PT99348A

PT99348A - Processo de preparacao de conjugados de corticosteroides com albumina humana e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT99348A
Application number: PT99348A
Authority: PT
Inventors: Fiume Luigi; Busi Corrado; Mattioli Alessandro; Spinelli Cosima; Spinosa Giulia; Bartolini Giovanna; Minghetti Luisa; Orlandi Marina; Tomasi Vittorio
Original assignee: Baldacci Lab Spa
Priority date: 1990-10-25
Filing date: 1991-10-25
Publication date: 1992-09-30
Also published as: IT9021880A1; IT9021880A0; EP0482540A1; IT1243751B; IT8922275A0

Description

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MEMÓRIA.....DESCRIΤIVA Ο presente invento refere-se ao processo de preparação de novos derivados de corticosteróides, particularmente daqueles conhecidos sob os nomes de prednisolona e betametasona e de composições terapêuticas que os contêm, como ingrediente activo»

Como é sabido, os corticosteróides inibem a produção ou a libertação de mediadores produzidos pelos macrófagos, aos quais é atribuído um papel chave nos mecanismos da inflamação e na resposta imunitária (prostaglandinas, leucotrienos, etc„), (Schlei-mar R-P-„ ANN. Rev„ Pharmacol. Toxicol,, 25, 381 (1985))«

Uma vez que os esteróides são activos também sobre outros sistemas celulares envolvidos nos processos flogístico e imunitário é difícil avaliar em que medida a actividade destas drogas sobre os macrófagos se adiciona aos seus efeitos anti--inflamatório e imuno-supressivo» Sabe-se também, que a albumina, conjugada com pequenas moléculas é selectivamente absorvida das células do sistema macrófago (Kruse H,, Me Master p„o,, J„ Exp„ Med, 90, 425, (1949)),

Por outro lado, experiências in.....vitro e in.....vivo têm mostrado que algumas toxinas, tais como a amanitina e a faloídina, e algumas drogas antivirais, tais como a arabinósiclo-citosína e a fluo-rodesoxi-uridina, após conjugação com a albumina não perdem a ac~ tividade biológica aplicada selectivamente nos macrófagos., (De-renzini M. e Coll., Lab, Invest. , 2.9 150, (1973) u Barbanti-Brodano fâ,, Fiume Ϊ,,, Nature New Biology 243, 281, (1973)Barbanti-Brodano Derenzini M„ Fiume L,, Nature, 248.. 63, (1974); Balboni Ρ,Θ, e Colab,, Nature 264, 181 (1976),

Veríficou-se agora que alguns corticosteróides, particularmente a prednisolona e a betametasona, se conjugados com albumina humana, entram especifícamente nos macrófagos, sugerindo assim que, para algumas patologias, os seus wfeitos terapêuticos podem ser explorados sem os efeitos secundários característicos destas drogas, graças à selectividade da distribuição celular depois da

, <21 73 280 91 QT 22 E kggt é- 3 administração»

Por sua vez» o processo do presente invento para a preparação dos conjugados anteriorrnente citados compreende a realização da conjugação entre albumina humana (USA) e o corticosteróide na forma de hemi-succinato» preparado de forma conhecida per se, acordo com o processo do anidrido misto usando clorocarbonato de isobutilo corno descrito por Erlanger B„F„ et ai»» 1b Biol„ Chem„a 228» 713» (1975)» e determinando por via espectrofotométrica (|~r~ langer B»F„íbidem) no conjugado resultante a razão molar entre o corticosteróide e a HSA» tendo-se verificado que esta razão estava em todas as experiências entre is e 19» Esta razão permanece inalterada também ao fazer-se a liofilização do conjugado e mantendo-se à temperatura ambiente durante um ano- A solução de conjugado» após 24 horas a 37 "C» não apresenta qualquer libertação de corticosteróide livre» demonstrando assim a estabilidade da ligação entre o corticosteróide e a HSAs esta ligação é muito provavelmente uma ligação carboamido entre o grupo succirrico do corticosteróide e os grupos amino da lisina da proteína»

Para os testes farmacológicos» as preparações de conjugado foram marcadas com de acordo com o método de Fraker ® Speck (Fraker P„J„» Speck Jr» J» C.» Biochem» Biophys. Res» Commum. 80» 849» (1978)),,

