 1 h, după care se procedează ca în exemplul 1.

Se obțin 79 mg lovastatin sub formă de lactonă, cu puritate de 90%.

Exemplul 3. 1000 ml mediu de fermentație obținut prin fermentarea Aspergillus terreus (ATCC 20542] sau Aspergillus oryzae (ATCC 74135) și avînd o valoare a pH- ului=4,78, o vîrstă de 120 h și un conținut de lovastatin de 5 pg /ml (lactonă + acid) în filtrat și 300 pg /ml de lovastatin în miceliu.se acidulează cu HCI (36%), pînă la un pH, de 3-5 și se centrifughează.Se îndepărtează filtratul, se adaugă o pătrime din volumul de acetat de butii la miceliu și apoi se răcește la o temperatură, în jur de 20°C. Se face extracția, timp de 4 h. Extracția este urmată de centrifugare. Se îndepărtează miceliul și filtratul este tratat ca în exemplul 1. Se obțin 90 mg de lovastatin sub formă de lactonă, avînd o puritate de peste 90%.

Claims (5)

1. Revendicări

   1. Procedeu pentru izolarea lovastatinului, caracterizat prin aceea că, constă în extragerea lovastatinului dintr-un mediu de fermentație, miceliu sau filtrat al unui microorganism capabil de a produce lovastatin, cu acetat de butii,urmată de concentrarea soluției de lovastatin obținută, sub presiune redusă la o temperatură, de peste 40°C și de cristalizare.
2. 2. Procedeu, conform cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că microorganismul capabil de a produce lovastatin este un fung.
3. 3. Procedeu, conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că fungul face parte din genul Aspergillus.

   RO 115444 Bl
4. 4. Procedeu, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că fungii utilizați pot fi din genul Aspergillus terreus sau Aspergillus oryzae.
5. 5. Procedeu, conform revendicării 4, caracterizat prin aceea că fungii sunt Aspergillus terreus /ATCC 2Q542J sau Aspergillus oryzae (ATCC 74135).