Os macrófagos foram obtidos a partir de monócitos humanos isolados de sangue periférico (Orlandí M» e colab» Prostaglandins Leukot» Med»„ 18» 205» (1985)) e colocados em cultura durante seis dias em RPMI 1640 (Flow) contendo 10% de soro humano do grupo AB»

Os fibrócitos da linha celular murína 3T3 foram cultivados em RPHl 1640 contendo 10% de soro bovino fetal» Para as experiências sobre a penetração dos conjugados» as células (macrófagos ou fíbroblastos) (4-6 x 1Q6) foram incubados ern rpmi 1640 (sem soro) na presença de 300 ng/ml de PRDN-(125I)HSA (actividade específicas 2»4 c 106 cpm/|ig) - As células foram recolhida© no momento 0 e após uma hora5 após três lavagems com solução salina

Kr/_

73 280 91 0Τ 22 E Λ- 4- % tamponada de fosfatos (PBS), foram colocadas em solução com 2 ml de NaOH 6 N e em seguida efectuou-se a rn edição da sua radioactívidade e do seu teor em proteína»

As concentrações cie conjugado foram calculadas com base nos valores da radioactívidade intracelular que foram obtidos subtraindo os cpm calculados no momento 0 dos rnedídos uma hora mais tarde (tempo 1 h) „ A produção de prostaglandina E2 (PfâE2) e de tromboxano A,:?(TXA2) foi induzida nos macrófagos por adição de 10% de soro bovino fetal ao meio de cultura (Bartolini G„ e colab. , Biochim, Biophys, Acta, 876, 486, (1986))»

Após 24 horas de incubação,, os valores de PGE2 e de tromboxano (metabolito estável de TXA2) foram avaliados no meio de cultura por RIA (Orlandi, ibidem)« 0 quadro 1 mostra as concentrações de PRDN-HSA nos macrófagos e nos fibrócitos cultivados durante uma hora na presença do conjugado» De acordo com as fontes da literatura que afirmam que as moléculas de albumina quimicamente modificadas entram selectivamente nos macrófagos, verificou-se que a concentração do conjugado nestas células é muito mais elevada do que a dos fibrócitos»

Quadro 1

Concentração de PRDN-(12¾)HSA em macrófagos e fibroblastos cultivados» Células Macrófagos 24,8+/-4,6a Fibroblastos PRDN- (1251) HSA ( n g/tn 1 proteína da célula) 0,8+/-0,1 au valor médio dos resultados (+/-erro padrão) dos 4 testes»

Na fig_ 1 incluída mostra-se que o conjugado PRDN-HSA inibe a produção de prostaglandina E2 © de tromboxano Ag induzida nos

73 280 91 ΟΤ 22 Ε macrófagos cultivados in......vj-t.ro por adição de soro bovino fetal fresco»

de tromboxano ^¢0) nos macrófagos» Cada ponto representa o valor médio dos resultados de quatro experiências» Os erros padrão da percentagem de inibição nas diferentes experiências variaram entre +/-0,6 a +/-5,,9, dependendo das diferentes concentrações de conjugação» Para uma concentração de conjugado de 0,6 pg/ml correspondendo a 0,05 pg/ml de PRDN (prednisolona) acoplada, obteve-se uma inibição de 50% da produção de ambos prostaglandina e tromboxano»

Sern impor limites indevidos ao presente invento parece plausível atribuir a actividade do conjugado a uma libertação intracelular da droga, do portador:: esta hipótese é suportada pelo facto de, como se sabe, a albumina depois da penetração nos macrófagos entrar nos lisossomas e por isso os esteróídes mostrarem a sua actividade depois de se terem ligado a um receptor citossólico» Parece assim provável que o conjugado PRDN-HSA tenha o comportamento de um agente lisossometrópícos a ligação que liga a droga à albumina é quebrada nos lisossomas e a droga livre aplica o seu efeito farmacológico depois de atravessar a membrana lisossómíca»

Esta selectivida.de de penetração do conjugado nos macrófagos tem a consequência de a actividade dos esteróide ocorrer assim apenas àquele nível sem os efeitos secundários comuns catalisados pela entrada, da droga noutros sistemas celulares»

Voltando agora ao conjugado de betametasona (BMT), ela é conjugada com HSA depois da sua. conversão no seu hemi-succínato» Esta preparação é aqui adiante descrita uma vez que o hemi-succinato, ao contrário do da prednisolona (PRDN), não está disponível comercialmente» Díssolveram-se BMT (0,5 mirioles), anidrido succínico (4 mmo-les) e 4-dimetílaminopiridína. (0,17 mmoles) em 6 ml de píridína

anidra e rnantiveram-se à temperatura ambiente» Após 24 horas3 a cromatografia em camada fina numa placa de sílica ~ gel (60F~254g Merck) com 2-propanol/hidróxida de amónio concentrado/água (60:30::10 v/v) mostrou que praticamente todo o BMT tinha sido convertido no seu hemi-succínato» Neste ponto, o pM da mistura, reaccional foi reduzido para o valor 1 por meio de HCl para precipitar o hemí-succinato de BMT„ Após 1 hora a 0-4 0C, a mistura foi centrifugada, sendo o sobrenadante rejeitado- 0 hemi-succinato de BMT foi dissolvido em 12 ml de água adicionando NaHCQg em pó e em seguida precipitado de novo, com HCl, recolhido e seco sob vácuo (0,45 mmoles)„ 0 hemi-succinato de BMT foi conjugado com HSA usando os mesmos procedimentos usados para a preparação do conjugado com he-mi-succiriato de PRDN» A razão molar droga/HSA, determinada espee-trofotometricamente, foi de 15, 15 e 18 em três preparações diferentes» A acção do conjugado BMT-HSA foi testada sobre a produção de prostaglandinas E2 induzida em macrofãgos activados ín vitro adicionando 10% de soro fetal» Usou-se o método usado para o conjugado PRDN-HSA» Os resultados, apresentados na fig» 2, mostraram que também o conjugado com BMT evita a formação de PfâE2. Foi conseguida uma inibição de 50% com concentrações de BMT-HSA de 0,3-0,4 pg/ml, correspondendo a 0,02-0,03 pg de BMT/ml-

Nas experiências efectuadas na ratazana, a penetração in. vivo do conjugado BMT-HSA nas células do parênquima do fígado foi comparada com a penetração nas células sinusoidais do mesmo órgão as quais pertencem ao sistema das células macrofagas (Van Furth et al. Buli wid Hl th Org» 46, 854 (1972))» Para estas experiências, usou-se uma preparação de conjugado radioactivo obtida por ligação de hemi-succinato de BMT a HSA marcado de acordo com o método de Jentof e Darborn usando formaldeído tritiado e seguindo o método descrito em Fiume et al» Câncer Drug Delivery 4, 11 (1987) (actividade específica 1,2 x 1G6 dpm/mg)» A razão molar droga/proteína do conjugado radioactivo foi de 15» As experiências foram realizadas exactamente como descrito em Fiume et

73 280 91 OT 22 Ε a 1., ,j Câncer Drug Oelivery 4, 11 (1987)

Os resultados, apresentados no quadro 2, mostrarn que a concentração do conjugado nas células si nu soí dais é cerca, de cem vezes mais elevada do que nas células do parênquima.

Quadro 2

Distribuição do conjugado BMT-Alburrdna nas células do parênquima do fígado 30 minutos depois da sua administração-

Composto dose (pg/g) !3MT~II3H]HSA 35 As experiências foram realizadas cer Drug Delivery 4, 11 (1987)„ células células do parênquima sinusoídais 1 „ 3+/-Q b 3 146 a 5+/™l „ 2 de acordo com o descrito em Cari-

Os resultados foram calculados a partir dos valores de ra-dioactividade insolúvel em ácido das preparações celulares» Eles foram expressos em percentagem de dpm ínjectado x 10ó de proteínas celulares» Os valores representam a média (+/-erro padrão) dos resultados de quatro experiências

Claims

8 73 280 91 0Τ 22 e ELJL.I.....ν.....Ι.....Ν.....D....I.....Ç.....A.....£.....0.....E.....S. 1 ~ Processo de preparação de um conjugado de um corticos-teróide e de albumina humana* caracterizado por se fazer reagir o corticosteróide,., na forma de hemi~succinato* com albumina humana* pelo método do anidrido misto,, usando clorocarbonato de isobuti-lo-
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1* caracterizado por o referido corticosteróide ser seleccionado de. entre predni-solona e betametasona e por a razão molar entre corticosteróide e albumina humana estar entre 15 e 19»
3 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica* caracterizado por’ se associar um conjugado de acordo com as reivindicações 1 e/ou 2* como ingrediente activo* com portadoi es ou excipientes farmaceuticamente aceitãveis- Lisboa* 2b. 01)1 1991 Por LABQRATQRI BALDACCI SPA ~Q AQENTE OFICIAL”